菌物学报 jwxt@im.ac.cn 15 March 2014, 33(2): 440 448 Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180/Q 2014 IMCAS, all rights reserved. 研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.130212 有害疣孢霉菌与双孢蘑菇的互作关系 * 黄清铧王松张扬温志强 福建农林大学菌物研究中心福建福州 350002 摘要 : 通过菌丝对峙 双重培养, 以及对发病双孢蘑菇子实体的显微观察, 探讨有害疣孢霉菌 Mycogone perniciosa (MP0012) 与双孢蘑菇 Agaricus bisporus(as2796) 之间的互作关系 结果表明, 在菌丝对峙生长阶段有害疣孢霉菌菌丝不侵入双孢蘑菇菌丝体内, 两者可交叉生长, 对双孢蘑菇生长影响不显著 ; 对峙与双重培养均显示有害疣孢霉菌菌丝会产生对双孢蘑菇菌丝生长有抑制作用的挥发性物质, 造成双孢蘑菇菌丝扭结断裂 同时试验证实了双孢蘑菇菌丝会促进有害疣孢霉菌厚垣孢子的产生和萌发 菌丝生长和发育 侵染实验结果表明, 有害疣孢霉菌可直接侵染双孢蘑菇子实体, 引起双孢蘑菇子实体病害 ; 对罹病子实体显微观察结果发现, 发病前期双孢蘑菇子实体表面长出绒毛状病原菌丝, 菌柄中空, 菌褶褐变腐烂并长出病原菌丝 ; 发病中期双孢蘑菇子实体内菌丝组织会出现萎缩裂解现象, 在近有害疣孢霉菌菌丝一侧的双孢蘑菇子实体菌丝细胞壁被降解 ; 发病后期双孢蘑菇子实体菌丝组织基本消失 由此初步判断有害疣孢霉菌对双孢蘑菇的寄生类型偏向于死体营养型 关键词 : 双孢蘑菇, 有害疣孢霉, 死体营养型 The interactions between Mycogone perniciosa and Agaricus bisporus HUANG Qing Hua WANG Song ZHANG Yang WEN Zhi Qiang * Mycological Research Center of Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China Abstract: Mycogone perniciosa MP0012 and Agaricus bisporus AS2796 were used as experimental materials, and the interactions between their mycelia of Mycogone perniciosa MP0012 and Agaricus bisporus AS2796 were investigated through confrontation culture, double culture and microscopic examination.the results of the confrontation culture test revealed that the mycelia of the two species were initially able to tolerate each other without any visually evident growth inhibition. However, both confrontation and double culture tests suggested that the volatile compounds produced by M. perniciosa eventually evidently inhibited the growth of A. bisporus and resulted in a large number of mycelial knots and 基金项目 : 食用菌质量安全控制和采后保质新技术示范推广 (No. 1GA720008B) * Corresponding author. E mail: 595154360@qq.com 收稿日期 : 2013 10 24, 接受日期 : 2014 01 26
黄清铧等 / 有害疣孢霉菌与双孢蘑菇的互作关系 441 fractures forming in the latter. On the other hand, the mycelia of A. bisporus had growth promoting effects on M. perniciosa. The infection experiment revealed that M. perniciosa could directly infected and caused an infection in A. bisporus. Observations of the fruiting body of infected A. bisporus revealed that the mycelium of M. perniciosa appeared during the early stages of infection and was responsible for stalk hollowing and gill browning. During the intermediate stage, the mycelia of A. bisporus began to shrink and crack, while the cell walls in the vicinity of M. perniciosa exhibited signs of degradation. During the final stages of infection, the mycelia of A. bisporus almost completely disappeared. So it can be concluded that this pattern of parasitism is consistent with what is exhibited by necrotrophic mycoparasites. Key words: Agaricus bisporus, Mycogone perniciosa, nectrophic mycoparasates 双孢蘑菇疣孢霉病是双孢蘑菇子实体阶段普遍发生且危害严重的主要病害之一, 其病原菌有害疣孢霉菌 Mycogone perniciosa Magn 具有潜伏侵染的特性 有害疣孢霉菌的生物学特性 (Smith 1924;Lambert 1930;Holland et al. 1991) 病原菌分化( 温志强等 2010) 发生规律及防治措施 ( 范建奇等 2012) 等研究较多, 但对于该病原菌的致病因子研究甚少 目前, 疣孢霉的致病机制还不明确,Umar et al. (2000) 报道疣孢霉病原菌在任何时期都侵入到双孢蘑菇子实体内, 并会导致宿主细胞发生剧烈的细胞学变化 Pieterse et al.(2005) 对疣孢霉病菇进行显微观察发现疣孢霉菌丝不侵入双孢蘑菇菌丝体, 可交叉生长, 互不影响 也有报道, 疣孢霉菌的致病性与其所带的病毒微粒有关 (Fletcher et al. 1995;Atkey et al. 1974) 本文通有害疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝对峙培养, 双重培养及罹病双孢蘑菇子实体显微观察, 初步分析有害疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝间的互作关系, 研究结果报告如下 1 材料与方法 1.1 材料供试菌株 : 双孢蘑菇菌株 As2796; 有害疣孢霉菌株 MP0012, 福建农林大学菌物中心 提供 1.2 菌丝对峙培养在 PDA 固体培养基上, 距离 As2796 菌丝块 3cm 处同时接入 MP0012 菌丝块 ( 图 1A), 25 条件下恒温培养, 待两者菌丝长至一起时, 观察两种菌丝的对峙结果 另设一组不接触对峙培养, 将平板中间的培养基切开一条沟, 在沟的两侧分别接种 As2796 和 MP0012 菌丝块 ( 图 1B) 1.3 挥发性物质的相互作用研究 MP0012 与 As2796 产生挥发性物质间的互作关系, 将 As2796 接种于 PDA 平板内, 25 培养, 待菌丝直径约为 1cm 时, 在另一个 PDA 平板内接种 MP0012, 倒扣两个培养皿, 形成双重培养 ( 图 1C D),25 培养 14d, 测量不同时期的菌落直径并进行显微观察 1.4 有害疣孢霉菌对双孢蘑菇感染试验二次发酵培养料, 装于 750mL 的塑料瓶内, 拌料播种, 待菌丝长满栽培料时, 草炭土覆土, 并进行出菇管理 感染方法设 2 种 :Ⅰ 用 MP0012 厚垣孢子处理覆土材料 将草炭土覆土材料用含厚垣孢子的水 (1mL 水含 MP0012 孢子 5 10 5 个 ) 喷湿 Ⅱ 子实体直接接种实验, 待 As2796 子实体发育至约小拇指大小时 ( 覆土后 12d), 直接吸取 10μL MP0012 子悬液点接于 As2796 子实体一侧表面 ( 图 2) 菌物学报
442 ISSN1672 6472 CN11 5180/Q Mycosystema March 15, 2014 Vol. 33 No. 2 实体, 分别切取表面 4 6 5mm 3 的子实体组织块, 标记为 AsS1 AsS2 AsS3 1 AsS3 2 参照 Stalpers et al.(1981) 的方法固定, 然后切片进行扫描电镜观察 1.5.3 透射电镜观察 : 在正常与 Ⅰ 侵染处理后发育至中期 ( 覆土后 14d) 的 As2796 子实体菌盖表皮下方 5mm 处分别切取 1.5 2 2mm 3 的组织块, 标记为 ABT1 ABT2 参照刘仁林等(2008) 的方法, 进行透射电镜观察 图 1 菌丝培养图解 A: 对峙培养 ;B: 不接触对峙培养 ;C D: 双重培养 ; 图中 M 指有害疣孢霉菌,A 指双孢蘑菇. Fig. 1 Diagrammatic illustration of mycelium culture. A: Confrontation culture; B: Confrontation culture without touch; C, D: Double culture. M: Mycogone perniciosa; A: Agaricus bisporus. 图 2 有害疣孢霉菌直接接种示意图 Fig. 2 Diagrammatic illustration of Agaricus bisporus inoculated with Mycogone perniciosa. 1.5 显微观察 1.5.1 子实体解剖观察 : 取正常 As2796 子实体与 Ⅱ 侵染处理 3d 后罹病 As2796 子实体的菌盖 菌褶等组织, 于相差显微镜下观察 1.5.2 扫描电镜观察 (SEM): 取正常 Ⅱ 侵染处理 3d 后的子实体 Ⅰ 侵染处理后发育至中期 ( 覆土后 14d) 和后期 ( 覆土后 18d) 的子 2 结果与分析 2.1 有害疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝对峙 As2796 与 MP0012 平板对峙发现, 两菌丝交界处不产生拮抗线 显微观察结果显示, MP0012 菌丝细胞间隔较短, 可见两个以上细胞隔膜, 分叉多, 多从间隔处分叉出来, 单边分叉未见双边分叉 ( 图 3A 箭头处 );As2796 菌丝细胞间隔比较长, 很难见到两个以上细胞隔膜, 分叉相对较少, 多见双边分叉 ( 图 3C 箭头处 ) 培养 7d 后,As2796 菌丝与 MP0012 菌丝接触后两菌丝尖端可相互交叉生长, 与各自单独培养的菌丝无明显差异 ( 图 3B); 极少数情况下会出现两菌丝相互缠绕现象 ; 培养 10d 后, As2796 菌丝出现扭结断裂现象 ( 图 3D) 不接触培养下, 培养基里面的代谢物质不相互传递, 培养 10d 后 As2796 菌丝同样出现卷曲扭结现象 ( 图 3E), 而有 MP0012 厚垣孢子提前出现, 在离菌丝尖端 3 5 个细胞隔膜处就出现, 且一个细胞上会出现两个或多个厚垣孢子 ( 图 3F), 说明 MP0012 菌丝不与 As2796 菌丝接触也可导致 As2796 菌丝扭结 ;As2796 可产生有利于 MP0012 厚垣孢子生长的物质 2.2 有害疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝双重培养 As2796 与 MP0012 双重培养结果发现, 双重培养下 As2796 菌丝生长速度明显低于对照 http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
黄清铧 等 /有害疣孢霉菌与双孢蘑菇的互作关系 图 3 对峙培养菌丝显微观察 A F 菌丝 左向箭头指向双孢蘑菇菌丝 右向箭头指向疣孢霉菌菌丝 B 有害 疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝交叉生长 D 对峙培养下双孢蘑菇菌丝扭结现象 E 不接触培养下双孢蘑菇菌丝扭结 现象 F 不接触培养下有害疣孢霉菌菌及其孢子. 标尺=20 m. Fig. 3 Microscopic results of mycelium from confrontation culture. A F: Mycelia, left arrow points to Agaricus bisporus, right arrow points to Mycogone perniciosa; B: Mycelia of both A. bisporus and M. perniciosa grow cross over each other; D, E: The kinky mycelia of A. bisporus; F: The mycelia and chlamydospore of M. perniciosa. Bars=20μm. 组 而 MP0012 的菌丝生长速度比对照组稍快 2.3 罹病子实体解剖观察 图 4 菌落形态观察显示 As2796 菌丝稀 直接接种感染 As2796 试验及罹病的子实体解 疏 气生菌丝较弱 疣孢霉菌落厚垣孢子明显 剖结果 图 6 表明 从接种 MP0012 孢子后 多于对照组 对 As2796 菌丝显微观察发现在培 的第 3 天起 MP0012 菌丝开始在 As2796 子实 养 7d 后少数 As2796 菌丝出现膨大结节现象 图 体表面生长 菌丝绒毛状与覆土材料污染罹病 5A 培养 10d 后部分 As2796 菌丝出现弯曲扭 早期菌丝一样 将 As2796 子实体 沿着接种 结现象 图 5B 培养 12d 后扭结现象更为明 处剖开 子实体沿着接种处向内部逐渐发生病 显 图 5C 到 14d 扭结现象严重且出现菌丝 变 颜色由白色逐渐变成黑色 图 6B 而未 断裂现象 图 5D 这一结果与不接触对峙培 接种 MP0012 的部位没有出现罹病症状 图 养结果相同 综上所述 在菌丝对峙生长阶段 6A 菌盖表面观察发现 正常的 As2796 子 MP0012 虽然没有侵入 As2796 菌丝体 但其产 实体菌盖表面整齐洁白 图 6C 而罹病的 生的挥发物却能明显抑制 As2796 菌丝的生长 As2796 子实体菌盖表面覆满白色绒毛状菌丝 使 As2796 菌丝出现扭结断裂 而 As2796 菌丝 部分 As2796 菌丝部分变黄 图 6D 菌柄剖 产生的挥发性物质对 MP0012 生长具有一定的 面观察结果显示 正常菌柄剖面整齐洁白 而 促进作用 并且能够促进 MP0012 厚垣孢子的 罹病子实体菌柄绒毛状 部分中空 图 6G H 产生 子实体的菌盖切面可见 正常的子实体侧面洁 菌物学报 443
444 ISSN1672 6472 CN11 5180/Q Mycosystema March 15, 2014 Vol. 33 No. 2 图 4 双重培养下挥发性物质的互作关系 A: 有害疣孢霉菌产生的挥发性物质对双孢蘑菇菌丝生长的影响 ;B: 双孢蘑菇产生的挥发性物质对有害疣孢霉菌丝生长的影响. Fig. 4 Interactive relation of volatile substances in double culture of Mycogone perniciosa and Agaricus bisporus. A: Volatile substances produced by Mycogone perniciosa affected Agaricus bisporus mycelium growth; B: Volatile substances produced by A. bisporus affected M. perniciosa mycelium growth. 图 5 双重培养的双孢蘑菇菌丝 A D: 箭头指向双孢蘑菇菌丝扭结处 ;A: 培养 7d;B: 培养 10d;C: 培养 12d; D: 培养 14d. 标尺 =20 m. Fig. 5 Agaricus bisporus mycelia affected by volatile substance from Mycogone perniciosa. A D: The arrow points to the kinky spot of A. Bisporus; A: 7d; B: 10d; C: 12d; D: 14d. Bars=20 m. 白, 菌褶整齐, 粉红色 ; 而罹病子实体变褐, 菌褶变黑腐烂 ( 图 6E F) 2.4 罹病双孢蘑菇子实体扫描电镜观察从图 7 中可以看出 As2796 子实体菌丝与 MP0012 菌丝明显不同,As2796 菌丝扁平 凹陷 ( 图 7A), 而 MP0012 菌丝 (MH) 结实 饱满 ( 图 7B) ABS2 电镜扫描发现,MP0012 菌丝沿着 As2796 丝生长,As2796 菌丝萎缩 ( 图 7B);ABS3 1 电镜扫描显示, 部分 As2796 菌丝萎缩更严重, 且开始出现断裂 ( 图 7C); 而 ABS3 2 电镜扫描结果, 几乎看不到 As2796 菌丝,MP0012 菌丝生长密集, 并产生分生孢子及厚垣孢子 ( 图 7D) 从电镜扫描结果可以看出 MP0012 菌丝并未侵入到 As2796 菌丝体内, As2796 子实体菌丝出现断裂 消化 降解现象可能是由 MP0012 分泌某些物质对 As2796 http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
黄清铧 等 /有害疣孢霉菌与双孢蘑菇的互作关系 图 6 子实体解剖观察 A 正常双孢蘑菇子实体 B 直接接种罹病双孢蘑菇 C 正常双孢蘑菇子实体菌盖表面 D 发双孢病蘑菇子实体菌盖表面 E 正常双孢蘑菇子实体菌褶切面 F 罹病双孢蘑菇子实体菌褶切面 G 正 常双孢蘑菇子实体菌柄切面 H 罹病双孢蘑菇子实体菌柄切面. 标尺=200 m. Fig. 6 Topography photograph of fruiting body. A: Healthy Agaricus bisporus fruiting body; B: Diseased A. bisporus inoculated with Mycogone perniciosa; C: Pileus surface of healthy A. bisporus fruiting body; D: Pileus surface of diseased A. bisporus fruiting body; E: Gill surface of healthy A. bisporus fruiting body; F: Gill surface of diseased A. bisporus fruiting body; G: Stipe surface of healthy A. bisporus fruiting body; H: Stipe surface of diseased A. bisporus fruiting body. Bars=200 m. 具有毒害作用引起的 害疣孢霉菌与双孢蘑菇菌丝可交叉生长 但 2.5 透射电镜观察 未发现有害疣孢霉菌穿透双孢蘑菇菌丝体 图 8A 为 1 000 倍条件下正常 As2796 细胞 health Agaricus bisporus cell 简称 HAbC 结 构 罹病 As2796 子实体在 1 500 倍条件下存在 正常 As2796 细胞和 MP0012 细胞 M. perniciosa cell 简称 MpC 图 8B As2796 与 MP0012 细胞接触位置的细胞壁结构被降解 图 8C 的现象 也未见其产生附着包 吸器等结构 双孢蘑菇也无显著的生长不良现象 这与许 多关于有害疣孢霉菌菌丝不侵入双孢蘑菇 菌丝体内 两者可交叉生长 互不影响的报 道结果相符 Pieterse et al. 2005 范建奇等 2012 黄建春等 2010 罗仰奋等 1997 然而在对峙培养后期以及双重培养过程中 说明 MP0012 可分泌降解 As2796 细胞壁成分的 均能观察到 在保证培养基中双方代谢物质 物质 使得 As2796 细胞内含物外漏 最终导致 不相互传递的前提下 一些双孢蘑菇菌丝会 As2796 细胞裂解 死亡 出现卷曲 扭结断裂现象 由此推断出有害 3 讨论 通过对峙试验发现在对峙培养前期 有 疣孢霉菌丝生长过程可能会产生某些挥发 性物质 会给双孢蘑菇菌丝生长发育造成不 利的影响 菌物学报 445
446 ISSN1672 6472 CN11 5180/Q 图 7 子实体扫描电镜图谱 Mycosystema March 15, 2014 Vol. 33 No. 2 A 正常双孢蘑菇子实体 AsS1 B 靠接罹病双孢蘑菇子实体 AsS2 C 覆土罹 病中期的双孢蘑菇子实 AsS3 1 D 覆土罹病晚期蘑菇子实体 AsS3 2. 标尺=20 m. Fig. 7 SEM photographs of mycelia of fruiting body. A: Mycelia of healthy Agaricus bisporus (ASS1); B: Mycelia of diseased A. bisporus (AsS2) caused by inoculation of Mycogone perniciosa; C: Mycelia of diseased A. bisporus (ASS3 1) at medium stage; D: Mycelia of diseased A. bisporus (ASS3 2) at later stage. Bars=20 m. 图 8 子实体透射电镜图谱 A 健康子实体细胞形态 AST1 标尺=10 m B 罹病子实体细胞形态 AST2 标尺=2 m C 罹病子实体细胞壁结构 AST2 标尺=500nm. Fig. 8 TEM photographs of cells of fruiting body. A: Cells of healthy Agaricus bisporus (AST1), Bar=10 m; B: Cells of diseased Agaricus bisporus (AST2), Bar=2 m; C: Cell wall of diseased Agaricus bisporus, Bar=500nm. http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
黄清铧等 / 有害疣孢霉菌与双孢蘑菇的互作关系 447 直接接种感染 As2796 试验及罹病的子实体解剖结果表明, 有害疣孢霉菌可以直接侵染双孢蘑菇子实体, 并在 3d 后发病 侵染过程中孢子先在双孢蘑菇子实体表面萌发形成菌丝体, 菌丝开始在双孢蘑菇子实体表面生长, 然后逐渐侵入子实体内部, 染病部位子实体组织颜色由白色逐渐变成黑色, 子实体菌柄绒毛状 部分中空, 最后整个子实体变褐, 菌褶变黑腐烂, 并长出绒毛状菌丝体 电镜扫描发现, 有害疣孢霉菌丝沿着双孢蘑菇菌丝组之间生长, 菌丝并未侵入到双孢蘑菇菌丝体内, 而是引起子实体菌丝组织出现断裂 消化 降解 进一步透射电镜观察发现双孢蘑菇与有害疣孢霉菌丝细胞接触部位的细胞壁被溶解, 导致双孢蘑菇细胞内含物外漏, 最终引起细胞裂解, 死亡 菌寄生菌物 (mycoparasate) 的寄生性分为活体营养菌寄生菌 (biotrophic mycoparasates) 及死体营养菌寄生菌 (nectrophic mycoparasates) 两种类型, 前者从活的寄主菌物中摄取营养对寄主没有明显破坏作用, 后者从死的寄主菌物上吸取营养对寄主破坏性大 ( Jeffries 1985 ) 有报道, 掉头霉科 Piptocephalidaceae 头珠霉属 Piptocephalis 集珠霉 Syncephalis 前期与活体寄生菌相似, 其后又会在寄生菌物内快速生长并破坏宿主细胞, 但在实验室对峙培养下并不出现寄生菌物杀死寄主的想象, 甚至对寄主没有明显的抑制作用 (Benjamin 1959) 实验室对峙培养及生产上菇房感染病原菌后, 由于有害疣孢霉菌可以直接从试验培养基或培养料获取营养物质, 而无需从双孢蘑菇菌丝中获取营养物质, 所以对双孢蘑菇不发生作用或作用较小 ; 子实体阶段, 由于有害疣孢霉菌未能从培养基质中直接获取营养物质, 所以通过溶解双孢蘑菇子实体细胞获取营养物质, 导致了双孢蘑菇子实体细 胞溶解或生长发育不良, 最终发病并引起死亡, 由此推断有害疣孢霉菌对双孢蘑菇属于死体营养菌 菌寄生菌物与寄主菌物 (mycohost) 之间相互作用分为趋向 识别 接触和穿透 营养获得 4 个连续过程 (Whipps et al. 1988) 趋向性即寄主菌物菌丝产生的化学刺激物质使菌寄生菌物能够正确的确定寄主的位置, 或者是一般条件下寄生菌物不萌发而在添加寄主菌物分泌物后就萌发生长 (Elad et al. 1983,1985;Lutchmeah & Cooke 1984) 支月娥等(1995) 研究发现, 休眠的有害疣孢霉厚垣孢子在一般条件下不萌发, 但在培养基中加入双孢蘑菇子实体 子实体浸提液 菌丝体等后便可萌发 本研究也发现有害疣孢霉菌的厚垣孢子在通常情况下不萌发, 但添加双孢蘑菇菌丝体或子实体浸提液会提高其萌发率 通过双重培养发现, 双重培养的有害疣孢霉菌菌丝生长速度和厚垣孢子产孢量明显较单纯培养高 由此可见, 双孢蘑菇菌丝生长会产生可促进有害疣孢霉菌菌丝生长及厚垣孢子产生和萌发的某种挥发性物质 这种刺激性化学物质具体是何物质及作用机理尚待进一步研究探明 [REFERENCES] Atkey PT, Barton RJ, Hollings M, 1974. Mushroom virus purification and characterization. Report Glasshouse Crops Research Institute, 9: 238 Benjamin RK, 1959. The merosporangiferous Mucorales. Aliso, 4: 321 433 Elad Y, Barak R, Chet I, 1983. Possible role of lectins in mycoparasitism. Journal of Bacteriology, 154(3): 1431 1435 Elad Y, Lifshitz R, Baker R, 1985. Enzymatic activity of the mycoparasite Pythium nunn during interaction with 菌物学报
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