第 40 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 第期 0 年月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ DOI:0.374/SP.J.096.0.5 基于免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的便携式光电型传感器 张洪才 刘国艳, 陈小连 刘春燕 叶雨丹 柴春彦 *, ( 上海交通大学农业与生物学院, 上海 0040) ( 上海市兽医生物技术重点实验室, 上海 0040) 摘要利用免疫竞争抗制原理制备检测盐酸克伦特罗的免疫纳米金试纸条, 盐酸克伦特罗与 CLḆ BSA 复合物竞争性结合胶体金上抗体的有限位点, 从而使试纸条上的检测带显色减弱或消失 将显色后的试纸条插入自行研制的光电型传感器的测试孔内, 根据反射光的强弱计算出克伦特罗的浓度 结果表明 : 用光电传感方法检测盐酸克伦特罗的线性范围为 ~0 mg/l, 检出限为 0.05 mg/l, 回收率为 85.46% ~ 96.05% 此光电型传感器检测克伦特罗具有简便 快速 灵敏 特异性强的优点 关键词 盐酸克伦特罗 ; 光电型传感器 ; 免疫胶体金试纸条 ; 猪尿 引言 盐酸克伦特罗, 又名为瘦肉精, 是一种人工合成的 β - 肾上腺素受体激动剂, 动物食用后能显著提高 瘦肉率, 但同时也造成动物性食品中瘦肉精的残留, 从而引起人类中毒事件的发生 [,] 中国农业部在 997 年就严令禁止 β - 肾上腺素激动剂在动物生产中的应用, 规定在动物性食品中的检出限为 0 mg/l [3~ 0] [,] [3,4] 目前, 盐酸克伦特罗的常用检测方法主要有色谱方法 免疫学方法 电化学方法和传感器 [5~ 7] 法等 有效的检测方法是控制盐酸克伦特罗滥用的关键之一, 因此有必要研究高灵敏的快速检测 方法 由于传统的免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗残留只能进行定性和半定量检测, 但与光电型 传感器相结合后, 可以达到定量检测的要求 [8] 此外, 传感器检测技术还具有检测迅速 简便 容易携 带 可实现现场检测等优点 目前, 用此方法检测盐酸克伦特罗的残留还未见报道 本实验制备出了检测盐酸克伦特罗的免疫胶体金试纸条 由于盐酸克伦特罗会占据胶体金上抗体 的位点, 使得其无法和硝酸纤维素膜上固定的 CLḆ BSA 复合物结合, 从而不产生抗原抗体复合物, 而不 显色或显色较浅 根据盐酸克伦特罗浓度的大小在试纸条上会显示出不同程度的颜色, 其显色强度能 通过光电型传感器的电流频率转换器转化为电信号, 再经微处理器转换成反射光的强度值, 建立了检测 盐酸克伦特罗残留的光电型传感器的分析方法 实验部分. 仪器与试剂 光电型传感器 ( 上海交通大学电子信息与电气工程学院的协助下自行研制而成 ); 台式高速离心机 ( 北京医用离心机厂 ); 切割机 ( 上海本善科技有限公司 ); 真空冷冻干燥机 ( 上海亚翔制冷设备工程有限 公司 ) PVC 板, 玻璃纤维,NC 膜购自上海金标科技有限公司 盐酸克伦特罗标准品 ( 中国农业科学院上海兽医研究所惠赠 ); 羊抗鼠二抗 (Sigma 公司 ); 抗盐酸克 伦特罗抗体和 CLḆ BSA 偶联物 ( 本实验室合成 ); 聚乙二醇 000 聚乙烯二醇 脱脂奶粉 甘氨酸 牛血 清白蛋白 氯金酸 柠檬酸三钠 ( 分析纯, 上海国药集团上海化学试剂公司 );Tris-HCl 缓冲液 (ph 7.4) 为 实验室配制, 实验用水均为二次蒸馏水 [8]. 免疫胶体金试纸条的制备.. 胶体金溶液的制备取 00 ml 蒸馏水倒入锥形瓶中, 滴加 500 ml % 氯金酸, 加热到沸腾, 再 0-0-9 收稿 ;0--3 接受本文系国家自然科学基金项目 () 和上海市兽医生物技术重点实验室开放课题基金资助 * E-mail: cychai88@ hotmail.com
分析化学 第 40 卷 滴加 500 ml % 柠檬酸三钠, 当溶液颜色由紫红色变成红色时, 再小火加热 5 min 即可, 冷却, 于 4 冰箱保存.. 金标垫的制备取标记好的离心管, 加入 ml Tris-HCl 缓冲液,4 ml 抗体, 混匀 ; 再加入 0 ml 胶体金溶液, 在冰浴中放置 5 min, 用 K CO 3 调至 ph>8.5;30 min 后, 再加入 0 ml BSA, 静止 5 min, 分装到 6 个离心管内, 以 000 r/min 离心, 产生红色沉淀 ; 用配制好的洗涤液离心一次, 将红色沉淀收集到一个离心管中 ; 将该红色沉淀均匀滴加到玻璃纤维上,-50 冷冻干燥, 备用..3 试纸条的组装为了增加 CLḆ BSA 偶联物和羊抗鼠二抗在 NC 膜上显色的表面积, 采用机械冲压打孔法在 PVC 板上制成直径为 0.5 cm 的圆孔 ; 在 PVC 底板上装上 NC 膜 (5 g/l 牛血清白蛋白和 0.3 g 甘氨酸先对其进行封阻, 以消除非特异性的结合 ); 在 PVC 底板上装配吸水纸 金标垫和玻璃纤维 ; 将其切成 6 cm 0.9 cm 的条子 ( 如图 所示 ); 在 NC 膜的打孔处均匀喷上 4 ml 二抗和 CLḆ BSA 偶联物, 自然晾干后备用.3 实验方法光电型传感器的硬件 检测原理和样机如图 所示, 光从光源发出, 投射到试纸条的测试区后被反射 ; 反射光由电流频率转换器接收, 并转换为电信号进行传输 ; 经过单片机的数据处理, 显示在显示器上, 且电信号的强度与试纸条的颜色深浅呈反比 图 Fig. 免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的示意图 Scheme for determination of clenbuterol based on immune colloidal gold strip. 吸水纸 (Hydrophilic paper);. C 带 (Control strap);3. 硝酸纤维 素膜 (nitrocellulose (NC) membrane); 4. T 带 (Test strap);5. 金标垫 (Colloidal gold pad); 6. 玻璃纤维 (Fiberglass);7. PVC 板 ( PVC plate) 将,, 4, 6, 8 和 0 mg/l 盐酸克伦特罗标准溶 液缓慢滴加在玻璃纤维上, 依靠毛细管虹吸的作用, 图 Fig. sensor 光电型传感器的检测原理和样机 Detection principle andprototype of photoelectric Ⅰ. 原理图 (Principle sketch of photoelectric sensor);Ⅱ. 样机 (Prototype the photoelectric sensor). 测试区 (Testing cell);. 液晶显 示屏 (Liquid crystal display(lcd)) 在 T 带和 C 带处显示程度深浅不同的颜色 ; 剪切显色的试纸条, 放在光电型传感器的测试区内, 盖上盖 子, 进行测试 分别在 0, 30, 60, 90, 0, 50, 80, 0 和 40 s 处对显色的试纸条进行测试, 记录光电型 传感器的光电信号值 3 结果与讨论 3. 免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的显色结果因为免疫胶体金试纸条的灵敏度和胶体金溶液中包被抗体的量密切相关, 分别滴加, 4 和 6 ml 的 抗体进行检测, 结果表明, 在金标垫上包被 ml 抗体, 检测灵敏度最高 因此, 本研究选用包被有 ml 盐酸克伦特罗抗体的胶体金试纸条 将剪切好的试纸条滴加不同浓度的盐酸克伦特罗标准品进行检测 显色结果如图 3 所示, 在有盐 酸克伦特罗的情况下, 盐酸克伦特罗先与金标垫上的单抗形成复合物, 从而与 NC 膜上的 CLḆ BSA 偶 联物形成竞争, 抑制 CLḆ BSA 偶联物捕获盐酸克伦特罗金标单抗的量,T 带较浅或消失, 判断为阳性 相反, 当无盐酸克伦特罗时,T 带颜色较深, 判断为阴性 而控制线 (C 带 ) 应一直显色, 因为二抗结合盐
第期张洪才等 : 基于免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的便携式光电型传感器 酸克伦特罗抗体的其它结合位点与盐酸克伦特罗的存在无关 随着盐酸克伦特罗浓度的增加, 试纸条 在检测带上的颜色由深变浅 3. 基于免疫胶体金试纸条的光电型传感器的时间 - 信号变化曲线为了研究恰当的时间记录光电型传感器的响应信号和测试传感器的灵敏性, 不同浓度盐酸克伦特罗的响应时间和传感器的响应信号如图 4 所示 随着响应时间和盐酸克伦特罗浓度的增加, 试纸条的颜色逐渐变浅, 光电型传感器的响应信号值也逐渐减小 在 50 s 后, 曲线基本达到平衡状态, 试纸条的反射率达到最大, 之后曲线变化不大, 逐渐进入稳定期, 所以 50 s 应为数据采集的最佳时间 3.3 基于免疫胶体金试纸条的光电型传感器检测盐酸克伦特罗的标准曲线基于免疫胶体金试纸条的光电型传感器检测盐 图 3 基于免疫金试纸条测试不同浓度的盐酸克伦特罗的显色结果 Fig.3 Coloration of immunecolloidal gold strip with different concentrations of clenbuterol a. blank; b. mg/l; c. mg/l; d.4 mg/l; e.6 mg/l; f.8 mg/l; g.0 mg/l. 酸克伦特罗的标准曲线如图 5 所示 回归方程为 y =604.53-30.050x (r=0.996), 试纸条显色后经光电型传感器显示的信号值与盐酸克伦特罗的浓度在 ~0 mg/l 范围内具有良好的线性关系 ; 检出限为 0.05 mg/l 这是由于盐酸克伦特罗与金标垫上的单抗竞争结合 NC 膜上的 CLḆ BSA 偶联物, 在 T 带处显示颜色深浅不同的印迹, 所以随着浓度的增加, 与标准进行对比发现, 试纸条的颜色逐渐变浅, 传感器的信号值也将逐渐降低 图 4 基于光电型传感方法检测不同浓度盐酸克伦特罗的时间 - 响应曲线 Fig.4 Sensor response versus time in detection of cleṉ buterol with different concentrations 图 5 基于光电型传感器检测盐酸克伦特罗的标准曲线 Fig.5 Tandard curve for determination of clenbuterol on the photoelectric sensor a. 0 mg/l; b. 8 mg/l; c. 6 mg/l; d. 4 mg/l; e. mg/l; f. mg/l. 3.4 传感方法的优越性为了比较本方法与其它检测盐酸克伦特罗方法的优越性 分别与文献报道的检测盐酸克伦特罗的方法进行比较分析 不同检测盐酸克伦特罗残留的方法如表 所示 基于免疫胶体金试纸条和光电型传感器检测盐酸克伦特罗显示出较高的灵敏性, 传统的免疫胶体金试纸条只能定性和半定量检测盐酸克伦特罗, 但免疫胶体金试纸条与光电型传感器相结合检测盐酸克伦特罗, 能够达到定量分析的要求, 并且检出限达到 0.05 mg/l 这可能是由于在 NC 膜处标记的 CLḆ BSA 偶联物与金标垫上的盐酸克伦特罗抗体竞争反应时, 一般肉眼看不到的颜色, 通过光电型传感器能够检测出信号值, 从而能够达到微量检测的要求
分析化学 第 40 卷 3.5 干扰实验和回收实验 选用实际样品中可能含有的违禁兽药莱克多巴胺和沙丁胺醇作为干扰物质, 在 mg/l 盐酸克伦特 罗标准液中分别添加两种干扰测试液, 所检测的盐酸克伦特罗的浓度差异不显著 (P> 0.05) 将上述 3 种溶液混合后, 检测出盐酸克伦特罗的浓度差异也不显著 表 用不同方法检测盐酸克伦特罗的比较分析 Table Comparative analysis of different types of methods for detection of clenbuterol 检测方法 Detection Method 高效液相色谱法 (HPLC) High Performance Liquid Chromatography 液 - 质联用法 (LC-MS) Liquid chromatography-mass spectrometry 气 - 质联用法 (GC-MS) Gas chromatography-mass spectrometry 酶联免疫吸附法 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay 毛细管电泳 - 电化学联用法 Capillary electrophoresis with electrochemical detection 微流体免疫法 Microfluidic immunoassay 电化学免疫传感器 Electrochemical immunosensor 光电型传感器 Photoelectric sensor 免疫胶体金试纸条 Immune colloidal gold strip 线性范围 Linear range 检测线 Detection limit 文献 References 0.~0 g/ml 0.05 g/ml [3] 0.5~5.0 mg/ml 0.04 mg/ml [0] 0~500 mg/l 0.005~.0 mg/l.4 mg/l mg/l [] [] 0~0 mg/kg 0.5 mg/kg [] 0.~00 mg/ml 0. mg/ml [3] 0~5 mg/l 0.088 mg/l [0] 0~0 g/ml 0. mg/l [6] ~0 mg/l 0.05 mg/l - - mg/l [9] 为了进一步探讨该传感器的可靠性, 选用未饲喂盐酸克伦特罗的健康仔母猪的尿液 ( 上海兽医生物 技术实验室 ), 分成 5 组加入 ~ 0 mg/l 的盐酸 克伦特罗标准液, 超声 5 min 后, 以 6000 r/min 离 心 0 min, 取其上清液, 用 0.45 mm 滤膜过滤, 收 集 备用 盐酸克伦特罗的回收率为 85.46% ~ 96.05% ( 如表 ) 因此, 本传感器能够满足现场 实际样品的检测 3.6 光电型传感器性能测试 制作好的免疫胶体金试纸条放在光电型传 表 猪尿中盐酸克伦特罗的回收率 Table Recovery study of clenbuterol in pig urin 样品 Samples (n=5) 加入量 Added (mg/l) 检测值 Found (mg/l) 回收率 Recovery (% ) RSD (% ) S.9±0.05 96.05.8 S 4 3.768±0.083 94.0 4.3 S3 6 5.555±0.04 9.58 4.8 S4 8 7.39±0.057 89.3 5. S5 0 8.546±0.094 85.46 5.7 感器上进行检测, 可在 min 内完成 更换同一批次制作的试纸条, 对相同浓度的盐酸克伦特罗进行检 测,5 次测试结果得相对标准偏差 (RSD) 小于 3.% 随机抽取 5 批次制作的试纸条, 检测同一浓度的盐 酸克伦特罗样品, 其 RSD<3.5% 因此, 本实验制备的基于免疫胶体金试纸条的光电型传感仪具有检 测速度快 特异性强等优点 4 结论 本实验采用与传统方法不同的制备方法, 以机械冲压打孔方法成功制备出检出限较低的盐酸克伦 特罗试纸条, 再将显色后的试纸条剪切成一定尺寸, 置于光电型传感上检测 在 ~0 mg/l 范围内有良 好的线性关系, 检出限为 0.05 mg/l 免疫胶体金试纸条在光电型传感器的测试在 min 内完成, 可实现 现场快速检测 References PatienceJF,RossK A,BeaulieuA D,MerrilJ,VessieG.J.Anim.Sci.,0,89(7):43~56 BrambilaG,FioriM,RizzoB,CrescenziV,MasciG.J.Chromatogr.B,00,759():7~3 3 MostafaG A E,Hefnawy M M,EḻMajedA.JournalofAOACInternational,009,9(3):84~89 4 LiC,WuYL,YangT,ZhangY,Huang-Fu W G.J.Chromatogr.A,00,7(50):7873~7877
第期张洪才等 : 基于免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的便携式光电型传感器 APortablePhotoelectricSensorBasedonImmuneColoidalGold StripsforRapidDeterminationofClenbuterolinPigUrine ZHANG Hong-Cai,LIU Guo-Yan,,CHEN Xiao-Lian,LIU ChuṉYan,YEYu-Dan,CHAIChuṉYan *, (SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai0040,China) (ShanghaiKeyLaboratoryofVeterinaryBio-tech,Shanghai0040,China) 5 ChurchwelMI,TwaddleNC,MeekerLR,DoergeDR.J.Chromatogr.B,005,85():34~43 6 JuanC,IgualadaC,MoraguesF,LeonN,ManesJ.J.Chromatogr.A,00,7(39):606~6068 7 KootstraPR,KuijpersCJPF,WubsK L,vanDoornD,SterkSS,vanGinkelL A,StephanyR W.Anal. Chim.Acta,005,59(-):75~8 8 WangL,LiY Q,ZhouY K,YangY.Chromatographia,00,7(7-8):737~739 9 WU YiṉLiang,YANGTing,SHANJI-Hao,HUANGFU Wei-Guo.ChineseJ.Anal.Chem.,00,38(6):833~837 吴银良, 杨挺, 单吉浩, 皇甫伟国. 分析化学,00,38(6):833~837 0 BlancaJ,MunozP,Morgado M,MendezN,Aranda A,ReuversT,Hooghuis H.Anal.Chim.Acta,005, 59(-):99~05 RenXF,ZhangF M,ChenFJ,YangTB.Food.Agr.Immunol,009,0(4):333~344 ZhengSL,SongSQ,LanH,QuG R,Li,RX,WuAB,ZhangDB.Anal.Let.,009,4(3):600~64 3 Wang W Y,ZhangYL,WangJY,ShiX,YeJN.Meat.Sci.,00,85():30~305 4 ZhaoC,JinGP,ChenLL,LiY,YuB.Food.Chem,0,9():595~600 5 GaoLJ,GanN,HuFT,CaoY T,ZhengL.Adv.Mater.Res.,0,(7-8):793~796 6 LiuG,ChenH D,PengHZ,SongSP,GaoJM,LuJX,DingM,LiLY,RenSZ,ZouZY,FanCH.Biosens. Bioelectron.,0,8():308~33 7 HePL,WangZY,ZhangLY,Yang WJ.Food.Chem.,009,(3):707~74 8 LIHuai-Ming,LAI Wei-Hua,XU Heng-Yi,XU Bo,LUO Wei,WEIHua,WANG Shui-Xing,XIONG Yong- Hua.ChineseJ.Anal.Chem.,0,39():647~65 李怀明, 赖卫华, 许恒毅, 徐波, 罗薇, 魏华, 王水华, 熊勇华. 分析化学,0,39():647~65 9 JIANG YaṉBin,SUN GuaṉRu,WANG Hai,YAOSong-Tao,YANG Hong-Ju,CUILi-Li,CAOJiaṉRong,YU Lei.ChineseAnimalHusbandryandVeterinary Medicine.,00,37(0):09~3 姜艳彬, 孙冠如, 王海, 姚松涛, 杨红菊, 崔立莉, 曹健荣, 于雷. 中国畜牧兽医,00,37(0):09~3 0 KongJ,JiangL,SuX O,QinJH,DuY G,LinBC.Lab.Chip,009,9():54~547 ZhaoL,ZhaoJA,Huangfu W G,WuYL.Chromatographia,00,7(3-4):365~368 XIE Meng-Xia,LIU Yuan,JIANG Min.ChineseJ.Anal.Chem.,00,30():308~3 谢孟峡, 刘媛, 蒋敏. 分析化学,00,30():308~3 Abstract Immunecoloidalgoldstripsforthedeterminationofclenbuterol(CLB)weredevelopedby principleofimmunecompetitiveinhibition.clenbuterolcompetesthespecificantibodycombiningsite withthecompoundofclenbuterolandbovineserumalbumin(bsa),whichmakethecolorofthetestingstrapabateordisappear.thesensingsystem waseasilyestablishedbyconnectingtheteststrips toaphotoelectricsensorthroughthetestingcelandthecolorofteststripsbecamelighterandlighter withtheincrementoftheconcentrationofclenbuterol.theresultsshowedthattheresponseofthe photoelectricsensortoconcentrationofclenbuteroldisplayedalinearcorrelationoverarangefrom to0 mg/l withadetectionlimitof0.05 mg/l,andtherecoveryreached85.46%-96.05%inpigurinesamples.thephotoelectricsensorbasedonimmunecoloidalgoldstripsforthedetectionofcleṉ buterolissimple,quick,andspecific. Keywords Clenbuterol;Photoelectricsensor;Immunecoloidalgoldstrip;Pigurine (Received9October0;accepted3December0)