淋球菌药物敏感性实验方法介绍及淋球菌耐药趋势 广州市皮肤病防治所检验科 曹文苓
主要内容 概况 淋球菌分离培养 淋球菌药物敏感性实验方法 淋球菌耐药性
概况 淋病 (gonorrhea) 是指由淋病奈瑟氏菌引起的泌尿生殖道化脓性感染, 是法定的乙类传染病, 主要引起尿道炎 宫颈炎 泌尿生殖器其它部位 : 附睾炎 前列腺炎 输卵管炎和盆腔炎等 全身其它部位 ( 播散性淋病 ): 淋球菌性关节炎 腱鞘炎 心内膜炎和脑膜炎等合并症 淋菌性咽炎 淋菌性直肠炎和淋球性眼炎 淋菌性皮炎 5%-20% 的男性和 60% 女性病人没有临床症状
淋球菌分离培养 ( 取材 ) 男性 : 尿道口 2~4cm, 标本略带粘液 必要时取前列腺液, 提高阳性率 女性 : 宫颈口 1.5cm 转动并停留 10~30 秒 幼女 : 阴道分泌物 肛门 : 将拭子插入肛门 2~3cm, 从紧靠肛环边的隐窝中取材, 避免接触粪便 咽 : 从咽后壁或扁桃体隐窝取材 眼 : 眼分泌物 取材时, 注意无菌操作, 取材前应该停药一周
淋球菌分离培养 ( 接种标本 1) 取材后标本应尽可能及早接种 培养基应先置于室温或孵箱中预温 将取材的拭子转动涂布于平皿的上 1/4 范围, 然后用接种环分区划线, 以保证获得较纯的单个菌落
淋球菌分离培养 ( 接种标本 2- 四区划分接种 )
淋球菌分离培养 ( 培养条件 ) 温度 :35~36 O C 湿度 : 一定的水份 5% CO 2, CO 2 环境可由 CO 2 培养箱 CO 2 产气袋及烛缸提供 使用烛缸时, 应使用白色 无芳香味的无毒性蜡烛 在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度 对外环境影响 : 标本离体时间要短 保湿, 必要时用运送培养基, 平皿接种前要预温
淋球菌培养 ( 观察结果 )
淋球菌分离培养 ( 临床意义 ) 培养法为诊断淋病的金标准, 特别是对女性淋病的确诊, 淋球菌培养是唯一的方法 可发现无症状淋球菌感染患者 可用于进一步作药敏试验 可用于治疗后的判愈试验
淋球菌药物敏感性实验方法 纸片扩散法 琼脂稀释法 E-test 法
淋球菌药物敏感性实验方法 ( 纸片扩散法 ) 原理 方法 结果观察 临床意义 注意事项
琼脂纸片扩散法结果观察
纸片扩散法原理 将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上, 药物即扩散到琼脂中 如果淋球菌对此药敏感, 则生长被抑制, 在纸片周围形成一个透明的抑菌圈 琼脂中药物浓度与纸片距离成反比, 距纸片越远药物浓度越小 根据抑菌圈的大小判定细菌对该药的敏感 中介 耐药
琼脂纸片扩散法
纸片扩散法的方法 菌种的纯化 菌悬液的制备 :M-H 肉汤 1*10 9 cfu/ml 浓度 菌液涂布 : 将菌悬液涂布于 10%GC 血液琼脂平板 贴纸片 孵育条件 :36 O C,5%CO 2,16~18 小时 结果观察 : 用直尺或卡尺量取抑菌环的直径大小
琼脂纸片扩散法 贴纸片
琼脂纸片扩散法 结果观察
纸片扩散法结果判断淋球菌抑菌圈直径判断标准 (CLSI) 药物 含量 抑菌圈直径 (mm) 耐药中间值中度敏感敏感 青霉素 10IU 头孢曲松 30ug 大观霉素 100ug 四环素 30ug 环丙沙星 5ug 氟哌酸 5ug <=26-27-46 >=47 -- - - >=35 <=14 15-17 - >=18 <=30-31-37 >=38 <=27-28-40 >=41 <=24-25-30 >=31
纸片扩散法临床意义 最常用的方法, 操作简便 影响因素多, 结果不够稳定 指导治疗, 但不适合淋球菌系统的耐药监测
纸片扩散法注意事项 每类药品选一种为代表 菌悬液制备 : 一定 18~24 小时菌苔 贴纸片的时间 : 菌液涂布后放置 3~5 分钟, 30 分钟内一定要贴完 药物纸片的贮存
淋球菌药物敏感性实验方法 ( 琼脂稀释法 ) 原理 方法 结果观察 临床意义
琼脂稀释法 ( 原理 ) 将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上 药物浓度小时细菌生长, 药物浓度高时细菌生长被抑制 测出药物对该菌的最小抑菌浓度 (MIC) 根据判定标准判定该菌是否为敏感 中敏耐药菌株
方法 1 抗生素贮存液 青霉素 :3200μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存 四环素 :3200μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存 壮观霉素 :25600μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存 头孢曲松 :2000μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存 环丙氟派酸 :3200μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存 阿奇霉素 : 800μ g/ml,-70 或 -30 冰箱贮存
方法 2 抗生素工作液 从低温冰箱中取出抗生素贮存液, 室温溶解, 用灭菌蒸馏水作倍比稀释, 从高浓度向低浓度 青霉素 : 1600-800-400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78μ g/ml 四环素 :1600-800μ g/ml 壮观霉素 :25600-12800-6400-3200-1600-800-400-200μ g/ml 头孢曲松 : 贮存液先作 1:10 稀释 (2000μ g/ml--200μ g/ml), 再作倍比稀释 100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78-0.4-0.2μ g/ml 环丙氟派酸 : 1600-800-400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78-0.4-0.2μ g/ml 阿奇霉素 :400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12-1.56-0.78μ g/ml
方法 3 抗生素琼脂培养基 3.7% GC 基础琼脂 + 9% 脱纤维羊血 + 适合浓度的抗生素 先将琼脂高压灭菌, 水浴冷却至 50, 加入无菌脱纤维羊血 ( 终浓度 9%) 取 0.2ml 倍比稀释好的抗生素工作液 + 19.8ml GC 血液琼脂培养基, 混匀后倾倒平皿 (9cm), 从低浓度到高浓度配制
方法 4 接种物的制备及接种 菌悬液 : 淋球菌菌苔, 在 0.03mol/l 磷酸盐缓冲液 (ph7.2) 中制成每毫升含 3 10 8 菌落形成单位的悬液 用多点接种器吸取 10 7 菌悬液或用特制的白金耳挑取菌液 (1 ~ 2μ l), 接种到不含抗生素的对照平皿和含不同抗生素的培养基上 ( 从低浓度平皿到高浓度平皿依次接种 ) 在 36 5% CO2 条件下培养
琼脂稀释法
结果观察 培养 36 ~ 48 小时后观察结果 观察阴性对照, 以确保未含抗生素的平皿中淋球菌生长良好 观察 WHO 标准菌株的 MIC 是否在正常范围 在培养皿上淋球菌被完全抑制或薄雾状生长判为终点结果 淋球菌不生长的最高药物稀释度即为抗生素对淋球菌的最小抑菌浓度 (MIC), 常用 μ g/ml 表示
淋球菌对抗生素敏感性的判断标准 (ug/ml) (WHO) 抗生素 敏感 中敏 耐药 TRNG 青霉素 0.03 0.06 0.5 1 四环素 16* 大观霉素 32 128 头孢三嗪 0.03 0.06 05 1 环丙沙星 0.03 0.06 0.5 1
淋球菌对抗生素敏感性的判断标准 (ug/ml) (CLSI) 抗生素 敏感 中敏 耐药 TRNG 青霉素 0.06 0.12 1 2 四环素 0.25 0.25-1 2 16* 大观霉素 32 64 128 头孢曲松 0.25 环丙沙星 0.06 0.12 1 1
阿奇霉素参考标准 阿奇霉素参考英国抗微生物化疗学会 (www.bsac.org.uk) 推荐 敏感 :MIC 0.25 ug/ml 中敏 :0.5 ug/ml 耐药 :MIC 1 ug/ml 袁柳风, 尹跃平, 戴秀芹等. 南京地区淋球菌分离株对阿奇霉素的敏感性研究 [ J ]. 中国麻风皮肤病杂志,2010;26(2):110-111.
琼脂稀释法的临床意义 作为药物敏感性实验, 结果稳定可靠, 有确定的最低抑菌浓度 (MIC) 可用于淋球菌的系统耐药监测, 可以指导临床制定淋病的治疗方案 操作繁琐, 不适合作为临床常规项目开展
淋球菌药物敏感性实验方法 (E-test 法方法 ) 原理 方法 结果 临床意义
E test
E-test 法原理 琼脂稀释法和纸片扩散法原理的结合产物 当 Etest 试条被放至一个已接种细菌的琼脂平板时, 其试条上的抗生素立即且有效地释放入琼脂平板中, 从而在试条下方马上建立了一个抗生素浓度的连续的指数梯度 结过孵育后, 当细菌的生长清晰可辨时, 即可见一个以试条为中心的对称抑菌椭园环 椭园环边缘与试条的交界处的刻度 ( 以 μ g/ml 为单位 ) 即为 MIC 值 根据判定标准判定该菌是否为敏感 中敏耐药菌株
E test
E-test 法方法 菌种纯化 菌悬液的制备 :18~24 小时的淋球菌菌落, 生理盐水调成 0.5 麦氏单位 菌悬液的涂布 : 将菌悬液涂布于 10%GC 血液琼脂平板 孵育 :36 O C,5%CO 2 24 小时 读取结果 : 读取 E-TEST 试条, 椭圆抑菌环边缘与刻度载体交界点上的数值为 MIC 值
E test
E test 结果
E-test 法的临床意义 作为药物敏感性实验, 结果稳定可靠, 有确定的最低抑菌浓度 (MIC) 操作简单, 适合作为临床常规项目开展, 但试剂成本高
淋球菌耐药性定义 定义 缩略词 标准 产青霉素酶淋球菌 PPNG β- 内酰胺酶阳性四环素 MIC 16ug/ml 质粒介导的耐四环素淋球菌 TRNG β- 内酰胺酶阴性四环素 MIC 16ug/ml 产青霉素酶淋球菌 / 质粒介导的耐四环素淋球菌 染色体介导的耐青霉素和四环素淋球菌 染色体介导的耐青霉素淋球菌 PPNG/TRNG CMRNG PT CMRNG P β- 内酰胺酶阳性 四环素 MIC 16ug/ml 非 PPNG, 非 TRNG 青霉素和四环素 MIC 1ug/ml 非 PPNG, 非 TRNG 青霉素 MIC 1ug/ml
淋球菌耐药性定义 定义缩略词标准 染色体介导的耐四环素淋球菌 CMRNG T 非 PPNG, 非 TRNG 四环素 MIC 1ug/ml 染色体介导的耐喹诺酮淋球菌 QRNG 环丙沙星 MIC 0.5ug/ml 染色体介导的耐环丙沙星淋球菌 CRNG 环丙沙星 MIC 1ug/ml 染色体介导的耐大观霉素淋球菌 大观霉素 MIC 128ug/ml 耐 cefozopran 淋球菌 CZRNG cefozopran MIC8-16 ug/ml
PPNG TRNG 测定的意义 PPNG 的定义 : 对青霉素耐药且产青霉素酶的淋球菌, β- 内酰胺酶阳性 TRNG 定义 : 质粒介导的耐四环素淋球菌, 四环素 MIC 16ug/ml 测定 PPNG TRNG 的意义 :PPNG TRNG 的流行率是淋球菌耐药性流行病学监测中的重要指标之一
1 全国淋球菌耐药监测加强点工作完成情况 1 深圳市慢性病防治院 158 2 广东省皮肤病防治中心 136 3 上海市皮肤病性病医院 124 4 四川省人民医院皮肤病性病研究所 118 5 陕西省西安市第四医院 108 6 辽宁大连市皮肤病医院 102 7 天津市疾病预防控制中心 100 8 浙江省皮肤病防治研究所 98 9 广州市皮肤病防治所 83 10 海南省皮肤病防治中心 66 11 新疆维吾尔族自治区疾病预防控制中心 42 南京 ( 性病控制中心 ) 166
广州地区药物敏感试验结果青霉素 年份 菌株 敏感 中敏 耐药 98 124 0.8% 39.5% 59.7% 99 167 1.7% 33.5% 65.3% 00 100 5% 52 % 43% 01 112 0 46.4% 53.6% 04 127 0 10.2% 89.8% 05 110 0 6.4% 93.6% 08 74 0 20.3% 79.7% 09 88 0 9.1% 90.9%
广州地区药物敏感试验结果 TRNG PPNG 年份 菌株数 TRNG PPNG 98 124 1.62% 3.22% 99 167 9.6% 5.4% 00 100 17% 21% 01 112 17.9% 13.4% 02 100 28% 15% 03 116 31% 25.9% 04 127 51.2% 29.1% 05 110 50.9% 34.5% 08 74 25.7% 41.9% 09 88 58% 38.6% 10 83 60.2% 28.9% 11 114 51.8% 40.3%
广州地区药物敏感试验结果环丙沙星 年份 菌株数 敏感 中敏 耐药 98 124 9.7% 33.9% 56.4% 99 167 3% 28.1% 68.9% 00 100 2% 37% 61% 01 112 2.7 % 25.9% 71.4% 02 100 0 2% 98% 03 116 0 6.9% 93.1 % 04 127 0 0.8% 99.2% 05 110 0 3.6% 96.4% 08 74 0 2.7% 97.3% 09 88 0 1.1% 98.9% 10 83 1.2% 98.8% 11 114 0.9% 99.1%
广州地区药物敏感试验结果头孢曲松 年份 菌株数 敏感 中敏 耐药 98 124 53.2% 46.8% 0 99 167 91.6% 8.4% 0 00 100 57 % 43% 0 01 112 77.7% 22.3 % 0 02 100 42% 58% 0 03 116 62.9% 37.1% 0 04 127 55.1% 44.9% 0 05 110 42.7% 57.3% 0 08 74 43.2% 56.8% 0 09 88 47.7% 52.3% 0 10 83 26.5% 73.5% 0 11 114 44.7% 55.3% 0
广州地区药物敏感试验结果大观霉素 年份 菌株数 敏感 中敏 耐药 98 124 99.2% 0.8% 0 99 167 100% 0 00 100 100 % 0 01 112 100% 0 02 100 100% 0 03 116 100% 0 04 127 100% 0 05 110 100% 0 08 74 100% 0 09 88 100% 0 10 83 100% 0 11 114 100% 0
广州地区药物敏感试验结果阿奇霉素 年份菌株数敏感中敏耐药 99 88 61.4% 11.4% 27.2% 10 76 64.5% 21.1% 14.4% 11 114 62.3% 28.1% 9.6%
广东广州 (2009 年 ) 广州地区 : 头孢曲松未发现耐药菌株, 但头孢曲松的中敏株达到 52.3%(46/88) 南京地区 :2007 年头孢曲松钠中度敏感性株达到了 72.28 % 南宁地区 :2000~2007 年间, 共检出 6 株 ( 0.01% ) 头孢曲松耐药株, 头孢曲松中敏株 ( 65.71% ) 济宁地区 :2008 年检出 9 株 ( 9% ) 头孢曲松耐药株 曹文苓 国际检验医学 2011 年 19 期 某地区淋球菌对 6 种抗生素耐药性结果分析
广东广州 (2009 年 ) 上海 : 淋球菌对阿奇霉素的耐药性达 92. 5% 南京 : 阿奇霉素的耐药性达 9.3%, 广州 : 检出阿奇霉素耐药株 24 株 (27.2%) 应该采取措施保护此药物临床的应用 曹文苓 国际检验医学 2011 年 19 期 某地区淋球菌对 6 种抗生素耐药性结果分析
广东广州 (2009 年 ) 广州 : 大观霉素抗菌活性最强, 敏感株 100%, 未发现耐药菌株, 南京 : 苏晓红等报道大观霉素治疗淋病失败的 3 例病例中,2 例分离出大观霉素耐药菌株 成都 上海等地偶有大观霉素耐药菌株检出 曹文苓 国际检验医学 2011 年 19 期 某地区淋球菌对 6 种抗生素耐药性结果分析
结束语 淋球菌的耐药性 因时间的推移而不断变化, 因地区的不同而有所不同, 广州乃至中国, 头孢曲松和大观霉素对淋球菌抗菌活性最强, 是治疗淋病的首选药物, 临床应该合理用药, 坚持对淋球菌的耐药性监测的十分重要
谢谢 Thanks