血型分子诊断技术进展与应用 浙江省血液中心朱发明 2013-06-28 E-mail:zfm00@hotmail.com
主要内容 红细胞血型系统分子诊断 红细胞血型系统分子基础 ABO 血型系统 Rh 血型系统 其他血型系统 红细胞血型系统分子诊断技术 应用 小结
红细胞血型系统 34 blood group systems 43 个基因 1435 个等位基因 ( 截止 2013 年 5 月 24 日 ) 参见 dbrbc
红细胞血型分子机制 点突变 同义突变 无义突变 有义突变 起始密码突变 拼接接受位点 插入 缺失 基因重组 (RHD/RHCE) 基因部分重复 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/ mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/systems
ABO 血型分子生物学研究 1990 年 Yamamoto 等首次克隆 基因定位于染色体 9q34 ABO 基因 cdna,dna 长度为 1062bp ABO 血型系统为三复等位基因, 有 A B O 三个基因 ABO 基因包括 7 个外显子, 长度大于 18kb 大多数编码序列位于第 6 和 7 外显子
ABO 基因示意图
常见等位基因 A 和 B 基因编码的蛋白都是 353 个氨基酸,O 基因编码的蛋白只有 115 个氨基酸 A101 A102 B101 O01 O02 A101 作为参考序列 A102 等位基因 C467T(Pro-Leu) B101 基因在 297 526 657 703 796 803 930 1096 位有 8 个核苷酸与 A101 基因不同 但只有 526 703 796 803 四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列的变化 (A101 依次是精氨酸 甘氨酸 亮氨酸和甘氨酸, B101 依次是甘氨酸 丝氨酸 蛋氨酸和丙氨酸 ) O01 基因在 261 位的 G 缺失, 提前终止
ABO 亚型频率分布 ABO 血型中存在 ABO 亚型 临床输血和献血者检测中常见 440617 份 A 亚型 22 份 AxB 11 例,AelB 3 例,Ax 3 例,Ael 2 例,Amh 2 例,A 3 1 例 B 亚型 41 份 Bx11 例,B 3 9 例,ABx7 例,AB 3 5 例,Bel3 例,Bm 2 例,ABel 1 例, ABend 1 例,ABm 1 例,Bend 1 例 B(A)1 例 CisAB2 例 A 2 14 例 A 2 B 35 例 引自中国输血杂志 2006,19(1):25
ABO 亚型的分子研究 通过检测 261 526 703 796 803 位的核苷酸可以确认大多数典型的 ABO 血型的基因型 近年来对血清学分类的 ABO 血型亚型抗原, 应用 PCR DNA 测序等技术, 在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上进行研究 结果表明 : 原为同一亚型的抗原存在异质性, 即血清学上同一亚型, 在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差异 几个位点以外的核苷酸变化引起的 ABO 血型亚型常会引起检测结果的偏差 发现的等位基因数为 318 个 (2013 年 05 月 24 日 )
A 等位基因 可简要分为 7 大类等位基因 A1 A2 A3 Ax Ael Aw Am A101 等位基因序列作为参照标准 A102(C467T)( 在中国人群中比例大于 A101) A103(C467T,C564T) A104(A297G) A105(A297G,B-O1 重组 ) A106(B-O02 重组 ) A205(A1009G )
B 等位基因型 可简要分为 5 大类等位基因 B1 B3 Bx Bel Bw B 等位基因中 297 703 796 803 位基本恒定 B101-B120 B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G80 3C;G930A;G1096A B301-B312 B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A, G803C, G930A, G1096A, C1054T
O 等位基因 O01-O75 大多数 261nt 缺失,13 个 261nt 不缺失 O01:261delG O02:261delG T646A G681T C771T G829A 人群中常见 003:261G A297G,C526G,G802A O50
CisAB01-08 CisAB 和 B(A) 等位基因 CisAB01:C467T,G803C CisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C, B(A)01-06 B(A) 型单克隆试剂应用于临床后, 抗 A 试剂偶尔与原定为 B 型的红细胞发生反应, 这类含有大量 B 抗原极少 A 抗原的红细胞称之为 B(A) 型 B(A)01:A297G,C526G, 796A,G803C,G930A,G1096A B(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A, C796A,G803C,G930A,G1096A
实验室发现的 ABO 等位基因 A208 allele* C467T; G539C A210 allele* 268T>C;467C>T A211 allele* 266C>T;467C>T B112 allele* 297A>G; 526C>G; 559C>T;657C>T; 703G>A; 796C>A; 803G>C;930G>A B305 allele* 297A>G; 425T>C; 526C>G; 657C>T; 703G>A; 796C>A; 803G>C; 930G>A B307 allele* 297A>G; 410C>T; 526C>G; 657C>T; 703G>A; 796C>A; 803G>C; 930G>A Bw12 allele* C278T CisAB05 allele* A297G; C526G; C657T; G703A; C 796A; G930A O61 allele* 261del 743C
实验室发现的 A2 等位基因
实验室发现的 A2 等位基因
实验室发现的 A2 等位基因
实验室发现的 A2 等位基因
ABO 亚型分子机制和诊断 凝集强度改变 正反定型不一致 点突变为主 PCR-SSP 261G PCR-SBT SNP( 单核苷酸多态性 )
ABO 亚型分子机制和诊断 PCR-SBT 常见为 6-7 外显子扩增 双向测序 存在风险 : 扩增引物 SNP 多态性位点在其它位置 其它机制 : 表观遗传 其它
ABO 亚型分子机制和诊断 PCR-SBT 1-7 外显子扩增技术和策略 全长 18kb 一般 3 对引物以上 外显子上的突变 ATG 位置突变 其它机制??
ABO 亚型分子机制和诊断 基层实验室如何有效获取信息 血清学结果 家系分析 保存抗凝全血 -20 以下 寻求分子诊断实验室帮助
人群 ABO 血型检测
人群 ABO 血型检测
Rh 血型基因 基因位于 1 号染色体短臂上, 即 1P34 36 两个基因 :RHD 编码 D 抗原,RHCE 编码 CcEe 抗原 RHD 和 RHCE 基因同源性高达 96% 以上 RHD 和 RHCE 基因均有 10 个外显子
RHCE 和 RHD 基因组成示意图 1p34-p36
RhD 阳性 正常 RhD 阳性 弱 D(weak D) 部分 D(partial D) Del RhD 阴性 RHD 基因缺失 RHD 基因功能丧失 RHD 等位基因
部分弱 D 的分子突变点 RHD weak D type 1 T809G RHD weak D type 1.1 C5G; T809G RHD weak D type 2 G1154A RHD weak D type 3 C8G RHD weak D intron 5'5A intron3 5 G5A RHD weak D type33 (Taiwan1) G520A RHD weak D type Taiwan2 T809A RHD weak D type 51 A594T; C602G RHD weak D type 52 92T>C RHD weak D type 53 T740G 分子机制 碱基突变 缺失 mrna 拼接位点变异
部分 D 分子机制 Partial D 发现等位基因 70 多个 - RHD Va 2 T667G;G697C;G712A; G1273C RHD Va 3 G697A RHD Va 4 hybrid D(1-4) CE5 D(6-10) RHD VI type I hybrid (D1-3) CE(4, 5) D(6-10) RHD VI type II hybrid D(1-3) CE(4-6) D(7-10) RHD VI type III hybrid D(1, 2) CE(3-6) D(7-10) RHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5) D(6-10) 分子机制 基因交换 RHD-CE-D 点突变
部分 D 分子机制示意图
Del 分子机制 Del(D elution) 亚洲人群常见 RHD DEL (Cde)1 intron 3 G1A RHD DEL (Cde)2 G885T RHD DEL (Cde)3 intron 9 G1A; G1227A RHD DEL (Cde)4 intron 5 38delCTCT RHD DEL (Cde)5 1252insT RHD DEL (Cde)6 T1203A RHD Del (Cde)7 G3A RHD Del (Cde)8 C28T RHD Del(Cde)9 T53C RHD Del(Cde)10 T251C RHD DEL T1222C RHD Del intron 8-9: del 1013 RHD DEL exon8 del 995nt including 3'intron7+exon8+5'intron8
RhD 阴性的机制 不同 Rh 阴性表现型频率不同 RHD 阴性的可能机制 RHD 基因缺失 RHD 基因发生改变 RHD-CE-D 融合基因 RHD 基因的第 3 到 9 外显子被 RHCE 基因取代 RHD 阴性个体中约 1/3 具有完整的 RHD 基因 非洲 D 阴性个体具有 RHDψ( 假基因 )
本实验室部分检测结果 9 例弱 D 样本 RHD 845A 5 例 (RHD weak D type 15) RHD 1227A 3 例 (D-el (CDe); minimal expression of D antigen; ) RHD 1013C 1 例 (RHD weak D type 24) 10 例部分 D 样本 Dva(Kou) 1 例 Dva(Hus) 1 例 DVa-like(YH) 1 例 DVI type III 7 例 Molecular basis of D variants in Chinese persons. Transfusion. 2007;47(3):471-7 Rh 表型样本量 RHD+/RHD+ RHD+/RHD- RHD-/RHD- RhD 阳性 198 186 (93.94%) Weak D 32 3 (9.37%) RhD 阴性 208 10 (4.81%) 12 (6.06%) 29 (93.63%) 53 (25.48%) 0(0) 0(0) 145(69.71%)
RHD 血型分子诊断 RhD 阴性 多重 PCR 技术 FQ-PCR PCR-RFLP D Variant PCR-SSP 测序技术
RHD 血型分子诊断 分子机制复杂 RhD 阴性分子机制 基因交换 RHD-CE-D 疑难标本 单一技术难以判定 多种技术并存 血清学结果
血清学特性 分子机制 点突变 基因重组 其它血型系统 PCR-SSP 基因芯片
其它血型系统 罕见表型 血清学特性 基因定位 测序技术 体外表达
红细胞血型中采用的技术 PCR-RFLP PCR-SSP 多重 PCR 技术 PCR-SBT PCR-SSCP PCR-RQ 基因芯片 方法的优缺点 与血清学方法的比较
PCR-SSP 利用 3 碱基特性 分别设计一系列序列特异性引物 直接扩增出目的基因片段 通过凝胶电泳观察 方法特性 简单快捷 易于操作 基于已知序列
DNA 测序法 通过 PCR 扩增基因的主要片段, 然后对产物进行序列分析测定, 分析发生突变的碱基便可确认血型 血型及其亚型的分子基础 本方法结果准确可靠 需要特殊的仪器设备 操作烦琐, 成本高
Partial sequence in exon 6 A novel allele O01 allele Bw12 allele
实时荧光技术 (PCR-RQ) Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction. Transfusion and Apheresis Science 27 (2002) 217 223 实时定量 荧光基团 特异性探针 产前诊断
红细胞血型系统分子诊断技术的应用 红细胞血型的诊断 人群遗传的分析 谱细胞血型的诊断 罕见表型分子机制研究 疑难血型的判断 多次输血后的血型检测 产前血型的诊断
红细胞血型系统分子诊断技术的应用 罕见表型 多次输血病人 ABO RhD 血型的不一致 RhD 变异体 弱表达的基因情况 RHD 杂合度 筛选稀有系统 ( 抗体缺乏 ) 谱细胞
国内红细胞血型系统基因诊断情况 基因分型方法的建立 分子遗传多态性检测 罕见表型分析 RHD 基因 ABO 血型亚型 类孟买型 其他 功能表达
红细胞血型基因分型 不能完全取代传统的血清学方法, 其原因有 : 血清学方法快速 简单, 易于操作 血清学试验比 PCR 方法成本低 DNA 技术不能用于抗体筛选, 至少目前尚没有合适的方法 DNA 技术只能预测血型表现型 基因分型方法 : 样本来源更广, 保存时间更长 稀有表型鉴定 疑难样本鉴定 阐明分子机理等 目前 DNA 分型结果应该与血清学结果相互补充
小结 : 血型分子机制 ABO RHD 其他血型 诊断技术 血型分子诊断发展
血型分子诊断发展 高通量技术 表观遗传 RNA 干扰 等位基因数量 分子机制 表达调控
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