盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸在大鼠体内释药研究 张瑜 1 2, 侯世祥 (1. 河南大学中药研究所, 河南开封 475004; 2. 四川大学华西药学院, 四川成都 610041) [ 摘要 ] 目的 : 研究盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸在大鼠体内的药物吸收及胃, 小肠和结肠组织中药物浓度经时变化, 评价其结肠定位释药特性 方法 : 将盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸 ( 小丸组 ) 和盐酸小檗碱羧甲基纤维素混悬液 ( 对照组 ) 大鼠灌胃给药 ( 以盐酸小檗碱计, 给药剂量 50mg kg -1 ), 采用 HPLC 测定大鼠体内盐酸小檗碱在血浆, 胃, 小肠和结肠组织中的浓度, 计算药物相对靶向释药指数 结果 : 盐酸小檗碱在血浆和组织匀浆中线性范围分别为 0 0252~2 52mg L -1 (r=0 9992) 和 0 126~25 22mg L -1 (r>0 99), 血浆和组织匀浆中检测限分别为 10,8mg L -1, 小丸组血浆中药时曲线下面积 (AUC 0 ) 是对照组的 0 477 倍 ; 小丸组胃, 小肠, 结肠组织 AUC 0 分别是对照组的 0 187,0 228,2 00 倍 ; 小丸组在大鼠胃, 小肠, 结肠组织的药物相对靶向释药指数分别为 0 3924,0 4786,4 193 结论: 盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸具有较好的结肠定位释药特性 [ 关键词 ] 盐酸小檗碱 ; 羧甲基魔芋胶 ; 体内药物释放 ; 结肠定位给药系统 [ 中图分类号 ]R285.5 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ]1001 5302(2008)13 1591 05 近年来, 炎症性肠道疾病 ( 包括溃疡性结肠炎 克罗恩氏病等 ) 在我国的发病率呈上升趋势, 其治疗主要采用 5 氨基水杨酸或糖皮质激素等药物的口服给药, 但普通制剂用药存在药效差 副作用大等问题, 因此, 口服结肠定位给药系统 (oralcolon spe cificdrugdeliverysystem,ocdds) 成为炎症性肠道疾病新型治疗系统的研究热点 [1] 羧甲基魔芋胶 (carboxymethylkonjacglucoman nan,cmkgm) 作为我国优势植物资源魔芋提取物 魔芋胶的氯乙酸醚化改性产物, 可用于新型给药系统的制备 [2,3] 前期研究发现,CMKGM 具有凝胶成丸 被结肠微生物酶特异性降解等性质, 可作为载体材料用于小丸剂的制备, 体外药物释放研究发现,CMKGM 小丸具有结肠定位释药的特性 [3,4], 为进一步评价其作为 OCDDS 的可行性, 作者选择炎症性肠道疾病治疗用中药成分 盐酸小檗碱 (berberinehydrochloride,bh) 为模型药物 [5], 采用滴制离子胶凝法制备 BH 羧甲基魔芋胶小丸, 通过比较小丸和 BH 羧甲基纤维素混悬液 ( 对照组 ) 大鼠灌胃给药后, 体内血浆和胃, 小肠及结肠组织中药物浓 [ 收稿日期 ] 2007 09 10 [ 通讯作者 ] 侯世祥,Tel:(028)85502809,E mail:housix@263. net 度的经时变化规律, 并计算药物相对靶向释药指数, 探讨小丸在大鼠体内胃 肠道的释药特性, 目前国内外未见相关报道 1 材料 1.1 动物 SD 大鼠 48 只, 雌雄各半, 体重 (200±20)g 四川大学实验动物中心提供, 合格证号川实动管第 70 号 1.2 药物与试剂盐酸小檗碱 ( 四川亚宝光泰制药有限公司, 纯度 99 3%); 羧甲基魔芋胶 ( 自制, 醚化度 0 479), 甲醇 ( 色谱纯 ), 其他试剂和试药均为分析纯 1.3 仪器 Agilent1100Series 高效液相色谱仪 ( 美国 );St artorious1721 型电子天平 ( 西德 );YKH-Ⅱ 型液体快速混合器 ( 江西医疗器械厂 );SK-5200H 超声清洗仪 ( 上海科导超声仪器有限公司 );TGL-16G 台式高速离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ) 2 方法 2.1 制剂的制备 2.1.1 BH 羧甲基魔芋胶小丸配制 20g L -1 CMKGM 水溶液, 加入 BH(BH 与 CMKGM 质量比 2 1), 搅拌得均匀混悬液, 将上述混悬液滴加至 10 倍体积量的凝胶液 (ph3 0, 含 5g L -1 三氯化铁和 1591
2 5g L -1 壳聚糖 ) 中, 凝胶化 8h 后, 过滤收集小丸, 用水冲洗丸粒后,37 干燥, 再置于 50 烘箱中热处理 10h; 将以上制得小丸在 30g L -1 氯化钙溶液中搅拌 10min, 取出吸干丸粒表面溶液后, 置于 6g L -1 海藻酸钠溶液中, 包衣 10min, 过滤收集小丸, 用水冲洗除去丸粒表面未凝胶化的海藻酸钠,37 干燥, 即得 (BH 含量 49 84%, 粒径 0 998mm) 2.1.2 BH 羧甲基纤维素混悬液称取羧甲基纤维素 0 5g, 加于 90mL 蒸馏水中, 搅拌使其溶解, 然后称取 BH1 0g, 加至上述溶液中, 搅拌, 并补加蒸馏水至 100mL, 即得 (10g L -1 ) 2.2 BH 测定用高效液相色谱法的建立 2.2.1 色谱条件迪马 C 18 色谱柱 (4 6mm 150 mm,5μm); 流动相磷酸盐缓冲液 (0 05mol L -1 磷 酸二氢钾, 含 0 5% 三乙胺, 用磷酸调 ph3 5) 甲醇 (60 40); 流速 1mL min -1 ; 检测波长 345nm; 柱温 30 ; 进样量 15μL 2.2.2 生物样品的处理及测定方法分别称取大鼠胃, 小肠和结肠组织, 按 5mL g -1 的比例加入 0 05 mol L -1 磷酸盐缓冲液 (ph6 8), 匀浆处理得匀浆液 分别精密吸取大鼠血浆 组织匀浆液各 0 4mL, 置离心管中, 加入甲醇 1 2mL, 旋涡振荡 5min, 12000r min -1 离心 10min, 精密吸取 0 9mL 上清液至离心管中,50 真空挥干溶剂, 加入 0 15mL 甲醇溶解残渣, 旋涡混合 5min, 超声 15min,12000r min -1 离心 10min 后取上清液 15μL 进样, 测定 在上述色谱条件下, 得空白血浆, 空白各组织及各生物样品和 BH 的色谱图, 见图 1 图 1 盐酸小檗碱的高效液相图谱 A. 空白血浆 ;B. 血浆样品 ;C. 空白结肠组织 ;D. 结肠组织样品 ;E. 盐酸小檗碱对照品 ;F. 空白胃组织 ;G. 胃组织样品 ;H. 空白小肠组织 ; I. 小肠组织样品 ;1 盐酸小檗碱 由图 1 中各色谱图比较发现, 在选定的色谱条件下, 血浆及各组织中内源性物质与 BH 分离良好, 不干扰 BH 的测定, 各生物样品中 BH 的保留时间 11min 左右 mg L -1 ), 按 2.2.2 项下操作, 将峰面积 (A) 对 BH 浓度 (C) 进行线性回归, 得标准曲线 : 血浆 A=56 87C+0 3667,r=0 9992; 胃组织 A=70 95C+3 452,r=0 9993; 小肠 A=67 36C+ 2.2.3 标准曲线的制备 精密吸取空白生物样品 2 649,r=0 9992; 结肠 A=70 07C-3 398,r= 0 4mL, 分别加入不同量 BH, 配得含不同 BH 浓度的生物样品 ( 血浆分别为 0 0252,0 126,0 252, 0 9989 各生物样品中,BH 的峰面积 (A) 与其浓度 (C) 线性关系良好 0 504,1 26,2 52mg L -1 ; 胃, 小肠和结肠组织匀 2.2.4 检测限测定 当信噪比 (S/N)=3 时,BH 在 浆均分别为 0 126,0 252,0 504,2 52,12 61,25 22 血浆和组织匀浆中的检测限分别为 10,8μg L -1 1592
2.2.5 回收率和精密度测定在空白生物样品中分别加入不同量 BH, 得高 中 低 3 种质量浓度的含药生物样品, 按 2.2.2 项下操作, 计算 BH 浓度, 以测得量与加入量之比计算方法回收率 ; 分别于日内测定 5 次及连续测定 5d, 计算日内和日间精密度, 结果见表 1 样品 表 1 各生物样品中 BH 测定的回收率和日内 日间精密度 (n=5) BH 加量 /μg 日内 RSD/% 日间 回收率 /% 血浆 0 0242 4 13 6 57 104 9±7 95 0 1816 4 06 3 02 102 1±5 49 0 8576 0 98 2 11 96 44±2 13 胃 0 0706 7 03 4 87 103 3±4 45 0 8072 3 30 2 82 96 94±1 99 9 0810 1 49 1 55 97 53±3 81 小肠 0 0706 5 79 4 98 104 0±8 55 0 8072 2 19 5 61 101 0±1 95 9 0810 3 02 2 92 98 79±4 54 结肠 0 0706 5 39 6 32 105 1±7 20 0 8072 1 18 2 78 102 6±5 82 9 0810 2 32 2 09 99 95±2 78 由上表数据可知, 该方法准确, 重复性好, 可用于 BH 在生物样品中的质量浓度测定 2.3 实验设计和数据处理 SD 大鼠随机分成 6 组, 每组 8 只, 实验前禁食 12 h, 其中 3 组大鼠经口插聚乙烯管, 灌胃 BH 羧甲基魔芋胶小丸适量 ( 以 BH 计, 给药剂量为 50mg kg -1 大鼠体重 ), 同时灌服 5g L -1 羧甲纤维素钠溶液 1 ml, 作为小丸组 ; 另 3 组大鼠灌胃 BH 羧甲基纤维素混悬液适量 ( 给药剂量同小丸组 ), 作为对照组 大鼠给药后, 分别于 0 5,1,2,4,6,8,12,24h 时间点, 经股动脉取血 4mL 置于含肝素钠的离心管中,6000r min -1 离心 10min 得血浆, 冷藏备用 ; 然后将大鼠处死, 取除去内容物的胃, 小肠和结肠组织用 ph6 8 的 PBS 漂洗 3 次, 每次 30mL, 吸干水分后, 冷藏备用 ; 按 2.2.2 项下操作, 测定样品中 BH 浓度 采用相对靶向释药指数 (drugdeliveryindex, DDI) 对 BH 羧甲基魔芋胶小丸的结肠定位释药特性进行评价 [6] 药物的相对靶向释药指数 (DDI)= (AUC 1/AUC 2 ) (AUC 3 /AUC 4 ) 其中 AUC 1,AUC 3,AUC 2,AUC 4 分别表示小丸组的各组织和血浆中药物浓度 时间曲线下面积和对照组的各组织和血浆中药物浓度 时间曲线下面积 AUC 0 采用梯形法计算, 其中消除速度常数 k 通过残数法求取 ;T max 和 C max 采用实测值 采用 SPSS 10 0 软件对小丸组和对照组的体内药动学参数进行两两 t 检验 3 结果 3.1 血浆药物浓度变化大鼠灌胃给药后, 血浆药物浓度的经时变化曲线见图 2 图 2 不同 BH 制剂大鼠灌胃给药的血浆药 时曲线 珋对照组药 时曲线无时滞,T max 为 2h,C max 为 (0 345±0 084)mg L -1,AUC 0 为 3 950mg h -1 L -1 ; 小丸组药时曲线存在 1h 时滞,T max 延后至 8h,C max 为 (0 136±0 085)mg L -1 低于对照组,AUC 0 (1 884mg h -1 L -1 ) 为对照组的 0 477 倍 另外血浆中药物浓度较低, 这与 BH 胃 肠道吸收差有关 ; 对照组的药 时曲线出现双峰现象, 这与 BH 存在肝肠循环有关 [7] 3.2 胃组织药物浓度变化大鼠灌胃给药后, 胃组织药物浓度的经时变化曲线见图 3 图 3 不同 BH 制剂大鼠灌胃给药的胃组织药 时曲线 珋与对照组相比, 小丸组 T max 由 0 5h 延后至 4h, C max 明显降低 (P<0 01),AUC 0 (92 08μg h -1 g -1 ) 为对照组 (491 6μg h -1 g -1 ) 的 0 187 倍 1593
3.3 小肠组织药物浓度变化大鼠灌胃给药后, 小肠组织药物浓度的经时变化曲线见图 4 图 4 不同 BH 制剂大鼠灌胃给药的小肠组织药 时曲线 珋与对照组相比, 小丸组 T max 由 2h 延后至 4h, C max 明显降低 (P<0 01),AUC 0 (180 6μg h -1 g -1 ) 为对照组 (790 5μg h -1 g -1 ) 的 0 228 倍 3.4 结肠组织药物浓度变化大鼠灌胃给药后, 结肠组织药物浓度的经时变化曲线见图 5 图 5 不同 BH 制剂大鼠灌胃给药的结肠组织药 时曲线 珋对照组药 时曲线的 T max 为 6h,C max 为 (60 66± 9 54)μg g -1,AUC 0 为 805 2μg h -1 g -1 ; 小丸组药 时曲线前 6h 药物浓度低于对照组,T max 延后至 8h, 而 C max 为 (95 96±23 62)μg g -1 明显高于对照组 (P<0 05),AUC 0 (1610 3μg h -1 g -1 ) 为对照组的 2 倍 3.5 相对靶向释药指数的计算与对照组相比, 小丸组的胃, 小肠和结肠组织的 DDI 值分别为 0 3924,0 4786,4 193 4 讨论目前,OCDDS 的体内释药特性评价方法主要有 1594 3 种 :1 血药浓度经时变化规律 [8] ;2 胃 肠道不同部位药物浓度及分布规律 [9] ;3 制剂进行放射性标记, 采用 γ 闪烁成像法监测其在胃 肠道内的转运及存在状态, 了解制剂所处位置及其崩散情况, 特别适用于剂量单元制剂 ( 如片剂 胶囊剂等 ) [10] 本研究中, 考虑到 γ 闪烁成像法要进行放射性标记, 存在一定的安全性问题, 并且 BH 羧甲基魔芋胶小丸属于剂量多单元制剂, 给药后在整个胃 肠道中广泛分布, 不便于对制剂在胃肠道的崩散释药情况进行评价, 确定采取测定小丸给药后血药浓度和胃, 小肠及结肠组织中药物浓度的经时变化, 并计算药物对胃, 小肠和结肠组织的 DDI 值, 来评价小丸剂的大鼠体内释药特性 考虑到试验中生物样品处理操作方法简便, 确定采用 HPLC 外标法进行体内生物样品的测定, 经标准曲线制备, 方法回收率和日内 日间精密度试验结果证实, 此方法简便 快速 可靠 ;BH 作为季铵型生物碱, 在 C 18 反相 HPLC 系统中拖尾严重, 采用在流动相中添加三乙胺, 并用磷酸调节流动相 ph 的方法, 可有效抑制 BH 拖尾 考虑到 BH 胃 肠道吸收差, 为提高血浆药物浓度, 确定大鼠灌胃给药剂量为 50mg kg -1 ( 以 BH 计 ) 由于 BH 在水中溶解度低, 作者采用羧甲基纤维素配制 BH 混悬液作为对照组制剂, 溶液中羧甲基纤维素浓度为 5g L -1, 过高不利于灌胃操作, 过低则 BH 在混悬液中不易均匀分散, 影响给药剂量的准确性 BH 羧甲基魔芋胶小丸和 BH 混悬液灌胃给药后, 两种制剂在大鼠胃 肠道的药物释放及吸收情况有所不同, 表现为 :1 与对照组相比, 小丸组血浆药 时曲线存在时滞,T max 延后,C max 和 AUC 0 均有所降低 ;2 小丸组胃, 小肠组织中药物浓度始终低于对照组 ;3 小丸组结肠组织中药物浓度开始低于对照组, 6h 后则高于对照组,T max 延后,C max 和 AUC 0 均高于对照组 ;4 与对照组相比, 小丸组对胃, 小肠组织的 DDI 值均小于 1, 而对结肠组织的 DDI 值大于 1 以上结果提示,BH 羧甲基魔芋胶小丸在胃 肠道上段的药物释放量较少, 造成胃, 小肠组织药物浓度低, 同时药物吸收存在时滞并且吸收量减少, 表现为血浆药 时曲线中 T max 延后,C max 和 AUC 0 降低 ; 小丸转运至结肠部位后, 在结肠特有微生物酶的降解作用下, 丸粒骨架溶蚀而大量释放药物, 造成小丸组
的结肠组织中药物浓度高于对照组 由此可见,BH 羧甲基魔芋胶小丸在大鼠体内具有结肠定位释药特性, 其价值还需进一步通过对炎症模型动物的治疗效果评价来证实 [ 参考文献 ] [1] FriendDR.Neworaldeliverysystemsfortreatmentofinflamma toryboweldisease[j].drugdevindpharm,2005,57:247. [2] JianD,SunR,ZhangSh,etal.Novelpolyelectrolytecarboxym ethylkonjacglucomannan chitosannanoparticlesfordrugdelivery [J].MacromolRapidCommun,2004,25(2):954. [3] 张瑜, 凌春生, 侯世祥. 结肠定位盐酸小檗碱羧甲基魔芋胶小丸释药机制的研究 [J].,2008,33(1):23. [4] 张瑜, 武亚玲, 侯世祥. 羧甲基魔芋胶的结肠定位酶降解性能研究 [J].,2007,32(22):2360. [5] 纪桂贤, 王邦茂, 方维丽. 盐酸小檗碱对 DSS 诱导的结肠炎小鼠血小板活化功能的影响 [J]. 天津医科大学学报,2004,10 (2):182. [6] RichardNF,BarbaraH,LonmieR,etal.Colonicdeliveryof dexamethasonefromaprodrugaccelerateshealingofcolitisinrats withoutadrenalsuppresion[j].gastroenterology,1995,108 (9):1688. [7] 山原条二, 后藤胜, 田德之助. 黄连およびベルベリン型アルカロイドの生物学的研究 ( 第二报 ) 代谢および治疗效果 [J]. 生药学杂志,1972,26(1):53. [8] KrishnaiahYSR,VeerRP,DineshKB,etal.Pharmacokinet icevaluationofguargum basedcolon targeteddrugdeliverysys temsofmebendazoleinhealthyvolunteers[j].jcontrolrel, 2003,88:95. [9] TozakiH,OdoribaT,OkadaN,etal.Chitosancapsulesforco lon specificdrugdelivery:enhancedlocalizationof5 aminosali cylicacidinthelargeintestineaccelerateshealingoftnbs in ducedcolitisinrats[j].jcontrolrel,2002,82:51. [10] SinhaVR,MitalBR,KumriaR.Invivoevaluationoftimeand siteofdisintegrationofpolysaccharidetabletpreparedforcolon specificdrugdelivery[j].intjpharm,2005,289:79. Studiesoninvivoreleaseofberberinehydrochloridefrom carboxymethylkonjacglucomannanpeletsinrats ZHANGYu 1,HOUShi Xiang 2 (1.InstituteofChineseMaterialMedica,HenanUniversity,Kaifeng475004,China; 2.WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China) [Abstract] Objective:Toobservetheabsorptionandconcentrationofberberinehydrochloride(BH)ingastric,entric,colon ictisueafterintragastricadministrationofbh containingcarboxymethylkonjacglucomannanpeletsforevaluatingcolon specificdrug deliverycharacteristicsofthepelets.method:bh containingcarboxymethylkonjacglucomannanpelets(peletsgroup)andbh con tainingcarboxymethylcelulosesuspension(controlgroup)wereintragastricadministratedtoratsatthedoseof50mg kg -1,respec tively.ahighperformanceliquidchromatographymethoddeterminatedbhconcentrationinratplasmaandtisue.drugdeliveryindex (DDI)wascalculated.Result:TherangeofBHinplasmaandtisueinratswere0 0252 2 52mg L -1 (r=0 9992)and0 126 25 22mg L -1 (R>0 99),respectively.ThedetectionofBHinplasmaandtisuewere10μg L -1 and8μg L -1,respectively. Theareaunderthecurve(AUC 0 )intheplasmasamplesofpeletsgroupwas0 477timesthatofthecontrolgroup;inthegastric, entric,colonictisue,theauc 0 ofpeletsgroupwasasmuchas0 187,0 228,2 00timesthatofthecontrolgroup,respectively. TheDDIofthepeletswas0 3924,0 4786,4 193inthegastric,entric,colonictisueoftherat,respectively.Conclusion:Car boxymethylkonjacglucomannanpeletsmaybeausefulcarierofbhforcolon specificdelivery. [Keywords] berberinehydrochloride;carboxymethylkonjacglucomannan;invivodrugrelease;colon specificdrugdelivery system [ 责任编辑古云侠 ] 1595