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1. 輔助調整過敏體質功能 2. 免疫調節功能 3. 不易形成體脂肪功能 4. 調節血脂功能 5. 輔助調節血壓功能 6. 調節血糖功能 7. 牙齒保健功能 8. 胃腸功能改善 9. 改善骨質疏鬆 10. 延緩衰老功能 11. 促進鐵吸收 12. 抗疲勞功能 13. 護肝功能 14. 健康食品安全性評估 2
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牙齒保健食品, 其功能係以能降低齲齒之發生率或牙菌斑形成現象 但不應有明顯化學刺激而直接會造成口腔黏膜或牙齒之傷害, 或過於堅硬而易造成牙齒磨耗 破折或牙周傷害之情形 5
齲齒是屬於多因子所造成的疾病 (multifactorial disease) 其發生應考慮牙齒組成元素 形態 位置 涎液組成成份 酸鹼值 分泌量 粘度 抗菌因子 飲食中的碳水化合物含量 氟化物 維生素以及其物理性質 6
由於目前引發動物齲齒技術的成熟及一致化, 對食品降低齲齒發生率方面之評估, 應有相當高的精確度 排除流行病學上多重因子所造成的干擾, 並且可以減少大量的費用, 以及實驗執行及結果判斷上的困難 7
以檢測人體牙菌斑之三種變化 : 1. 酸鹼值 2. 堆積量 3. Streptococcus mutans 數量 來評估食品之牙齒保健功能 8
降低口腔內細菌的數量, 可減少齲齒及細菌造成的牙周病之發生率 而會影響到牙齒保健的細菌, 皆是以牙菌斑 (plaque) 形式存在 牙菌斑是一層附著在口腔內牙齒表面上的一層膜, 外表變化可以從透明的外觀到白色堆積物 ( 的外表變化 ) 牙菌斑內的細菌包括有各種球菌, 桿菌及纖毛菌, 其中最容易引發齲齒或導致牙周發炎的主要牙菌斑細菌有 Streptococcus utans, Streptococcus sanguis, Actinomyces viscosus 及 Porphyromonas gingivalis. 牙菌斑可由人體直接取樣 觀察 分析, 其實驗之方法及結果之判斷已有公認之一致性步驟 9
( 一 ) 原理 : 利用會在動物引發齲齒之細菌和蔗糖來引發齲齒, 而用來評估測試食品之抗齲效果 10
1. 分設實驗組及對照組, 每組各 40 隻大鼠 2. 二組之飲水中, 皆添加 5% 蔗糖, 採用自由餵食 3. 二組之實驗鼠, 皆應接種細菌, 使用 Streptococcussobrinus6715(10 8 cell/ml) 之菌株, 可於口腔塗拭或或添入於飲用之糖水中 4. 接種二天後, 使用口腔棉花擦拭法 (oral swab method) 採得檢體, 並用含 200μg/mlstreptomycinsulfate 之 Mitis Salivarius Agar 培養, 檢視是否接種成功 接種成功後, 實驗組投予混合有測試食品之飼料, 而對照組仍給與大鼠飼料 LabChow500l. 5. 測試食品餵飼 20 日後, 各犧牲第一批五隻, 以後每隔 20 日犧牲一批 6. 大鼠犧牲後, 牙齒採用 Keyes caries score 方式記錄, 並比較二組之差異 11
7. Keyes caries score 之記錄, 應採用 Keyes caries scors card 之方式 8. 大鼠犧牲後, 應將上下顎骨切下, 清除周圍軟組織, 並將之乾燥, 使牙齒部位便於觀察及操作 9. 觀察臼齒之頰側 舌側 咬合面 鄰接面及牙溝之齲齒變化 10. 觀察牙溝時, 應用環狀鋸將臼齒近遠心縱切 11. 齲齒之嚴重程度,E 為 1,DS 為 2,DM 為 3,DX 為 4 E 為齲齒之部位只限於牙釉質 DS 侵犯至牙釉牙本質交界處 DM 侵犯至牙本質 DX 牙本質嚴重破壞 12. 經統計其數值後, 再比較實驗組及對照組之差異, 如果實驗組之數值較對照組為低, 經 Student's T-test 統計, 若 P<0.05 時, 該測試食品有抗齲效果 12
1. 為避免遭 Streptococcusmutans 污染, 應採用 specified pathogen-free 之大鼠 2. 飼料及飲水應經消毒 3. 為便於齲齒部位之觀察, 可將顎骨浸泡於 Kernechtrot B salt 飽和溶液 (Nuclear fast red) 中 6 小時 4. 如果使用接種之菌種為一般 Streptococcus mutans 菌種, 應在實驗中證明未遭致其他菌種之污染 5. 大鼠可採用任何品種之出生四週後之大鼠 13
可選動物抗齲齒實驗或人體牙菌斑檢驗之其中一項評估食品之牙齒保健功能 凡動物抗齲齒實驗有正向意義或人體牙菌斑檢驗之三項檢測中有兩種檢測結果為正向即可評估為具有牙齒保健功能之食品 14
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賜多利奶粉雙歧桿菌奧利多碳酸飲料味全優酪乳豐力富鈣低脂奶粉複合益生菌優沛蕾低脂原味活性醱酵乳優沛蕾 ABC 三益菌光泉晶球優酪乳桂格成長奶粉健康三益菌配方金車乳酸活菌康貝兒乳酸菌桂格高鈣脫脂奶粉養樂多活菌發酵乳 林鳳營優酪乳桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉法舶纖維飲料 TCELL-1 乳酸菌粉暢樂有益菌顆粒威望常寶寧 LGG 優酪乳田中寶養生液如新華茂益生菌配方賜多利奶粉凝態活性發酵乳雅芳康采乳酸菌台糖果寡醣桂格成長奶粉健康三益菌配方 16
消化器官的主要功能是使食物消化, 營養素吸收及排便 消化最主要是經由消化酵素的作用, 自律神經的調節及體液性的調節 ( 消化管荷爾蒙等 ) 等系統來控制 因此, 除了病原菌的侵襲外, 各種飲食內容的改變及精神壓力或過敏都會引起胃腸道的不適, 影響食物的消化及營養素的吸收 17
人類的腸道中棲息了約數百種細菌, 這些正常菌相的存在, 除了可抑制有害病菌在腸內孳生及危害外, 且可產生人體所需的物質, 如維生素 B 及 K 等 在人體正常菌相中, 包含了有益菌與有害菌, 有益菌產生的代謝產物 ( 如乳酸與醋酸 ) 可抑制有害菌的增殖, 對健康的維持與整腸方面有相當的幫助 一般健康人體腸道中有害細菌 ( 如產氣莢膜梭菌 Clostridium perfringens) 含量不高, 無法危害人體, 然而身體的不適, 飲食及環境的變化 精神壓力 老化等都可能使有害菌增加, 造成腸內菌相平衡的崩解, 進而引起便祕 下痢 18
若食品具有 (1) 促進消化吸收 (2) 改善腸內細菌菌相 (3) 促進胃腸蠕動, 幫助維持腸道正常機能等 三種功能中任一種功能時, 可認為具有改善胃腸道功能 19
一 改善胃腸功能必須明確具有以下四種功能指標之ㄧ : 1. 促進消化吸收 2. 改善腸內細菌菌相 3. 幫助 ( 改善 ) 胃腸運動 4. 有助於胃黏膜之保護作用 20
二 所進行的實驗可分為動物實驗與人體實驗, 兩者可擇一施行 三 若廠商所提產品的相關科學研究證據不明確或不足時, 須同時進行 人體實驗 和 動物實驗, 以加強證據之可信度 四 動物實驗進行時間至少需 4 星期以上, 人體實驗至少需進行 2 星期以上 五 所使用的實驗動物以哺乳類動物為原則 動物隻數每組至少為 8 隻, 小白鼠隻數每組至少為 10 隻 21
六 實驗動物必須來自各大實驗動物中心 七 人體實驗每組人數至少為 8 人, 且必須有控制組 八 人體實驗必須由大學食品 營養 醫藥等相關系所 研究機構 醫學中心執行, 需有醫師參與, 並遵循衛生單位對人體實驗有關之相關規定 九 動物實驗進行時, 飼料的內容與比例必須符合 AIN (American Institute of Nutrition) 之規範, 進行人體實驗的飲食內容與比例必須符合衛生署所公佈之飲食指南 十 評估對胃腸道功能所採用的實驗方法, 必須是學術界或醫學單位所採用或普遍認可之方法, 亦可使用市售的生化試劑 (Test Kit) 直接測定之 22
動物實驗 1. 動物體重的測定及消化吸收率的測定 2. 消化酵素活性的測定 : 如 trypsin, chymotrypsin, amylase, lipase, leucine amino peptidase, disaccharidase 結果判定 : 動物實驗中必須至少一項指標為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) 23
樣品製備 : 截取實驗老鼠 (Sprague-Dawley 或 Wistar 品系 ) 小腸片段, 刮下腸黏膜 ( 脂解酵素活性測定不必刮下腸黏膜 ), 取 0.2 g 加入 2 ml 含 protease 抑制劑 (1 μm phenylmethylsulfonylfluoride 及 2.2 mm iodoacetic acid) 之 4 0.9% NaCl 溶液, 以均質機均質化 24
(1) 雙醣酵素 (disaccharidase) 活性測定目的 : 測定小腸雙醣類消化酵素 ( 乳糖酵素 麥芽糖酵素與蔗糖酵素 ) 活性 測定方法 : 1. 取 30 μl 的腸黏膜均質液加入 15 μl 的 56 mm 雙醣溶液 ( 乳糖 麥芽糖或蔗糖 ) 於 37 下作用 30 分鐘, 再加入 100 μl 的 0.6 N NaOH 溶液溶解細胞, 另以 10 μl 的 6 N HCl 溶液中和之 2. 取 45 μl 處理過後之腸黏膜液或葡萄糖標準液 (0-40 mg/ml) 與 625 μl 反應緩衝液 (50 mm Tris-malate 33 mm sodium potassium phosphate 與 30 mm MgCl2,pH 6.8) 150 μl 的 1 mm ATP 150 μl 的 1 mm NADP 15 μl 的 330 IU/mL hexokinase (EC 2.7.1.11) 與 15 μl 的 170 IU/mL glucose-6- phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) 3. 37 下作用 30 分鐘 4. 將樣品置於冰浴上以終止其反應 5. 葡萄糖產物含量則以分光光度計於 340 nm 波長下測定減少的 NADPH 6. 以改良的 Lowry 方法測定樣品中蛋白質含量 7. 而雙醣酵素活性以 μm 葡萄糖 / 分鐘 /μg 蛋白質表示之 25
(2) 脂解酵素 (lipase) 活性測定目的 : 測定小腸內脂質消化酵素活性測定方法:用市售試劑組 (Sigma Lipase-PS ) 測定之 1. 將 900 μl 受質溶液 (1.1 mm 1,2-diglyceride 2 mm sodium N- ethyl-n-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine 0.66 mm ATP 860 U/L monoglyceride lipase 1340 U/L glycerol kinase 40,000 U/L glycerol-3-phosphate oxidase 1340 U/L horseradish peroxidase 40,000 U/L co-lipase 與緩衝液 ) 加至 15 μl 之腸均質液或標準液 ( 附於試劑組 ) 中 2. 於 37 下作用 3-5 分鐘 3. 再加入 300 μl 活化劑 (36 mm deoxycholate 6 mm 4- aminoantipyrine 0.05% sodium azide 與緩衝液 ) 4. 於 37 下作用 3 分鐘後 5. 以分光光度計於 550 nm 波長下測定 2 分鐘 6. 並以改良的 Lowry 方法測定樣品中蛋白質含量 7. 而脂解酵素活性以 unit/μg 蛋白質表示之 26
(3) 白胺酸胺基酵素 (leucine aminopeptidase,lap) 活性測定目的 : 測定小腸絨毛刷狀緣膜上蛋白質消化酵素活性 測定方法:用市售試劑組 (Sigma Diagnostics LAP) 測定之 1. 取 0.5 ml 腸黏膜均質液, 混合 0.5 ml LAP 受質溶液 (20 mg/dl L-leucyl-βnaphthylamine 溶於 phosphate 緩衝液,pH 7.1) 2. 於 37 下作用 1 小時 3. 再加入 0.5 ml 的 2 N HCl,1.5 ml 處理過後之腸黏膜液或 1.5 ml 標準液 (0-12 Sigma unit/ml) 與 0.5 ml sodium nitrite 溶液 4. 於室溫下作用 3 分鐘後 5. 混合 1.0 ml 0.5% (w/v) ammonium sulfamate 6. 於室溫下作用 3 分鐘 7. 加入 2.0 ml N-1-naphthylethylenediamine 酒精溶液 8. 室溫下作用 45 分鐘後 9. 以分光光度計於 580 nm 波長下測定吸光值 10. 並以改良的 Lowry 方法測定樣品中蛋白質含量 11. 白胺酸胺基之酵素活性以 Sigma unit/μg 蛋白質表示之 12. 1 Sigma unit 定義為於 37oC ph 7.1 下, 每 1 小時生成 1 μmole β-naphthylamine 的酵素量 27
(1)Lundh 測試 ( 主要為胰臟功能 ): 使用 300 ml 之流質食物 ( 含 6% 脂肪 5% 蛋白質及 15% 醣類 ), 並放置十二指腸管, 依時段抽取十二指腸液, 以測定消化酵素之濃度 ( 如 Trypsin) 或以內視鏡抽取胰液作消化酵素之分析 (2)Schilling 測試 ( 主要為胃腸功能 ) - 以維生素 B12 之吸收來測定胃腸功能 - 以放射性標示之維他命 B12 給予空腹之受試者 - 一小時後再由肌肉注射未標示 B12-24 小時後收集尿液, 並測定 B12 含量 -7 天後重複此步驟, 但口服 B12 則加入 Intrinsic factor - 兩次檢查加以比較評估 (3) 脂肪之吸收判定 : 糞便脂肪分析 : - 正常值 :< 7g/day - 每日食用食物中至少有 100 g 中鏈三酸甘油酯共三天 ; 並收集糞便 3 天 - 測定糞便中脂肪含量 - 使用 Sudan stain, 只可測三酸甘油酯及 lipalytic product 28
(4)D-xylose 耐受測試 ( 主要為小腸功能 ): - 主要測定近端小腸之醣類吸收 - 隔夜禁食, 再服用 25g 之 D-xylose,5 小時後之尿液中若 xylose 排出大於 25%, 即表示正常 -1 及 2 小時抽血, 若其中一次大人血中 xylose>300 mg/l, 或小孩血中 xylose >100 mg/l, 則表示正常 (5) 核子醫學檢查目前只使用於 gastric emptying study - 受試者服下含有放射源 (Tc-99m and In-111) 的固體及液體食物 - 測量受試者 90 分後的胃排空率 (6) 放射線科檢查小腸排空速度檢測 - 受試者喝下 600 cc barium 後, 隔 15 分透視一次, 直到 barium 完全排出 ileocecal valve 29
動物實驗 : 1. 檢測 1 種益生菌 :Bifidobacterium 2. 檢測 1 種有害 ( 或無益 ) 菌 :Clostridium perfringens 測定方法 : 腸內細菌菌相 材料 : 大白鼠, 雄性 Spraguae Dawley(SD) 或 Wistar 系統大白鼠之盲腸或糞便 取樣及均質 : 1. 以按摩方式收集糞便於密閉容器內 ( 維持厭氧狀態 ), 再於厭氧操作箱內秤取約 0.5 g, 加入含 4.5 ml 無菌厭氧稀釋液 ( 附註 ) 之試管中 ( 內含 5 粒玻璃珠 ), 以試管震盪器混合 2. 大白鼠經餵養試驗後, 麻醉, 解剖, 在厭氧狀況取出盲腸 (cecum) 內容物, 秤取約 1 g, 加入含 9 ml 無菌厭氧稀釋液之試管中 ( 內含 5 粒玻璃珠 ), 以試管震盪器混合 30
稀釋及微生物平板分析 : 於厭氧狀況下, 上述均質液以厭氧稀釋液進行一系列十倍稀釋 取適當稀釋倍數, 以表面塗抹法 (spread plate method) 或混稀平板法 (pour plate method) 加入雙叉桿菌培養基中, 置於厭氧操作箱或厭氧缸中 ( 內含厭氧包, 或抽氣維持厭氧狀態 ), 於 35~37oC 培養, 計數菌落數 結果判定 : 若盲腸或糞便的 bifidobacteria 明顯增加, 以及 Clostridium perfringens 減少或無明顯變化者, 則稱之具改善腸內細菌相功能 31
1. 胃腸運動 ( 活性碳 腸鋇計檢查或核子醫學檢查 ) 2. 胃黏膜保護 3. 觀察糞便之乾重 粒數 水分及形狀 檢查方法 : 胃腸運動測定 離體實驗 : 擷取絕食老鼠之胃或腸片段約 1-2cm, 放於組織浴 (organ bath) 中並通氣之 (95%O2,5%CO2), 放置 2hr 使其穩定而後做等長收縮 (0.5-1 gm), 視測試食品對於胃或腸片段之收縮情況, 若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05), 即可判定, 即可判定測試食品具有改善胃腸運動之功能 活體實驗 : 動物配置的灌胃溶液灌食 ( 含有 10% 活性碳及測試物 ) 而後追蹤計算排空率, 活性碳則以黑色易觀察之特性作為胃腸排空之另一指標 30 分鐘後, 大白鼠去頭犧牲, 隨後剪開腹腔以線綁住賁門處, 將胃 小腸完整取出, 計算胃腸排空率, 方法如下 : charcoal marker Charcoal Transit = 100% Intestinal length 32
1. 離體實驗 : 培養鼠胃黏膜細胞, 先將測試物至於胃黏膜細胞內, 培養 2 小時, 而後置入酸性培養液 (ph=4) 或含 indomethacin 之培養液下 測定胃黏膜細胞之存活率 (viability) 的變化 (MTT assay), 若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05), 即可判定測試食品具有保護作用之功能 2. 活體實驗 : 胃酸的分泌測定 :Shay 潰瘍法 (Shay s ulcer) 雄性實驗絕食老鼠 (24 小時 ), 胃部幽門結紮, 再予以縫合復原, 俟 4 小時候, 將其犧牲取出胃部, 收集胃液並定量胃液體積, 並以 0.1N NaOH 溶液滴定, 求其實驗組及控制組之總酸度之變化若 p<0.05, 即可判定測試食品具有胃黏膜保護作用之功能 33
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人體共有 206 塊骨骼, 依外形可分為長骨 短骨 扁平骨和不規則骨等 骨骼的外層是 皮質骨 (cortical), 含有板層結構, 其間含有細胞, 因其結構緻密, 又稱之為 緻密骨 (compact bone) 骨骼的內層則是 枝狀骨, 富含骨小樑 (trabecular), 在骨小樑的表面則有 造骨細胞 (osteoblast) 和 破骨細胞 (osteoclast), 其像海綿狀, 因此又稱為 海綿骨 (spongy bone) 體內約有 80% 的骨量屬於皮質骨, 但身體各部位的骨骼所含皮質骨與海綿骨的比例並不相同, 例如脊椎骨含有 50-75% 的海綿骨, 而股骨則只有約 20% 是屬海綿骨, 且主要是分布在兩端 35
由於海綿骨的表面積較大, 所以骨骼的代謝速率較快, 當骨骼因某因素而產生骨質流失時, 主要的流失部位即在海綿骨 在一般的代謝情況下, 每年約有 25% 的海綿骨被分解和更新, 但只有約 3% 的皮質骨會被新陳代謝 這也是何以脊椎骨較易發生骨質疏鬆, 造成身高變矮或駝背的原因 ; 又由於股骨的海綿骨分布在兩端, 因此年輕人骨質較緻密, 若因撞擊而產生骨折時, 常折斷在股骨的中央部位 若已年老發生骨質流失之後, 當跌倒而骨折時, 則常發生在股骨的兩端, 尤其斷裂在與骨盤連接的位置, 而很難醫治和恢復 36
由於人體的骨骼並非是無生命現象的架子而已, 而是終生不斷地分解與重造 (remodeling), 因此若只測量當時的密度, 並不能真正了解骨骼新陳代謝的實際情況, 而得以及時設法加以改善 骨質流失是一種無症候的生理現象, 儘管骨質流失了 20-30 %, 甚至超過此數值, 若無骨折, 很難被察覺到 37
營養素之所以會被認為與骨質疏鬆症有關, 主要是因骨骼構造中的有機質為蛋白質, 而無機質為多種礦物鹽沈澱組成, 因此如飲食中之某些營養素量不適當時, 會影響骨骼代謝之平衡, 而造成骨質流失 在所有的營養素中, 通常鈣質被認為對骨骼的結構與代謝最為重要, 也最是一般人所較易缺乏而影響到骨骼的健康 38
宜採成熟或年老之大白鼠 (rats) 為實驗動物, 性別視實驗需要而自行擬定, 但以年老或卵巢切除之雌性動物為佳 動物必須來自公立研究機構 公私立大學或其他衛生主管機關認可之實驗動物中心 每組動物 8 隻 實驗飼料含該保健食品之劑量 ( 重量百分比 ) 應為換算成廠商擬建議消費者之每天攝取量的 1-5 倍之間 ( 以每人每日攝取 500 克乾重食物為基準 ) 39
實驗組飼料與控制組飼料必須含相近之熱量 蛋白質 脂肪 鈣質 磷 鎂和維生素 D 實驗期之長短自行視產品特性而擬定 以一般醫學或生理學認可之方法來進行股骨 (femur) 脛骨(tibia) 或其他適當骨骼的切片, 計算其骨小樑數目 ; 或其他適當生理或病理之觀察與診斷 亦可測股骨或其他適當骨骼的骨質密度 ( 質量 / 體積 ) 灰分與鈣質 40
食品進行以本辦法推薦之實驗或以更嚴謹之其他被醫學或相關科學界所認可的實驗或檢測方法, 且得明確之結果時, 得向中央衛生主管機關申請宣稱 廣告或產品介紹 攝取本產品可減緩骨質流失或骨質疏鬆症的發生 或其他相近有科學依據的詞句 而以測定 鈣質生物利用率 所獲結果, 宜宣稱 本食品所含鈣質之生物利用率較一般鈣質來源優良 41
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老化是許多分子 細胞及系統方面的一種效應改變 分子與細胞的老化是基因 ( 內在 ) 與環境 ( 外在, 如熱 冷 疾病 營養素缺乏等因素 ) 所造成 而系統的老化是器官某部分的變化, 最常見的是皮膚上的變化, 例如變硬 變粗及生皺等 所以老化細分為功能上 (function) 行為上 (behavior) 及外表上 (performance) 上的變化 43
基因預設 (genetic program) 預設的基因結構或基因表現的改變導致老化 隨機破壞 (stochastic) 體內大分子物質像核酸 蛋白質隨時間所累積的隨機破壞超過體內的修復能力, 這些隨機破壞可以來自自由基 (free radical) 氧化作用 (oxidation) 或醣化作用 (glycation) 等 老化可能是多種因子所共同參與的過程, 而遺傳與各種環境因子亦都扮演舉足輕重的角色 44
(1) 小鼠生存實驗條件 : 選用小鼠 12 月齡小鼠, 每組 40 隻, 雌雄各半 分組 : 隨機分成 1 個正常對照組和 3 個實驗劑量組, 其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量, 小鼠擴大 10 倍 ( 必要時得依受試物之特性另定之 ), 作為其中 1 個劑量, 以此為基礎, 另設兩個劑量 實驗方法 : 一般用灌胃法, 摻入飼料法或加入飲水法給予受試物, 從 12 月齡開始給予, 直到死亡 然後每天統計其死亡鼠數, 直至全部自然死亡 比較實驗組與對照組的平均壽命和最高壽命, 畫出其生存曲線圖, 計半數動物死亡的天數 45
(2) 大鼠生存實驗 條件 : 選用大鼠 18 月齡大鼠, 每組 30 隻, 雌雄各半 分組 : 如同小鼠生存實驗, 但其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量大鼠擴大 5 倍 實驗方法 : 如同小鼠生存實驗, 從 18 月齡開始給予, 直到死亡 46
(3) 果蠅生存實驗條件 : 選用果蠅 Oregen 品系, 雌雄分組, 每個分組雌雄果蠅各 200 隻, 分裝在 10 個培養管內, 每管 20 隻 分組 : 需有四種劑量組, 受試物推薦劑量 = 每天每人推薦攝入量 (g)/3000 100 %, 以此濃度為中間劑量, 按 3 倍組距上下各設 1 或 2 個劑量組 若受試物處理時使用了普通培養基中未使用的溶劑, 則還應另設 1 個溶劑對照組 實驗方法 : 收集羽化後 8 小時內未交配的果蠅進行分組雌雄分組, 每個分組雌雄果蠅各 200 隻, 分裝在 10 個培養管內, 每管 20 隻 每個劑量組均應準備 2~3 管裝有相同數目果蠅的後備管 成蟲從分窩 2 週後開始並重新給予受試物 每天定時觀察紀錄果蠅的死亡數, 每 4 天更換一次培養基, 一直觀察到果蠅全部死亡 實驗結束, 計算半數死亡天數, 平均壽命和平均最高壽命 47
1. 動物選擇 : 老齡動物 過氧化損傷處理動物或國際認可之老化模型動物任選其一 2. 劑量分組及受試物試驗期間 : 設 1 個空白對照組,1 個模型對照組及 3 個受試物劑量組, 根據人體每日每公斤體重推薦攝取量, 小鼠擴大 10 倍 ( 大鼠擴大 5 倍 ) 每組大鼠單一性別 8-10 隻, 小鼠單一性別 10-15 隻 受試物經口連續至少給予 30 天 3 個劑量組經口給予不同濃度受試物, 模型對照組和空白組給予同體積溶劑 48
3. 實驗方法 : (1) 老齡動物 選用 15 月齡大鼠 12 月齡小鼠, 按血中 MDA 水平分組, 隨機分為 1 個老齡對照組和 3 個受試物劑量組, 另增設 1 個少齡對照組 ( 大鼠 3 月齡, 小鼠 8 週 ),30 天後犧牲動物測氧化指標和生化指標 49
(2) 過氧化損傷模型動物 (A) D- 半乳糖模型 : a. 原理 :D- 半乳糖供給過量, 大量產生活性氧, 打破了受控於遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態, 引起過氧化效應 b. 動物模型方法 : 選 3 月齡健康成年的小鼠, 用 D- 半乳糖 1.2 g/kg.bw 頸背部皮下注射模型, 注射量為 0.1ml/10g.bw, 每日 1 次, 連續 6 週, 取血測 MDA, 按 MDA 水平隨機分組, 如上述之分組方式 在給受試物同時, 除空白對照組外, 各組繼續給予 D- 半乳糖 1.2g/kg.bw 頸背部皮下注射, 空白對照組皮下注射生理鹽水,30 天後, 犧牲動物測氧化指標和生化指標 50
(B) 輻照模型 : a. 原理 : 電離輻射通過直接破壞生物膜中不飽和脂肪酸和間接通過水輻解產生自由基, 引發脂類過氧化 b. 動物模型方法 : 選 18-22 g 健康成年小鼠, 隨機分 5 個組, 如上述之分組方式 30 天後, 除空白對照組外, 各組給予 5-8Gy 60 Coγ 射線全身一次性照射, 照射後第 3 4 天犧牲動物, 取肝組織 ( 或第 9 10 天犧牲動物, 取睪丸組織 ) 測氧化指標和生化指標 51
(C) 溴代苯模型 : 選 18-22g 健康成年小鼠, 隨機分 5 個組, 如上述之分組方式 30 天後, 動物禁食過夜, 給受試物 0.5-1 小時後, 除空白對照組外, 各組灌胃 0.3 mol/l 溴代苯油, 灌胃量 0.2 ml/20g.bw, 空白對照組灌胃同體積植物油, 大約 18-22 小時後犧牲動物, 取肝組織測氧化指標和生化指標 52
動物實驗 ( 生存及生化 ) 與人體實驗都要做 若人體試驗沒顯著延緩衰老效果, 但動物實驗看到有不錯的結果, 建議可允許標示為 在動物實驗表明有延長生命作用 動物之生存實驗可簡化, 果蠅不用做 ( 因為不是哺乳動物 ), 其中大鼠或小鼠之材料可選其中之一項即可 53
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缺鐵的定義是體內鐵儲存耗竭, 並且增加貧血的危險, 而貧血是缺鐵末期的症狀 影響鐵吸收的主要因素有鐵的化學形式與鐵可用率 (bioavailability) 55
血鐵質 ( heme iron )主要來自肉類, 吸收率平均 25% 非血鐵質 ( non-heme iron )來自各種植物性食品, 鐵蛋白 (ferritin) 以及鐵補充劑等等, 其吸收率平均約 7.5% 56
大鼠血紅素再生法, 簡稱 血紅素再生法 實驗動物採用 Wistar 雄性大鼠, 鼠齡限定為離乳, 約四週大, 體重不宜超過 70 公克, 以快速達到缺鐵貧血階段, 縮短耗鐵期時間 57
基礎飼料組 :6-7 隻 Wistar 鼠, 實驗期間全程飼以 基礎飼料 標準對照組 : 共有 4 組, 每組採用 6-7 隻 Wistar 鼠, 再生期間飼以 鐵標準飼料, 每組一種鐵濃度 實驗組 : 每一種樣品需要 4 組動物, 每組採用 6-7 隻 Wistar 鼠, 再生期間飼以 試驗飼料, 每組一種鐵濃度 58
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鐵量分析飼料或測試樣品經灰化後, 灰份以濃 HCl 溶解完全, 經適當稀釋後, 以原子吸收光譜儀配合鐵標準溶液與標準檢量線而定量 灰化反應需嚴防鐵污染, 所需容器必須泡酸後充分清洗方可使用 血紅素分析採用 cyano-methemoglobin 法, 以 Drabkin s 試劑呈色, 反應在玻璃或塑膠試管中進行, 每個樣品需要二重複分析 每支試管中加入 5.0 ml Drabkin's 試劑與全血 20 μl, 對照組以蒸餾水替代全血 試劑與樣品充份振盪混合後, 靜置 10 min, 以分光光譜儀測量波長 540 nm 之吸光值, 經乘以 36.8 可得血紅素濃度以 g/dl 表示 60
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所謂疲勞是指身體無法維持在一定水平上運作, 各器官也不能保持固定的工作能力 ; 即身體因過度活動而造成作業肌肉無法維持力量, 而導致活動能力下降 造成身體活動疲勞的原因可包括心理 生理與生化三方面, 其中心理方面的疲勞因較易受主觀因素影響, 而生理方面的疲勞主要為神經 肌肉傳導方面機制的改變, 因此暫不列入評估之中 62
生化疲勞的潛在機轉包括中樞與週邊疲勞兩方面 中樞疲勞的機制包括 : 低血糖 (hypoglycemia) 血液中關鍵胺基酸濃度的改變, 導致大腦中神經傳導物質濃度的改變 而週邊疲勞的機轉則有 肌肉中的磷酸肌酸 (phospocreatine) 耗竭, 導致血氨增加 肌肉中的氫離子堆積, 導致乳酸增加 肌肉中的磷酸堆積 及 肌肉中的肝醣耗竭 63
現階段健康食品的抗疲勞功能, 乃針對經過運動測試後, 延緩運動期間疲勞的發生或促進運動後疲勞消除之評估 對受測對象給予運動測試, 觀察運動期間或運動後的休息期間一些與疲勞相關數值變化的情形 64
1. 游泳測試 (1) 實驗前一週, 在餵食 30 分鐘後, 先進行游泳適應 (2) 末次餵食後 30~60 分鐘, 將鼠放入直徑 15 cm 水深 20 cm 水溫 27±1 的玻璃水缸中 ( 可視鼠之大小調整水缸之直徑及水深 ), 強迫鼠進行游泳掙扎, 直到體力消耗殆盡下沉溺死為止, 計算自落水開始至鼻孔沉入水中的死亡時間即為游泳時間 也可記錄小鼠入水至頭部全部入水持續 8 秒不能浮出水面為止的時間 (3) 為了縮短試驗時間, 可在鼠背部綁上鉛絲 ( 保險絲 ) 進行負重游泳 負重量可依據動物月齡選擇體重的 2~5 %, 如選擇 3 % 負重, 在整個試驗過程中每隻鼠負重都應是自身體重的 3 % 而鼠進食量的多少會影響秤重及游泳時間, 在試驗前應禁食 12~24 小時 65
(1) 因鼠集體游泳時會互相推擠而影響試驗結果, 故以單隻游泳較佳 (2) 水溫對鼠的游泳時間有明顯的影響, 因此要求各組水溫應控制一致, 每一批鼠下水之前都應測量水溫, 如果過低可能引起鼠痙攣, 影響實驗結果, 過高 (30 以上 ) 則游泳時間太長不便操作 (3) 鉛絲纏繞時的鬆緊應適宜 (4) 在整個實驗過程中應使每隻鼠四肢保持運動, 如果鼠漂浮在水面四肢不動, 觀察者可用木棒在其附近攪動 66
實驗前一週, 在餵食 30 分鐘後, 先進行跑步機適應 末次餵食後 30~60 分鐘, 將 SD 鼠放在跑步機上, 並在跑步機的末端設置電擊區 用逐漸增加速度與坡度的方法直至力竭 (exhaustion) 若鼠落入電擊區, 而經過多次電擊仍無法起身往前跑即判定已經力竭, 記錄開始跑步至力竭的跑步時間 67
1. 血尿素氮試驗末次餵食 30 分鐘後, 在溫度為 30 的水中不負重游泳 90 分鐘, 休息 60 分鐘後採血 大鼠採尾血, 小鼠由眼窩採血, 取血漿或血清備用 利用比色測定之原理, 於定量的血漿或血清中加入 urase 反應後再加入 ammonia 為呈色劑, 作用後產生紅色化合物, 於 660 nm 波長下測定其吸光度, 再換算得血尿素氮的濃度 2. 肝醣試驗末次餵食 30 分鐘後犧牲動物, 取肝臟, 將肝醣分解為葡萄糖, 測定其濃度 3. 血乳酸試驗末次餵食 30 分鐘後採血, 然後不負重在溫度為 30 的水中游泳 10 分鐘後停止 在游泳後及休息 20 分鐘後亦分別採血 血液經處理後, 利用酵素作用及比色測定之原理, 於定量的血漿中加入 lactate oxidase 反應後, 再加入 4-aminoantipyrine 及 1,7- dihydroxynaphthalene, 經 peroxidase 作用後產生紅色化合物, 於 540 nm 波長下測定其吸光度, 再換算得乳酸之濃度 68
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肝臟為人體最大 機能最複雜的重要代謝器官 它在醣 脂質 蛋白質 維生素 激素 膽汁等物質代謝中, 均有重要作用 ; 同時肝臟還有分泌 排泄 生物轉化等方面的功能 肝細胞含有豐富的肽, 並合成許多肽和某些凝血因子, 儲存和釋放造血因子, 參與血液凝固和造血過程 肝臟也是機體重要屏障器官, 其解毒功能對機體有重要保護作用 當肝功能損傷時則代謝障礙, 並影響其他臟器功能, 嚴重則危及生命 70
將研究組別 每組 10-12 隻雄性 SD 或 Wistar 大白鼠 (200-250 克 ) 或 ICR 小白鼠 (20-25 克 ) 分為 1. 正常對照組 : 正常飲食組 ;2. 負對照組 : 四氯化碳處理組 ;3. 正對照組 :Silymarin 處理組 ; 實驗組 : 試驗樣品處理組 ( 需有二種或以上劑量組, 其中之一為人體建議攝取量, 另一組則為人體建議攝取量之 5-10 倍左右 ) 71
( 一 ) 血清 : 測定與肝傷害相關之成分或酵素活性 GOT (AST) GPT (ALT) TG Cholesterol ( 二 ) 肝臟 : 測定各種與抗氧化功能相關之成分或酵素活性 Glutathione (GSH) Glutathione reductase (GSH Rd) Glutathione peroxidase (GSH Px) Superoxide dismutase (SOD) Catalase 72
在八星期結束時, 所有大白鼠均予以犧牲, 頸動脈採血後, 割取肝臟, 在最大右葉的同一位置割取 1 公分見方的肝組織, 放入 10% 的中性福馬林中, 做進一步的病理染色, 其餘五葉肝臟則置於 -80 的冷凍櫃中冷凍, 以便檢測抗氧化酵素的活性 73
由以上血清與肝臟之各項測定值 病理切片觀察結果, 並配合其他由送審單位送出之相關測定項目之數據, 經統計分析後所得之客觀結果, 再由審查委員進行評估 74
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