研究报告 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 05, 3(3):3-7 鸡 neurexophilin 基因在毕赤酵母中的表达 陈美玲聂彬姜勋平刘桂琼 ( 华中农业大学动物科技学院, 武汉 430070) 摘要 : Neurexophilin 是母鸡子宫阴道结合部位的差异表达基因 根据鸡 nxph 的序列, 结合毕赤酵母密码子的偏好性, 合成 nxph 基因, 设计引物以合成基因为模板, 扩增其去除信号肽的 DNA 序列 nxph, 将合成的 nxph 基因及去除信号肽的 nxph 基因片段 nxph 分别插入 ppiczαa 真核表达载体, 构建重组表达质粒 ppiczαa/nxph 和去除信号肽的重组表达质粒 ppiczαa/ nxph, 电转入毕赤酵母 GS5, 阳性菌用终浓度为 % 的甲醇诱导表达,SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测表达产物, 结果表明重组菌成功分泌鸡 NXPH 蛋白和去除信号的 NXPH 蛋白, 大小约 9 kd, 为探索 NXPH 在母鸡生殖道内的功能奠定基础 关键词 : nxph ; 毕赤酵母 ; 基因表达 DOI :0.3560/j.cnki.biotech.bull.985.05.04.030 Expression of Chicken Neurexophilin Gene in Pichia pastoris Chen eiling Nie Bin Jiang Xunping Liu Guiqiong (College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070) Abstract: Neurexophilin is the differentially expressed gene at the chicken utero-vaginal junction. According to the mrna sequence of chicken nxph and codon bias of Pichia pastoris, the modified DNA sequence for chicken nxph which encodes the same amino acid sequence as that of chicken nxphwere synthesized. Specific primers were designed to amplify part of the synthesized DNA sequence whose expression product has no signal peptide. The two sequences were inserted into ppiczαa vector to construct the recombinant ppiczαa/ nxph and ppiczαa/ nxph(without signal peptide), and then the recombinant plasmids were transfected into Pichia pastoris GS5 by electroporation. The positive recombinant strains were inducted to express protein by addition of % methanol. The expression protein was displayed on the Tricine-SDS- PAGE electrophoresis and Western blot. The result showed that chicken NXPH protein and NXPH protein were successfully expressed, and the molecular weight of the protein was approximately 9 kd, which provided foundations for analyzing functions of NXPH in chicken reproductive tract. Key words: nxph ;Pichia pastoris ;gene expression Neurexophilin(NXPH) 是一种从大鼠和牛的脑部分离纯化的神经糖蛋白, 其成熟肽 9 kd, 因其与神经元表面蛋白 Iα(neurexin Iα) 紧密结合而命名 [] 哺乳动物至少含 4 个与 NXPH 相关的基因, 分别是 nxph nxph nxph3 和 nxph4, 这 4 种基因在不同动物不同组织中的表达不一致, 如人类可表达 4 种基因, 而鼠类则只表达 nxph nxph3 和 nxph4 基因, 且只有 NXPH 和 NXPH3 可以与 neurexin Iα 结合 [] [3] 朱金金等发现 nxph 是鸡子宫阴道结合部的差异表达基因, 且该基因在高受精率组母鸡子宫阴道交接部的表达高于低受精率组, 推测其可能与精子贮 [4] 存相关 刘桂琼等也发现在人工授精后, 母鸡贮精腺表达神经系统内特异表达的 Neurexophilin 基因, 而高受精力母鸡贮精腺 Neurexophilin 表达量高于低受精力母鸡, 因此神经调控可能参与贮精腺内的精子贮存 本研究根据酵母基因表达的密码子偏 收稿日期 :04-07-07 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (307088) 作者简介 : 陈美玲, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 动物遗传育种与繁殖 ;E-mail :chenmeiling064@6.com 通讯作者 : 刘桂琼, 副教授,E-mail :liuguiqiong@mail.hzau.edu.cn
4 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 05,Vol.3,No.3 好改造鸡 nxph 基因, 在毕赤酵母 GS5 中表达该基因, 以期为后续研究 NXPH 蛋白的生物学功能奠定基础 材料与方法. 材料真核表达载体 ppiczαa 毕赤酵母 GS5 菌株为华中农业大学国家微生物重点实验室郭爱珍教授课题组惠赠 ; 克隆载体 PD-8T 购自大连宝生物公司 (TaKaRa) 公司 ; 大肠杆菌 DH5α 菌株购自北京全式金生物技术有限公司 ; Zeocin T 购自 Invitrogen 公司 ; 质粒提取试剂盒购自 Omega 公司 ;T4 DNA 连接酶 TEED 限制性内切酶 EcoR Ⅰ Not Ⅰ Sac Ⅰ 均购于 TOYOBO 公司 ;neurexophilin 抗体购自美国 R&D 公司. 方法.. Nxph 基因合成和引物设计根据 GenBank 公布的鸡 nxph 基因 (X - 48683)mRNA 编码序列, 结合毕赤酵母密码子的偏好性优化序列, 在基因的两端添加 EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 限制性内切酶位点, 序列长为 833, 序列依次为保护性碱基 EcoR Ⅰ 酶切位点 氨基酸的编码序列 83 Not Ⅰ 酶切位点和保护性碱基 依据优化后的碱基序列设计一对可扩增去除 NXPH 蛋白信号肽的特异性引物 P 和 P, 并在引物序列的两端分别添加 EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 两个限制性内切酶位点, 其扩增产物为 770, 其中氨基酸的编码序列长 750, 将该序列命名为 nxph 优化基因序列和引物由北京金唯智公司合成.. Nxph 基因的序列鉴定以合成的 nxph 基因为模板, 分别以 P/P 为上下游引物进行 PCR 扩增 PCR 反应条件 :94 预变性 4 min,94 变性 30 s, 55 退火 min,7 延伸 30 s,40 个循环,7 延伸 0 min % 的琼脂糖凝胶检测 PCR 产物 DNA 凝胶回收试剂盒 ( 北京庄萌生物公司 ) 回收 PCR 产物, 与 pd8-t 载体连接, 转化 DH5α, 提取质粒后用 EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 双酶切鉴定, 阳性克隆菌液送上海生工测序..3 酵母表达载体的构建将 nxph 质粒 合成的基因 nxph 和酵母表达载体 ppiczαa 用 EcoRⅠ 和 Not Ⅰ 在 37 条件下双酶切 3 h,% 的琼脂糖凝胶电泳, 回收酶切产物,T4 DNA 连接酶 6 连接过夜, 构建成重组表达质粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph 连接产物转化 DH5α 感受态细胞, 挑选菌落培养提质粒, 用通用引物 5' AOX 和 3' AOX 进行 PCR 鉴定, 用 EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 进行双酶切鉴定, 阳性克隆菌液送上海生工测序..4 构建重组 nxph 的酵母菌株用 Sac Ⅰ 线性化重组质粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph, 取制备好的 GS5 感受态 50 μl 与 0 μl 线性化的 ppiczαa/nxph ppiczαa/ nxph 质粒充分混匀后转移到预冷的 0. cm 电击杯中, 放入 Bio-Rad 电转仪中 V 50 μf 和 μs 电击, 立即加入 ml 冰冻的山梨醇液, 冰浴静止 0 min, 菌液 30 孵育.5 h, 离心后弃上清液, 取 00 μl 混合沉淀涂布在含有 Zeocin(00 μg/ml) 的 YPD 平板上,30 培养至出现白色单菌落 挑选白色单菌落培养, 采用 煮 - 冻 - 煮 的方法提取酵母基因组, 用通用引物扩增, % 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物..5 NXPH 在酵母中的表达阳性酵母重组质粒菌液接种 BGY 培养基,30 0 r/min 培养 0-4 h 室温 6 000 r/min 离心 5 min, 弃上清, 沉淀用 00 ml 的 BY 培养基悬浮,30 0 r/min 振荡培养, 甲醇诱导表达, 每隔 4 h 添加 00 % 甲醇使终浓度为.0 %, 持续诱导 96 h, 每次添加甲醇时取 ml 的菌液, 000 r/min 离心 5 min, 取上清至新的离心管中 -0 保存 按照 BCA 蛋白浓度定量试剂盒 ( 北京索莱宝生物 ) 测定表达蛋白的浓度, 选择诱导 7 h 的上清液进行真空冷冻干燥, 冻干后的蛋白于 -0 长期保存备用..6 表达产物的 SDS-PAGE 和 Western blot 检测将 00 μl 的三氯乙酸加入到 ml 的表达上清, 4 过夜 000 r/min 离心 0 min, 弃上清液, 加入 ml 预冷的丙酮,-0 静止 30 min, 离心弃上清, 室温晾干获得浓缩蛋白 向离心管中加入 00 μl 的 SDS-PAGE Loading Buffer, 将离心管在沸水中煮 0 min, 取 0 μl 做 Tricine-SDS-PAGE, 考马斯亮蓝染色, 同时转印到硝酸纤维素膜上进行 Western blot 分析
结果. 5 陈美玲等 鸡 neurexophilin 基因在毕赤酵母中的表达 05,3(3) nxph的pcr扩增 PCR 扩增的产物经 % 的琼脂糖凝胶进行电 000 泳 可以看出在 750 附近有一特异性的 DNA 条带 与预期目的产物 770 相符 图 将 PCR 产 物连接 T 载体 阳性克隆再用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶 00 切鉴定 在 000 和 750 有特异性条带 图 分别是 T 载体片段和 nxph 目的基因片段 将此 阳性克隆的菌液进行测序检测 确定为目的基因 片段 000 DNA arker EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 酶 切 重 组 质 粒 ppiczαa/ nxph EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ酶切重组质粒 ppiczαa/ nxph 图3 重组表达质粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/nxph 的酶切图 ppiczαa/nxph 和 ppiczαa/ nxph 为 模 板 进 行 PCR 反应 检测到扩增出的目的片段大小在 000 之间 图 4 目的基因序列大小为分别为 000 750 83 和 750 载体自身序列为 588 故扩增 50 片段一致 可以进一步进行测序检测 产物的片段大小约 300 扩增产物片段与预测 00 DNA arker PCR 产物 图 000 000 000 000 750 50 00 00 DNA arker ppiczαa/ nxph 的 PC R 结 果 ppiczαa/ nxph 的 PCR 结果 图4 DNA arker nxph 阳性克隆的 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ酶切产物. nxph PCR 产物 图 nxph 阳性克隆的双酶切 重组质粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph 的 PCR 检测 将 PCR 鉴 定 和 双 酶 切 鉴 定 正 确 的 重 组 质 粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph 送上海生工进 重组表达质粒的鉴定 行序列测定 测序结果证明目的基因片段已正确插 用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切重组质粒 ppiczαa/ 入到载体 ppiczαa 中 nxph 和 ppiczαa/ nxph 酶 切 的 重 组 质 粒.3 重组酵母菌的鉴定 ppiczαa/ nxph 应在约 3 处和 83 处有特 重组表达质粒 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ n- 异性的条带 酶切的重组质粒 ppiczαa/ nxph 应 xph 转入到毕赤酵母 GS5 后 以 5'AOX 和 3'AOX 在约 3 处和 750 处有特异性的条带 图 3 为引物进行 PCR 检测 在 000- 处有一条 显示在 3 处和 - 000 处分别有两条带 特异性条带 图 5 扩增产物的片段大小约 300 与预期结果相符 扩增产物片段与预测片段一致 说明目的基因 以 5'AOX 和 3'AOX 为引物 以重组表达质粒 片段已整合入酵母基因组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 6 表 样品 000 000 00 05,Vol.3,No.3 蛋白浓度测定结果 浓度 / mg ml- 诱导时间 /h A595OD 值 重组蛋白 48 0.0396 0.40 ppiczαa/ nxph 7 0.049 0.480 96 0.034 0.08 重组蛋白 48 0.0404 0.440 ppiczαa/ nxph 7 0.045 0.563 96 0.0396 0.40 DNA arker ppiczαa/ nxph PCR 结果 ppiczαa/ nxph PCR 结果 图5 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph 在 GS5 中的 PCR 鉴定.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blot检测结果 阳性重组菌用甲醇诱导表达 将表达产物浓缩 变 性 后 进 行 Tricine-SDS-PAGE 电 泳 用 ppiczαa 空酵母载体作对照 电泳完毕后考马斯亮蓝 R-50 进行染色 发现在约 9 kd 处有一条清晰的细条带 对照组没有条带 选择诱导 7 h 的蛋白做 Western blot 结果 图 6 显示在相应位置有特异的免疫性 条带 kd 30 00 70 55 ppiczαa 载 体 是 含 有 强 启 动 子 AOX 和 α-交 配 因 子信号肽序列 能够引导外源蛋白的分泌 可以用 ZeocinT 抗性基因对重组子直接进行筛选 同时载 体上 His 标签可以进行亲和纯化 6-8 本试验选用 ppiczαa 作为表达载体 携带外源基因 nxph 进入 酵母表达系统并整合入酵母 GS5 的染色体 利用 ppiczαa 表达载体上的信号肽序列引导 NXPH 蛋白 的分泌 使 NXPH 高效表达 也证实外源基因在毕 赤酵母中能得到高表达 987 年 Hoekema 等 报 道 了 酵 母 所 偏 爱 的 5 3 个密码子 所以在合成外源基因时可以根据毕赤酵 母的密码子偏爱性 在保持翻译时氨基酸不变的 情况下对密码子进行突变以获得高效表达的蛋白 4 40 5 00 年 Sinclair 和 Choy 在毕赤酵母中表达人源葡 35 糖脑苷酯酶时 通过对 C+G 含量的调整和密码子的 5 优化证明其蛋白产量比天然基因提高很多倍 9 张.5 朝春和梁伟锋 0 根据人神经营养素 hnt-3 的 A B 蛋白质 arker 载体 重组蛋白 ppiczαa/ nxph 表达上清 3 ppiczαa/ nxph 表达上清 4 ppiczαa/ nxph Western blot 结果 5 ppiczαa/ nxph Western blot 结果 图6 重组蛋白的 Tricine-SDS-PAGE 和 Western blot 检测.5 蛋白浓度检测结果 基因序列 根据毕赤酵母密码子的偏爱性把编码氨 基酸的密码子进行了替换 发现蛋白表达量提高 倍 Delroisse 等 研究发现没有改造的赤拟盗羧 酯酶基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中并不表达 但是当按照酵母密码子的偏好性改造之后 可以检 蛋白标准品绘制完成蛋白标准曲线 R =0.99 说明标准曲线较为理想 可以用于测定蛋白样品浓 度 表 是分别对诱导 48 h 7 h 96 h 的重组蛋 白 ppiczαa/ nxph 和 ppiczαa/ nxph 的浓度检测 结果 从表中可以看出去除信号肽的 NXPH 表达量 相对更高一些 且在 7 h 蛋白的浓度达到最高 3 可以进行修饰 另外有利于表达蛋白的分离纯化 5 讨论 巴斯毕赤酵母作为真核机体对产生蛋白的翻译 测到改基因的表达 Shumiao 等 研究也发现通过 优化密码子之后 可以大幅度提高瑞氏木霉纤维素 内切酶基因的表达量 本研究根据 GenBank 上公布 的鸡 nxph 基因 mrna 编码序列 结合毕赤酵母密 码子的偏好性优化序列 将优化后的鸡 nxph 全长 基因序列和去除信号肽的鸡 nxph 基因序列分别 定向插入酵母载体 电转化入 GS5 转化后阳性 菌用抗性进行筛选 甲醇诱导表达 表达的产物为 NXPH 表明我们已经通过毕赤酵母表达系统成功
05,3(3) 陈美玲等 : 鸡 neurexophilin 基因在毕赤酵母中的表达 7 [3] 表达鸡 NXPH 蛋白 Thill 等研究发现, 如果在 外源基因的自身信号肽引导下表达蛋白, 则酵母细胞自身信号肽的表达量不高, 而且分泌效率也低, 因此在构建质粒时通常将外源基因的信号肽去除 [4] 龚婷等对鸡白介素 - 基因进行去除信号肽和全基因的诱导表达研究发现, 在相同条件下去除信号 [5] 肽的重组质粒的表达量高 马亮等也在弓形虫表面抗原 SAG3 基因的原核表达发现, 不含信号肽的 SAG3 基因, 所构建的原核表达质粒在大肠杆菌中具有高效表达 另有研究表明, 利用外源基因的信号肽引导表达的蛋白较易降解, 利用酵母细胞对外源蛋白的信号肽识别后对蛋白进行传送, 则表达的外源蛋白更稳定 [6] 所以本试验中同时选取了去除信号肽的 nxph 基因和 nxph 全基因, 转化到酵母中, 蛋白的表达量分别为 0.563 mg/ml 和 0.480 mg/ml, 结果也证实去除信号肽的 NXPH 表达量相对更高一些 4 结论本研究根据 GenBank 上公布的鸡 nxph 的序列, 结合毕赤酵母码子的偏好性, 成功构建了重组表达质粒 ppiczαa/ nxph 和去除信号肽的重组表达质粒 ppiczαa/ nxph, 并成功获得大小约 9 kd 鸡 NXPH 蛋白和去除信号的 NXPH 蛋白, 且去除信号肽的 NXPH 表达量相对更高 参考文献 []Petrenko AG, Kovalenko VA, Shamotienko OG, et al. Isolation and properties of the alpha-latrotoxin receptor[j]. EBO J, 990, 9(6): 03-07. []Yang P, Wang J, Gong G, et al. Cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human lactoferrin[j]. PLoS One, 008, 3(0): e3453. [3] 朱金金, 刘桂琼, 王志跃, 等. 鸡贮精腺差异表达基因的研 究 [J]. 畜牧兽医学报, 007():76-79. [4]Liu G, Jiang X, He C, et al. Neurexophilin gene polymorphism in chickens and its variation among species[j]. Biochemical Genetics, 03, 5(7-8):68-65. [5]Ciarkowska A, Jakubowska A. Pichia pastoris as an expression system for recombinant protein production[j]. Postepy Biochem, 03, 59(3):35-3. [6] 董燕, 王捷, 杨连生, 等. 人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达 [J]. 华南理工大学学报 : 自然科学版, 003 ():6-9. [7] 黄海, 谢蓓, 于瑞嵩, 等. 猪 IFNα 基因在毕赤酵母中的高效分泌表达 [J]. 遗传, 005, 7():5-0. [8] 朱骞, 张汇东, 等. 犬白细胞介素 在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定 [J]. 农业生物技术学报, 007(4):574-578. [9]Sinclair G, Choy FY. Synonymous codon usage bias and the expression of human glucocerebrosidase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris[j]. Protein Expr Purif, 00, 6():96-05. [0] 张朝春, 梁伟锋, 杨希才. 神经营养素 -3 基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达 [J]. 微生物学报, 004(): 0-4. []Delroisse J, Dannau, Gilsoul JJ, et al. Expression of a synthetic gene encoding a Tribolium castaneum carboxylesterase in Pichia pastoris[j]. Protein Expr Purif, 005, 4():86-94. []Shumiao Z, Huang J, Zhang C, et al. High-level expression of an Aspergillus niger endo-beta-, 4-glucanase in Pichia pastoris through gene codon optimization and synthesis[j]. J icrobiol Biotechnol, 00, 0(3):467-473. [3]Thill GP, Davis GR, Stillman C, et al. Positive and negative effects of multi-copy integrated expression vectors on protein expression in Pichia pastoris[c]// In Proceedings of the 6th International Symposium on Genetics of icroorganisms. Paris :Societe Franscaise de icrobiologie, 990, :477-490. [4] 龚婷, 杨孝朴, 李银聚, 等. 鸡 IL- 全基因和去信号肽基因的原核表达 [J]. 甘肃农业大学学报, 009(0):-4. [5] 马亮, 刁玉梅, 任保彦, 等. 弓形虫 RH 株表面抗原 SAG3 去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定 [J]. 吉林农业大学学报, 0, 34():04-08. [6]Ferrarese L, Trainotti L, Gattolin S, et al. Secretion, purification and activity of two recombinant pepper endo-beta-, 4-glucanases expressed in the yeast Pichia pastoris[j]. FEBS Lett, 998, 4 ():3-6. ( 责任编辑李楠 )