液 - 液相層析管柱是天然物分析中最常使用的種類, 依其性質主要有正相 (normal phase) 和逆相 (reverse phase) 兩種 正相層析正相層析指固定相為極性 移動相為非極性, 適用於低極性樣品分析, 在圖譜中低極性分子會先沖提出來 ; 逆相層析指固定相為非極性 移動相為極性, 適用極性樣品分析, 在圖譜中高極性分子會先沖提出來 正相層析固定相為帶 -OH 基的矽膠分子, 逆相層析固定相為矽膠上以八烷基 (-C 8 ) 十八烷基 (-C 18 ) 烷基或 -RNH 2 -RCN 等其他官能基取代原來 -OH 基上之氫 逆相結合層析管柱最常被使用在食品與天然物分析中, 主要是因為此類試樣多為中高極性, 且移動相可使用水作基質 (base), 可降低有機溶劑使用而降低成本與環保問題 逆相結合層析以水為主要移動相品成溶劑, 可配合互溶的溶劑如 : 甲醇 氰甲烷 (acetonitrile) 等 不過若以水為基質, 有時需考量添加緩衝劑 (buffer) 或調整 ph 值以提高分配效率 Chromatography Stationary Phases Silica Gel Derivatized Silica Gel O Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O R O Si O Si O Si O R Where R = C 18 H 37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or C18 ) bulk (SiO 2 ) x surface bulk (SiO 2 ) x surface relatively polar surface normal phase relatively nonpolar surface reversed phase 1
離子交換層析 離子交換層析 (ion-exchange chromatography;iec) 是指當固定相為離子交換樹脂的液相層析管柱, 作用力主要為離子交換作用 離子交換層析管柱主要用於分離與分析離子樣品 陰離子交換層析固定相為陰離子交換樹脂, 試樣應為陰離子, 移動相應以鹼液沖提 ; 陽離子交換層析固定相為陽離子交換樹脂, 試樣應為陽離子, 移動相應以酸液沖提 影響離子交換層析管柱分析效果的因素有 ph 值 離子性質 強度 溫度 有機溶劑添加 固定相性質與鉗合作用等 需注意的是, 離子交換層析管柱有安定性低且再現性差的缺點 離子對層析 離子對層析 (ion-pair chromatography;ipc) 是指固定相為類似結合相層析管柱的化學鍵結液體, 移動相為添加與樣品相反電荷離子 (counter ion) 的水性緩衝液 試樣待測成分與樣品相反電荷離子僅溶在水性移動相中, 但兩者所形成的離子對則會與固定相發生作用 例如分析醋酸, 移 動相為 ph=7 的緩衝液, 醋酸在移動相中形成 CH 3 COO -, 添加如四丁烷銨離子 (tetrabutylammonium ion) 之四級銨離子, 則醋酸銨離子對會與固定相產生作用 離子對層析管柱適用於分析極性樣品 具解離性化合物或生理體液等 分子篩層析 分子篩層析 (size exclusion chromatography;sec) 是指當固定相為分子篩的液相層析管柱, 主要作用力為依尺寸大小分離的斥濾作用 分子篩為表面有微細孔洞的凝膠顆粒, 當沖提進行時, 尺寸越小的分子會跑到孔洞中而延後流出, 因此越大的分子會越早被沖提出來 尺寸大小斥濾層析管柱適用於分析分子量高於 2,000 的不解離化合物或分子量差距大的樣品, 也可作為檢測未知樣品的分子量分佈 尺寸大小斥濾層析可分成二種 :(1) 凝膠過濾層析 (gel fitration chromatography;gfc): 適用於水溶性樣品, 移動相可使用水或水溶性溶劑 ;(2) 凝膠浸透層析 (gel permeation chromatography;gpc), 有時也被稱為 SEC, 用於油溶性樣品, 移動相可使用強溶解力的有機溶劑, 最常使用四氫呋喃 (tetrahydrofuran;thf), 是塑化工業分析高分子的常用方法, 食品中則可利用於油炸油氧化聚合程度分析 第三節 高效能液相層析儀之實務操作 高效能液相層析的分析操作 層析管柱的保養與維護 高效能液相層析的分析操作 在選擇分離條件時, 首先應瞭解樣品特性, 考慮選擇不同種類層析法, 如圖 11-6 所示, 判別是為大分子或小分子? 水溶性或有機性樣品? 極性或非極性? 有無帶電荷或離子性? 儀器分析林志城 薛文發編著 2
操作步驟 層析分析的分離效果主要與 k' α 及 N 值有關 k' 值太小分離效果不好, 太大則分離時間太久, 最好控制在 2~10, 而影響 k' 值的因素主要是溶劑的極性 ;α 值受溶劑官能基的化學性質所影響 ;N 值則受管柱充填物的特性 充填技術及管柱長度所影響 三個變數中以調整 α 值最能提高分離效果, 而調整 k' 可獲得滿意的分離程度,N 的調整與所購管柱有關 以正相層析分析管柱為例, 移動相的極性愈低, 待分析物質越容易溶析出, 但若太快則會降低分離程度, 此時應增加移動相的極性以提高 k' 值 但如果 k' 值已在範圍內, 仍無法分離待測物的話, 則需重新選擇移動相 操作步驟 影響因素 常見問題與解決方法 高效能液相層析的分析操作步驟如下 : 裝接層析管柱與接頭, 此時應防止洩漏問題, 且應注意不鏽鋼材質的延展特性 開機並設定流速 偵測器波長等 使用單一溶劑沖洗整個系統並使基線 (baseline) 維持穩定 配製移動相, 使用過濾膜裝置過濾溶劑中雜質並同時進行脫氣 (degas) 特別是含有水的移動相, 脫氣是非常重要的步驟 以注射針筒 (syringe) 抽取樣品載入試樣閥分析 影響因素 常見問題與解決方法 確定所有成分已被沖提出, 以移動相再沖洗後進行下一個分析 整批樣品分析完後, 以溶劑低速隔夜 (overnight) 流洗 移動相的組成會直接影響管柱對化合物之分離效率 管柱可在室溫下操作, 但是有時若要得到較好的分離效果, 應使用管柱恆溫槽 (column thermostats) 將管柱的溫度維持其變化誤差在範圍內, 例如在以折射率偵測器分析醣類時就應注意溫度控制問題 高效能液相層析在分析前後與分析時會遇到一些問題, 應採取適當手段解決 3
流速不穩定 訊號不穩定 拖尾 飄移 流速不穩定 分析前若發現幫浦壓力不穩定所導致的流速不穩定現象, 表示系統中存在氣泡或有阻塞情形 管柱汙染阻塞嚴重會使壓力上升, 甚至發生溶劑洩漏情形 可先進行幫浦的沖洗 (purge), 若情況不能改善則需分段拆卸管路, 分段流洗 ; 有時尚需以改變溶劑沖洗來去除氣泡 溶劑輸送系統中的抽取頭一段時間應拆卸以超音波洗淨 訊號不穩定 分析前若發現基線一直無法穩定, 應持續清洗管柱 若情況不能改善則應重新審視各組件汙染情形, 可先拆卸管柱, 以幫浦直接聯結偵測器, 使用高流速清洗管路與偵測器 若仍無法改善表示該購買新管柱 拖尾 層析圖譜若出現拖尾 (tailing) 或分叉現象時, 可能是以下幾個原因 : 管柱汙染或阻塞 ; 此時可以管柱使用手冊建議的溶劑或實驗時所使用的移動相沖洗 沖洗時約以 20 倍體積的溶劑流洗, 再將管柱以原來方向接回 樣品注射體積太多或濃度太高 管柱前端的篩板阻塞 ; 來自樣品或流動相的汙染物可能造成篩板堵塞, 也有可能是幫浦密封墊圈 (seal) 經過長期使用而磨損下來的碎屑 防護管柱或分析管柱已損壞 飄移 波峰的滯留時間會有飄移 (draft) 的現象, 這種滯留時間再現性與溶劑組成 幫浦混合效果 系統溫度穩定情形 移動相酸鹼度 離子強度變化等因素有關 若移動相平衡時間不夠, 波峰也會有位移的現象 另外, 管柱汙染 堵塞或移動相除氣不完全也會有此現象發生 固定相的乾涸 (dewet) 也會導致飄移現象, 最常發生在管柱含碳重量百分率 (carbon loading) 較高, 移動相含水率又多的分析 由於 C 18 官能基無法與移動相親合, 因碳鏈沒有充分伸展, 導致分析物與固定相之間還沒有充分作用即已流出 排除的方法很簡單, 只要先用有機溶劑將固定相表面潤溼 (rewet), 再利用移動相將管柱平衡, 然後進行分析 ; 或利用極性官能基與水相的親合力防止固定相的乾涸 層析管柱的保養與維護 層析管柱是層析的心臟, 其維護應詳細閱讀使用及維護手冊 (use and care manual), 注意管柱的安裝 使用 維護等注意事項, 並妥善保存管柱空盒 操作時除要注意可使用的溶劑和管柱可接受的 ph 值範圍以外, 也應注意樣品是否會造成管柱的汙染或阻塞 ; 成分複雜的樣品可在樣品的前處理後 打入 HPLC 前, 先以過濾匣 (filter cartridge) 處理 選用與分析管柱相同類型的填充物的防護管柱 (guard column), 除提供保護的作用外, 也會提高整個系統的分析效率 管柱在不使用時, 應以溶劑將充填物洗淨, 再以適合的溶劑保存 ( 參考管柱使用手冊 ) 為避免管柱內細菌的生長, 應避免使用純水保存, 最好讓有機溶劑充滿整個管柱或含有 10% 以上的有機溶劑 收藏時應將管柱兩端以螺絲鎖緊, 裝在管柱專用盒中, 以避免傷害管柱填充物 4
第四節 高效能液相層析應用與實例 由藥物食品檢驗局所公告方法中可知, 高效能液相層析在食品原料成分 添加物與動植物用藥殘留等是常用的分析工具, 在藥物分析確效上, 更是不可或缺的方法 現行藥品優良製造規範 - 分析確效作業指導手冊針對專一性提及含量測定與雜質試驗 : 對於層析法而言, 必須使用代表性的層析圖來表現其專一性 ; 圖譜中之各層析峰應標記成分名 在應用層析法時, 關鍵性的層析峰應能解析分離達某一適當的程度 對於這種關鍵性的分離, 可利用彼此先後緊靠沖溶出來的兩個成分之解析度來表現該方法之專一性 高效能液相層析因解析度不如氣相層析高, 在定量上最好使用外標準法 其實無論樣品的型式是食品 藥品與化粧品, 對 HPLC 分析者而言都是進行生化物質的分析 就生化分子的醣類分析而言, 因醣類屬極性化合物, 因此可採逆相層析分析, 移動相可使用由水與氰甲烷組成 移動相水分含量越高, 可縮短分析時間 ; 但極性物質對非極性的固定相作用較弱, 較極性的成分會比非極性物質較快沖提出, 所以移動相中氰甲烷含量比例越高其極性越低, 醣類分離效果會越好 ; 但如果氰甲烷含量比例太高靠近 100%, 則需注意醣類可能無法被沖提出來, 會損害管柱與分析 最常利用於醣類分析的偵測器為折射率偵測器, 受干擾較少, 但其靈敏度較低且較易受溫度影響訊號穩定, 最好配合使用管柱控溫箱 三酸甘油酯的分析可利用高效能液相層析, 雖然 RI 或 UV 偵測器皆可偵測到, 但折射率偵測器靈敏度較高波峰較好 ; 固醇類也可以利用 HPLC 法定性或定量 ; 磷脂質因有層析管柱再生困難問題, 不建議採用以 HPLC 分析 在胺基酸 胜肽及蛋白質分析方面, 黃豆蛋白或牛乳蛋白可以離子交換層析法直接分離, 酸性胺基酸 ( 如 : 麩胺酸 ) 含量較多的蛋白質宜選用陰離子交換層析法, 而鹼性胺基酸 ( 如 : 離胺酸 ) 含量較多的蛋白質宜選用陽離子交換層析法 大多數樣品需先將蛋白質水解後得胺基酸 胜肽後再以 HPLC 分析, 其中胺基酸解離與否與調整移動相 ph 值有關 偵測方式許多設計以成分流出管柱後 (postcolumn) 與 ninhydrin 或其他呈色劑反應, 再以紫外光 / 可見光偵測器偵測 維生素分析部份, 水溶性維生素中, 如 : 維生素 C 可利用逆相層析配合並以紫外線偵測, 但維生素 B 1 B 2 最好使用螢光偵測器 脂溶性維生素 D K 利用逆相分層析或吸附層析法進行分析, 維生素 E 多使用正相層析聯結螢光偵測器分析 其他如食品添加物或天然物的分析, 最常使用逆相 C 18 層析管柱, 以梯度式沖提方式分析 樣品液在注入高效能相層析儀前須以 0.22 μm 之濾膜過濾 許多樣品成分複雜, 應先作好區分前處理再作分離, 因為所有的成分不見得會出現在同一個分析圖譜 除使用溶劑或製備管柱區分外, 也常利用固相萃取 (solid phase extraction) 方式, 如市售商品 Sep-pak OASIS, 此法具有快速與濃縮的效果 實例一 : 食用油脂中維生素 E 之檢驗方法 實例二 : 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 - 苯并咪坐 (Benzimidazole) 類多重殘留分析 實例一 : 食用油脂中維生素 E 之檢驗方法 適用範圍 器具與材料 樣品製備 層析條件 鑑別與計算 適用範圍 本檢驗方法適用於食用油脂中維生素 E(dlα-tocopherol 及 dl-α-tocopheryl acetate) 之檢驗 5
器具與材料 容量瓶 :50 ml 100 ml, 褐色 濾膜 : 孔徑 0.45 μm,nylon 材質 試藥 : 正己烷及甲醇均採用液相層析級, 維生素 E(dl-α-tocopherol 及 dl-αtocopheryl acetate) 對照用標準品 標準溶液之配製 檢液之調製 樣品製備 標準溶液之配製 取維生素 E 對照用標準品 dl-α-tocopherol 及 dl-α-tocopheryl acetate 各約 100 mg, 精確稱定, 以正己烷溶解並定容至 100 ml, 供作標準原液, 使用時再以正己烷稀釋成 20~1,000 μg/ml, 供作標準溶液 檢液之調製 取檢體約 1 g, 精確稱定, 以正己烷溶解並定容至 100 ml, 經濾膜過濾後, 供作檢液 層析條件 高效能液相層析儀 : 具有 280 nm 波長之紫外光檢出器 層析管柱 :ODS (octadecyl-siloxane) 粒徑 10 μm, 管內徑 3.9 mm, 長度 30 cm, 或同級品 偵測器 : 紫外光偵測器, 波長 280 nm 移動相 : 甲醇溶液, 流速 1.0 ml/min 樣品注入量 :5 μl 鑑別與計算 精確量取檢液及標準溶液各 5 μl, 分別注入高效液相層析儀中, 參照上述條件進行液相層析 就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間比較鑑別之 並依下列計算式求出檢體中維生素 E 之含量 (mg/g) 6
實例二 食品中動物用藥殘留量檢驗方 法 苯并咪坐(Benzimidazole) 類多重殘留分析 適用範圍 器具與材料 適用範圍 本檢驗方法適用於畜禽產品中febantel fenbendazole oxfendazole oxfendazole sulfone之檢驗 樣品製備 檢量線之製作 層析條件 鑑別與計算 儀器分析 林志城 薛文發 編著 器具與材料 均質機(homogenizer) 研缽及杵 玻璃材質 減壓濃縮裝置(rotary 過濾淨化管 聚丙烯材質 6 evaporator) mixer) 試藥 乙腈及正己烷均採用液相層析級 甲醇 二氯甲烷 磷酸二氫銨及 benzthiazuron均採用試藥特級 BondesilC18吸附劑(40 μm)或同級品 febantel fenbendazole oxfendazole oxfendazole sulfone對照用標準品 旋渦混合器(vortex 0.01 M磷酸二氫銨溶液之調製 ml 直徑 0.5 in. 附有二片過濾片 孔徑20 μm 聚乙 烯材質 中性氧化鋁固相萃取匣(alumina N cartridge for solid phase extraction) 500 mg 6 ml 濃縮瓶 100 ml 濾膜 孔徑0.2及0.45 μm nylon材質 7
0.01 M 磷酸二氫銨溶液之調製 稱取磷酸二氫銨 1.15 g 以水溶解使成 1,000 ml, 以 0.45 μm 濾膜過濾 標準溶液之配製 內部標準溶液之配製 檢液之調製 樣品製備 標準溶液之配製 取 febantel fenbendazole oxfendazole 及 oxfendazole sulfone 對照用標準品各約 5 mg, 精確稱定, 分別以乙腈溶解並定容至 100 ml, 作為標準原液 ; 使用時, 精確量取上述各標準原液 0.2~10 ml, 依其取量不同分別共置於 100 ml 容量瓶中, 再加入內部標準溶液 2 ml, 並以乙腈 :0.01 M 磷酸二氫銨溶液 (1:1,v/v) 之混合溶液定容至 100 ml, 混勻, 使濃度為 0.05~1.0 μg/ml, 供作標準溶液 內部標準溶液之配製 取 benzthiazuron 約 5 mg, 精確稱定, 以乙腈溶解並定容至 100 ml, 作為內部標準溶液 檢液之調製 將檢體細切, 以均質機均質後, 取檢體約 1 g, 精確稱定, 乳類檢體精確量取 1 ml, 置於研缽中, 加入內部標準溶液 10 μl 及 Bond esil-c 18 吸附劑 2 g, 以杵研磨成均態分布, 將此混合物充填於底部裝有過濾片之過濾淨化管中, 充填物頂端再蓋上過濾片, 以玻璃棒壓至使充填物高度約 4 cm 以正己烷 8 ml 分次清洗研缽及杵, 其洗液注入過濾淨化管, 捨棄流出液, 管柱中殘留之正己烷以針筒推桿加壓去除完全 將過濾淨化管與預先以乙腈 4 ml 潤洗之中性氧化鋁固相萃取匣串聯 ( 過濾淨化管在上, 中性氧化鋁固相萃取匣在下 ), 以乙腈 4 ml 清洗器具二次, 注入串聯之過濾淨化管及固相萃取匣沖提, 收集沖提液於濃縮瓶, 於 40 水浴減壓濃縮至乾, 殘留物加乙腈 :0.01 M 磷酸二氫銨 (1:1,v/v) 溶液 0.5 ml, 以旋渦混合器振盪溶解, 經 0.2 μm 濾膜過濾後, 供作檢液 檢量線之製作 精確量取各標準溶液添加於檢體 1 g( 乳類 1 ml) 中, 按照檢液之調製同樣操作, 得到各種濃度之添加分析檢液 精確量取添加分析檢液各 50 μl, 分別注入高效能液相層析儀中, 參照層析條件進行液相層析, 就各動物用藥與 benzthiazuron 波峰面積比, 與對應之各動物用藥濃度, 製作檢量線 8
層析條件 鑑別與計算 高效能液相層析儀 精確量取檢液及標準溶液各50 μl 分別注 入高效能液相層析儀中 參照層析條件進 行液相層析 就檢液與標準溶液所得波峰 之滯留時間及圖譜比較鑑別之 並依檢量 線求出檢體中各動物用藥之含量(ppm) 層析管柱 Cosmosil 5C18 MS-II 5 μm 內徑4.6 mm 25 cm 或同級品 偵測器 光電二極管矩陣偵測器 (photodiode array detector) 波長298 nm 移動相 乙腈 0.01 M磷酸二氫銨溶液 流速1.0 ml/min 線性梯度條件 儀器分析 林志城 薛文發 編著 THE END 回目錄 儀器分析 林志城 薛文發 編著 9