中国农业科学 203,46():2377-2385 Scientia Agricultura Sinica doi: 0.3864/j.issn.0578-752.203..023 苎麻 ACC 氧化酶基因 (BnACO) 的克隆及表达 薛丽君, 周精华,2, 邢虎成 ( 湖南农业大学苎麻研究所, 长沙 4028; 2 湖南省种质资源创新与资源利用重点实验室, 长沙 4028) 摘要 : 目的 克隆苎麻中的一个 ACO 基因 (BnACO), 并对其进行生物信息学分析 表达分析 胁迫应答分析 方法 通过 RT-PCR 结合 RACE 技术从湘苎 3 号中克隆该基因的全长 cdna 序列, 利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析 利用实时荧光定量 PCR 分析 BnACO 在苎麻不同部位的表达量以及在 ABA 干旱和高盐胁迫下的应答 结果 BnACO 的 cdna 序列全长为 476, 其开放阅读框为 98, 编码 326 个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为 36.8 kd 和 4.95, 基因登录号为 JX878855 与无花果(AB307720) 香叶天竺葵 (U9856) 柿树 (AB073009) 梨 (JN807390) 猕猴桃(HQ293208) 的 ACO 基因核苷酸序列相似性分别为 83% 8% 79% 79% 和 79%, 氨基酸序列的相似性分别为 87% 80% 80% 78% 和 83% 实时荧光定量 PCR 分析表明苎麻 BnACO 在苎麻根 茎 茎尖 叶片 雌花和雄花中均有表达, 其中, 在雄花中表达最高, 在根 茎中表达最低, 且该基因受 ABA 干旱和 NaCl 胁迫诱导表达 结论 获得的 BnACO 是 ACO 家族成员之一, 参与 ABA 干旱 NaCl 胁迫应答, 该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式 关键词 : 苎麻 ; 乙烯 ;ACC 氧化酶 ; 表达 Cloning and Characterization of ACC Oxidase Gene (BnACO) from Ramie (Boehmeria nivea) XUE Li-jun, ZHOU Jing-hua, XING Hu-cheng,2 ( Institute of Ramie, Hunan Agricultural University, Changsha 4028; 2 Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Changsha 4028) Abstract: Objective An -Aminocyclopropane--Carboxylic acid Oxidase gene (BnACO) was cloned from ramie and analyzed by bioinformatics method. The expression pattern was revealed in different organs and under stresses. Method The full-length sequence of ACO gene cdna was cloned from Xiangzhu 3 ramie by RT-PCR and RACE methods. Then the sequence of BnACO gene and protein sequences were analyzed through bioinformatics means. The relative expression level of BnACOgene in various organs of ramie and under ABA, drought, NaCl stresses was examined by real-time fluorescence PCR. Result The full length sequence and the ORF of the BnACO gene were 476 and 98, respectively, which encoded 326 amino acids. The molecular weight is 36.8 kd and the pi is 4.95. The similarity comparison revealed that the gene nucleotide sequence shared 83%, 8%, 79%, 79%, and 79% of homology with the Ficus carica (AB307720), Pelargonium (U9856), Diospyros kaki (AB073009), Pyrus pyrifolia (JN807390), Actinidia chinensis (HQ293208) ACO gene, and the similarity of the amino acid sequences with that of these species was 87%, 80%, 80%, 78%, and 83%, respectively. The results of semi-quantitative RT-PCR showed that the BnACO expressed in root, stem, shoot tip and blade, female flowers and male flowers, with the higher expression level in male flowers, while the lowest expression level in root and stem. The results of real-time PCR showed that the BnACO was induced by ABA, 收稿日期 :202-2-04; 接受日期 :203-04-03 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30098) 湖南省教育厅科学研究优秀人才项目 (0B05) 湖南省自然科学基金青年项目 (JJ4025) 联系方式 : 薛丽君,E-mail:xuelijun028@63.com 通信作者邢虎成,E-mail:xhcsoldier@63.com
2378 中国农业科学 46 卷 dehydration and NaCl. Conclusion BnACO belongs to ACO gene family, which involved in abiotic stress responses to ABA, drought and NaCl. It may play a role in gender differences of ramie and have distinctive expression pattern in the regulation of development and stress responses. Key words:boehmeria nivea (L.)Gaud; ethylene; ACC oxidase; expression 0 引言 研究意义 苎麻(Boehmeria nivea (L.) Gaud) 是荨麻科苎麻属多年生宿根性韧皮纤维作物, 其生殖生长对营养生长有显著的抑制作用, 导致纤维产量和品质下降 乙烯作为一种重要的植物激素, 参与调控 [-5] 植物的整个生命周期, 在植物生长发育和逆境胁 [6] 迫等方面发挥着重要的作用,ACC 氧化酶 (ACO) 是乙烯合成途径中最后一个关键酶, 在有氧条件下直接催化 ACC 合成乙烯 [7] 研究苎麻性别分化及其调控机制, 可以为生产中提供不开花 少开花的苎麻品种, 从而提高苎麻纤维产量和品质 前人研究进 [8] 展 邢虎成等研究表明苎麻性别分化与内源乙烯密切相关, 高水平乙烯释放速率诱导雌性苎麻产生, 乙烯合成抑制剂 AVG 和作用抑制剂 AgNO 3 均可以 [9] 抑制雌性花形成 Iwahori 等在黄瓜上施用外源乙烯利, 发现黄瓜雌花的比例增加, 且全雌性黄瓜雌蕊中乙烯含量比雌雄性同株黄瓜中雌蕊乙烯的含量高 [0] Holdsworth 等首次从成熟番茄 cdna 文库中克隆得 [-5] 到 ACO 基因 现在已从多种植物中克隆到 ACO 基因, 并应用于基因工程改良植物品质和研究植物性别分化 ACO 基因参与植物的逆境胁迫应答 胡 [6] 宗利等研究表明干旱抑制 LeACO 在番茄根 茎 [7] 叶中表达, 而复水能强烈诱导其表达 Jiang 等研究发现 50 mmol L - NaCl 处理拟南芥时, 一个 ACO 基因明显上调表达, 另外 3 个 ACO 则下调表 [8] 达 郭春芳等研究表明斑茅 ACO 基因在 ABA 胁迫下, 在 3 h 时有微弱上调表达, 而 6 h 时明显抑制, 其后表达趋向平缓 本研究切入点 目前在苎麻中克隆乙烯生物合成途径中相关基因鲜有报道, 也未见获得苎麻 ACC 氧化酶全长序列以及对其组织特异性表达和胁迫应答模式的报道 拟解决的关键问题 本研究拟在前期研究工作基础上, 克隆苎麻中的一个 ACO 基因 (BnACO), 分析 BnACO 在苎麻不同部位表达量以及在 ABA 干旱和高盐胁迫下的应答水平 为进一步研究该基因功能, 阐明乙烯与苎麻性别分化的关系及苎麻抗逆分子机理奠定基础 材料与方法. 试验材料及其处理湘苎 3 号苎麻取自湖南农业大学耘园实验基地 在湘苎 3 号营养生长期剪取根 茎 茎尖和叶片, 在生殖生长期剪取 3 mm 长的雌花和雄花, 用于基因组织表达特异性分析 ; 选用株高 0 cm 左右 茎粗和叶片数基本一致的大田幼苗, 在培养室用自来水培养 0 d, 长出幼嫩须根后分别用 20% PEG 6000 250 mmol L - NaCl 200 μmol L - ABA 进行干旱 高盐和非生物胁迫信号处理, 分别在处理 0 2 4 6 和 8 h 后取样, 剪取茎 茎尖和叶片用液氮速冻,-80 保存以备提取总 RNA, 用于基因胁迫表达特征分析.2 总 RNA 的提取与 cdna 的合成在液氮中将苎麻不同组织和不同处理时间点的茎 茎尖和叶片材料研磨成粉末 将约 0. g 粉末迅速转入已加入 700 μl pbizol 的离心管中, 漩涡混匀 ; 室温放置 5 min 后,2 000 r/min, 离心 2 min; 取上清, 加入 300 μl 氯仿, 颠倒混匀 ;2 000 r/min, 离心 0 min; 取上清, 加入与上清等体积的异丙醇, 混匀后放置 0 min; 将上述溶液加入离心吸附柱,2 000 r/min, 离心 2 min, 弃废液 ;75% 乙醇洗涤 2 次, 用 30 μl DEPC 处理水洗脱总 RNA, 然后用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性 ; 将提取效果较好的 RNA 经 DNaseⅠ 消化后按照 First strand cdna Synthesis 试剂盒 ( Fermentas) 说明书合成第一链 cdna.3 BnACO 5 端的克隆根据苎麻转录组测序中得到的 ACO 基因片段序列, 利用软件 Primer 5.0 设计 5 RACE 下游槽式引物 ( BnACO-R: 5 -CGCACAGCAGCTCCAGCA-3, BnACO-R2:5 -TCCCAGTCCAAGTCGGTGAT-3 ), 参照 ABI 公司 RLM-RACE 试剂盒说明书, 以根和茎尖混合总 RNA 模板反转录合成 5 RACE 首链 cdna, 以 μl 反转录产物为模板进行第一次 PCR, 反应体系为首链 cdna μl 上下游引物 (0 μmol L - ) 各 μl 0 Buffer 2.5 μl dntp μl Taq 酶 0.2 μl, 加 ddh 2O 至 25 μl 反应程序为 94 2 min;94 30 s,60 30
期薛丽君等 : 苎麻 ACC 氧化酶基因 (BnACO) 的克隆及表达 2379 s,72 min,32 个循环 ;72 7 min 反应终止于 4 第 2 次 PCR 取第一次 PCR 产物 μl 为模板, 反应程序和体系同第一次 PCR,PCR 结束之后, 取 0 μl PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收纯化后与 pmd9-t 载体连接, 转化大肠杆菌 Trans-T, 经 M3 引物和槽式引物验证阳性克隆, 送华大基因测序.4 BnACO 3 端克隆利用软件 Primer 5.0 设计 3 RACE 引物 (ACO-F: 5 -TCTACGCGGGCCTGAAATTC-3,ACO-F2:5 -CC GTCAACGCTGATCCCA-3 ), 反应体系和反应程序同 5 RACE.5 BnACO 开放读码框 cdna 序列的克隆将 RACE 测序结果和已知序列用 SEQUENCHER 软件拼接得到 BnACO 全长 cdna 序列, 在其开放读码框两端设计特异引物 (BnACO-F:5 -ATGGAACA ACAAAACACTTTCCCA-3 ;BnACO- R:5 -TCAAAC AGTTGCAATGGGATCA-3 ), 以雄花和雌花混合总 RNA 为模板反转录合成首链 cdna, 然后进行 PCR 扩增, 反应体系为 cdna μl 上下游引物(0 μmol L - ) 各 μl 0 Buffer 2.5 μl dntp 2 μl Taq 酶 0.2 μl, 加 ddh 2O 至 25 μl 反应程序为 94 2 min;94 30 s,60 30 s,72 min,34 个循环 ; 72 7 min 反应终止于 4 PCR 结束之后, 取 20 μl PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收纯化 PCR 产物并连接 pmd9-t 载体, 转化大肠杆菌 Trans-T, 经 M3 引物和特异引物验证阳性克隆, 送华大基因测序验证.6 生物信息学分析将 RACE 测序结果和已知序列用 SEQUENCHER 软件拼接得到全长 cdna 序列, 然后利用在线分析网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html ) 预测 BnACO 开放读码框, 并通过美国国立生物技术信息中心网站 (NCBI) 对 BnACO 核苷酸序列进行 BLASTN 比对, 对其推测的氨基酸序列进行 BLASTP 比对和保守性功能域预测, 利用 (http://www. expasy.ch/tools/pi_tool.html) 网站分析 BnACO 编码蛋白质的等电点和分子量, 并利用 DNAStar 软件生成 BnACO 氨基酸序列进化树, 分析其进化关系 利用软件 TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/tmhmm-2.0) 分析 BnACO 跨膜结构域.7 BnACO 表达分析根据 BnACO 的全长 cdna 序列设计表达分析 PCR 引物 (BnACO-F:5 -GACGCAGACGGACGGAA AC-3, BnACO-R : 5 -CGGCTCCTTGGCTTGGAA T-3 ) 以苎麻肌动蛋白基因为内参 ( Actin-F : 5 -GCTCCGTTGAACCCTAAG-3,Actin-R:5 -GCTC CGATTGTGATGATTT-3 ) 利用 ABI 7300 实时定量 PCR 仪, 采用 real-time PCR 分析 BnACO 在根 茎 茎尖 叶片 雌花和雄花中组织表达特异性, 并对该基因在不同胁迫处理时间点 (0 2 4 6 8 h) 不同部位 ( 茎 茎尖和叶片 ) 胁迫表达特征进行分析, 反应体系为 2 SYBR Green Master Mix 0 μl cdna μl 上下游引物各 0.5 μl(0 μmol L - ), 加水至 20 μl; 反应程序为 50 2 min,95 0 min,95 5 s, 60 60 s,40 个循环 采用 ABI 7300 荧光定量 PCR 仪进行,3 个重复, 利用 2 -ΔΔCT 法计算目的基因相对表达量 2 结果 2. BnACO 5 端和 3 端克隆及全长 cdna 序列验证根据转录组测序中得到 ACO 基因片段设计 5 和 3 RACE 引物, 分别进行 5 RACE PCR 和 3 RACE PCR 扩增, 分别获得长度为 400 ( 图 -A) 和 450 ( 图 -B) 条带 将测序结果与已知序列比对分析, 该片段序列为 BnACO 的 5 和 3 序列, 拼接获得了该基因全长 cdna 序列, 在 GenBank 中登录号为 JX878855 根据拼接得到的全长 cdna 序列, 在开放读码框两端设计特异引物, 进行 PCR 扩增, 获得长度为 000 ( 图 -C) 左右条带, 测序结果验证了该基因的准确性 2.2 BnACO 生物信息学分析经过拼接测序, 该基因 cdna 序列全长为 476, 其开放阅读框为 98, 编码 326 个氨基酸 ( 图 2 ), 利用在线软件 ( http://us.expasy.org/tools/ pi_tool.html) 推测其编码蛋白的理论分子量和等电点分别为 36.8 kd 和 4.95 经 NCBI 网站 BLAST 比对, 发现苎麻与无花果 ( AB307720 ) 香叶天竺葵 (U9856) 柿树(AB073009) 梨(JN807390) 猕猴桃 (HQ293208)ACO 基因核苷酸序列相似性分别为 83% 8% 79% 79% 和 79%, 氨基酸序列相似性分别为 87% 80% 80% 78% 和 83% 将苎麻与以上 5 个物种进行氨基酸序列多重比对 ( 图 3) 表明, 苎麻 BnACO 与其它物种 ACC 氧化酶基因存在很高的保守性, 且 5 端和 3 端保守性较低而中间保守性较高 利用 DNAStar 软件将苎麻与柿树 猕猴桃 香叶天竺葵 山茶 无花果 番木瓜 白桦 陆地棉 毛果杨 梨等 0 种植物 ACO 氨基酸序
2380 中国农业科学 46 卷 A 2 B 2 C 500 000 500 400 500 000 500 450 500 000 500 2 000 :Marker;A:BnACO 5 RACE;B:BnACO 3 RACE;C:cDNA 开放读码框序列扩增 ORF amplified from cdna 图 苎麻 BnACO RACE 扩增及 cdna 开放读码框序列 RT-PCR 电泳图 Fig. Electrophoretogram of RACE products and RT-PCR products of ORF amplification of BnACO cdna in ramie atc ttc tca tcc aca aca cac caa ata act tcg agc tct ctt tac cct tct att gct cta atc aaa 67 cac tca cta cag tgc tag aga aaa cac aaa gcc aag tcc cca aaa aaa cag aga gag aaa ta 29 ATG GAA CAA CAA AAC ACT TTC CCA GTC ATC GAC ATG TCC AAG CTC AAC GGC GAA GAG AGA GCC TCA ACC ATG M E Q Q N T F P V I D M S K L N G E E R A S T M 20 GAG ATG ATC AAC GAC GCT TGC GAG AAC TGG GGC TTC TTC GAG CTG ATG AAC CAC GGG ATA TCG CAC GAG CTT E M I N D A C E N W G F F E L M N H G I S H E L 273 ATG GAC ATA GTG GAG AGG CTG ACG AAA GAG CAC TAC AGG AAG TGC ATG GAA CAA AGG TTC AAG GAA ATG GTG M D I V E R L T K E H Y R K C M E Q R F K E M V 345 GCC ACC AAA GGC CTC GAG GCC GTA CAG TCG GAG ATC ACC GAC TTG GAC TGG GAA AGC ACC TTC TTC CTC CGC A T K G L E A V Q S E I T D L D W E S T F F L R 47 CAC CTC CCC TTC TCC AAC ATC GCC GAG ATC CCC GAT CTC GGC GAC GAC TAC AGG TCG GCG ATG AGG GAG TTC H L P F S N I A E I P D L G D D Y R S A M R E F 489 GCG GCG GAG CTT GAG AAG CTG GCG GAG CAA CTG CTG GAG CTG CTG TGC GAG AAC CTC GGG CTC GAG AAG GGC A A E L E K L A E Q L L E L L C E N L G L E K G 56 TAC ATC AAG GAG GTG TTC TAC GGC TCC AAA GGC CCG AAT TTC GGC ACC AAG GTG AGC AAC TAC CCG CCC TGT Y I K E V F Y G S K G P N F G T K V S N Y P P C 633 CCG AAG CCG GAG CTG ATC AAG GGC CTC CGG GCC CAC ACC GAC GCC GGC GGC ATC ATC TTG CTC TTC CAG GAC P K P E L I K G L R A H T D A G G I I L L F Q D 705 GAC AAG GTC AGC GGC CTT CAG CTC CTC AAG GAC GGC CAG TGG GTC GAC GTC CCC CCG ATG CGC CAC TCC ATT D K V S G L Q L L K D G Q W V D V P P M R H S I 777 GTC ATC AAC TTG GGT GAC CAG CTC GAG GTG ATC ACG AAT GGG AAG TAC AAG AGC GTG CTC CAC CGG GTG GTG V I N L G D Q L E V I T N G K Y K S V L H R V V 849 ACG CAG ACG GAC GGA AAC AGG ATG TCG CTG GCG TCG TTC TAC AAC CCG GGG AGC GAC GCC GTG ATC TAC CCG T Q T D G N R M S L A S F Y N P G S D A V I Y P 92 GCG CCG GCA TTG GTC GGA GAT CAA GGC GAG GCT GAT GAG AAA AAG AGC TCT GTG GTG TAC CCT AAG TTT GTG A P A L V G D Q G E A D E K K S S V V Y P K F V 993 TTC GAC GAC TAC ATG AAG CTC TAC GCG GGC CTG AAA TTC CAA GCC AAG GAG CCG AGG TTT GAG GCC ATG AAG F D D Y M K L Y A G L K F Q A K E P R F E A M K 065 GCC ATG GAA TCC GCC GTC AAC GCT GAT CCC ATT GCA ACT GTT TGA ctg tac ttt gag tcc ctt tcg gtg aca A M E S A V N A D P I A T V * - 326 37 tgc tca aar atg gga atg rga aaa gaa gat mga mgr att ggt taa cta gta gta cga gta ggt gtg tta gtt 209 atg tct cta tgt tgt tta gtg ata tat ttg gta ctg tgt tga tgt tta tgt gtg tgt act gtg gtg ttt ttc 28 tct cgt gtt ttg gta cta ttg tta gtt gtt act gtg tga caa tgt ttg gaa aca ttg tcg ttg ttg tag ctt 353 ttg tta cat aaa aaa gct tta att aaa ggg ctt ttg tac gga gta aac tag tta ttt tgg gtg tgt cga ata 425 act ttc atg tct tca atg atg tgt cag ttt gat tat gac aaa aaa aaa aaa a -476 小写字母表示非编码区, 大写字母表示编码区,* 表示终止子 Lowercase represent non-coding region, uppercase represent coding region, * represent terminator 图 2 BnACO cdna 全长核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比对 Fig. 2 cdna sequence and its deduced amino acid sequence of BnACO gene 列进行系统进化分析 ( 图 4), 结果表明,BnACO 与无花果 ACO 基因亲缘关系最近, 与沙梨 ACO 基 因亲缘关系较远 利用 TMHMM Server v.2.0 软件对 BnACO 进行蛋白质跨膜区段预测,BnACO 整条 肽链都位于细胞膜外, 说明该蛋白不存在跨膜结构 域
期薛丽君等 : 苎麻 ACC 氧化酶基因 (BnACO) 的克隆及表达 238 0 20 30 40 50 60 70 80 BN(JX878855) FC(BAG06705) PE(AAB70883) Dk(BAB89352) PP(AFA46526) AC(AEM6288) 86 85 83 83 83 83 90 00 0 20 30 40 50 60 70 BN(JX878855) FC(BAG06705) PE(AAB70883) Dk(BAB89352) PP(AFA46526) AC(AEM6288) 7 70 68 68 68 68 80 90 200 20 220 230 240 250 BN(JX878855) FC(BAG06705) PE(AAB70883) Dk(BAB89352) PP(AFA46526) AC(AEM6288) 256 255 253 253 253 253 260 270 280 290 300 30 320 330 BN(JX878855) FC(BAG06705) PE(AAB70883) Dk(BAB89352) PP(AFA46526) AC(AEM6288) BN: 苎麻 Boehmeria nivea;fc: 无花果 Ficus carica;pe: 香叶天竺葵 Pelargonium;DK: 柿树 Diospyros kaki;pp: 梨 Pyrus pyrifolia;ac: 猕猴桃 Actinidia chinensis 图 3 苎麻 BnACO 氨基酸序列与其它物种同源氨基酸序列多重比对 Fig. 3 Alignment of the deduced BnACO amino acid sequence and its homologus amino acid sequences from other species 20.8 猕猴桃 Actinidia chinensis (AEM6288) 柿树 Diospyros kaki (BAB89352) 香叶天竺葵 Pelargonium (AAB70883) 山茶 Camellia sinensis (ABI33224) 苎麻 Boehmeria nivea (unigene46678) 无花果 Ficus carica ( BAG06705) 白桦 Betula pendula (CAA7738) 番木瓜 Carica papaya (AAF64528) 陆地棉 Gossypium hirsutum (AAZ83342) 毛果杨 Populus trichocarpa (XP_00233528) 梨 Pyrus pyrifolia (AFA46526) 20 5 0 5 0 核酸替换率 Nucleotide substitutions ( 00) 图 4 苎麻 BnAC0 氨基酸序列与其它物种同源序列的进化树分析 Fig. 4 Phylogenetic analysis of ramie and other species putative BnACO 2.3 BnACO 表达分析荧光定量 PCR 分析表明 ( 图 5),BnACO 在根 茎 茎尖 叶片 雌花 雄花中均有表达, 在营养生长期,BnACO 在根 茎 茎尖和叶片中表达量逐渐升高, 其中叶片中的表达量最高, 是根中表达量的 7 倍 在茎中表达量与根中的表达量相似, 茎尖 表达量略高于根而低于叶片表达量 在生殖生长期, BnACO 在雄花中表达量最高, 是雌花中表达量的 33 倍 生殖生长期 BnACO 在雄花中的表达量远远高于营养生长期其它器官中的表达量, 说明 BnACO 在苎麻中表达存在器官表达特异性差异和时空表达差异
2382 中国农业科学 46 卷 采用株高 茎粗和叶片数基本一致水培苎麻幼苗进行模拟干旱 (20% PEG 6000) 高盐(250 mmol L - NaCl) 及激素 ABA(200 μmol L - ) 诱导处理, 探索 BnACO 在非生物胁迫下表达情况 ( 图 6), 在 ABA 干旱和高盐处理下,BnACO 在茎 茎尖和叶片都有表达, 但表达量随着时间在不同器官中存在变化 在 ABA 处理下,BnACO 在茎中表达量呈先增加后减少的趋势, 胁迫 6 h 时达到最大, 后表达量开始下降 ; 在茎尖的表达呈先降低后升高的趋势, 同样在胁迫 6 h 时达到最大, 后维持在最高的表达量水平 ; 在叶片中的表达呈现先降低后升高的趋势, 在胁迫 6 h 时表达量降到最低 在干旱胁迫下,BnACO 在茎 茎尖和叶片的表达量都呈先降低后升高再降低的趋势, 但是只有在茎尖中的表达出现了上调超过未胁迫时 (0 h) 的情况, 而在茎和叶片中的表达都是下调的 ( 小于 0 h 表达 ) 干旱胁迫后,BnACO 在不同器官的表达量出现最高的时间不同, 在茎和叶片中 BnACO 表达量在胁迫 4 h 时达到最高, 而茎尖中胁迫 6 h 达到最大 在 NaCl 胁迫下,BnACO 在茎中表达上调, 表达量呈先增加后减少的趋势, 胁迫 6 h 时达到最大, 后表达量开始下降 ; 在茎尖和叶片中的表达呈先降低后升高 再降低的趋势, 也是在胁迫 6 h 时达到最大, 后表达 量水平开始下降 不同非生物胁迫条件下 BnACO 表达水平的时空差异表明该基因以不同的方式参与 植物逆境胁迫响应过程, 且该基因的胁迫诱导存在 滞后现象 相对表达量 Relative expression 80 70 60 50 40 30 20 0 0.00.06 2.28 7.08 2.09 69.54 R S SA B F M 苎麻组织 Tissues of ramie R: 根 Root;S: 茎 Stem;SA: 茎尖 Stem apex;b: 叶片 Blade;F: 雌花 Female flower;m: 雄花 Male flower 图 5 BnACO 组织特异性表达分析 Fig. 5 Expression analysis of BnACO in various tissues of ramie 相对表达量 Relative expression 7 6 5 4 3 2 0 ABA 处理 ABA treatment 茎 Stem 茎尖 Stem apex 叶片 Blade 0 2 4 6 8 2.5 2.0.5.0 0.5 0 干旱处理 Drought treatment 0 2 4 6 8 3.5 3.0 2.5 2.0.5.0 0.5 0 NaCl 处理 NaCl treatment 0 2 4 6 8 时间 Time (h) 图 6 BnACO 在非生物胁迫下表达分析 Fig. 6 Expression analysis of BnACO under abiotic stresses 3 讨论 苎麻属于荨麻科苎麻属, 多年生宿根性韧皮纤维作物, 一年收三季, 第三季麻大量开花结实, 抑制了 [9] 营养生长, 导致纤维产量和品质下降, 本研究通过研究苎麻性别的决定机制来调控苎麻开花, 减少或消除生殖生长, 为生产中提供不开花苎麻品种 前期研究发现苎麻性别与乙烯释放速率有密切关系, 而乙烯抑制剂能够抑制苎麻雌花形成 为了进一步研究苎 麻的性别是否由乙烯释放速率的高低来调节, 从 ACC 氧化酶入手, 利用分子生物学手段来研究乙烯调控的分子机制及其作用机理 ACC 氧化酶是乙烯合成途径中的最后一个酶, 直接催化 ACC 合成乙烯 ACC 氧化酶由多基因家族编码, 家族中不同成员调控植物不同的生长发育过程 大量研究表明,ACO 基因家族特异表达, 不论是在植物营养器官生长发育过程, 还是在果实成熟和花器官发育过程, 对乙烯生物合成调节都非常重要 [20]
期薛丽君等 : 苎麻 ACC 氧化酶基因 (BnACO) 的克隆及表达 2383 番茄 4 个 LeACO 在花发育过程中表达, 而且每个基因在时空上都具有不同的累积方式,LeACO 主要在花瓣 柱头 花柱中表达,LeACO2 主要在心皮相关组织表达,LeACO3 除了萼片外, 在所有花器官中都有表达 [5] 牵牛花中 PHACO 在衰老花冠中表达, PHACO3 和 PHACO4 在发育的雌蕊柱头中特异性表达 [2] 在桑树雌花中, 桑树 ACO 基因在子房表达量较低, 在花柱的表达量高于子房, 授粉后在子房和花柱的表达量都升高, 花柱升高尤为明显 [3] 本研究中,BnACO 在苎麻根 茎 茎尖 叶片 雌花 雄花中均有不同程度的表达, 其中在雄花中表达最高, 推测该基因可能在苎麻性别分化中起到一定的调控作用 苎麻属于雌雄异花同株, 植株上部发育雌花, 下部发育雄花 雄花含有退化雌蕊, 即雄花中雌蕊珠心原始体并不伴随雄花发育继续分化, 而是在发育过程中逐渐萎缩消失 [22] BnACO 在雄花中超量表达是否与雌蕊程序性死亡有关需要进一步验证 ABA 能够促进脱落, 对细胞分裂与伸长起抑制作用, 促进休眠, 影响气孔关闭 本研究中, 在 ABA 胁迫处理下,BnACO 在茎和茎尖中诱导表达 [8] 上调, 在叶片中诱导表达下调 ; 郭春芳等研究外源 ABA 胁迫下斑茅叶片 ACO 基因表达中发现, 在 ABA 处理下,ACO 基因在 3 h 微弱上调表达, 而 6 h 时明显抑制, 其后表达趋向平缓, 说明 ACO 基因表达不依赖于 ABA 本研究中, 苎麻叶片经 ABA 处理后 BnACO 表达下调, 说明 ABA 不能诱导苎麻叶片 ACO 基因表达量增加, 反而在一定程度上抑制了其表达 在干旱胁迫处理下,BnACO 在茎和叶片中诱导表达下调, 在茎尖中诱导表达上调 在叶中表达敏感, 可能与叶片感知干旱胁迫比较敏感的生理基础有关, 在后期叶片中表达量很高, 其表达量的增加对抵御干旱胁迫具有积极的响应 在高盐胁迫处理下,BnACO 在茎 茎尖和叶片中诱导表达均上调 ACO 基因表达调控着细胞内乙烯产生, 并与植物耐受胁迫条件的能力紧密相关 例如, 在烟草中, 盐处理能显著增加 NtACO NtACO2 [23] 和 NtACO3 表达 ; 在拟南芥中, 过量表达棉花 [24] GhACO2 可以增强其耐盐性 在 NaCl 胁迫处理拟南芥的比较转录谱研究中发现 个 ACO 基因上调表达 [7] 而本研究中 NaCl 胁迫也是显著诱导表达了苎麻茎 茎尖 叶片中的 BnACO 在基因工程上, 有人利用反义 RNA 或 RNAi 技术把植物 ACC 氧化酶的基因片段导入优良品种中, 可以在一定程度上抑制或干扰其内源 ACO 基因表达, 从而抑制乙烯生物合成, 进而抑制果实成熟 叶片和花瓣衰老与脱落 [25-26] 利用 ACC 氧化酶基因反义 RNA 技术抑制了康乃馨乙烯释放, 从而延缓了花瓣衰老 [27] 在前期研究中已经发现了苎麻全雌株, 如果后续试验证实苎麻性别由乙烯释放率影响, 那么就可以利用 RNAi 技术将 ACC 氧化酶基因导入其中, 使该基因的作用受到部分抑制或完全抑制, 从而抑制乙烯合成, 调控苎麻开花, 减少或抑制消除生长, 为育种家提供不开花的苎麻材料和品种 4 结论 从苎麻中克隆到 BnACO 全长 cdna 序列 476, 与其它物种 ACO 基因高度同源, 且该基因具备典型的 ACO 基因家族结构特征, 是 ACO 家族成员之一 参与 ABA 干旱 NaCl 胁迫应答, 在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式 References [] 王爱勤, 王自章, 杨丽涛, 韦宇拓, 李杨瑞. 乙烯生物合成途径中的两个关键酶基因的研究进展. 广西农业生物科学, 2004, 23(2): 64-69. Wang A Q, Wang Z Z, Yang L T, Wei Y T, Li Y R. Research progress of two key enzyme genes on the ethylene biosynthesis. Journal of Guangxi Agricultural and Biological Science, 2004, 23(2): 64-69. (in Chinese) [2] 王佳, 方俊, 易文凯, 田云, 卢向阳. 水稻体内的乙烯信号传导途径. 亚热带植物科学, 20, 40(2): -7. Wang J. Fang J, Yi W K, Tian Y, Lu X Y. A review of ethylene signal transduction pathway in rice. Subtropical Plant Science, 20, 40(2): -7. (in Chinese) [3] Jafari Z, Haddad R, Hosseini R, Garoosi G. Cloning, identification and expression analysis of ACC oxidase gene involved in ethylene production pathway. Molecular Biology Reports, 203, 40: 34-350. [4] Shi H Y, Zhang Y X. Pear ACO genes encoding putative -aminocyclopropane--carboxylate oxidase homologs are functionally expressed during fruit ripening and involved in response to salicylic acid. Molecular Biology Reports, 202, 39(0): 9509-959. [5] Lin Z, Zhong S, Grierson D. Recent advances in ethylene research.
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