中国农学通报 011,7():14-18 Chinese Agricultural Science Bulletin 莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用 蔡元保 1 杨祥燕 1 黄明忠 曾黎明 1 崔明勇 1 陈显国 1 林玉虹 1 1 广西亚热带作物研究所 南宁 530001 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南儋州 571737 摘 要 以莲雾 DNA 为模板 应用正交设计法对 SRAP 反应体系中的各个主要影响因素进行了优化筛 选 结 果 表 明 0 μl 反 应 体 系 中 各 组 分 的 最 适 浓 度 或 用 量 分 别 为 1 Buffer 3.0 mmol/l Mg + 0.3 mmol/l dntps 0.4 μmol/l 引物 0.5 U Taq DNA 聚合酶和 40 ng 模板 DNA 利用该优化体系通过 64 对 SRAP 引物组合对 7 份莲雾进行了 SRAP-PCR 扩增 证实了该体系具有稳定可靠 重复性好 多态性较 强等特点 关键词 莲雾 SRAP 正交设计 体系优化 中图分类号 Q945.1 文献标志码 A 论文编号 011-17 Optimization of SRAP-PCR System and its Application in Wax Apple (Syzygium samarangens) Cai Yuanbao1, Yang Xiangyan1, Huang Mingzhong, Zeng Liming1, Cui Mingyong1, Chen Xianguo1, Lin Yuhong1 (1Guangxi Sub-tropical Crops Research Institute, Nanning 530001; Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737) Abstract: The main influential factors of SRAP reaction system were optimized for genomic DNA in wax apple (Syzygium samarangens) by orthogonal design. The results showed that the optimum concentration was 1 Buffer, Mg + 3.0 mmol/l, dntps 0.3 mmol/l, primer 0.4 μmol/l, Taq DNA polymerase 0.5 U, 40 ng template DNA with a total volume of 0 μl reaction solution. The molecular identification of 7 varieties of wax apple were achieved by 64 SRAP primer combinations with this optimum system which could provide clear, reliable and repeatable abundant polymorphisms molecular markers. Key words: wax apple (Syzygium samarangens); SRAP; orthogonal design; optimization 0 引言 的收集与利用带来了极大的不便 至今 从分子水平 莲雾 Syzygium samarangense Merr. et Perry 又 上对莲雾种质的研究甚少 在国内只报道用同工酶技 名洋蒲桃 爪哇蒲桃等 为桃金娘科 Myrtaceae 蒲桃 术[1]和 ISSR 分子标记[]对部分莲雾种质资源的遗传多 属植物 其果实色泽艳丽 果形独特 风味清香 是著名 样性作了初步评价 这些从分子水平上为莲雾种质资 的热带 亚热带水果之一 莲雾在中国海南 广东 广 源的收集与利用提供了一些参考依据 西 福建 台湾等省区有广泛分布 种质资源丰富 有必 相关序列扩增多态性 sequence-related amplified 要加强对其资源的收集 鉴定与评价工作 以发掘利用 polymorphism, SRAP 又称为基于序列扩增多态性 这一资源 但目前多以莲雾果实的色泽进行命名 极 sequence-based amplified polymorphism, SBAP [3] 是 有可能造成同名异物和同物异名 这对莲雾种质资源 由 Li 和 Quiros[4] 在 001 年创建的一种 DNA 分子标记 基金项目 广西壮族自治区直属公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(桂热研 0110) 第一作者简介 蔡元保 男 1981 年出生 福建莆田人 硕士 主要从事植物生理与分子生物学研究 通信地址 530001 广西壮族自治区南宁市邕武路 号广西亚热带作物研究所 Tel 0771-3348061 E-mail caiyuanbao05@163.com 通讯作者 杨祥燕 女 1984 年出生 云南大理人 硕士 主要从事果树栽培学研究 通信地址 530001 广西壮族自治区南宁市邕武路 号广西亚热 带作物研究所 Tel 0771-3348061 E-mail yangxiangyan8441@16.com 收稿日期 011-04-6 修回日期 011-05-31
15 蔡元保等 莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用 技术 该标记具有简便 高效 稳定 产率高 便于克隆 1.. SPRA-PCR 反应体系的优化及检测 针对 0 μl 目标片段等特点 已被广泛应用于植物遗传图谱构 反应体系中的 5 个因素 Mg+ dntps 引物 Taq DNA 建 比较基因组学 遗传多样性分析 基因连锁标记的 聚合酶和模板 DNA 设定 4 个水平 采用 L16(45)正交试 寻找与基因定位等多个研究领域 目前 SRAP 标记 验设计进行筛选 方案如表 1 其中 MgCl dntps 和 [5] [6] [7] [8] 已成功应用于石榴 柿 香蕉 桃 [9-11] [1] 苹果 等果树 遗传多样性 遗传图谱等多领域的研究 但在国内尚 未见 SRAP 标记在莲雾上有研究报道 本文以莲雾 长青 为试材 建立并优化了适合莲雾 SRAP 分析的 反应体系 旨在为 SRAP 标记在研究莲雾的遗传多样 性和亲缘关系等奠定基础 1 材料和方法 1.1 试验材料 参试莲雾材料共 7 份 分别是 文昌青皮 水晶 青皮蝶形 南洋 长红 长青 和黑珍珠 除 长红 长青 和 黑珍珠 取自海南大学儋州校区的 农学院基地外 其他材料均取自广西亚热带作物研究 所水果基地 选取无病虫害幼叶 洗净后于-70 保存 备用 1. 方法 1..1 DNA 提取及检测 莲雾 DNA 提取参照 Doyle 等[13] 的方法并加以改良 所提取的基因组 DNA 用 1.0%琼脂 糖凝胶电泳检测其质量 用 Biophotometre 型核酸蛋白 仪检测其浓度 稀释至 0 mg/l 置于-0 保存备用 Taq DNA 聚合酶均购自大连宝生物公司 正反向引 物采用 Li 和 Quiros[4] Ferriol 等 [14] 及 Vandemark 等 [15] 发 表的引物序列 由上海生工公司合成 如表 所示 随 机选用其中的引物 me5+em1 组合 对莲雾 长青 材料 进行体系优化 试验重复 次 PCR 扩增程序参考 Li 和 Quiros[4] 的 方 法 即 94 预 变 性 5 min 94 变 性 1 min 35 复性 1 min 7 延伸 90 s 5 个循环 94 变性 1 min 50 复性 1 min 7 延伸 90 s 35 个循环 最后 7 延伸 10 min 4 保存 PCR 产物在含有核 酸 染 料 的 1.8% 琼 脂 糖 凝 胶 中 电 泳 电 极 缓 冲 液 为 0.5 TBE 电泳结束后 于凝胶成像系统上检测并拍 照 1..3 SPRA-PCR 优化体系的确立和验证 根据上述试 验结果确定的 SRAP-PCR 最佳反应体系 分别选取 8 条正反向引物 表 合成 64 个 SRAP 引物组合 以莲 雾长青 材料的 DNA 为模板进行 PCR 扩增以验证该 最佳反应体系在不同引物组合下的稳定性和可靠性 同样 在该最佳反应体系下 随机选用引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材料进行 PCR 扩增 从而进一步验证 表 1 SRAP-PCR L16(45)正交试验设计 处理号 因素和水平 Mg /(mmol/l) dntps/(mmol/l) 模板 DNA/(mg/L) 引物/(μmol/L) Taq DNA 聚合酶/(U/0μL) 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 13 14 15 16 +
16 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 表 SRAP 所用引物序列 编号 正向引物(5' 3') 编号 反向引物(5' 3') me1 5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3' em1 5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3' me 5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3' em 5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3' me3 5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3' em3 5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3' me4 5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3' em4 5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3' me5 5'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3' em5 5'-GACTGCGTACGAATTAAC-3' ME6 5'-TGAGTCCTTTCCGGTAA-3' R8 5'-GACACCGTACGAATTGAC-3' ME7 5'-TGAGTCCTTTCCGGTCC-3' R9 5'-GACACCGTACGAATTTGA-3' F7 5'-GTAGCACAAGCCGGAGC-3' R15 5'-CGCACGTCCGTAATTCCA-3' 最佳的莲雾 SPRA-PCR 扩增体系 因组 DNA 质量和浓度都较好 满足本试验的要求 结果与分析. 正交试验设计结果分析.1 莲雾基因组 DNA 的检测结果 莲雾正交试验 16 个组合 表 1 的 SRAP 扩增效果 用改良 CTAB 法提取的 7 份莲雾材料 DNA 经电 如图 所示 在 16 个组合中 Mg+ dntps 模板 DNA 泳后条带清晰 无拖尾现象 图 1 经分光光度计测 引物和 Taq DNA 聚合酶 5 个因素浓度的组成不同 其 定 OD60/A80 值为 1.7~1.9 结果表明 参试材料的基 扩增结果表现出显著差异 从 次的重复结果来看 l 8 l0 1 号组合基本上扩增不出谱带 3 4 13 16 号处理的扩增结果相对较好 得到的谱带清晰 亮度和 重复性好 其中以 4 号组合的带型最为丰富 因此 确 定 第 4 组 合 为 莲 雾 SRAP-PCR 的 最 佳 反 应 体 系 即 0 μl 反应体系中中含有 3.0 mmol/l Mg+ 0.3 mmol/l dntps 0.4 μmol/l 引 物 0.5 U Taq DNA 聚 合 酶 和 1 7 分别是 文昌青皮 水晶 青皮蝶形 南洋 长红 长青.3 莲雾 SRAP-PCR 反应体系的稳定性检测 和 黑珍珠 莲雾材料 图 1 莲雾基因组 DNA 的电泳检测图 ｂｐ Ｍ 40 ng 模板 DNA 根据上述所确立的优化条件 选用 64 个 SRAP 引 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ ２０００ １０ ００ ７５０ ５００ ２５０ １００ M: DNA Marker DL000 1 16 处理编号同表 图 正交设计 SRAP-PCR 反应体系扩增结果 物组合 表 对莲雾 长青 材料进行扩增以验证该体 增出清晰 多态性好的谱带 说明所确立的体系具有 系在不同引物组合下的稳定性和可靠性 由图 3 可 稳定可靠 重复性好 多态性较强等特点 适于进行莲 见 绝大部分引物组合均能扩增出清晰 重复性好的谱 雾的 SRAP 分析 带 同样 随机选用引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材 3 结论 料进行 PCR 扩增结果表明 图 4 7 份莲雾材料均能扩 本试验应用正交设计法对影响莲雾 SRAP 反应体
蔡元保等 : 莲雾 SRAP 反应体系的优化及其应用 17 1 36: 部分引物组合编号 图 3 部分 SRAP 引物组合对莲雾 长青 材料的扩增结果 1 7 分别是 文昌青皮 水晶 青皮蝶形 南洋 长红 长青 和 黑珍珠 莲雾材料 图 4 引物 ME6+em5 组合对 7 份莲雾材料的扩增结果 系的 Mg + dntps 引物 Taq DNA 聚合酶和模板 DNA 浓度等进行了优化, 建立了适用于莲雾的最佳 SRAP 反应体系, 即 0 μl 反应体系中包含 3.0 mmol/l Mg +, 0.3 mmol/l dntps,0.4 μmol/l 引物,0.5 U Taq DNA 聚合酶和 40 ng 模板 DNA 利用此优化体系进行莲雾 SRAP-PCR 扩增, 证实了该体系具有稳定可靠 重复性好 多态性较强等特点 4 讨论 SRAP 标记是基于 PCR 的技术, 具有很多优点, 但其扩增结果受反应条件和扩增程序以及不同物种的影响 其中,SRAP-PCR 扩增程序一般都参考 Li 和 Quiros [4] 的固定扩增程序 因此,SRAP 标记应用到不同物种上时需要优化反应体系和条件 从本试验结果来看, 不同组合的反应体系对 SRAP-PCR 扩增结果影响很大 可见, 对莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应条件进行优化是非常必要的 目前, 莲雾的遗传多样性分析和品种测试中尚未看到 SRAP 标记应用的报道, 寻求和优化适合该物种的最佳 SRAP-PCR 反应体 系也是深入开展该相关研究的基本条件 有关 PCR 反应体系优化的报道大多采用单因子 设计, 但该方法费时费工, 且不能兼顾到各因素间的交 互作用 正交试验设计不仅具有均衡分散 综合可比 伸缩灵活及效应明确的特点, 还可以顾及各因素间的 交换效应 本试验采用正交试验设计对影响 SRAP-PCR 反应的主要因素进行筛选, 能较快的找到合 适的反应参数, 即避免了单因子实验结果的不足, 又减 少了工作量 目前, 正交试验设计已成功应用于枣 [16] [17] [18] 假俭草 花生等其他植物 SRAP-PCR 反应体系优 化, 但在莲雾上还未曾报道 本试验采用正交试验设 计从最经济的角度, 在对扩增结果图谱进行直观分析 的基础上, 最终确定了莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应的最佳反应体系 在莲雾 SRAP 体系优化的过程中, 发现 Mg + dntps Taq DNA 聚合酶和引物浓度等均会显著影响 SRAP 扩增效果,4 个因素浓度过低均会造成谱带缺失 现象, 但模板 DNA 浓度对扩增无明显影响 (0~40 ng 之
18 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 间均有稳定的扩增 ), 这与其他学者的研究结果相 [19-1] 似 SRAP 一般用 PAGE 电泳检测 PCR 产物, 但本试验用琼脂糖凝胶电泳检测也能获得得较丰富的多态性, 而且稳定可靠 重复性好 此外, 相对其他分子标记而言,SRAP 由于其特殊的引物设计, 能更好地反映 [4] 物种的遗传多样性和亲缘关系 由此可见,SRAP 标记适用于莲雾亲缘关系鉴定和遗传多样性分析等研究 本试验优化的 SRAP-PCR 反应体系稳定可靠 重复性好 多态性较强, 不仅适用于莲雾基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应, 也为今后 SRAP 标记在莲雾种质鉴定 遗传多样性分析和优良性状标记等方面的广泛应用奠定了良好基础 参考文献 [1] 王家保, 姜成东, 李金成, 等. 11 份莲雾资源的同工酶评价 [J]. 热带作物学报, 004, 5(): 15-19. [] 何桥, 梁国鲁, 谢江辉, 等. 莲雾种质资源遗传多样性的 ISSR 分析 [J]. 园艺学报, 006, 33(): 39-39. [3] Ferriol M, Picó B, Nuez F. Genetic diversity of some accessions of Cucurbita maxima from Spain using RAPD and SBAP markers [J]. Genet Resour Crop Evol, 003, 50: 7-38. [4] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 001, 103: 455-461. [5] Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I, et al. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers [J]. Theor Appl Genet, 004, 108: 38-334. [6] 张四普, 汪良驹, 曹尚银, 等. 3 个石榴基因型遗传多样性的 SRAP 分析 [J]. 果树学报,008,5(5):655-660. [7] Guo D L, Luo Z R. Genetic relationships of some PCNA persimmons (Diospyros kaki Thunb.) from China and Japan revealed by SRAP analysis [J]. Genet Resour Crop Evol, 006, 53: 1597-1603. [8] Phothipan S, Silayoi B,Wanichkul K, et al. Genetic relationship among bananas in AA, AAB and BB groups using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and sequence related amplified polymorphism (SRAP) techniques [J]. Kasetsart Journal, 005, 39(4): 703-710. [9] Ahmad R, Potter D, Southwick S M. Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers [J]. J Amer Soc Hort Sci, 004, 19: 04-10. [10] Peace C P, Crisosto C H, Gradziel T M, et al. The use of molecular genetics to improve peach and nectarine post-storage quality [J]. Acta. Hort, 005, 8(1): 403-409. [11] 沈志军, 马瑞娟, 俞明亮, 等. 油蟠桃组合遗传连锁图谱构建及糖酸性状 QTL 分析 [J]. 园艺学报, 010, 37(11): 1735-1744. [1] 张春雨, 陈学森, 林群, 等. 新疆野苹果群体遗传结构和遗传多样性的 SRAP 分析 [J]. 园艺学报, 009, 36(1): 7-14. [13] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull, 1987, 19:11-15. [14] Ferriol M, Picó B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers [J]. Theor Appl Gent, 003, 107: 71-8. [15] Vandemark G J, Ariss J J, Bauchan G A, et al. Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms [J]. Euphytica, 006, 15: 9-16. [16] 李莉, 彭建营, 郑宝强. 枣 SRAP-PCR 体系的正交优化 [J]. 农业生物技术学报, 008, 16(): 361-36. [17] 郑轶琦, 王志勇, 郭海林, 等. 正交设计优化假俭草 SRAP-PCR 反应体系及引物筛选 [J]. 草业学报, 008, 17(4): 110-117. [18] 邹小云, 邹晓芬, 陈伦林, 等. 花生 SRAP-PCR 反应体系的正交设计优化 [J]. 分子植物育种, 010, 8(4): 8-86. [19] 郭凌飞, 邹明宏, 杜丽清, 等. 均匀设计优化澳洲坚果 SRAP 反应体系 [J]. 果树学报, 008, 5(): 50-53. [0] 路娟, 张绍铃, 刘庆忠, 等. 樱桃 SRAP-PCR 体系优化及其遗传多样性分析 [J]. 果树学报, 009, 6(): 163-169. [1] 乔燕春, 林顺权, 刘成明, 等. SRAP 分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用 [J]. 果树学报, 008, 5(3): 348-35.