89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 论著 溶菌酶与.12* 二钠的协同抑菌作用 李小曼 王晓燕 高学军 北京大学口腔医学院 口腔医院牙体牙髓科 北京 摘 要 目的 研究溶菌酶与乙二胺四乙酸二钠 /*" )"))++)+!' %!)*05 二钠 对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用 方法 分别培养粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌 并调整菌液浓度至 菌落形成单位 +'*'"-'"%".,: ; 配制终浓度为 和 ; 的单纯溶菌酶抑菌液 以及添加浓度为 ; 的 05 二钠的混合抑菌液 将菌液与抑菌液作用 " 加入水溶性四唑盐 )!'*%*)'*%3$5 工作液染色 酶标仪测定光密度值 计算细菌活性 结果 单纯溶菌酶抑菌液 浓度 < ; 对两种细菌的抑菌作用随溶菌酶浓度的升高而增强 且对粪肠球菌的抑菌作用更显著 05 二钠与溶菌酶有协同抑菌作用 与溶菌酶浓度相关 溶菌酶浓度为 < ; 时 05 二钠协同溶菌酶作用于粪肠球菌 可使其抑菌作用提高约 < 倍 溶菌酶浓度为 < ; 时 05 二钠协同溶菌酶作用于牙髓卟啉单胞菌 可使其抑菌作用提高约 < 倍 当溶菌酶浓度大于 ; 时 加入 05 二钠对细菌均没有明显的协同抑菌作用 E 结论 对于粪肠球菌及牙髓卟啉单胞菌 在溶菌酶较低浓度时 05 二钠有协同抑菌作用 在溶菌酶较高浓度时 05 二钠无协同抑菌作用 关键词 胞壁质酶 依地酸 药物协同作用 抗菌药 中图分类号 文献标志码 文章编号!" '!#$&!!&$$8!.12*9" '"'"&!#""& ;6)')" 3()')" 9%%" 0&)"'-.)'*')" "''"'*' 12 ":"!$+/''*)" '!& )*'-$')'*' 4"./ ") *2+*203!&! 5')*%)/!"!+)")+)*-+!'-*!'/ /*" ) "))++)+!' %!)*05() '" + #+$# )" %&! " " #$" " #)!$ +$#)" $" " #+%*% )" )%! '.,:;5/" )" ;'-*!'&&) / '" ) )" /*!'!'*%'"!= / ;'-05()!&+*5/)+))" *!'!'/ /'%05() ")+ -' " /" )!'*%* )'*%3$5 '2 "!'*%'" )!) )" /)+'-/)+))!+)*+%*) )!%"'&+)*"!!)# ")" "/ +'&*)!&+'&/''+!$$ ) "/ &%*!'-' ;' ; '+$#)" $" " # "/ /" / +'"+")'" '-*!')!/ /!&+)*-'+$#5/)!!"!+-+'-*!' / 05()'" )")+)*)+ / +/ )!*) '/+'"+")'" '-*!'9" +$ # /)")+)*)+'-*!'/ 05())!? -'*!/)" /&%*!' /" /+'"+")'" '-*!')!? ; )" '" $" " # /)")+ )*)+'-*!'/ 05())!? -'*!/)" /&%*!' /" /+'"+")'" '-*!')!? ; 3/" /+'"+")'" '-*!')! / //)" ; 05() "'!/'!"!+-+'" /)")+)*)+E '&$','+$#)" $" " # )*' +'"+")'" '-*!'/ 05()!/'!" -+)"!"!+)")+)*)+ / *)/ / +'"+")'" '-*!'/ 05 () "' -.,/0+1 %))! +)+ 0%!"! ")+)*)"! 根管冲洗是根管预备过程中的重要环节 目前临床常用的次氯酸钠与乙二胺四乙酸二钠 / *" )"))++)+!' %!)*05 二钠 冲洗剂存在刺激性大 易对牙本质造成损伤等不 足? 因此需要寻找更为理想的根管冲洗剂 天然抑菌剂来源于自然界 具有生物相容性高等独特 基金项目 国家自然科学基金 资助 $%&&' /()'")*()%)*$+"+,'%")'" '-./ ").'!&'" ")%/'!)* )"=)')"&2%!%%+" 网络出版时间 # 网络出版地址 / & +"2 "2+!)*#/*
李小曼 等 溶菌酶与 05 二钠的协同抑菌作用 优势 开发利用新型天然抗菌剂是当前抗菌药物研 # 发的热点? 溶菌酶 *!';@ 又名胞壁质酶或 ( 乙酰胞壁质聚糖水解酶 是目前应用最为广泛的天然抑菌剂之一 溶菌酶作为一种抑菌免疫蛋白 存在于人的鼻黏液 泪液 唾液 乳汁及部分细菌和噬菌体中 溶菌酶化学性质稳定 对热也极为稳定 在 & < 的溶液中 溶菌酶结构几乎不变 且在 & < 范围内其活性最强 在 < 范围内随着作用温度的升高 酶的活性增强 () 对 其活性有轻微激活作用? 溶菌酶主要通过水解细菌肽聚糖主链上的 # 糖苷键抑制细菌 革兰氏阳性菌细胞壁外层为肽聚糖层 因此溶菌酶对大多数革兰氏阳性菌都有较好的抑菌效果 革兰氏阴性菌的肽聚糖层位于细胞内壁层 其外层覆盖着大量的脂多糖 因此溶菌酶对大多数革兰氏阴性菌的抑菌效果并不理想 近年来研究发现 可以通过加入细胞膜干扰剂 如 05 乳铁蛋白 乳酸等 与细胞表面的脂多糖之间盐桥二价阳离子螯合 使细菌的细胞膜失去稳定 性? 从而调节部分细菌对溶菌酶的耐受性 本研究选取难治性根尖周炎中最常检出的革兰氏阳性菌粪肠球菌 + # 和革兰氏阴性菌牙髓卟啉单胞菌 %&! " " # 作为实验菌株 配制不同浓度的溶菌酶和 05 二钠混合抑菌液 观察 05 二钠与溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用 材料与方法 菌种与试剂实验菌种与试剂包括 粪肠球菌 5.. 首都医科大学口腔医学院赠送 牙髓卟啉单胞菌 5..# 北京中原公司 蛋清溶菌酶 高铁血红素 维生素 美国 $ ) 公司 05 二钠 美国!+' 公司 脑心浸液培养基 )" /) "-%!'"46 美国 40 公司 胰蛋白胨大豆肉汤培养液 &+!''/5$4 琼脂 酵母提取物 英国 9=' 公司 新鲜羊血 中国北京动物饲养场 微生物活性检测试剂盒 3$5# 日本同仁公司 抑菌药液配制用去离子水配制终浓度分别为 和 ; 的单纯溶菌酶抑菌液 采用析因设计配制混合抑菌液 用去离子水配制溶菌酶终浓度分别为 ; 共 个水平 与 05 二钠终浓度分别为 ; 共 # 个水平 的 种混合抑菌液 过滤除菌 封口待用 细菌复苏及培养 粪肠球菌的复苏及培养 取冻存的粪肠球菌菌株 蘸取菌液划线接种于含 ;46 和 ; 琼脂的培养皿中 孵育 # / 后 挑取乳白色单克隆菌落置于 46 浓度为 ; 培养液中扩增传代 进行抑菌实验前 调整稀释菌液浓度至.,:;.,:+'*'"-'"%" 菌落形成单位 牙髓卟啉单胞菌的复苏及培养 取冻存的牙髓卟啉单胞菌菌株 加入含 ;5$4 ; 酵母提取物 ; 维生素 和 ; 氯化血红素的培养液中 使菌株溶解并涂布于血平皿 含 ; 5$4 ; 酵母提取物 ; 琼脂 ;; 羊血 ; 维生素 和 ; 氯化血红素 上 使用厌氧产气系统 英国 0'" 3/ *$+"+ 公司 制造厌氧环境 孵育 # / 后 挑取黑色单克隆菌落置于 5$4 培养液中扩增传代 进行抑菌实验前 调整稀释菌液浓度至.,:; 水溶性四唑盐染色法测定抑菌作用取 ; 抑菌液与 ; 菌液 在 孔板中混合并于培养箱内作用 " 分别配制革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌水溶性四唑盐 )!'*%* )'*%3$5 工作液 并各孔加入 ; 进行染色 培养箱内作用 # " 酶标仪 *= 美国 4' 52 公司 测定各样本 # " 检测波长 及 " 参比波长 处的光密度值 * 同时将 ; 去离子水与 ; 菌液混合 作为阴性对照组 加入 3$5 工作液测定 * 值 每组抑菌液均重复 次 细菌活性 ) * F* = * 其中 * = 为实验组 * # "?* " * 为阴性对照组 * # "? * " 数据处理与统计所有数据的统计分析由 $1$$ 软件完成 采用双因素多水平析因设计资料的方差分析对溶菌酶和 05 二钠的交互作用进行统计分析 并使用单因素方差分析 9")(9 5%2 检测方法进行多组间两两比较 为差异有统计学意义 结果 单纯溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用单纯溶菌酶抑菌液浓度在 < ; 时 对
# 89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 两种细菌的抑菌作用随溶菌酶浓度的升高而增强 同一浓度溶菌酶对粪肠球菌的抑菌作用显著高于牙髓卟啉单胞菌 当溶菌酶浓度大于 ; 时 达到对粪肠球菌的最大抑菌能力 当溶菌酶浓度小于 ; 时 对牙髓卟啉单胞菌几乎无抑菌能力 图 图 单纯溶菌酶溶液对两种细菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-&%*!'!'*%'" ' +$#)" $" " # 不同配比混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用同浓度配比溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用见图 双因素多水平析因设计资料的方差分析结果显示 05 二钠与溶菌酶存在交互作用 05 二钠与溶菌酶交互项 F # 进一步固定溶菌酶浓度水平 运用单因素方差分析得出 05 二钠可促进溶菌酶抑制粪肠球菌 且与溶菌酶浓度相关 溶菌酶浓度为 < ; 时 加入 05 二钠对粪肠球菌有协同抑制作用 可使其抑菌作用提高约 < 倍 当溶菌酶浓度大于 ; 时 加入 05 二钠没有明显的协同抑制作用 E ;05 二钠与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在各组中差异均没有统计学意义 E 但与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在溶菌酶 < ; 各组中差异均有统计学意义 $ ;05'%& K $ ;05'%& 图 混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-*!')" 05()!'*%'" '+$# 不同配比浓度药液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用不同浓度配比溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用见图 双因素多水平析因设计资料的方差分析结果显示 05 二钠与溶菌酶存在交互作用 05 二钠与溶菌酶交互项 F 进一步固定溶菌酶浓度水平 运用单因素方差分析得出 05 二钠可促进溶菌酶抑制牙髓卟啉单胞菌 且与溶菌酶浓度相关 溶菌酶浓度为 < ; 时 加入 05 二钠可对牙髓卟啉单胞菌起到协同抑制作用 可使其抑菌作用提高约 < 倍 当溶菌酶浓度大于 ; 时 加入 05 二钠没有明显的协同抑 制作用 E ;05 二钠与 ; 05 二钠所产生的协同抑菌作用在各组中差异均无统计学意义 E 但与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在溶菌酶 ; 组中差异有统计学意义 讨论 本研究选用了生物相容性好 易分解 对组织无刺激的天然抑菌剂溶菌酶 探讨其对于根管内粪肠球菌 革兰氏阳性菌 以及牙髓卟啉单胞菌 革兰氏阴性菌 的抑菌作用 结果表明 单纯溶菌酶抑菌液在一定浓度范围内 < ; 均可抑制两种细菌的生长 并且随着溶菌酶浓度增高 其抑菌作用
李小曼 等 溶菌酶与 05 二钠的协同抑菌作用 增强 相同浓度溶菌酶对于粪肠球菌的抑菌作用更加明显 溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌作用效果的差异与两类细菌菌壁构造差异有关 粪肠球菌作为革兰氏阳性菌 其细胞壁外层含有 # 层肽聚糖层 因此溶菌酶对其有较好的抑菌效果 而牙髓卟 啉单胞菌作为革兰氏阴性菌 其肽聚糖层位于细胞内壁层 其外层覆盖着大量的不对称双分子层 脂多糖 使得溶菌酶难以作用于肽聚糖层 而且存在部分肽聚糖层的修饰 因此溶菌酶对其抑菌效果不理想 # $ ;05'%& K $ ;05'%& 图 混合抑菌液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-*!')" 05()!'*%'" '$" " # 对于提高溶菌酶抑菌能力的研究表明 可通过改变溶菌酶的构象 如对酶干热变性处理 利用还原剂还原二硫键 将酶水解成小分子多肽段等方法使处理后的溶菌酶易于穿透细胞壁进入细胞而发挥抑菌活性 运用超高压匀质等物理方法处理细胞 使细胞形态发生变化 减小外膜阻碍力 便于溶菌酶进入肽聚糖层 添加其他化学物质与溶菌酶协同作用 提高溶菌酶的抑菌活性 如 05 二钠 乳铁 蛋白等? 本研究还探讨了不同配比浓度的溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对于两种细菌的抑制作用 结果表明 在溶菌酶浓度较低时添加 05 二钠可显著增强溶菌酶的抑菌能力 其他研究已证实 05 二钠通过螯合作用可去除细胞膜表面的阳离子 如.) () 等 从而影响膜表面酶的活性激活及膜局部的完整性 破坏细胞膜的结构和功能 利于溶菌酶的渗入 尤其对于革兰氏阴性菌来说 05 二钠还可以溶出细胞表面的一部分脂多糖片段 促进磷脂迁移到外膜的外层 磷脂取代丢失的脂多糖 磷脂的失去进一步导致脂质从质膜转运以补 充磷脂 从而使细胞膜变得不稳定? 本研究结果还显示 在溶菌酶浓度较高时 添加 05 二钠并不能够起到协同增强溶菌酶的抑菌作用 可能是因为 一方面高浓度溶菌酶已具有较强的抑菌能力 05 二钠的协同作用不明显 另一方面 05 二 钠的螯合作用需要适宜的离子 质子强度及匹配的结合位点与电化学构象等 较高浓度的溶菌酶一定程度上不利于 05 二钠与细胞膜充分地接触和作用 从而削弱了其协同抑菌能力 本研究结果显示 05 二钠协同溶菌酶作用于革兰氏阳性菌粪肠球菌 可使其抑菌作用提高 < 倍 尤其是当溶菌酶浓度较低时 其他学者也证实溶菌酶 05 二钠对李斯特菌,! &' 粪肠球菌 魏斯氏菌 -# " 有明显的协同抑菌作用 本实验观察了溶菌酶 05 二钠对革兰氏阴性菌牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用 研究结果表明 溶菌酶浓度较低时 05 对牙髓卟啉单胞菌的协同抑制作用最高可增强约 < 倍 但总体抑菌作用较弱 仅可抑制约 7 <#7 的细菌生长 对于革兰氏阴性菌 已有研究表明溶菌酶 05 二钠的协同抑菌作 用与菌种和培养条件有关? 另外 有学者报告溶菌酶 05 二钠在营养丰富条件下 对乳酸杆菌,# 李斯特菌 金黄色葡萄球菌.%&# 等革兰氏阳性菌无协同作用 各学者所得结论的差异可能与不同细菌细胞外膜或脂多糖层结构及修饰程度不同有关 也可能与实验时选用的细菌所处生长状态不同存在一定关系 综上所述 本研究结果表明 对于粪肠球菌及牙
89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 髓卟啉单胞菌 溶菌酶浓度较高时的抑菌作用较强 05 二钠无显著的协同抑菌作用 溶菌酶浓度较低时 05 二钠有显著的协同抑菌作用 但对牙髓卟啉单胞菌的总体抑菌作用较弱 对粪肠球菌的总体抑菌作用较强 参考文献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尹金凤 史锋 王小元 蛋清溶菌酶与渗透剂对大肠杆菌的协同抑菌作用 8 食品科学? ' "'"+), 6!)* )* /*" )" ))+))" *!' &'!)"+' )*)+!'-'' )"!-" ))"!+%% #9 81'%*$+ #?## # 收稿 本文编辑 赵 波