外泌体分离与鉴定 外泌体分离与鉴定 项目编号 客户姓名 客户单位 报告出具人 报告审核人 本报告涉及到 LC Sciences 的公司商业秘密, 请确保本报告内容仅供您个人科研使用, 并承担保密责任. 若擅自向任何第三人或者公司泄露本报告的内容, 根据国家有关法律 法规, LC Sciences 公司将有权追究法律责任. 电话 :0571-87662413
1. 外泌体简介 外泌体 (Exosomes) 产生于细胞中的多泡体, 是活细胞分泌的直径约为 30~150nm 的膜性囊泡, 密度为 1.13-1.19g/ml, 有典型的 杯盘 形态 人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体, 近乎于平均每个人体细胞产生 1000-10000 个 通常 1ml 血液中存在 1 10^12 个外泌体 外泌体具有异质性, 即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别 外泌体几乎存在于所有的组织 细胞间隙 体液中, 包括血液 唾液 尿液和母乳 外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白 mirna lncrna circrna mrna 以及其降解片段, 参与细胞活动的重要调控 ; 在肿瘤转移 免疫调控机制 疾病发生发展 阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角, 有望成为多种疾病的早期诊断标志物 外泌体的分离方法主要有 : 差速离心 密度梯度离心 体积排阻色谱法 过滤法 聚合物沉淀法 免疫分离 隔离筛选法等 但是 CNS 上外泌体研究的文献中主流的分离方法目前还是超速离心的方法 超速离心分离可以准确地重复获取外泌体, 同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化 目前我司对于外泌体的鉴定主要方法有 : 透射电子显微镜 (TEM) 粒径分析 ( 纳米流式检测仪 ) 蛋白指标检测 (Western Blot FCM) 2. 实验目的 采用超速离心法提取外泌体, 并进行透射电镜 粒径分析及蛋白指标检测 3. 材料与仪器 3.1 样本情况细胞培养上清 ( 客户提供 ) 3.2 主要试剂与仪器名称 品牌 货号 细胞培养板 Corning 430167 青 链霉素混合液 Gibco 15140-122 DMEM Hyclone SH30243.1 0.25%Trypsin Gibco 25200-072 名称 品牌 型号 电话 :0571-87662413
多功能酶标仪 Thermo VARIOSKAN LUX 生物安全柜 ESCO AC2-4S1 细胞培养箱 ESCO CCL-170B-8 移液器 Eppendorf Research Plus 小型冷冻离心机 Beckman Microfuge 20R 超低温冰箱 Thermo 905 透射电镜 FEI Tecnai Spirit T12 纳米流式检测仪 福流生物 Flow NanoAnalyzer 超速离心机 Beckman Optima L-100XP 4. 实验方法 4.1 超速离心法提取外泌体 4.1.1 收集培养 48 h 后的细胞上清 4.1.2 将上清液移动至一个新的离心管内,2000 g,4,10 min 离心 4.1.3 小心地在将上清液移至新的离心管中,10000 g,4,30 min 再次离心, 以去除较大的囊泡 4.1.4 小心取上清液至新的离心管中, 选择超速转子,4,110000 g 离心 70 min 4.1.5 去除上清, 用预冷的 1 PBS 重悬后再次 4,110000 g,70 min 超速离心 4.1.6 去除上清并且用适量的 1 PBS 重悬 4.1.7 提取后的外泌体应该立即检测或者冻存 -80 4.2 外泌体样品透射电镜观察 4.2.1 将通过超速离心分离得到的外泌体, 重悬于 30μL 的 PBS 中 4.2.2 吸取样品 10 μl 滴加于铜网上沉淀 1 min, 滤纸吸去浮液 4.2.3 醋酸双氧铀 ( 磷钨酸 )10 μl 滴加于铜网上沉淀 1 min, 滤纸吸去浮液 4.2.4 常温干燥数分钟 4.2.5 80 kv 进行电镜检测成像 4.2.6 获得透射电镜 (FEI Tecnai Spirit TEM T12) 成像结果 ( 图 1) 电话 :0571-87662413
4.3 外泌体样品粒径分析 4.3.1 先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样, 注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针 4.3.2 待样本完成检测即可获得 NanoFCM 仪器 ( 福流生物 Flow NanoAnalyzer) 检测外泌体的粒径和浓度信息 ( 图 2) 4.3.3 若外泌体已进行荧光抗体标记也可同时获得 NanoFCM 仪器 ( 福流生物 Flow NanoAnalyzer) 检测表面蛋白指标阳性结果 ( 图 4) 4.4 外泌体样品 WB 蛋白指标检测 4.4.1 根据待检测样品蛋白大小配制浓度为 10% 或 15% 的 SDS PAGE 电泳胶 ; 将电泳装置装好后, 加入适量 Running Buffer 4.4.2 取出蛋白样品, 恒温金属浴上煮 3-5 min, 离心甩下 ; 将蛋白样品以及蛋白 Maker 按所需顺序用移液器或上样针加入到电泳胶上的孔内 4.4.3 盖上槽盖, 打开电源,80 V 跑胶至样品跑出浓缩胶, 转 100 V 跑胶至溴酚蓝至胶底部 4.4.4 电泳完毕后取出电泳胶, 修整胶的大小, 切去边缘与多余的部分, 左下角切角标记 ; 根据修整后胶的尺寸, 裁剪相应大小的 PVDF 膜, 在左下角剪角做标记, 在适量甲醇中活化 20 s, 然后浸泡于预冷的转膜缓冲液中 4.4.5 取 8 张滤纸切成 8 cm 10 cm 的尺寸, 同样浸泡在预冷的转膜缓冲液中 ; 按照海绵 - 滤纸 - 电泳胶 - 膜 - 滤纸 - 海绵的顺序制作转膜 三明治 4.4.6 将转膜缓冲液加入槽中, 组装好转膜装置, 加入浮冰, 将装置埋于冰浴或置于冰箱, 打开电源,300 ma 转膜, 转膜时间依据需检测蛋白的大小确定, 一般规则为 1 kd=1 min 4.4.7 转膜完毕后取出 PVDF 膜, 将膜按蛋白面朝上浸泡于 5% 脱脂牛奶 TBST 电话 :0571-87662413
中, 封闭 1 h 4.4.8 一抗封闭 : 牛奶封闭后的膜按需裁剪, 将膜浸泡于配制好的一抗溶液 (1:1000 ) 中, 4 孵育过夜 4.4.9 回收一抗, 用 20 ml TBST 在室温下洗膜 10 min, 重复三次 4.4.10 根据一抗选择二抗, 将二抗按 1:5000 配在 5% 脱脂牛奶 TBST 溶液中, 将膜浸泡在二抗溶液中, 室温孵育 1h 左右 4.4.11 回收二抗, 用 20 ml TBST 在室温下洗膜 10 min, 重复三次 4.4.12 取出 PVDF 膜, 沥干水分, 蛋白面朝上平铺于保鲜膜上, 将等体积混合的 ECL A/B 液混合液滴加到膜上避光反应 5 min; 将膜夹起移入塑封膜中, 蛋白面始终朝上 4.4.13 将膜放在成像仪 (GE LAS4000mini) 中, 设置好参数, 开始曝光 ; 调整好亮度和对比度, 保存图片 ( 如图 3) 5. 实验结果 5.1 超速离心法提取细胞上清外泌体电镜图 电话 :0571-87662413
图 1 外泌体电镜图 (bar=200nm) 5.2 超速离心法提取细胞上清外泌体粒径分析结果 5.2.1 细胞上清外泌体粒径检测 : 平均粒径为 81.14 nm,30-150nm 的占总颗粒数的 96.62%, 具体的分布见附件 : 外泌体粒径分布.xlsx 图 2 纳米流式检测外泌体粒径 5.2.2 浓度结果 : 浓度为 1.43E+10 个 /ml 电话 :0571-87662413
图 3 纳米流式检测外泌体浓度 5.3 超速离心法提取细胞上清外泌体蛋白指标检测结果 5.3.1 BCA 测定外泌体蛋白浓度 : 标准曲线 : 图 4 BCA 法标准曲线 电话 :0571-87662413
外泌体蛋白测出的 OD560 为 0.2157, 带入到以上公式算出, 提取出的外泌体总 蛋白浓度为 1.88 μg/μl, 总体积为 85 μl, 得提取出的蛋白总质量为 159 μg 5.3.2 WB 检测外泌体蛋白表达 : 图 5 WB 检测外泌体标志性蛋白 电话 :0571-87662413
5.3.3 纳米流式检测仪检测细胞上清外泌体表面蛋白表达 : 图 6 纳米流式仪检测检测外泌体膜蛋白 CD9 的阳性率 5.4 外泌体鉴定结果评判 质量参数质控标准评估 样本量评估细胞上清总量 20ml 优 电镜质量评估 外形 形态完整 球 形 大小均一 优 粒径质量评估 颗粒浓度 10^9-10 个 /ml 优 粒径大小 30-150nm 优 提取蛋白浓度阳性指标结果 1 2 15µg 有 优 优 蛋白质量评估 阴性指标结果无优 CD9 蛋白阳性率 >30% 优 CD81 蛋白阳性率 >30% 优 注 : 1 2 在 Western Blot 实验上样前采用 BCA 蛋白定量方法, 并通过酶标仪检测蛋白浓度 ; 默认采用纳米流式检测 CD9 和 CD81 两个指标, 根据客户需求会有增减 电话 :0571-87662413
6. 样品寄送 寄送货物清单 根据客户要求, 实验产物外泌体 DNA RNA 或蛋白等将与客户原材料采用干冰快递运送的方式寄回 若有涉及款项支付将附有对应的发票及合同等 货物名称 规格 编号 外泌体 50µL/ 管 1 外泌体提取蛋白 50 µl/ 管 1 表 6.1 实验产物清单 货物名称 规格 编号 抗体 50ug 1 管 表 6.2 客户原材料清单 客户需知 : 一 : 应先检查快递包裹是否完好, 有无破损 二 : 其次检查干冰是否挥发完全, 并快速将样品转移至 -80 冰箱保存 三 : 低温样品保存应避免反复冻融, 建议分装保存, 用时再取 四 : 注意, 本产品只做科研使用, 不得另做它用 电话 :0571-87662413