入 侵 紅 火 蟻 之 鑑 定 吳 孟 玲 行 政 院 農 委 會 林 業 試 驗 所 森 林 保 護 組 前 言 新 入 侵 台 灣 的 螞 蟻 - 入 侵 紅 火 蟻 是 當 前 最 嚴 重 的 入 侵 害 蟲 該 火 蟻 在 受 到 外 力 干 擾 騷 動 時 極 具 攻 擊 性, 其 成 熟 蟻 巢 的 個 體 數 約 可 達 到 20 萬 至 50 萬 隻 個 體, 因 此 入 侵 者 往 往 會 遭 受 大 量 的 火 蟻 以 螫 針 叮 咬, 大 量 酸 性 毒 液 的 注 入, 除 立 即 產 生 破 壞 性 的 傷 害 與 劇 痛 外, 毒 液 中 的 毒 蛋 白 往 往 會 造 成 被 攻 擊 者 產 生 過 敏 而 有 休 克 死 亡 的 危 險, 若 膿 泡 破 掉, 則 又 常 常 容 易 引 起 細 菌 性 的 二 次 感 染 在 外 觀 鑑 別 上 以 其 成 熟 蟻 巢 呈 現 明 顯 隆 起 的 蟻 丘, 是 極 容 易 快 速 認 定 紅 火 蟻 的 方 法 之 一, 但 入 侵 紅 火 蟻 族 群 在 未 成 熟 前 的 蟻 丘 並 不 明 顯, 容 易 與 其 他 種 螞 蟻 的 蟻 巢 造 成 判 斷 上 的 錯 誤 若 能 應 用 生 物 技 術 製 成 快 速 而 正 確 的 檢 測 試 劑, 則 對 紅 火 蟻 鑑 定 上 幫 助 極 大, 亦 能 免 除 一 般 民 眾 不 必 要 之 恐 慌 本 研 究 團 隊 於 93 年 下 半 年 度 致 力 於 發 展 出 一 套 快 速 精 確 經 濟 且 易 於 使 用 的 方 法, 以 提 供 給 民 眾 或 相 關 單 位 知 道 所 捉 到 的 螞 蟻 是 否 確 為 入 侵 紅 火 蟻 這 套 方 法 乃 開 發 對 入 侵 紅 火 蟻 特 殊 毒 蛋 白 具 專 一 性 的 單 元 抗 體, 作 成 膠 金 標 誌 檢 測 試 劑 (colloidal gold-labeling kit), 如 驗 孕 試 劑 一 樣 方 便 使 用, 以 提 供 一 般 民 眾 居 家 自 行 檢 測 紅 火 蟻 的 生 物 學 入 侵 紅 火 蟻 是 屬 於 地 棲 型 螞 蟻 類, 築 巢 於 地 下 並 形 成 高 於 地 表 的 蟻 丘, 此 種 蟻 巢 形 式 可 方 便 職 蟻 移 動, 蟻 丘 內 部 呈 現 蜂 巢 狀 結 構 蟻 丘 對 外 的 水 平 蟻 道 可 以 拓 展 到 蟻 巢 100 ft 遠 的 區 域, 垂 直 蟻 道 達 6 ft, 甚 至 達 地 下 水 層 影 響 蟻 丘 大 小 及 形 狀 的 因 子 包 括 : 土 壤 類 型 植 被 溫 度 與 季 節 低 溫 及 乾 燥 一 直 是 入 侵 紅 火 蟻 生 存 限 制 因 子, 入 侵 紅 火 蟻 族 群 正 常 生 長 活 動 的 溫 度 範 圍 在 3.6 ~ 40.7,22 至 36 是 火 蟻 職 蟻 活 動 最 旺 盛 的 溫 度 一 般 來 說, 乾 季 的 蟻 巢 較 濕 季 時 的 蟻 巢 來 的 小, 溫 度 低 時, 蟻 巢 會 築 得 較 高 以 獲 取 太 陽 熱 能, 且 在 族 群 創 始 之 初, 蟻 丘 並 不 明 顯 易 見 入 侵 紅 火 蟻 沒 - 55 -
有 特 定 的 婚 飛 時 期, 全 年 都 可 以 有 新 的 生 殖 個 體 形 成, 雄 蟻 在 交 配 後 不 久 即 會 死 去, 蟻 后 24 h 內 開 始 產 卵 紅 火 蟻 的 分 類 與 鑑 定 入 侵 紅 火 蟻 分 類 上 屬 膜 翅 目 家 蟻 亞 科 火 蟻 族 之 火 蟻 屬 已 知 火 蟻 屬 有 181 種 類 被 發 現 命 名, 台 灣 記 錄 有 熱 帶 火 蟻 獵 食 火 蟻 知 本 火 蟻 與 入 侵 紅 火 蟻 等 4 種 入 侵 紅 火 蟻 分 類 特 徵 如 下 : 1. 中 軀 與 腹 錘 間 有 2 節 明 顯 腰 節, 無 前 伸 腹 節 齒 2. 觸 角 10 節, 錘 節 部 分 由 2 節 組 成 3. 具 明 顯 複 眼, 由 數 十 個 小 眼 構 成 4. 具 明 顯 頭 楯 中 齒 5. 職 蟻 外 部 形 態 上 屬 於 連 續 多 態 型, 體 長 在 1.8 mm 至 6 mm 之 間 6. 兵 蟻 亞 階 級, 後 頭 部 平 順 無 凹 陷, 大 顎 內 緣 有 明 顯 小 齒 單 元 抗 體 製 備 免 疫 抗 體 偵 測 法 至 今 仍 被 認 為 是 最 簡 單 且 經 濟 的 偵 測 方 法 之 一, 本 研 究 依 下 列 實 驗 步 驟 進 行 : 1. 抗 原 之 純 化 : 於 解 剖 顯 微 鏡 下, 取 出 紅 火 蟻 的 毒 腺, 加 入 適 量 的 PBS 緩 衝 液, 置 於 試 管 中 磨 碎 後, 離 心 10000 g 取 上 澄 液, 經 SDS-PAGE 蛋 白 電 泳 確 認 毒 蛋 白 存 在 後, 做 為 老 鼠 免 疫 之 抗 原 2. 單 元 抗 體 之 製 備 : (1) 小 白 鼠 免 疫 注 射 : 以 純 系 六 週 大 的 雌 性 Balb/C 小 白 鼠, 免 疫 注 射 共 四 次, 間 隔 二 至 三 週 ; 注 射 部 位 以 腹 腔 為 主, 但 最 後 一 次 注 射 尾 巴 靜 脈 (2) 培 養 基 製 備 : 培 養 基 選 用 RPMI-1640(pH 7.3), 經 無 菌 過 濾 後 保 存 於 4 用 於 融 合 瘤 培 養 者 (CRPMI) 需 再 添 加 胎 牛 血 清 (3) 細 胞 融 合 : 完 成 免 疫 過 程 之 白 鼠, 進 行 無 菌 操 作 解 剖 取 出 脾 臟, 以 針 筒 沖 出 脾 臟 細 胞, 與 老 鼠 骨 髓 癌 細 胞 (NS-1 cell) 混 合 後 離 心, 以 45%PEG 1500 進 行 融 合 反 應, 以 HAT 培 養 基 懸 浮 並 分 裝 注 入 細 - 56 -
胞 培 養 盤 (4) 細 胞 單 株 化 與 篩 選 : 以 間 接 免 疫 酵 素 抗 體 法 進 行 單 元 抗 體 篩 選 找 出 與 紅 火 蟻 組 織 反 應 強 烈, 但 不 與 其 他 種 類 的 火 蟻 ( 或 螞 蟻 ) 組 織 反 應 者, 進 行 單 元 抗 體 之 生 產 3. 單 元 抗 體 之 生 產 : (1) 抗 體 獲 自 小 白 鼠 體 內 培 養 之 融 合 瘤 細 胞 : 將 細 胞 養 至 log phase, 離 心 收 集 細 胞, 以 RPMI 懸 浮, 直 接 注 射 到 小 白 鼠 之 腹 腔, 經 兩 週 後 抽 取 腹 水 (2) 抗 體 純 化 與 酵 素 標 誌 : 抗 體 純 化 採 用 Protein A IgG Purification Kit 純 化 後 的 抗 體, 進 行 抗 體 酵 素 (alkaline phosphatase) 標 誌, 抗 體 保 存 於 4 4. 製 成 簡 易 偵 測 試 紙 條 : 先 將 抗 體 標 誌 於 檢 驗 試 紙 條 上, 利 用 膠 金 標 誌 原 理, 以 毛 細 擴 散 作 用, 達 到 顯 色 目 的 此 項 作 業 將 由 台 大 植 微 系 蘇 鴻 基 名 譽 教 授 提 供 技 術 協 助, 蘇 教 授 先 前 已 經 成 功 開 發 出 多 種 植 物 病 毒 的 簡 易 偵 測 試 紙 條, 技 術 已 臻 純 熟, 可 有 效 促 成 本 計 畫 目 的 之 達 成 紅 火 蟻 快 速 鑑 定 技 術 開 發 已 完 成 入 侵 紅 火 蟻 的 毒 蛋 白 抽 取, 成 功 自 入 侵 紅 火 蟻 的 腹 部 分 離 出 毒 囊 與 毒 腺 並 將 毒 腺 內 的 毒 蛋 白 萃 取 出 來, 先 進 行 蛋 白 質 電 泳 分 析, 發 現 確 有 毒 蛋 白 分 子 出 現 在 預 期 的 位 置 本 分 子 試 劑 製 備 先 以 毒 蛋 白 為 抗 原 進 行 老 鼠 的 免 疫 注 射, 經 六 週 後 解 剖 老 鼠 取 其 脾 臟 做 融 合 瘤 細 胞 篩 選 及 單 元 抗 體 製 備, 經 抗 原 抗 體 免 疫 分 析 實 驗 證 實 其 血 清 含 抗 火 蟻 多 元 抗 體, 對 火 蟻 的 毒 蛋 白 具 特 異 性, 在 " 入 侵 紅 火 蟻 " 與 " 熱 帶 火 蟻 " 反 應 上 極 為 強 烈, 且 " 入 侵 紅 火 蟻 " 的 反 應 值 比 " 熱 帶 火 蟻 " 要 稍 高 一 些 進 一 步 將 融 合 瘤 細 胞 株 進 行 對 入 侵 紅 火 蟻 抗 體 篩 選, 共 計 獲 得 約 1000 個 融 合 瘤 細 胞 株, 並 做 毒 蛋 白 抗 原 抗 體 免 疫 分 析 試 驗, 篩 選 得 到 細 胞 株 具 分 泌 抗 體 可 以 區 分 " 入 侵 紅 火 蟻 " 與 " 熱 帶 火 蟻 ", 目 前 共 得 到 12 株 具 對 入 侵 紅 火 蟻 毒 蛋 白 專 一 性 之 單 元 抗 體 細 胞 株, 再 從 這 些 篩 選 到 的 抗 體 細 胞 株 中, 尋 找 力 價 高 者, 進 行 較 大 量 的 抗 體 生 產 與 純 化, 目 前 已 成 功 地 完 成 對 入 侵 紅 火 蟻 特 殊 毒 蛋 白 具 專 一 性 的 單 元 抗 體 製 備 及 單 元 抗 體 抗 原 力 價 測 試, 皆 表 現 出 良 好 抗 體 抗 原 反 應, 已 可 成 功 地 應 用 免 疫 酵 素 抗 體 法 檢 測 紅 火 蟻, 同 時 並 進 一 步 作 成 膠 金 標 誌 - 57 -
檢 測 試 劑, 以 提 供 非 試 驗 單 位 快 速 鑑 定 紅 火 蟻 用 誌 謝 本 研 究 獲 行 政 院 農 業 委 員 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局 經 費 補 助 (94 農 科 -13.3.1- 檢 -B2(1)), 謹 誌 謝 忱 參 考 文 獻 Bolton, B. 1995. A taxonomic and zoogeographical census of the extant ant taxa (Hymenoptera: Formicidae). J. Nat. Hist. 29: 1037-1056. Cokendolpher, J. C., and S. A. Phillips. 1990. Critical thermal limits and locomotor activity of the red imported fire ant (Hymenoptera: Formicidae). Environ. Entomol. 19: 878-881. Deslippe, R. J., and Y. J. Guo. 2000. Venom alkaloids of fire ants in relation to worker size and age. Toxicon 38: 223-232. Goddard, J., J. Jarratt, and F. R. de Castro. 2000. Evolution of the fire ant lesion. JAMA. 284: 2162-2163. Hannan, C. J., C. T. Stafford, R. B. Rhoades, B. B. Wray, H. Baer, and M. C. Anderson. 1986. Seasonal variation in antigens of the imported fire ant Solenopsis invicta. J. Allergy Clin. Immunol. 78: 331-336. Hoffman, D. R. 1987. Allergens in Hymenoptera venom. XVII. Allergenic components of Solenopsis invicta (imported fire ant) venom. J. Allergy Clin. Immunol. 80: 300-306. Hoffman, D. R. 1995. Fire ant venom allergy. Allergy 50: 535-544. Hoffman, D. R., D. E. Dove, and R. S. Jacobson. 1988. Allergens in Hymenoptera venom. XX. Isolation of four allergens from imported fire ant (Solenopsis invicta) venom. J. Allergy Clin. Immunol. 82: 818-827. Kemp, S. F., R. D. deshazo, J. E. Moffitt, D. F. Williams, W. A. Buhner II. 2000. J. Allergy Clin. Immunol. 105: 683-691. Kim, S. S., H. S. Park, H. Y. Kim, S. K. Lee, and D. H. Nahm. 2001. Anaphylaxis caused by the new ant, Pachycondyla chinensis: demonstration of specific IgE and IgE-binding components. J. Allergy Clin. Immunol. 107: - 58 -
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植物重要防疫檢疫害蟲診斷鑑定研習會 五 Oct. 2005 圖一 萃取自入侵紅火蟻 Solenopsis invicta Si 與熱帶火蟻(S. geminate Sg)不同部位之蛋白 SDS-PAGE 電泳圖 Lane 1, Protein ladder; lane 2, Si soldier (20 whole body); lane 3, Si worker (20 whole body); lane 4, Si queen (2 abdomen); lane 5, Si soldier (20 abdomen); lane 6, Si worker (20 abdomen); lane 7, Si soldier (20 venom organ); lane 8, Si soldier (10 venom organ); lane 9, Si worker (10 venom organ); lane 10, Sg soldier (20 venom organ). 箭頭所指處為火蟻毒蛋白的兩條主要條帶 26 kda & 13 kda 圖二 利用膠金標誌檢測試劑 colloidal gold-labeling kit 提供快速鑑 定紅火蟻用 左邊為正反應 紅火蟻抗原 右邊為負反應 - 60 -
表 一 以 免 疫 酵 素 抗 體 法 測 試 抗 血 清 對 不 同 種 螞 蟻 的 檢 測 值 37, 1 h Blank 0.116 Ant species ELISA value ELISA value index a 入 侵 紅 火 蟻 Solenopsis invicta 1.295 +++ 熱 帶 火 蟻 S. geminata 1.221 +++ 錫 蘭 迷 蟻 Aenictus ceylonicsu -0.110 - 大 林 長 腳 家 蟻 Aphaenogaster tipuna -0.142 - 白 疏 巨 山 蟻 Camponotus albosparsus -0.093 - 畢 氏 粗 角 蟻 Cerapachys biroi -0.111 - 吉 悌 細 顎 針 蟻 Leptpgenys kitteli -0.024 - 小 黃 單 家 蟻 Monomorium pharaonis -0.089 - 高 山 鋸 針 蟻 Odontomachus monticola -0.019 - 黃 足 粗 針 蟻 Pachycondyla luteipes -0.084 - 黃 腳 黃 山 蟻 Paratrechina flavipes -0.102 - 熱 烈 大 頭 家 蟻 Pheidole fervens -0.055 - 節 膜 角 瘤 家 蟻 Pyramica membranifera -0.083 - 蓬 萊 瘤 顎 家 蟻 Strumigenys formisensis -0.124 - 日 本 瘤 顎 家 蟻 S. solifontis -0.101 - 愛 默 網 家 蟻 Vollenhovia emeryi -0.093 - a ELISA value index: -, OD 405 < 0.1; +, 0.1 ~ < 0.5; ++, 0.5 ~ < 1.0; ++ +, 1.0 ~ < 1.5. - 61 -
表 二 以 免 疫 酵 素 抗 體 法 測 試 抗 血 清 對 入 侵 紅 火 蟻 與 熱 帶 火 蟻 不 同 稀 釋 倍 率 的 檢 測 值 Ant species Dilution values ELISA value a ELISA index b Solenopsis invicta 1X 1.524 +++ ( 入 侵 紅 火 蟻 ) 2X 1.488 +++ (soldier poison gland 25) 4X 1.478 +++ 8X 1.540 +++ 10 3 X 0.980 ++ 10 4 X 0.439 + S. geminata 1X 1.220 +++ ( 熱 帶 火 蟻 ) 2X 1.193 +++ (soldier poison gland 25) 4X 1.184 +++ 8X 1.320 +++ 10 3 X 0.666 ++ 10 4 X 0.226 + a Values of OD 405nm after 60 min substrate incubation at 37. b ELISA value index: -, OD 405 < 0.1; +, 0.1 ~ < 0.5; ++, 0.5 ~ < 1.0; +++, 1.0 ~ < 1.5. - 62 -
表 三 以 免 疫 酵 素 抗 體 法 測 試 抗 腹 水 和 純 化 抗 體 IgG 對 入 侵 紅 火 蟻 與 熱 帶 火 蟻 不 同 稀 釋 倍 率 的 檢 測 值 37, 30 min 37, 1 h Blank 0.096 0.103 Antibody Ascetic fluid Purified antibody IgG Ascetic fluid Purified antibody IgG Dilution values RIFA TFA RIFA TFA RIFA TFA RIFA TFA 10 2 X 2.436 1.126 3.214 3.31 3.333 2.073 OVER * OVER * 10 3 X 2.440 1.747 2.428 1.973 OVER * 2.971 3.255 3.040 10 4 X 2.304 0.977 2.107 0.687 3.272 1.792 3.173 1.232 10 5 X 2.066 0.572 1.045 0.152 3.172 1.088 1.899 0.286 10 6 X 0.794 0.122 0.253 0.035 1.466 0.244 0.488 0.069 10 7 X 0.100 0.007 0.035 0.003 0.197 0.023 0.078 0.017 Antigen: 0.37 g of Solenopsis invicta (RIFA) or S. geminata (TFA) with 5 ml coating buffer. * OVER means OD 405 value over 3.5. - 63 -
表 四 以 免 疫 酵 素 抗 體 法 測 試 抗 體 對 不 同 種 螞 蟻 的 檢 測 值 37, 1 h Blank 0.105 Ant species ELISA value ELISA value index a 入 侵 紅 火 蟻 Solenopsis invicta 2.335 +++++ 熱 帶 火 蟻 S. geminata 0.284 + 大 頭 家 蟻 Pheidole sp. 0.524 ++ 小 紅 蟻 Phedolegeton diversus 0.219 + 黑 棘 蟻 Polyrhachis dives 0.171 + 柯 氏 黃 山 蟻 Paratrechina kraepelini 0.037 - 白 足 扁 琉 璃 蟻 Techomyrmex albipes 0.057 - 花 居 單 家 蟻 Monomorium floricola 0.311 + a ELISA value index: -, OD 405 < 0.1; +, 0.1 ~ < 0.5; ++, 0.5 ~ < 1.0; +++, 1.0 ~ < 1.5; ++++, 1.5 ~ < 2.0; +++++, 2.0 ~ < 2.5. Antibody: Antibody diluted with PBST to 10 5 X. Antigen: 0.06g of ant with 10ml coating buffer. - 64 -
表 五 以 免 疫 酵 素 抗 體 法 測 試 抗 體 對 入 侵 紅 火 蟻 與 熱 帶 火 蟻 不 同 稀 釋 倍 率 的 檢 測 值 Ant species Dilution values ELISA value a ELISA index b Solenopsis invicta 4X 1.650 ++++ ( 入 侵 紅 火 蟻 ) 8X 2.163 +++++ (soldier 75 mg) 16X 2.238 +++++ 32X 2.148 +++++ 64X 2.809 ++++++ 512X 0.150 + S. geminata 4X 0.176 + ( 熱 帶 火 蟻 ) 8X 0.229 + (soldier 75 mg) 16X 0.340 + 32X 0.380 + 64X 0.290 + 512X 0.004 - a Values of OD 405nm after 60 min substrate incubation at 37. b ELISA value index: -, OD 405 < 0.1; +, 0.1 ~ < 0.5; ++, 0.5 ~ < 1.0; +++, 1.0 ~ < 1.5; ++++, 1.5 ~ < 2.0; +++++, 2.0 ~ < 2.5; ++++++, 2.5 ~ < 3.0. Antibody: Antibody diluted with PBST to 10 5 X. - 65 -
表 六 蟲 體 自 然 死 亡 與 冷 藏 (-20 ) 之 保 存 測 試 37, 1 h Blank 0.119 Solenopsis invicta (Fresh, not treatment) 3.353 S. geminata (Fresh, not treatment) 0.292 Days Death Ice (4 ) 1 day 2.511 3.347 2 day 2.065 2.487 3 day 1.933 3.261 4 day 1.750 2.992 5 day 1.995 2.520 6 day 1.595 2.240 7 day 1.090 2.172 Antibody: Antibody diluted with PBST to 10 5 X. Antigen: 3 of ant with 10ml coating buffer. - 66 -