Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

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Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

液 相 色 谱 手 册 液 相 色 谱 柱 与 方 法 开 发 指 南

目 录 前 言 5 色 谱 的 基 本 概 念 6 柱 效 (N) 7 保 留 因 子 (k) 8 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 8 分 离 度 (R s ) 9 压 力 10 van Deemter 曲 线 11 梯 度 方 程 11 液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 13 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 14 压 力 范 围 14 Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 15 溶 剂 混 合 16 延 迟 体 积 18 柱 外 体 积 18 自 动 进 样 器 操 纵 工 作 流 程 自 动 化 体 系 的 大 脑 19 固 定 样 品 环 和 流 通 式 自 动 进 样 器 19 进 样 精 度 和 准 确 度 21 灵 活 性 和 样 品 容 量 21 进 样 周 期 21 交 叉 污 染 22 新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 23 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 23 检 测 器 感 知 器 官 24 检 测 器 灵 敏 度 26 线 性 范 围 26 数 据 采 集 速 率 27 HPLC 柱 的 选 择 28 HPLC 模 式 29 色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 30 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 31 UHPLC 柱 32 表 面 多 孔 填 料 柱 32 LC/MS 柱 33 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 34 生 物 表 征 柱 34 色 谱 柱 特 性 35 硅 胶 35 键 合 相 35 聚 合 物 35 孔 径 36 粒 径 36 色 谱 柱 规 格 37 卡 套 柱 系 统 38 性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 41 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 42 实 现 完 美 的 接 头 连 接 43 接 头 连 接 要 求 43 不 可 调 金 属 接 头 43 可 调 手 紧 式 接 头 45 Agilent A-Line 接 头 45 200 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 47 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 47 进 样 量 47 2

设 置 数 据 采 集 速 率 48 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 49 测 量 系 统 的 驻 留 体 积 51 评 估 驻 留 体 积 的 影 响 53 驻 留 体 积 与 分 析 时 间 54 螯 合 物 54 ph 和 流 动 相 改 性 剂 55 梯 度 操 作 56 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 57 色 谱 柱 老 化 59 键 合 相 流 失 59 清 洗 反 相 硅 胶 柱 59 清 洗 正 相 硅 胶 柱 61 清 洗 反 相 聚 合 物 柱 61 方 法 开 发 62 方 法 开 发 : 从 何 处 入 手 63 模 式 选 择 63 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 66 选 择 固 定 相 67 反 相 色 谱 的 方 法 开 发 67 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 67 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 70 流 动 相 操 作 70 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 70 流 动 相 混 合 71 流 动 相 脱 气 71 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 71 UV 检 测 器 常 用 的 缓 冲 液 73 LC/MS 的 考 虑 因 素 74 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 76 问 题 排 查 实 例 : 基 线 漂 移 76 问 题 排 查 实 例 : 高 ph 造 成 的 峰 展 宽 和 峰 分 裂 78 问 题 排 查 实 例 : 流 动 相 改 性 剂 和 选 择 性 78 轻 松 可 靠 的 ph 测 试 79 优 化 反 相 色 谱 条 件 80 等 度 优 化 81 梯 度 优 化 84 用 于 反 相 色 谱 的 聚 合 物 色 谱 柱 86 反 相 色 谱 的 等 度 方 法 开 发 上 手 步 骤 指 南 87 从 常 规 柱 向 高 效 柱 进 行 方 法 转 移 的 技 巧 89 自 动 化 方 法 开 发 工 具 91 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 93 HILIC 93 正 相 色 谱 95 离 子 交 换 色 谱 97 凝 胶 渗 透 色 谱 / 体 积 排 阻 色 谱 98 液 质 联 用 仪 基 本 原 理 99 什 么 是 LC/MS? 99 LC/MS 可 提 供 哪 些 信 息? 100 液 质 联 用 仪 的 类 型 101 单 四 极 杆 仪 器 101 三 重 四 极 杆 仪 器 101 飞 行 时 间 和 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 101 匀 场 离 子 淌 度 系 统 102 MS/MS 碎 裂 化 合 物, 获 得 额 外 的 特 异 性 102 化 合 物 的 电 离 103 电 喷 雾 电 离 103 转 下 页 3

大 气 压 化 学 电 离 103 大 气 压 光 电 离 103 利 用 LC/MS 开 发 方 法 的 技 巧 104 ESI-MS 的 溶 剂 选 择 104 APCI-MS 和 APPI-MS 的 溶 剂 选 择 105 离 子 对 色 谱 与 质 谱 联 用 系 统 的 溶 剂 选 择 105 样 品 前 处 理 106 基 质 组 分 106 浓 度 问 题 106 关 于 离 子 抑 制 的 注 意 事 项 106 使 用 配 备 高 效 色 谱 柱 的 LC/MS 时 的 注 意 事 项 107 灵 敏 度 的 提 升 107 质 谱 扫 描 速 率 108 系 统 扩 散 108 LC/MS 软 件 109 扫 描 类 型 比 较 TIC EIC 和 SIM 109 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 110 色 谱 结 果 的 保 护 112 可 扩 展 性 113 使 用 高 纯 度 级 别 溶 剂 的 重 要 性 116 UHPLC 的 特 殊 考 虑 116 在 线 过 滤 器 117 低 体 积 在 线 过 滤 器 117 保 护 柱 118 溶 剂 饱 和 柱 118 色 谱 柱 入 口 筛 板 118 色 谱 柱 保 护 和 保 存 118 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 118 保 存 注 意 事 项 120 疏 通 色 谱 柱 120 色 谱 柱 变 坏 时 的 快 速 检 查 120 确 保 方 法 在 全 球 范 围 内 都 重 现 121 提 高 方 法 的 耐 用 性 121 有 关 驻 留 体 积 的 提 示 122 快 速 故 障 排 查 指 南 123 有 效 排 查 故 障 的 要 点 123 有 用 的 参 考 资 料 129 美 国 药 典 指 定 填 料 129 溶 剂 相 溶 性 135 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 138 固 相 萃 取 吸 附 剂 139 SPE 吸 附 剂 条 件 140 其 它 推 荐 的 读 物 141 其 它 安 捷 伦 资 源 141 词 汇 表 142 索 引 169 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 175 安 捷 伦 毛 细 管 和 接 头 181 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪 器 用 灯 186 安 捷 伦 溶 剂 安 全 盖 188 安 捷 伦 在 线 过 滤 器 190 Agilent 1200 Infinity 系 列 液 相 色 谱 产 品 组 合 191 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 192 备 注 194 4

前 言 从 何 说 起 呢? 液 相 色 谱 是 一 个 庞 大 而 复 杂 的 话 题, 但 也 是 一 个 我 们 永 不 会 失 去 兴 趣 的 话 题 遍 及 世 界 各 地 的 色 谱 工 作 者 正 在 使 用 HPLC 技 术, 确 保 我 们 食 物 和 水 的 安 全 开 发 挽 救 生 命 的 药 物 保 护 我 们 的 环 境 保 卫 公 共 健 康, 而 这 仅 仅 是 其 应 用 的 一 角 您 对 色 谱 技 术 了 解 得 越 多, 您 能 应 用 这 一 神 奇 技 术 所 能 做 的 工 作 就 越 多 如 今, 有 更 多 的 色 谱 柱 和 填 料 供 您 选 择, 以 适 应 日 益 广 泛 的 应 用 需 求 安 捷 伦 现 在 有 2000 多 种 色 谱 柱 可 供 选 择, 覆 盖 了 最 广 泛 的 应 用 和 条 件 这 就 增 加 了 根 据 您 的 需 要 选 择 最 适 用 色 谱 柱 的 机 会 帮 助 您 得 到 最 好 的 液 相 色 谱 结 果 是 我 们 承 诺 的 一 部 分, 因 此, 我 们 编 制 了 这 本 液 相 色 谱 柱 选 择 手 册, 其 中 包 含 了 大 量 的 提 示 和 技 巧, 让 您 的 工 作 更 轻 松 更 高 效 另 外, 我 们 还 以 40 多 年 积 累 的 经 验 为 基 础, 为 您 提 供 色 谱 柱 和 接 头 日 常 使 用 中 常 见 的 问 题 提 供 建 议 本 指 南 涵 盖 了 液 相 色 谱 中 的 主 要 色 谱 柱, 重 点 是 反 相 高 效 液 相 色 谱 如 何 使 用 本 指 南 : 为 便 于 查 询, 各 章 节 有 不 同 颜 色 标 记 附 加 的 词 汇 表 非 常 全 面 虽 然 限 于 篇 幅, 我 们 没 能 收 录 本 书 中 的 每 个 词 汇 术 语, 但 仍 不 失 为 良 好 的 资 源 虽 然 本 书 也 涉 及 了 其 它 技 术, 但 重 点 是 反 相 HPLC 5

色 谱 的 基 本 概 念 我 们 都 还 记 得 在 学 校 里 学 习 数 学 的 感 觉, 总 是 想 知 道 怎 么 把 它 用 到 实 际 生 活 中 去 科 学 家 们 要 比 专 业 人 员 学 习 更 多 的 数 学, 本 章 将 告 诉 我 们 其 中 的 原 因 这 里, 我 们 将 简 要 概 述 一 下 色 谱 概 念 所 涉 及 的 公 式 和 理 论 对 这 些 概 念 的 理 解 将 帮 助 您 获 得 最 好 的 结 果, 并 在 遇 到 问 题 时 进 行 排 查 我 们 将 从 以 下 的 性 能 基 本 概 念 开 始 : 柱 效 保 留 选 择 性 分 离 度 压 力 这 些 都 是 理 解 如 何 优 化 结 果 成 功 开 发 方 法 的 关 键 我 们 还 将 探 讨 一 些 较 复 杂 的 概 念 : van Deemter 曲 线 梯 度 方 程 这 两 项 内 容 对 方 法 开 发 也 很 重 要 6

柱效 (N) 柱效用于比较不同色谱柱的性能 柱效可能是描述色谱柱性能引用频率最高的参数 以理论塔板数 N 表示 柱效 保留时间 峰底宽 方程 1. 柱效方程 保留时间 半峰宽 方程 2. 计算柱效的变换方程 塔板数高的色谱柱柱效更高 理论塔板数高的色谱柱与理论塔板数低的色谱柱相比 在给定保留时间内的 色谱峰更窄 柱效 N = 16 (tr/wt)2 对于色谱峰 B 16 (4.5 分钟/0.9 分钟) 2 = 400 塔板数 k = (tr-t0)/t0 保留 检测器响应 ka = (2.5-1)/1 = 1.5 kb = (4.6-1)/1 = 3.6 kc = (6.2-1)/1 = 5.2 选择性 (C-B) α = k2/k1 α = kc/kb = 5.2/3.6 = 1.44 α = 1.44 选择性 (B-A) α = k2/k1 α = kb/ka = 3.6/1.5 = 2.4 图 1. 柱效的色谱示意图 α = 2.4 7

如 果 我 们 在 约 4σ 峰 宽 处 做 切 线, 并 测 量 t w 距 离, 就 可 以 用 方 程 1 计 算 色 谱 峰 B 的 理 论 塔 板 数,N = 16 (t R /t W ) 2 有 时,4σ 峰 宽 很 难 测 量 ( 如, 基 线 噪 音 较 大 时 ), 可 以 使 用 变 换 方 程 ( 方 程 2), 测 量 半 峰 宽 (w 1/2 ):N = 5.54 (t R /w 1/2 ) 2 高 柱 效 的 好 处 很 大, 即 使 选 择 性 较 低 也 可 以 分 离 窄 峰 柱 效 受 柱 参 数 ( 内 径 柱 长 粒 度 ) 洗 脱 液 类 型 ( 特 别 是 粘 度 ) 流 速 或 平 均 线 速 度 的 影 响 柱 效 还 受 化 合 物 及 其 保 留 的 影 响 常 使 用 每 米 理 论 塔 板 数 (N/m) 进 行 色 谱 柱 的 比 较, 但 需 要 在 相 同 的 色 谱 温 度 条 件 和 峰 保 留 (k) 下 进 行 对 于 α 较 小 的 固 定 相, 柱 效 对 分 离 更 为 重 要 保 留 因 子 (k) 过 去 称 为 容 量 因 子 或 k (k 值 ), 保 留 因 子 是 指 样 品 组 分 停 留 在 固 定 相 中 相 对 其 驻 留 在 流 动 相 中 的 时 间 之 比 用 保 留 时 间 除 以 峰 不 保 留 时 间 (t 0 ) 进 行 计 算 样 品 峰 的 保 留 时 间 保 留 因 子 峰 不 保 留 时 间 方 程 3. 保 留 因 子 方 程 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 分 离 因 子 是 对 两 个 色 谱 峰 之 间 时 间 或 距 离 的 最 大 测 量 值 如 果 α = 1, 则 两 个 色 谱 峰 具 有 相 同 的 保 留 时 间 并 共 洗 脱 选 择 性 因 子 第 一 个 峰 的 保 留 因 子 第 二 个 峰 的 保 留 因 子 方 程 4. 选 择 性 方 程 8

选 择 性 因 子 的 定 义 是 容 量 因 子 之 比 在 图 1 中, 您 会 看 到, 峰 A 和 峰 B 之 间 的 选 择 性 比 峰 B 和 峰 C 的 选 择 性 更 好 图 中 提 供 了 计 算 说 明 改 变 流 动 相 或 固 定 相 都 可 以 改 变 选 择 性 温 度 也 是 调 节 选 择 性 的 一 个 因 素 分 离 度 (R s ) 分 离 度 代 表 色 谱 柱 分 离 目 标 峰 的 能 力, 因 此, 分 离 度 越 高, 两 峰 之 间 越 容 易 得 到 基 线 分 离 从 方 程 5 中 可 以 看 出, 分 离 度 与 柱 效 选 择 性 和 保 留 值 相 关 可 以 通 过 改 善 这 些 因 素 来 提 高 分 离 度 方 程 5. 分 离 度 方 程 在 图 2 中, 我 们 可 以 看 到 每 个 参 数 在 分 离 过 程 中 的 不 同 作 用 所 有 这 些 参 数 都 呈 效 应 递 减 趋 势 即 取 值 越 大, 对 分 离 度 的 影 响 就 越 小 如 果 将 柱 长 加 倍, 将 得 到 更 多 的 理 论 塔 板 数, 但 分 离 时 间 也 将 延 长 2 倍, 而 分 离 度 只 能 得 到 2 的 平 方 根 即 1.4 倍 的 提 高 如 果 要 对 色 谱 峰 进 行 定 量, 那 么 分 离 度 最 小 应 等 于 1 分 离 度 要 达 到 0.6, 才 能 分 辨 两 个 等 高 峰 间 的 峰 谷 如 需 建 立 耐 用 方 法, 理 想 分 离 度 值 一 般 应 大 于 等 于 1.7 基 线 分 离 并 确 保 最 准 确 定 量 结 果 的 分 离 度 应 为 1.6 9

选择性对分离度的影响主要是通过 改变键合相 改变流动相 塔板数是最容易增加的 分离度 增加 N 增加选择性 增加 k 塔板数 选择性 图 2. 分离度为选择性 柱效和保留值的函数 压力 压力方程 方程 6 包含影响系统压力的 5 个重要参数 溶剂粘度 (h) 流速 (F) 柱长 (L) 色谱柱半径 (r) 和填料粒径 (dp) 熟悉压力方程将能很好地理解这些重要参数对系统压力的影响 压力的改变 粘度 流速 柱长 柱渗透性 柱半径 粒径 方程 6. 压力方程 从公式中可以看出 粒径 (dp) 稍微降低就会对反压造成明显影响 10

van Deemter 曲 线 van Deemter 方 程 是 将 柱 效 作 为 线 速 度 (u) 或 流 速 的 函 数 对 柱 效 ( 用 H 表 示, 见 方 程 7) 进 行 评 价 H 称 为 塔 板 高 度, 或 理 论 塔 板 高 度, 用 柱 长 (L) 除 以 理 论 塔 板 数 进 行 计 算 我 们 的 目 标 是 得 到 小 塔 板 高 度 可 以 通 过 使 用 较 小 填 料 色 谱 柱 优 化 线 速 度, 以 及 使 用 低 粘 度 流 动 相, 更 有 效 地 实 现 这 一 目 标 随 着 粒 径 减 小, 优 化 线 速 度 将 增 大 方 程 7. van Deemter 方 程 塔 板 高 度 (H) 大 粒 径 填 料 小 粒 径 填 料 总 曲 线 :van Deemter 传 质 阻 力 纵 向 扩 散 涡 流 扩 散 线 速 度 (u) 塔 板 高 度 越 小, 塔 板 数 越 大, 色 谱 分 离 度 将 越 大 图 3. van Deemter 方 程 图 示 我 们 经 常 通 过 绘 制 van Deemter 曲 线 评 价 不 同 色 谱 柱 的 性 能, 并 理 解 如 何 根 据 方 法 进 行 线 速 度 的 优 化 (u opt ) 梯 度 方 程 当 样 品 中 存 在 各 种 类 型 的 组 分 时, 我 们 很 难 用 等 度 洗 脱 ( 即, 恒 定 流 动 相 组 成 ) 在 适 当 时 间 内 让 所 有 组 分 都 得 到 分 离 梯 度 洗 脱 是 一 个 随 时 间 提 高 流 动 相 强 度 的 过 程, 最 终 使 分 析 速 度 更 快 峰 形 和 定 量 结 果 更 好 通 过 梯 度 洗 脱, 峰 宽 通 常 将 更 窄, 并 保 持 恒 定 ( 有 关 梯 度 洗 脱 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 55 页 ) 梯 度 方 程 ( 方 程 8) 显 示 了 影 响 分 析 的 关 键 因 素, 如 果 忽 视 它 们, 可 能 会 给 色 谱 分 离 带 来 问 题 该 方 程 显 示 了 流 速 (F) 梯 度 时 间 (t G ) 梯 度 范 围 (DF) 和 柱 体 积 (V M ) 对 保 留 因 子 的 影 响 切 记, 为 保 持 保 留 因 子 恒 定, 如 需 改 变 分 母 则 需 按 比 例 改 变 分 子, 反 之 亦 然 11

增 加 保 留 因 子 k ( 或 k*, 在 梯 度 中 ) 是 提 高 分 离 度 的 简 便 途 径, 但 如 图 2 所 示, 它 并 不 如 增 加 柱 效 和 选 择 性 更 有 效 如 通 过 延 长 梯 度 时 间 增 加 保 留 因 子, 将 使 分 析 时 间 延 长, 如 方 程 8 所 示 梯 度 时 间 流 速 梯 度 保 留 值 色 谱 柱 死 体 积 常 数 B 溶 剂 体 积 变 化 方 程 8. 梯 度 方 程 在 梯 度 方 程 中,S 为 常 数, 与 所 分 离 的 分 子 大 小 有 关 小 分 子 的 S 值 约 为 4 到 6, 多 肽 和 蛋 白 质 的 S 介 于 10 到 1000 之 间 现 在, 经 常 使 用 不 同 尺 寸 的 色 谱 柱, 或 使 其 更 短 ( 例 如, 为 实 现 更 高 通 量 ), 或 使 用 窄 内 径 柱 ( 如, 用 于 质 谱 检 测 ) 必 须 按 比 例 缩 短 梯 度 时 间 (t G ) 或 减 小 流 速 (F), 以 补 偿 柱 体 积 的 减 少 使 用 相 同 色 谱 柱 时, 如 果 想 保 持 相 同 的 梯 度 斜 率 和 k* 值, 则 需 在 梯 度 时 间 (t G ) 内 按 比 例 调 整 梯 度 组 成 (DF) 改 变 速 率 或 流 速 (F) 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 软 件 是 将 方 法 转 移 到 不 同 规 格 色 谱 柱 时 的 绝 佳 方 法 登 录 www.agilent.com 输 入 液 相 色 谱 方 法 转 移 器 (LC Method Translator) 搜 索 得 到 方 法 转 移 器 12

液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 HPLC 或 UHPLC 分 离 分 析 物 混 合 物 和 检 测 各 种 化 合 物 采 用 的 典 型 液 相 色 谱 系 统 由 四 个 核 心 组 件 组 成 本 章 将 介 绍 这 些 组 件, 并 着 重 介 绍 它 们 最 重 要 且 最 关 键 的 方 面 在 操 作 或 选 择 液 相 色 谱 系 统 时 对 这 些 方 面 的 慎 重 考 量, 有 助 于 我 们 获 得 稳 定 一 致 的 结 果 和 实 现 效 率 最 大 化 典 型 液 相 色 谱 系 统 中 的 每 个 组 件 或 模 块 在 分 离 和 检 测 过 程 中 都 各 自 发 挥 着 它 们 独 有 的 功 能, 而 这 些 功 能 都 同 等 重 要 为 了 描 述 这 些 功 能, 我 们 将 按 照 系 统 流 路 的 顺 序 ( 从 泵 到 进 样 器 和 色 谱 柱, 再 到 检 测 器 ) 进 行 介 绍, 见 图 4 色 谱 柱 泵 自 动 进 样 器 检 测 器 一 维 色 谱 图 泵 泵 自 动 进 样 器 色 谱 柱 检 测 器 ( 可 选 ) 阀 ( 进 样 器 ) 色 谱 柱 检 测 器 二 维 色 谱 图 图 4. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 的 组 件 13

Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 新 型 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 代 表 UHPLC 的 未 来, 其 拥 有 安 捷 伦 提 供 的 无 与 伦 比 的 可 靠 性 和 稳 定 性, 采 用 了 突 破 性 技 术, 能 够 最 大 程 度 地 提 高 您 的 业 务 效 率 分 析 效 率 最 大 化 : 无 可 比 拟 的 分 离 和 检 测 性 能, 可 提 供 最 高 质 量 的 分 析 数 据, 让 您 对 结 果 充 满 信 心 仪 器 效 率 最 大 化 : 最 高 的 样 品 容 量 最 快 的 进 样 周 期 以 及 前 所 未 有 的 可 用 性 使 仪 器 在 任 何 应 用 中 均 可 实 现 最 高 通 量 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 在 将 流 动 相 输 送 入 系 统 之 前, 泵 将 以 恒 定 的 比 例 ( 等 度 ) 或 变 化 的 比 例 ( 梯 度 ) 混 合 溶 剂 在 梯 度 模 式 下, 泵 逐 渐 提 升 流 动 相 中 第 二 种 组 分 所 占 的 百 分 比 我 们 将 流 动 相 的 第 二 种 组 分 称 为 溶 剂 B, 它 的 洗 脱 强 度 比 流 动 相 的 第 一 种 组 分 ( 溶 剂 A) 更 高 许 多 泵 还 设 有 脱 气 单 元, 用 于 去 除 溶 解 在 溶 剂 中 的 空 气 溶 剂 脱 气 有 助 于 减 少 检 测 器 基 线 波 动 ( 例 如 基 线 漂 移 和 噪 音 ) 压 力 范 围 HPLC 和 UHPLC 的 泵 输 送 流 动 相, 使 其 通 过 装 填 有 固 定 相 的 色 谱 柱 泵 必 须 在 50 bar 至 1300 bar 的 高 压 下 输 送 流 动 相 才 能 克 服 色 谱 柱 中 的 固 定 相 产 生 的 阻 力 标 准 HPLC 色 谱 柱 一 般 装 填 5 µm 硅 胶 基 质 颗 粒 对 于 50 mm 至 300 mm 长 内 径 为 4.6 mm 的 标 准 HPLC 色 谱 柱 而 言, 采 用 能 够 在 400 bar 的 压 力 下 输 送 液 流 的 泵 通 常 就 已 足 够 相 比 之 下, 现 代 UHPLC 所 用 的 色 谱 柱 颗 粒 可 达 到 2 µm 以 下 采 用 小 粒 径 的 全 多 孔 颗 粒 ( 小 于 2 µm) 且 内 径 较 小 ( 小 于 2.1 mm) 柱 长 较 长 ( 例 如 300 mm) 的 色 谱 柱 要 求 泵 具 有 1000 bar 或 更 高 的 输 送 压 力 分 析 型 液 相 色 谱 应 用 常 用 的 典 型 流 速 介 于 100 µl/min 和 10 ml/min 之 间 我 们 根 据 泵 的 能 力 范 围 ( 定 义 为 流 速 和 耐 压 能 力 的 组 合 ) 对 其 进 行 分 类 14

Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 在 高 达 2 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 1300 bar, 在 高 达 5 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 800 bar, 见 图 5 表 1 展 示 了 各 种 泵 适 用 的 色 谱 柱 类 型 bar 1200 1000 1290 Infinity II 1290 Infinity 800 600 400 200 1220/1260 Infinity HPLC 200 bar 10 ml/min 1220 / 1260 Infinity VL 0 0 1 2 3 4 5 ml/min 图 5. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 组 件 色 谱 柱 类 型 颗 粒 HPLC 3-5µm HPLC 表 面 多 孔 UHPLC < 2µm (STM) UHPLC 表 面 多 孔 色 谱 柱 柱 长 /mm 50-300 50-250 Short 30-50 Long 100-150 30-150 色 谱 柱 内 径 /mm 3.0-4.6 3.0-4.6 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0-4.6 最 大 压 力 /bar 400 400 1200 1200 600 1200 1200 600 600 600 安 捷 伦 色 谱 柱 类 型 多 种 Poroshell 120 4 µm 1290 高 速 泵 - 1300 bar 1290 全 能 泵 - 1300 bar RRHD RRHD RRHT RRHD RRHD RRHT Poroshell 120 2.7 µm Poroshell 120 2.7 µm 1260 Bin/600 bar 2) 1260Q/1220G - 600 bar 1) 2) 1) 常 规 液 相 色 谱 400 bar 2) 2) 2) 2) 3) 3) 图 示 说 明 最 好 良 好 可 接 受 不 适 用 1) 由 于 延 迟 体 积 的 原 因 2) 由 于 延 迟 体 积 和 压 力 的 原 因 3) 由 于 压 力 的 原 因 STM 短 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 30-50 mm STM 长 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 100-150 mm HPLC:3-5 µm 颗 粒 表 1. 色 谱 柱 填 料 应 用 条 件 指 南 15

溶 剂 混 合 除 了 输 送 流 动 相, 泵 还 必 须 以 高 准 确 度 和 高 精 度 混 合 溶 剂 泵 必 须 能 够 为 等 度 洗 脱 提 供 比 例 精 确 恒 定 的 溶 剂, 还 必 须 能 够 将 两 种 或 更 多 种 溶 剂 混 合 成 为 比 例 随 时 间 变 化 的 溶 剂 梯 度 泵 精 确 混 合 溶 剂 和 提 供 可 重 现 流 速 的 能 力 决 定 了 泵 的 保 留 时 间 重 现 性 保 留 时 间 是 液 相 色 谱 的 基 本 参 数 之 一, 它 能 指 示 采 用 特 定 的 色 谱 柱 和 流 动 相 组 合 进 行 分 离 时, 物 质 的 保 留 特 性 我 们 通 常 使 用 两 种 不 同 类 型 的 泵, 根 据 泵 混 合 溶 剂 的 方 式 来 区 分 它 们 四 元 泵 在 低 压 下 混 合 溶 剂 最 多 四 条 溶 剂 管 线 通 向 多 通 道 阀, 按 预 设 的 比 例 进 行 混 合 采 用 这 种 方 式, 泵 能 够 形 成 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 溶 剂 混 合 在 泵 的 低 压 侧 进 行, 见 图 6 对 溶 剂 进 行 适 当 的 脱 气 对 于 防 止 溶 剂 配 比 和 混 合 过 程 中 形 成 气 泡 至 关 重 要 通 常, 泵 利 用 内 置 单 元 或 外 部 单 元 对 溶 剂 进 行 脱 气, 然 后 利 用 高 压 泵 腔 将 混 合 好 的 溶 剂 ( 流 动 相 ) 输 送 至 进 样 器 脱 气 单 元 阻 尼 器 比 例 阀 伺 服 驱 动 的 串 联 式 双 活 塞 泵 图 6. 用 于 低 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 脱 气 单 元 比 例 阀 和 泵 腔 自 动 进 样 器 二 元 泵 在 泵 的 高 压 侧 混 合 溶 剂, 通 常 只 能 混 合 两 种 溶 剂 二 元 泵 的 主 要 优 势 在 于, 当 溶 剂 组 分 之 一 所 占 的 比 例 较 小 时, 它 能 够 更 准 确 更 精 密 地 混 合 溶 剂 此 类 混 合 可 在 溶 剂 梯 度 开 始 和 结 束 时 提 供 高 精 度 的 溶 剂 组 成, 见 图 7 高 压 混 合 二 元 泵 的 另 一 个 优 势 是 延 迟 体 积 较 小 我 们 将 延 迟 体 积 定 义 为 混 合 点 到 色 谱 柱 梯 度 启 始 处 之 间 的 流 动 相 体 积 缩 小 延 迟 体 积 有 利 于 加 快 运 行 速 度 和 缩 短 分 析 时 间 对 于 高 压 混 合 而 言, 脱 气 不 再 是 一 个 问 题, 因 为 溶 剂 在 混 合 时 处 于 加 压 状 态 16

脱 气 单 元 阻 尼 器 阻 尼 器 混 合 器 通 道 A 通 道 B 泵 自 动 进 样 器 图 7. 用 于 高 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 用 于 生 成 二 元 洗 脱 液 梯 度 的 两 个 溶 剂 通 道 与 二 元 泵 相 比, 四 元 泵 更 灵 活, 因 为 它 们 不 仅 能 提 供 二 元 梯 度, 还 能 提 供 三 元 和 四 元 梯 度 另 外, 四 元 泵 还 能 向 流 动 相 中 在 线 混 入 添 加 剂 低 压 混 合 泵 的 价 格 通 常 较 低, 因 为 它 们 只 有 一 个 泵, 而 高 压 混 合 则 需 要 两 个 泵, 见 表 2 等 度 泵 四 元 泵 二 元 泵 溶 剂 1 4 2 混 合 不 混 合 低 压 混 合 高 压 混 合 梯 度 无 梯 度, 仅 等 度 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 仅 二 元 梯 度 延 迟 体 积 无 梯 度, 无 延 迟 体 积 延 迟 体 积 较 大 延 迟 体 积 较 小 脱 气 机 必 须 脱 气 建 议 脱 气 梯 度 混 合 性 能 无 梯 度 中 心 处 性 能 良 好, 梯 度 两 端 性 能 较 差 (1290 Infinity II 全 能 泵 除 外 ) 性 能 极 佳 表 2. 液 相 色 谱 泵 的 不 同 混 合 原 理 比 较 17

延 迟 体 积 我 们 将 延 迟 体 积 或 滞 后 体 积 定 义 为 流 动 相 混 合 点 到 色 谱 柱 柱 头 之 间 的 系 统 体 积 延 迟 体 积 会 显 著 影 响 分 析 速 度 会 影 响 延 迟 体 积 的 主 要 系 统 组 件 包 括 样 品 混 合 器 和 阻 尼 器 连 接 毛 细 管 进 样 器 的 液 压 容 积 和 热 交 换 器 的 体 积 因 此, 泵 和 进 样 器 的 设 计 会 极 大 影 响 分 析 速 度 现 代 UHPLC 泵 经 过 专 门 设 计, 力 求 在 不 影 响 混 合 性 能 的 前 提 下 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 的 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 与 市 面 上 的 其 他 四 元 泵 均 不 同 此 款 泵 的 混 合 性 能 与 高 压 混 合 泵 相 当, 而 且 在 较 低 和 较 高 的 溶 剂 比 例 下 均 能 形 成 高 重 现 性 的 梯 度 相 比 之 下,Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 具 有 极 低 的 延 迟 体 积, 有 利 于 缩 短 运 行 时 间 Agilent 1290 Infinity II 泵 采 用 的 新 技 术 可 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent Jet Weaver 和 Inlet Weaver 混 合 器 可 确 保 有 效 混 合 小 体 积 溶 剂,Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 则 采 用 了 主 动 阻 尼 技 术, 在 混 合 过 程 中 将 流 动 相 的 压 缩 特 性 也 考 虑 在 内 这 种 可 实 现 皮 升 水 平 精 密 计 量 的 主 动 阻 尼 技 术 取 代 了 物 理 阻 尼 器 柱 外 体 积 我 们 将 柱 外 体 积 定 义 为 进 样 点 与 检 测 器 出 口 之 间 的 系 统 体 积 导 致 柱 外 体 积 产 生 的 主 要 因 素 包 括 毛 细 管 热 交 换 器 连 接 件 和 接 头, 以 及 检 测 器 流 通 池 如 果 柱 外 体 积 过 大, 会 导 致 样 品 扩 散 和 分 析 物 谱 带 展 宽, 进 而 导 致 分 离 度 下 降 和 灵 敏 度 降 低 使 用 毛 细 管 柱 接 头 或 者 在 系 统 中 安 装 色 谱 柱 时 尤 其 需 要 注 意 接 头 使 用 不 当 常 常 会 导 致 意 料 之 外 且 通 常 不 易 被 察 觉 的 死 体 积, 这 可 能 会 严 重 影 响 分 离 效 果 使 用 小 内 径 (2.1 mm 或 更 小 ) 的 色 谱 柱 进 行 等 度 分 离 时, 必 须 慎 重 考 虑 柱 外 体 积 和 毛 细 管 的 内 径 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 采 用 精 心 设 计 的 系 统 以 及 用 户 友 好 的 接 头 ( 例 如 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 ), 可 基 本 上 消 除 死 体 积, 让 液 相 色 谱 分 析 更 加 稳 定, 并 且 不 受 用 户 操 作 水 平 的 影 响 18

自动进样器 操纵工作流程自动化体系的 大脑 自动液体进样器 又称自动进样器 现在已经取代了手动进样器 因为它们能够在无需用户干预的前提下以 高准确度和高精度进样多个样品 分析型自动进样器 例如那些用于 HPLC 的进样器 可进样的样品体积通 常在 100 nl 至 100 µl 之间 通过一些改动 我们可以提高这些自动进样器可进样的样品量 从而将它们应 用于高度稀释的样品或半制备分析 在 UHPLC 分析中 自动进样器注入的样品量通常较少 因为此类系统 采用小内径色谱柱 为了实现良好的分离 必须避免色谱柱过载 固定样品环和流通式自动进样器 自动进样器可采用两种不同的设计方案 固定样品环和流通式自动进样器 在固定样品环设计中 样品被 吸入或推入一个样品环中 然后该样品环被切换到样品流路中 见图 8 泵 辅助溶剂 计量装置 废液 针座 1 2 10 9 3 8 4 5 自动进样器 色谱柱 6 7 废液 图 8. 采用固定样品环设计的自动进样器 图中所示为样品环被切换到样品流路中的状态 在流通式自动进样器中 流动相将通过样品环以及计量装置和进样针 流通式设计的主要优势在于其进样 量范围更灵活 见图 9 在固定样品环设计中 用户通常必须使样品环过载才能达到最高的重现性 用户 也可以部分填充样品环 但是这种方法的重现性较差 如果用户需要使用固定样品环自动进样器注入较小 或较大体积的样品 通常必须更换样品环 19

泵 样品环 计量装置 废液 针座 4 2 6 自动进样器 3 5 1 色谱柱 图 9. 采用流通式设计的自动进样器 显示液流如何将样品输送入色谱柱中 流通式设计的另一个优势是交叉污染较低 交叉污染是指前一次分析的样品组分出现在下一次运行的色谱 图中的现象 这是由于某些组分粘附到了系统表面 管线 接头或色谱柱材料上 并在下一次分析中被洗 脱下来 在流通式自动进样器设计中 整个梯度将会冲洗自动进样器的所有液压部件 这样可确保在色谱 运行过程中高效地清洁计量装置 样品环和进样针的内表面 表 3 总结了固定样品环和流通式自动进样器 之间的差异 固定样品环自动进样器 流通式自动进样器 原理 样品环被切入和切出溶剂流 样品环 进样针和计量装置被切入和切出溶剂流 样品浪费 高 因为样品环须过量填充 无 不更换硬件前提下的 低 可以部分填充样品环 但精度较低 高 进样量灵活性 进样量线性 差 因为必须使用不同的样品环 极佳 延迟体积 低 高 交叉污染 中等 低 因为在梯度运行过程中将冲洗所有的流路部件 表 3. 固定样品环和流通式自动进样器对比 在 HPLC 或 UHPLC 应用中 为了获得高质量的结果 我们必须考虑多个关键的自动进样器参数 后面的章 节将介绍这些参数 20

进 样 精 度 和 准 确 度 要 在 运 行 之 间 获 得 良 好 的 定 量 重 现 性, 进 样 精 度 至 关 重 要 进 样 精 度 是 指 自 动 进 样 器 在 多 次 运 行 中 保 持 相 同 进 样 量 的 能 力 另 一 方 面, 进 样 准 确 度 则 描 述 了 自 动 进 样 器 达 到 预 设 的 进 样 量 绝 对 值 的 能 力 现 代 UHPLC 仪 器 的 进 样 精 度 通 常 可 达 到 小 于 0.15% RSD 灵 活 性 和 样 品 容 量 如 今, 实 验 室 在 提 高 样 品 通 量 和 降 低 总 成 本 方 面 面 临 着 极 大 的 压 力 另 外,UHPLC 仪 器 也 越 来 越 多 地 应 用 于 多 用 户 环 境, 或 是 在 高 通 量 模 式 下 运 行 由 于 自 动 进 样 器 是 样 品 的 入 口 端, 因 此 该 模 块 需 要 使 用 灵 活 的 样 品 容 器 以 支 持 不 同 的 工 作 流 程, 还 要 避 免 造 成 干 扰 或 产 生 重 组 样 品 的 需 求 用 于 此 类 环 境 的 自 动 进 样 器 必 须 能 够 支 持 多 种 形 式 的 样 品 容 器 另 一 方 面, 通 常 需 要 采 用 大 型 进 样 器 装 置 来 满 足 高 容 量 要 求, 由 于 占 用 的 台 面 空 间 较 大, 通 常 会 导 致 成 本 升 高 Agilent 1200 Infinity 系 列 自 动 进 样 器 Agilent Infinity 系 列 的 大 多 数 自 动 进 样 器 均 采 用 流 通 式 设 计, 具 有 卓 越 的 灵 活 性 新 型 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 完 美 设 计 仅 占 用 极 小 的 台 面 空 间, 同 时 很 好 地 解 决 了 灵 活 性 和 高 样 品 容 量 问 题 用 户 可 使 用 不 同 的 样 品 抽 屉, 并 且 可 对 样 品 抽 屉 进 行 配 置 和 更 改 以 满 足 用 户 的 当 前 需 求 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 样 品 容 量 已 进 行 优 化 设 计, 使 用 384 孔 微 量 滴 定 板 时, 通 过 单 模 块 堆 叠 即 可 实 现 6000 个 样 品 以 上 的 容 量 进 样 周 期 进 样 周 期 是 液 相 色 谱 分 析 中 容 易 被 忽 视 的 一 个 参 数 现 在, 借 助 新 型 UHPLC 仪 器 和 亚 2 µm 颗 粒 色 谱 柱 技 术, 运 行 时 间 可 缩 短 为 1 分 钟 以 下, 甚 至 仅 30 秒, 而 且 不 会 影 响 分 离 度 从 前 一 次 运 行 结 束 到 吸 取 样 品 并 最 终 进 样 开 始 下 一 次 运 行 所 需 的 时 间 已 接 近 甚 至 超 出 上 述 运 行 时 间 受 高 载 样 量 的 限 制 以 及 鉴 于 快 速 获 得 结 果 的 需 要, 我 们 必 须 将 非 生 产 性 的 额 外 时 间 降 至 最 低 新 型 自 动 进 样 器 设 计 在 前 一 次 运 行 过 程 中 即 开 始 下 一 次 进 样 操 作, 并 将 这 种 运 行 方 式 与 快 速 自 动 装 置 相 结 合, 能 够 很 好 地 满 足 上 述 要 求 这 样 可 最 大 程 度 减 少 运 行 的 额 外 时 间, 将 其 缩 短 至 10 秒 以 下 21

交 叉 污 染 近 年 来, 液 相 色 谱 的 检 测 限 已 经 大 幅 降 低 ( 尤 其 是 与 高 端 质 谱 检 测 相 结 合 时 ) 甚 至 浓 度 极 低 的 杂 质 也 可 轻 松 检 出 要 想 达 到 极 低 的 检 测 限, 必 须 使 用 纯 净 的 溶 剂 和 洁 净 的 仪 器 前 一 次 分 析 中 分 离 和 检 测 的 化 合 物 不 应 出 现 在 下 一 次 或 后 续 的 分 析 中, 否 则 会 影 响 样 品 序 列 的 结 果 和 定 量 分 析 自 动 进 样 器 必 须 精 心 设 计, 力 求 最 大 程 度 减 少 交 叉 污 染 在 自 动 进 样 器 中, 进 样 针 和 针 座 之 间 的 接 口 至 关 重 要 粘 着 力 强 的 化 合 物 容 易 吸 附 到 这 些 部 件 的 表 面, 而 除 去 这 些 痕 量 的 化 合 物 可 能 是 一 项 繁 琐 的 工 作 必 须 对 材 料 表 面 进 行 设 计, 消 除 它 们 与 非 极 性 分 析 物 之 间 的 相 互 作 用 连 接 部 件 时 应 非 常 小 心, 以 避 免 任 何 死 体 积 ( 即 使 非 常 小 ), 以 及 避 免 产 生 任 何 划 痕 或 磨 损, 防 止 其 造 成 机 械 影 响 使 用 强 溶 剂 进 行 进 样 针 清 洗 程 序 通 常 有 助 于 大 幅 减 少 交 叉 污 染 大 多 数 现 代 自 动 进 样 器 均 配 备 有 内 置 的 进 样 针 清 洗 站, 用 于 在 吸 入 样 品 并 将 其 转 移 到 进 样 口 之 前 对 进 样 针 的 外 表 面 进 行 清 洗 如 果 不 进 行 适 当 清 洗, 进 样 针 的 外 表 面 将 成 为 交 叉 污 染 的 主 要 来 源 利 用 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 消 除 交 叉 污 染 新 型 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 具 有 更 先 进 的 交 叉 污 染 消 除 功 能 该 系 列 的 自 动 进 样 器 可 配 置 多 重 清 洗 功 能, 该 功 能 不 仅 能 够 清 洁 进 样 针 的 外 表 面, 还 能 有 效 反 冲 针 座 ( 交 叉 污 染 的 第 二 大 主 要 来 源 ), 可 选 择 的 外 部 清 洗 溶 剂 多 达 三 种 利 用 多 重 清 洗 功 能, 洗 必 泰 的 交 叉 污 染 值 可 降 低 至 10 ppm 以 下, 这 使 得 Multisampler 成 为 了 高 端 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 的 理 想 之 选 清 洗 进 样 针 内 部 应 用 流 通 式 原 理 充 分 清 洗 进 样 针 内 部, 确 保 洗 脱 液 的 一 致 性 清 洗 进 样 针 外 部 可 设 置 进 样 针 外 的 清 洗 程 序, 提 供 多 达 3 种 外 部 清 洗 溶 剂 供 您 选 择 主 动 式 针 座 反 冲 可 选 择 3 种 外 部 溶 剂 反 冲 针 座 22

新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 自 动 进 样 器 不 仅 能 够 用 作 简 单 的 进 样 装 置, 用 于 在 无 用 户 干 预 的 情 况 下 引 入 样 品, 它 们 还 具 有 处 理 和 制 备 样 品 或 者 执 行 并 行 任 务 以 节 省 时 间 等 多 种 功 能 另 外, 现 代 自 动 进 样 器 都 采 用 针 对 许 多 经 验 不 足 的 用 户 而 设 计 的 防 呆 界 面 组 合, 让 这 些 用 户 只 需 提 交 样 品 即 可 完 成 分 析, 它 们 同 时 也 是 智 能 的 样 品 组 织 器, 能 够 根 据 企 业 优 先 级 来 安 排 连 续 分 析 运 行 自 动 进 样 器 还 可 帮 助 您 对 独 立 操 作 进 行 编 程 利 用 该 功 能, 您 可 以 混 合 样 品 添 加 内 标 或 执 行 稀 释 步 骤 例 如, 在 氨 基 酸 分 析 中, 您 可 以 利 用 自 动 进 样 器 直 接 进 行 自 动 衍 生 化 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 的 双 针 头 功 能 将 进 样 器 的 功 能 扩 展 到 简 单 进 样 功 能 之 外 的 另 一 个 例 子 是 1200 Infinity 系 列 Multisampler 全 新 的 双 针 头 功 能 两 个 进 样 针 样 品 环 组 件 能 够 以 多 种 不 同 方 式 使 用 在 两 个 经 过 校 准 且 具 有 类 似 容 量 的 进 样 针 之 间 切 换 还 有 助 于 进 一 步 提 高 通 量 第 二 个 进 样 针 在 前 一 次 运 行 还 在 进 行 的 过 程 中 即 可 开 始 进 样 针 清 洗 和 样 品 吸 入 操 作, 如 此 一 来, 前 一 次 运 行 完 成 之 后 即 可 立 即 进 样 或 者, 两 个 进 样 针 可 配 备 不 同 尺 寸 的 样 品 环, 从 而 交 替 地 执 行 小 体 积 进 样 ( 用 于 UHPLC 分 析 ) 和 大 体 积 进 样 ( 用 于 传 统 方 法 或 富 集 分 析 ), 而 不 会 由 于 延 迟 体 积 较 大 而 影 响 分 析 速 度 利 用 双 针 头 配 置, 用 户 还 能 在 特 定 工 作 流 程 中 为 特 定 样 品 或 标 样 保 留 一 个 进 样 针, 从 根 本 上 消 除 产 生 交 叉 污 染 的 可 能 性 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 柱 温 箱 是 液 相 色 谱 系 统 中 一 个 经 常 被 低 估 的 组 件, 但 事 实 上 该 模 块 对 于 确 保 分 离 柱 运 行 环 境 的 稳 定 性 和 获 得 可 重 现 的 结 果 而 言 至 关 重 要 当 实 验 室 的 室 温 在 一 天 之 中 会 发 生 变 化 或 者 需 要 将 方 法 从 一 个 场 所 转 移 至 另 一 个 场 所 时, 稳 定 的 环 境 尤 其 重 要 温 度 会 影 响 保 留 因 子 k, 还 会 影 响 样 品 的 分 离 度 温 度 还 是 方 法 开 发 过 程 要 使 用 的 参 数 之 一 柱 温 箱 可 以 是 简 单 的 柱 温 箱, 或 者 是 能 够 将 色 谱 柱 周 围 加 热 到 预 设 温 度 ( 通 常 高 达 80 C) 的 加 热 器 现 代 柱 温 箱 配 备 有 溶 剂 热 交 换 器, 还 可 将 溶 剂 加 热 到 预 设 温 度 进 行 方 法 开 发 时, 我 们 可 以 使 用 帕 尔 帖 型 柱 温 箱, 因 为 此 类 装 置 能 够 更 快 速 地 改 变 温 度, 而 温 度 是 开 发 色 谱 方 法 时 可 以 改 变 的 参 数 之 一 另 外, 帕 尔 帖 型 柱 温 箱 不 仅 能 够 加 热 溶 剂 和 色 谱 柱 环 境, 还 能 冷 却 色 谱 柱 或 维 持 定 义 的 室 温 左 右 的 稳 定 温 度 大 多 数 应 用 都 在 约 40 C 下 进 行 分 离 在 较 高 的 温 度 下, 保 留 时 间 将 缩 短, 可 实 现 更 快 速 的 洗 脱 在 较 低 的 温 度 下, 保 留 时 间 通 常 会 增 加, 在 反 相 分 离 中 尤 其 如 此 UHPLC 应 用 通 常 采 用 较 高 的 温 度, 目 的 是 降 低 溶 剂 粘 度 以 及 降 低 由 小 颗 粒 和 高 流 速 引 起 的 背 压 因 此, 用 于 UHPLC 的 柱 温 箱 通 常 需 加 热 至 高 达 100 C 或 更 高 的 温 度 23

柱 温 箱 是 一 个 需 要 用 户 频 繁 干 预 的 液 相 色 谱 模 块 用 户 需 要 不 同 的 选 择 性 或 需 要 达 到 更 出 色 的 分 离 度 时, 必 须 连 接 或 移 除 色 谱 柱 柱 温 箱 通 常 还 可 容 纳 多 根 色 谱 柱 和 / 或 阀, 以 支 持 自 动 化 的 方 法 开 发 色 谱 柱 切 换 富 集 或 交 替 色 谱 柱 再 生 等 功 能 为 确 保 柱 温 箱 便 于 用 户 操 作, 以 及 避 免 安 装 色 谱 柱 时 出 错 ( 如 产 生 死 体 积 或 导 致 泄 漏 ), 易 用 性 具 有 重 要 的 意 义 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 的 灵 活 性 和 易 用 性 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 让 用 户 在 几 秒 钟 内 即 可 轻 松 安 装 色 谱 柱 热 交 换 器 和 带 有 多 根 毛 细 管 的 阀 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 避 免 了 在 色 谱 柱 连 接 中 意 外 引 入 微 小 泄 漏 点 的 可 能 性 检 测 器 感 知 器 官 液 相 色 谱 系 统 中 可 整 合 各 种 类 型 的 检 测 器 最 常 用 的 检 测 器 类 型 是 光 吸 收 型 检 测 器 荧 光 检 测 器 示 差 折 光 检 测 器 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 本 章 将 重 点 介 绍 光 吸 收 型 检 测 器, 因 为 超 过 三 分 之 二 的 液 相 色 谱 系 统 都 采 用 此 类 检 测 器 不 同 类 型 的 检 测 器 在 灵 敏 度 选 择 性 和 线 性 范 围 方 面 各 有 差 异 灵 敏 度 定 义 了 检 测 器 可 检 出 的 最 低 化 合 物 浓 度 选 择 性 决 定 了 检 测 器 对 特 定 化 合 物 的 特 异 性 线 性 范 围 是 特 定 化 合 物 的 一 个 浓 度 范 围, 在 该 范 围 内 检 测 器 可 提 供 线 性 的 响 应 信 号 检 测 器 还 分 为 破 坏 性 检 测 器 和 无 损 检 测 器 紫 外 吸 收 检 测 器 荧 光 检 测 器 和 示 差 折 光 检 测 器 属 于 无 损 检 测 器 通 过 检 测 池 的 化 合 物 将 保 持 其 完 整 性, 并 且 可 以 进 行 回 收 相 反, 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 则 属 于 破 坏 性 检 测 器, 因 为 化 合 物 在 检 测 过 程 中 将 被 破 坏 通 过 紫 外 吸 收 光 度 法 进 行 定 量 分 析 的 基 础 是 朗 伯 - 比 尔 定 律 吸 光 度 A 是 通 过 洗 脱 介 质 前 后 的 光 强 度 对 数 之 比, 它 与 吸 光 化 合 物 的 浓 度 C 光 程 d 和 摩 尔 吸 光 系 数 [ 的 乘 积 成 正 比 l0l=a=[cd 现 代 HPLC 和 UHPLC 中 应 用 最 广 泛 的 检 测 器 类 型 是 基 于 对 紫 外 线 (UV) 和 可 见 光 的 吸 收 此 类 检 测 器 对 许 多 化 合 物 具 有 较 高 的 灵 敏 度, 但 前 提 是 化 合 物 必 须 能 够 吸 收 190 nm 至 600 nm 范 围 内 的 紫 外 或 可 见 光 24

光 吸 收 型 检 测 器 可 采 用 两 种 光 学 技 术 第 一 种 是 采 用 直 接 光 学 元 件, 具 有 目 标 波 长 的 光 将 通 过 检 测 池, 然 后 由 单 个 光 电 二 极 管 捕 获 产 生 的 光 线 配 备 直 接 光 学 元 件 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 固 定 波 长 检 测 器, 见 图 10 第 二 种 是 采 用 反 向 光 学 元 件, 波 长 在 190 nm 至 600 nm 内 的 所 有 光 线 都 将 通 过 流 通 池 产 生 的 光 线 将 由 光 栅 分 离 为 其 组 成 波 长, 然 后 由 光 电 二 极 管 阵 列 采 集 所 得 的 光 谱 信 息 配 备 反 向 光 学 元 件 和 光 电 二 极 管 阵 列 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 二 极 管 阵 列 检 测 器, 见 图 11 二 极 管 阵 列 检 测 器 不 仅 能 够 在 多 个 波 长 下 进 行 检 测, 还 能 生 成 UV 光 谱 用 于 明 确 鉴 定 特 定 的 化 合 物 氘 灯 滤 光 片 组 件 狭 缝 镜 1 光 栅 镜 2 样 品 二 极 管 流 通 池 分 束 器 参 考 二 极 管 检 测 器 (VWD) MCT 图 10. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 光 栅 狭 缝 二 极 管 阵 列 氘 灯 流 通 池 检 测 器 (DAD) MCT 图 11. 配 备 反 向 光 学 元 件 的 二 极 管 阵 列 检 测 器 的 检 测 原 理 25

检 测 器 灵 敏 度 检 测 限 (LOD) 是 指 信 号 能 够 与 检 测 器 噪 音 区 分 的 最 低 化 合 物 浓 度, 见 图 12 LOD 取 决 于 信 号 高 度 和 检 测 器 噪 音, 并 且 根 据 其 比 值 进 行 计 算 :H 信 号 = 3 h 噪 音 信 号 噪 音 图 12. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 在 UV 检 测 中, 信 号 高 度 取 决 于 化 合 物 特 有 的 吸 光 系 数 光 程 峰 扩 散 和 检 测 波 长 检 测 器 噪 音 取 决 于 许 多 因 素, 例 如, 光 强 度 泵 脉 动 电 子 元 件 噪 音 数 据 采 集 速 率 RI 效 应 温 度 流 速 和 流 通 池 设 计 增 加 光 程 而 保 持 流 通 池 内 部 体 积 不 变, 同 时 尽 可 能 保 持 最 低 水 平 的 检 测 器 噪 音, 可 获 得 最 高 的 灵 敏 度 与 老 式 流 通 池 ( 检 测 池 的 流 路 通 常 采 用 锥 形 设 计 ) 相 比, 现 代 检 测 器 配 备 的 流 通 池 已 经 能 够 实 现 全 内 反 射 线 性 范 围 当 您 需 要 在 较 宽 的 浓 度 范 围 内 进 行 定 量 分 析 时, 检 测 器 的 线 性 范 围 非 常 重 要 当 目 标 化 合 物 具 有 显 著 不 同 的 浓 度 和 UV 响 应 时, 线 性 范 围 也 非 常 重 要 在 分 析 含 有 大 量 主 要 组 分 和 微 量 杂 质 的 样 品 时 可 能 会 遇 到 上 述 情 况 对 于 此 类 样 品, 我 们 必 须 同 时 采 集 所 有 化 合 物 的 定 量 信 息 目 前 的 液 相 色 谱 UV 检 测 器 具 有 4 到 5 个 数 量 级 的 线 性 范 围 使 用 可 在 单 次 分 析 中 定 量 分 析 低 浓 度 和 高 浓 度 化 合 物 的 检 测 方 案 可 显 著 扩 展 这 一 线 性 范 围 该 方 法 有 助 于 同 时 定 量 分 析 主 要 组 分 微 量 组 分 及 其 杂 质 ( 如 固 定 剂 量 复 方 药 ) 由 于 无 需 进 行 系 列 稀 释 和 多 次 运 行, 可 节 省 大 量 时 间 和 成 本 26

数据采集速率 数据采集速率是检测器每秒能够采集的数据点的数量 常规 UV 检测器的数据采集速率高达 20 Hz 足以用 于标准 HPLC 分析 但 UHPLC 分析要求更高的数据采集速率 因为它需要在快速运行中对窄峰进行精确的定 量分析 配备最大光强流通池的安捷伦二极管阵列检测器 安捷伦最大光强高灵敏度流通池采用了光流波导技术 尽管光程达 60 mm 但扩散体积仅为 4 µl 见图 13 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器采用了这种流通池 因此其灵敏度比之前的检测器高出 10 倍 见图 14 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器的另一个功能是能够以 240 Hz 的速率采集数据 可确保在仅耗时几秒的快速运行中获得出 色的定量结果 安捷伦高动态范围检测解决方案显著扩展了线性检测范围 见图 15 通过结合分别具有短光程和长光 程的两个检测器 该解决方案通过单次分析即可同时定量分析低浓度和高浓度样品组分 灵敏度比之前的型号高 n 倍 图 13. 配备最大光强流通池的 1260/1290 Infinity DAD 中的光流波导 1050 系列 1100 系列 1200 系列 图 14. DAD 检测灵敏度的发展史 1260/1290 Infinity DAD 的问 世将灵敏度提高了 10 倍以上 灵敏度提高 30 倍 检测器噪音低 10 倍 线性水平的上限提高了 3 倍 信号 0倍 了3 宽 围拓 AD RD D 将H 性范 的线 之前的 DAD 浓度 图 15. 利用 1200 Infinity 系列 DAD-HDR 解决方案扩展线性范围 27

HPLC 柱 的 选 择 色 谱 柱 的 选 择 一 半 是 科 学, 一 半 是 艺 术 我 们 之 所 以 这 么 说, 是 因 为 这 里 有 一 些 确 定 的 明 了 标 准 : 与 应 用 相 适 合 的 色 谱 柱 固 定 相 与 系 统 压 力 限 相 适 应 的 规 格 等 等 在 多 数 情 况 下, 预 定 义 方 法 可 能 规 定 了 特 定 的 固 定 相 或 色 谱 柱 规 格, 所 以, 选 择 色 谱 柱 必 须 符 合 这 些 规 格, 确 保 来 自 可 靠 的 高 质 量 色 谱 柱 供 应 商 ( 我 们 推 荐 安 捷 伦, 您 也 可 以 选 择 别 的 品 牌 ) 此 外, 方 法 开 发 可 能 更 有 技 巧, 在 这 个 过 程 中 要 测 试 各 种 固 定 相 和 流 动 相 的 性 能, 以 获 得 符 合 您 应 用 需 求 的 选 择 性 本 节 首 先 要 回 顾 一 些 基 本 概 念 : HPLC 模 式 常 见 的 HPLC 柱 填 料 接 下 来, 我 们 再 来 专 门 讨 论 现 在 最 常 用 的 主 要 色 谱 柱 类 型 及 其 特 点 : HPLC 柱 UHPLC 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 LC/MS 柱 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 生 物 表 征 色 谱 柱 28

我 们 还 将 解 释 一 些 关 键 柱 参 数 的 重 要 性 : 填 料 硅 胶 键 合 相 聚 合 物 孔 径 粒 径 柱 规 格 在 本 节 的 最 后, 我 们 将 对 现 有 卡 套 式 色 谱 柱 进 行 概 要 介 绍, 包 括 保 护 柱 半 制 备 柱, 以 及 制 备 和 生 产 柱 本 节 资 料 应 与 包 含 更 多 色 谱 柱 固 定 相 和 选 择 性 信 息 的 方 法 开 发 一 节 ( 第 61 页 ) 中 色 谱 柱 选 择 部 分 结 合 使 用 HPLC 模 式 在 开 始 评 估 色 谱 柱 之 前, 最 重 要 的 工 作 是 要 确 定 HPLC 模 式 目 前 有 很 多 常 用 的 HPLC 模 式 或 技 术 : 反 相 HILIC 正 相 离 子 交 换 体 积 排 阻 调 查 显 示, 一 般 而 言 95% 的 色 谱 工 作 者 都 在 其 工 作 中 使 用 反 相 色 谱, 基 于 这 一 原 因, 本 手 册 将 把 这 项 技 术 作 为 重 点 除 此 之 外, 本 手 册 也 会 涉 及 其 它 的 技 术, 指 出 其 主 要 差 别, 并 介 绍 获 取 更 多 信 息 的 来 源 如 需 了 解 各 种 模 式 之 间 差 异 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 62 64 页 29

色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 液 相 色 谱 柱 采 用 不 锈 钢 或 聚 合 物 制 成, 也 有 极 为 罕 见 的 玻 璃 柱, 柱 中 填 充 键 合 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 有 多 种 尺 寸 规 格 可 供 选 择, 以 适 应 色 谱 工 作 者 及 其 使 用 的 不 同 需 求 从 用 于 高 通 量 LC/MS 的 短 柱 窄 径 柱, 到 50 mm 内 径 的 制 备 柱, 制 备 柱 填 充 内 径 最 大 可 达 600 mm, 适 用 于 小 规 模 制 备 放 大 和 生 产 色 谱 柱 规 格 影 响 着 灵 敏 度 和 柱 效, 决 定 着 柱 载 样 量 例 如, 小 内 径 色 谱 柱 与 大 内 径 柱 相 比, 提 高 了 灵 敏 度, 但 降 低 了 载 样 量 现 代 不 锈 钢 分 析 柱 (1 到 4.6 mm 内 径,20 到 250 mm 柱 长 ) 使 用 非 常 低 或 零 死 体 积 的 接 头 色 谱 柱 填 料 被 柱 两 端 的 不 锈 钢 筛 板 挡 住 来 自 HPLC 的 液 流 入 口 筛 板 HPLC 柱 ( 灰 色 ) 出 口 筛 板 液 流 流 出 至 检 测 器 硅 胶 填 料 图 16. 色 谱 柱 示 意 图 液 流 方 向 色 谱 柱 结 构 材 料 HPLC 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 不 锈 钢 分 析 柱 4.0-4.6 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 传 统 定 量 分 析 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 硅 胶 1.8-5 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 窄 径 柱 2.0-2.1 硅 胶 1.8-5 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 微 径 柱 1 硅 胶, 聚 合 物 3-5 提 高 灵 敏 度, 可 分 析 ng 到 µg 的 样 品 分 析 型 毛 细 管 柱 0.3-0.5 硅 胶, 聚 合 物 3-5 可 分 析 pg 到 ng 的 样 品 分 析 型 纳 升 柱 0.075-0.1 硅 胶, 聚 合 物 3 可 分 析 < 1 pg 的 样 品 制 备 或 半 制 备 柱 9.4-50 硅 胶, 聚 合 物 5-50 样 品 纯 化 表 4. 液 相 色 谱 柱 的 一 些 性 能 指 标 转 下 页 30

色 谱 柱 结 构 材 料 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 LC/MS UHPLC/MS 不 锈 钢 分 析 柱 3 硅 胶 1.8-5 与 安 捷 伦 MS 流 量 匹 配 的 良 好 选 择 分 析 型 窄 径 柱 和 微 径 柱 1-2.1 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 需 要 更 高 选 择 性 或 需 要 特 殊 检 测 器 时 石 英 分 析 型 毛 细 管 柱 0.3-0.5 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 使 用 MS 检 测 器 UHPLC 不 锈 钢 分 析 柱 4.6 Silica 1.8-2.7 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 Silica 1.8-2.7 分 析 型 窄 径 柱 2.1 Silica 1.8-2.7 用 于 所 有 快 速 和 高 分 离 度 的 分 析 应 用 制 备 柱 不 锈 钢 制 备 柱 10-100 聚 合 物 10-50 化 合 物 分 离 生 产 柱 不 锈 钢 生 产 柱 10 cm 到 聚 合 物 10-50 化 合 物 生 产 100 cm 注 : 某 些 生 物 HPLC 柱 提 供 PEEK 管 线, 确 保 样 品 流 路 中 无 金 属 使 用 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 色 谱 柱 以 及 Poroshell 120 2.7 µm 色 谱 柱, 压 力 上 限 可 达 600 bar 使 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 离 度 (RRHD) 色 谱 柱,1.8 µm, 压 力 上 限 可 达 1300 bar 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 硅 胶 是 正 相 HPLC 常 用 的 固 定 相, 也 是 许 多 化 学 键 合 固 定 相 的 支 持 剂 硅 胶 表 面 覆 盖 着 强 极 性 的 硅 醇 基, 在 非 极 性 流 动 相 中 与 样 品 分 子 发 生 相 互 作 用, 也 可 以 作 为 化 学 键 合 的 反 应 位 点 正 相 HPLC 适 用 于 在 水 中 不 溶 解 的 分 析 物 和 有 机 正 相 溶 剂, 与 反 相 HPLC 中 常 用 的 某 些 缓 冲 液 相 比, 对 质 谱 更 为 友 好 但 是, 这 种 技 术 有 时 保 留 时 间 的 重 现 性 较 差, 因 为 水 或 质 子 有 机 溶 剂 ( 含 有 氢 氧 键 或 氮 氢 键 ) 改 变 了 硅 胶 的 水 合 状 态 反 相 HPLC 中 就 不 会 发 生 这 种 问 题, 因 此 成 为 了 主 要 的 HPLC 技 术 在 反 相 色 谱 系 统 中, 硅 胶 颗 粒 被 化 学 改 性 为 非 极 性 或 疏 水 性, 流 动 相 采 用 极 性 液 体 31

UHPLC 柱 超 高 压 液 相 色 谱 (UHPLC) 一 般 指 在 超 过 400 bar (6000 psi) 压 力 ( 这 一 压 力 是 过 去 几 十 年 来 常 见 的 最 大 系 统 操 作 压 力 ) 下 操 作 的 液 相 色 谱 通 常,UHPLC 柱 装 填 小 粒 径 填 料 (< 3 µm), 与 常 规 HPLC 柱 填 充 的 3 到 5 µm 填 料 相 比, 在 速 度 分 离 度 和 柱 效 方 面 有 很 大 优 势 但 是, 从 压 力 方 程 ( 第 9 页 的 方 程 6) 可 以 看 出, 填 料 粒 径 越 小, 流 动 相 通 过 色 谱 柱 所 需 要 的 反 压 就 越 大, 因 此,UHPLC 柱 采 用 了 在 400 bar (6000 psi) 以 上 压 力 下 工 作 的 设 计 安 捷 伦 为 UHPLC 提 供 了 三 种 类 型 的 色 谱 柱 : 在 600 bar 以 内 操 作 的 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 粒 径 柱 填 充 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 的 Poroshell 120 柱 ( 也 可 以 在 600 bar 以 内 操 作 ) 和 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 1.8 µm 柱, 在 1300 bar 下 稳 定 UHPLC 可 以 得 到 非 常 快 的 分 离 速 度 一 般 情 况 下, 10 分 钟 之 内 完 成 的 UHPLC 分 离 为 快 速,1 分 钟 内 完 成 的 分 离 常 称 为 超 快 速 另 一 方 面, 使 用 1.8 µm 填 料 UHPLC 柱, 提 高 了 柱 效 和 峰 容 量 分 析 柱 最 长 150 mm, 内 径 最 大 4.6 mm 现 在 可 以 获 得 差 不 多 300% 的 峰 容 量, 这 对 于 改 善 从 新 药 发 现 到 食 品 安 全 和 环 境 应 用 ( 如 农 药 筛 查 ) 中 的 许 多 复 杂 分 离 非 常 有 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 近 来 表 面 多 孔 填 料 (SPP) 柱 在 小 粒 径 填 料 中 比 早 先 的 薄 壳 型 填 料 柱 更 受 青 睐 如 图 17 所 示,Agilent Poroshell 120 2.7 µm 填 料 包 括 一 个 实 心 核 ( 直 径 1.7 µm) 和 覆 盖 在 外 的 多 孔 硅 胶 层 ( 厚 0.5 µm) Poroshell 120 与 常 规 全 多 孔 柱 相 比, 能 够 为 色 谱 工 作 者 提 供 方 法 开 发 的 明 显 优 势 由 于 扩 散 仅 发 生 在 多 孔 外 壳, 而 实 心 核 没 有, 所 以 与 同 样 粒 径 的 全 多 孔 填 料 相 比, 柱 效 有 所 提 高 事 实 上,2.7 µm SPP 可 提 供 能 与 1.8 µm 全 多 孔 颗 粒 色 谱 柱 媲 美 的 柱 效, 而 4 µm SPP 的 柱 效 大 约 是 全 多 孔 5 µm 颗 粒 色 谱 柱 的 两 倍 由 于 压 力 间 接 地 与 粒 径 成 比 例, 因 此 粒 径 较 大 的 2.7 µm SPP 色 谱 柱 产 生 的 压 力 远 低 于 亚 2 µm 色 谱 柱, 让 色 谱 工 作 者 能 够 提 高 流 速 并 加 快 分 析 速 度, 同 时 获 得 出 色 的 分 离 度 Poroshell 120 柱 装 配 2 µm 筛 板, 这 一 点 非 常 重 要, 这 样 使 其 对 于 较 脏 的 样 品 具 有 更 高 的 忍 耐 性, 而 不 会 像 装 配 更 小 筛 板 的 色 谱 柱 那 样 容 易 堵 塞 样 品 过 滤 32

1.7 µm 实心核 0.5 µm 多孔壳 图 17. Poroshell 120 2.7 µm 填料 生物分子 例如蛋白质和肽 的分离具有一定的挑战性 因为它们扩散较慢 所以我们通常都必须保持较低 的流速以防止峰展宽 安捷伦提供多种基于表面多孔颗粒的色谱柱 Poroshell 300 5 µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 300Å 孔径 AdvanceBio RP-mAb 3.5 µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 450Å 孔径 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 100Å 孔径 该技术缩短了扩散距离 能够对 500 Da 至 1000 kda 的生物分子进行快速 HPLC 分离 LC/MS 柱 根据不同的样品类型 有许多种色谱柱适用于 LC/MS 对于简单的分析样品 使用短柱 高分离度 可以 缩短分析时间 实现高通量 LC/MS 如果需要更高分离度 则可使用较长的色谱柱 流速也是影响色谱柱选择的因素 LC/MS 系统一般操作流速范围为 1 µl/min 到 1 ml/min 因而 要进行高 灵敏度 快速分析 宜选择较小内径柱 如安捷伦的溶剂节省柱 3.0 mm 内径 窄径柱 2.1 mm 内径 和毛细管柱与纳流柱 见第 29 页 表 4 键合相的最好选择是高效并封端的 C18 键合相 在宽 ph 范围内稳定 与 LC/MS 使用的挥发性流 动相添加剂 包括甲酸和乙酸 兼容 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统是药物 ADME/DMPK 研究 生物标记物验证 临床研究 食品安全 法医学 毒理学以及环境分析的定量领 域的可靠选择 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统 33

凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 以 分 子 大 小 为 基 础 的 分 离 通 常 采 用 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 进 行 这 种 色 谱 类 型 在 分 离 聚 合 物, 包 括 生 物 聚 合 物 时 使 用 通 常 用 来 表 征 聚 合 物 分 子 量 及 分 子 量 分 布 色 谱 柱 一 般 采 用 不 锈 钢, 填 充 凝 胶, 交 联 键 合 聚 合 物 或 孔 径 经 过 严 格 控 制 的 硅 胶 颗 粒 分 离 机 理 与 其 他 色 谱 类 型 不 同, 溶 质 颗 粒 与 固 定 相 间 不 应 有 化 学 相 互 作 用, 而 是 依 据 分 子 在 溶 液 中 的 大 小 而 进 行 的 我 们 用 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 描 述 有 机 聚 合 物 ( 如 塑 料 ) 在 有 机 溶 剂 中 的 分 离, 而 使 用 水 相 SEC 描 述 主 要 使 用 水 相 流 动 相 对 水 溶 性 有 机 聚 合 物 ( 如 聚 乙 烯 醇 ) 和 水 溶 性 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 核 酸 和 多 糖 ) 进 行 的 分 离 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 以 前 用 来 描 述 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 ) 在 低 压 下 的 分 离 GPC/SEC 仪 器 色 谱 柱 和 标 准 品 我 们 向 您 推 荐 GPC/SEC 的 综 合 指 南, 安 捷 伦 的 凝 胶 渗 透 色 谱 和 体 积 排 阻 色 谱 说 明 ( 出 版 号 5990-6969EN) 生 物 表 征 柱 生 物 色 谱 柱, 或 生 物 柱, 是 分 离 生 物 化 合 物 ( 如 蛋 白 质 和 多 肽 寡 核 苷 酸 和 多 聚 核 苷 酸, 以 及 其 它 生 物 分 子 和 复 合 物, 包 括 病 毒 颗 粒 ) 的 色 谱 柱 生 物 柱 在 设 计 上 大 大 减 少 或 消 除 了 样 品 与 填 料 之 间 的 不 可 逆 或 非 特 异 性 结 合, 并 保 留 了 其 生 物 功 能 ( 酶 活 性 ) 通 常, 在 生 物 柱 上 样 品 不 能 与 活 性 金 属 接 触 因 此 生 物 柱 可 以 用 聚 合 物 ( 如 PEEK) 石 英 和 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 或 外 镀 金 属 部 件 制 成, 以 使 色 谱 柱 具 有 生 物 兼 容 性 生 物 色 谱 柱 系 列 34

色 谱 柱 特 性 硅 胶 硅 胶 是 理 想 的 色 谱 填 料, 数 十 年 来 是 键 合 相 HPLC 柱 的 主 要 基 础 填 料 硅 胶 为 刚 性 颗 粒, 可 抵 抗 液 流 造 成 的 挤 压, 当 填 料 粒 径 在 5 µm 或 更 低 时, 需 要 加 更 高 压 力 的 情 况 下 显 得 尤 为 重 要 其 极 大 的 比 表 面 积 能 够 满 足 HPLC 和 UHPLC 所 需 的 吸 附 容 量, 填 料 表 面 的 硅 醇 基 或 Si-OH 基 团 是 功 能 性 碳 链 的 理 想 键 合 位 点 毫 不 奇 怪, 用 作 柱 填 料 的 硅 胶 颗 粒 有 各 种 粒 径 纯 度 和 酸 性 最 现 代 的 填 料 是 B 型 硅 胶, 痕 量 金 属 含 量 极 低, 比 以 前 的 A 型 硅 胶 酸 性 更 低 低 酸 性 硅 胶 意 味 着 碱 性 分 析 物 与 硅 胶 表 面 硅 醇 基 的 相 互 作 用 更 小, 有 助 于 改 善 峰 形 用 高 纯 度 硅 胶 制 成 的 色 谱 柱, 是 目 前 色 谱 工 作 者 最 常 选 择 的 柱 子 键 合 相 反 相 色 谱 最 常 用 的 键 合 相 是 C18( 十 八 烷 基 硅 烷 化,ODS) 这 只 是 硅 胶 颗 粒 表 面 众 多 连 接 烷 烃 或 碳 链 类 型 的 一 种 其 它 常 用 的 线 性 烷 烃 硅 烷 化 固 定 相 选 择 还 有 C8 和 C4 苯 基, 包 括 苯 基 己 基 与 联 苯 和 AQ CN 以 及 PFP 固 定 相, 能 够 提 供 与 直 链 烷 烃 固 定 相 明 显 不 同 的 选 择 性, 以 实 现 成 功 分 离 还 有 不 断 增 加 的 针 对 某 些 高 水 相 流 动 相 或 其 它 应 用 的 键 合 相 选 择 一 般 来 说, 较 大 的 溶 质, 如 蛋 白 质, 最 好 用 键 合 到 大 孔 硅 胶 ( 孔 径 :300Å) 的 短 链 反 相 柱 (C3 CN 二 醇 ) 分 离 多 肽 和 小 分 子 用 长 链 柱 (C8 C18) 分 离 但 在 许 多 情 况 下, 这 种 规 律 并 不 适 用 因 此, 最 好 在 开 始 时 选 择 处 于 疏 水 谱 中 间 位 置 的 固 定 相 ( 如 C8), 然 后 根 据 初 步 分 离 结 果 和 样 品 的 溶 解 性, 再 采 用 疏 水 性 更 强 或 亲 水 性 更 强 固 定 相 还 可 以 考 虑 其 它 选 择, 如 离 子 交 换 凝 胶 过 滤 / 体 积 排 阻 或 HILIC 色 谱 我 们 将 在 后 面 第 92 97 页 讨 论 这 些 内 容 聚 合 物 当 需 要 在 非 常 低 和 高 的 ph 下 使 用 色 谱 柱 时, 除 了 硅 胶 基 质 填 料 还 可 以 选 择 聚 合 物 填 料 聚 合 物 填 料 是 小 规 模 色 谱 分 析 的 理 想 选 择, 特 别 是 LC/MS, 因 为 其 化 学 性 质 稳 定, 不 会 出 现 可 溶 性 物 质 或 发 生 沉 淀 例 如, RLRP-S 柱 中 所 用 的 反 相 球 形 聚 合 物 填 料, 是 以 带 天 然 疏 水 性 表 面 的 聚 苯 乙 烯 / 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 为 基 质 的 用 聚 合 物 颗 粒 作 为 反 相 色 谱 填 料 不 需 要 键 合 相 对 这 种 刚 性 的 多 孔 颗 粒 可 以 进 行 涂 层 和 衍 生 化, 加 上 各 种 功 能 基, 包 括 弱 和 强 阳 离 子 和 阴 离 子 交 换 剂 35

孔 径 孔 径 的 选 择 取 决 于 待 分 析 组 分 的 分 子 量 对 于 小 分 子 的 反 相 分 离, 选 择 小 孔 径 (60-120Å) 填 料 柱 对 于 小 分 子 和 多 肽, 使 用 80-150Å, 对 于 聚 合 多 肽 和 多 数 蛋 白 质 选 择 200-450Å 和 1000Å, 对 于 分 子 量 很 高 的 蛋 白 和 疫 苗 选 择 4000Å 对 于 GPC/SEC 分 离, 分 离 的 分 子 量 范 围 一 般 会 和 孔 径 信 息 一 起 给 出, 以 便 选 择 合 适 的 色 谱 柱 这 些 信 息 与 色 谱 柱 选 择 一 起 列 于 表 中 粒 径 HPLC 柱 在 很 长 的 一 段 时 期 内 都 采 用 5 µm 作 为 标 准 粒 径, 直 到 二 十 世 纪 九 十 年 代 中 期 3.5 µm 粒 径 柱 才 在 方 法 开 发 中 得 以 广 泛 使 用 近 来, 随 着 对 更 快 速 度 和 / 或 更 高 分 离 度 需 求 的 增 加, 色 谱 工 作 者 开 始 使 用 填 充 亚 2-3 µm 粒 径 填 料, 包 括 安 捷 伦 生 产 的 1.8 µm 填 料 使 用 这 些 填 料 可 在 更 短 的 色 谱 柱 上 获 得 更 快 的 高 分 离 度 分 离 3.5 µm 粒 径 柱 是 在 常 规 操 作 压 力 下 操 作 的, 可 以 在 所 有 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 包 括 400 bar 操 作 压 力 上 限 的 仪 器 1.8 µm 短 柱 (50 mm 及 更 短 ) 可 以 在 优 化 的 标 准 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 而 长 柱 则 需 要 更 高 压 力 的 液 相 色 谱 仪 ( 如, 快 速 分 离 液 相 色 谱 或 UHPLCs), 在 600 到 1300 bar 压 力 范 围 下 操 作 近 来, 我 们 开 发 了 更 新 的 技 术 ( 如 表 面 多 孔 填 料 ), 性 能 类 似 于 亚 2 µm 柱, 但 产 生 的 反 压 较 低, 从 而 使 其 能 够 在 常 规 HPLC 上 使 用 ( 表 面 多 孔 填 料, 见 第 31 页 ) 如 果 色 谱 柱 的 填 料 粒 径 减 小 一 半, 塔 板 数 将 增 加 一 倍 ( 假 设 柱 长 保 持 不 变 ) 但 如 果 粒 径 减 半, 柱 反 压 则 将 增 大 4 倍 (~1/d 2 p ) 如 果 柱 长 加 倍, 塔 板 数 和 分 析 时 间 也 会 加 倍 随 着 柱 长 增 加, 反 压 将 呈 线 性 增 加 例 如, 一 根 填 充 3.5 µm 填 料 的 2.1 x 100 mm 柱, 理 论 塔 板 数 大 约 为 12000-14000, 这 一 柱 效 足 以 使 许 多 样 品 得 到 分 离 如 果 将 粒 径 从 3.5 µm 减 小 到 1.8 µm, 同 样 是 2.1 x 100 mm 柱, 其 柱 效 将 增 加 一 倍, 约 为 24000 理 论 塔 板 数 但 是, 该 色 谱 柱 产 生 的 反 压 将 比 填 充 3.5 µm 填 料 的 柱 子 大 4 倍 我 们 通 常 并 不 需 要 24000 塔 板 数 的 色 谱 柱, 所 以, 可 以 把 柱 长 减 半 到 50 mm, 得 到 期 望 的 12000 塔 板 数 柱 效 用 这 种 较 短 的 色 谱 柱, 分 析 时 间 将 缩 短 一 半, 反 压 也 仅 为 3.5 µm 填 料 粒 径 100 mm 色 谱 柱 的 两 倍 36

色 谱 柱 规 格 多 年 来, 用 于 分 析 方 法 开 发 推 荐 最 多 的 色 谱 柱 规 格 都 是 5 µm 填 料 粒 径 的 4.6 x 150 mm 或 4.6 x 100 mm 色 谱 柱 如 果 需 要 更 高 的 分 离 度, 则 推 荐 使 用 4.6 x 250 mm 色 谱 柱 但 现 在 随 着 色 谱 柱 选 择 范 围 的 扩 大, 我 们 推 荐 使 用 3.5 µm 4.6 x 100 mm 色 谱 柱, 或 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 色 谱 柱 作 为 分 析 方 法 开 发 的 起 点 在 方 法 开 发 过 程 中, 色 谱 柱 内 径 ( 如 2.1 或 3.0 mm) 的 选 择 也 要 适 应 应 用 目 标 ( 如 灵 敏 度 溶 剂 消 耗 ) 或 与 某 些 仪 器 类 型 相 兼 容 ( 毛 细 管 纳 流 或 制 备 柱 ) 当 需 要 提 高 灵 敏 度 或 样 品 量 极 为 有 限 时, 使 用 纳 流 柱 毛 细 管 柱 或 微 径 柱 样 品 量 低 于 1 pg 时, 使 用 纳 流 柱, 流 速 为 nl/min 样 品 量 在 pg 到 ng 范 围 内 时, 使 用 毛 细 管 柱, 流 速 为 4 µl/min 左 右 样 品 量 为 ng 到 µg 时, 使 用 微 径 柱, 流 速 一 般 为 40 µl/min 左 右 应 用 目 标 柱 内 径 (mm) 极 高 灵 敏 度 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.1, 0.075 极 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.3, 0.5 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 1.0 节 省 溶 剂 ; 特 殊 的 低 体 积 仪 器 2.1 特 殊 检 测 器, 如 MS 2.1 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 2.1 节 省 溶 剂 ; 标 准 HPLC 仪 器 LC/MS 3.0 标 准 分 离 4.6 小 规 模 (mg) 制 备 性 分 离 9.4 中 等 规 模 制 备 分 离 (100 mg 到 g) 或 半 制 备 21.2 大 规 模 实 验 室 制 备 性 分 离 ( 最 多 100 g) 30, 50 中 试 和 生 产 100 mm 到 1 m 表 5. 应 用 与 柱 内 径 在 需 要 建 立 常 规 方 法 时, 应 考 虑 将 柱 尺 寸 降 至 分 析 方 法 和 仪 器 可 容 许 的 最 小 规 格 ; 较 小 的 色 谱 柱 通 常 价 格 比 较 便 宜, 溶 剂 消 耗 也 较 少 在 某 些 例 子 中, 如 果 柱 尺 寸 减 小 一 半, 灵 敏 度 将 提 高 4 到 5 倍 ( 假 设 进 样 质 量 保 持 不 变 ) 例 如, 在 优 化 的 液 相 色 谱 上, 使 用 2.1 mm 内 径 柱 进 样 时, 色 谱 峰 的 峰 高 将 比 使 用 4.6 mm 内 径 柱 及 同 样 进 样 量 时 提 高 3 到 5 倍 如 果 仪 器 针 对 低 体 积 柱 进 行 了 优 化, 只 要 保 持 流 量 线 速 度 不 变, 减 少 色 谱 柱 直 径 不 会 对 柱 效 理 论 塔 板 数 反 压 带 来 明 显 影 响 37

用 不 同 的 方 法 开 发 柱 数 据, 可 以 很 容 易 计 算 出 较 短 色 谱 柱 是 否 能 得 到 与 长 柱 同 样 的 结 果 通 过 简 单 计 算 得 出 的 结 论 将 为 您 节 省 大 量 时 间 可 以 使 用 安 捷 伦 的 方 法 转 换 软 件 ( 登 录 www.chem.agilent.com, 搜 索 LC 方 法 转 换 软 件 ) 帮 助 您 完 成 计 算 卡 套 柱 系 统 卡 套 柱 芯 是 安 装 在 已 有 的 柱 硬 件 上, 所 以 卡 套 系 统 具 有 经 济 灵 活 的 特 点 分 析 系 统 的 卡 套 式 柱 芯 是 预 填 充 的, 而 制 备 和 半 制 备 应 用 则 可 以 用 购 买 的 散 装 填 料 填 充 柱 芯 类 型 特 点 优 点 分 析 柱 和 分 析 / 保 护 柱 组 合 安 捷 伦 HPLC 卡 套 式 柱 芯 可 倒 装 柱 端 接 头, 添 加 保 护 柱 经 济 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 使 用 2, 3, 4 和 4.6 mm 柱 芯 ChromSep: 包 含 柱 套 分 析 柱 芯 和 保 护 柱 的 独 立 系 统 ZORBAX 快 速 分 离 和 快 速 分 离 高 通 量 卡 套 柱 : 1.8 和 3.5 µm 填 料 的 独 立 系 统 保 护 柱 ZORBAX 卡 套 型 保 护 柱 : 独 立 式 卡 套 柱 芯 的 两 端 都 有 独 特 的 滤 垫 和 筛 板 有 各 种 柱 长 和 内 径 组 合 有 各 种 填 料 的 柱 芯 和 保 护 柱 无 需 特 殊 工 具 适 用 于 高 通 量 LC/MS LC/MS/MS 和 组 合 分 离 填 充 Eclipse XDB,pH 范 围 2-9 填 充 StableBond, 低 ph 条 件 下 使 用 单 支 销 售 或 三 支 套 装 高 效 独 立 低 死 体 积 柱 芯 设 计 独 特 的 高 聚 物 柱 芯, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 接 头 可 重 复 使 用 有 助 于 防 止 阻 塞 模 块 式 灵 活 性 经 济 使 用 方 便 适 用 于 各 种 分 析 类 型 适 用 于 各 种 分 析 类 型 低 流 失 适 用 于 各 种 分 析 类 型 密 封 耐 压 高 达 340 bar 无 需 垫 圈 适 合 与 1/16 英 寸 LC 接 头 连 接 表 6. 卡 套 系 统 转 下 页 38

柱 芯 类 型 特 点 优 点 半 制 备 保 护 柱 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱 的 卡 套 : 独 立 式 ZORBAX 和 Agilent Prep 卡 套 型 制 备 柱 与 保 护 柱 : 独 立 式 和 内 置 式 选 件 制 备 轴 向 压 缩 制 备 柱 和 装 柱 机 : 能 提 供 动 态 轴 向 压 缩 和 静 态 锁 定 轴 向 压 缩 的 独 立 系 统 简 单 低 死 体 积 组 件 设 计 独 特 的 聚 苯 基 砜 管 线, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 可 重 复 使 用 的 接 头 简 单 低 死 体 积 组 件 可 重 复 使 用 的 接 头 用 于 内 部 和 外 部 保 护 柱 的 硬 件 选 件 适 用 于 实 验 室 级 和 生 产 级 纯 化, 有 三 种 高 质 量 和 高 容 量 的 柱 规 格 可 供 选 择, 内 径 最 高 可 达 24 英 寸 移 动 式 装 柱 机 使 用 压 缩 空 气 几 分 钟 内 快 速 安 装 和 卸 载 密 封 耐 压 高 达 2000 psi (135 bar, 13.5 MPa) 无 需 垫 圈 适 合 连 接 至 1/16 英 寸 LC 接 头 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 与 21.2 和 30 mm 内 径 柱 配 合 使 用 很 方 便 地 从 克 级 放 大 到 几 公 斤 级 可 在 各 处 使 用 在 危 险 环 境 下 安 全 使 用 效 率 最 高 Dynamax 制 备 卡 套 柱 和 保 护 柱 : 独 立 的 动 态 轴 向 压 缩 系 统 模 块 式 设 计, 接 头 可 重 复 使 用 降 低 了 硬 件 成 本 10, 21.4 和 41.4 mm 内 径 便 于 放 大 一 体 式 保 护 柱 选 件 延 长 了 复 杂 样 品 制 备 的 柱 寿 命 生 产 聚 合 物 型 PLRP-S, PL-SAX 和 PL-SCX 各 种 孔 径 和 粒 径, 得 到 高 样 品 通 量 良 好 的 化 学 和 热 稳 定 性 可 实 现 适 当 净 化 适 合 生 产 过 程 硬 件 的 稳 定 填 充 方 法 提 高 效 率 延 长 柱 寿 命 提 高 填 充 柱 性 能 39

保护柱卡套 内径 (mm) 固定相 卡套柱卡套 保护柱芯 一体化系统 2.0 Asahipak 5021-1845 卡套 3.0 LiChrospher 5021-1845 4.0 Nucleosil 4.6 Purospher 柱型 柱芯/保护柱芯系统兼容性指南* Superspher ZORBAX 标准接头 快速分离柱卡套 保护柱 独立 2.1 ZORBAX 卡套 3.0 820888-901 4.6 无保护柱卡套 4.6 ZORBAX 半制备保护柱 独立 卡套 9.4 ZORBAX 21.2 ZORBAX 820555-901 半制备柱 840140-901 PrepHT 无图片 保护柱芯 820444-901 Agilent Prep * 独立保护柱芯可用于安捷伦提供的所有卡套柱和标准接头色谱柱 表 7. 卡套柱/保护柱卡套系统兼容性指南 40

性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 在 许 多 关 于 色 谱 的 论 著 中 论 述 的 性 能 的 关 键 比 我 们 这 里 所 涉 及 的 要 多 得 多 我 们 的 目 的 是 强 调 常 被 忽 视 或 容 易 造 成 混 淆 的 几 个 方 面 让 我 们 从 系 统 和 机 理 问 题 开 始 : 减 少 柱 外 体 积 进 行 良 好 的 连 接 进 样 理 解 并 测 量 系 统 延 迟 体 积 为 获 得 高 效 柱 设 置 数 据 采 集 速 率 接 下 来, 我 们 再 把 话 题 转 向 色 谱 分 析 和 方 法 开 发 过 程 中 需 要 做 的 其 他 一 些 工 作 : 了 解 螯 合 化 合 物 ph 的 影 响 使 用 梯 度 洗 脱 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 在 本 节 的 最 后, 我 们 还 将 了 解 一 下 在 应 用 过 程 中 您 可 能 需 要 做 的 几 项 工 作 : 色 谱 柱 老 化 色 谱 柱 清 洗 反 相 ( 硅 胶 基 质 与 聚 合 物 固 定 相 ) 和 正 相 41

减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 柱 外 体 积 是 指 额 外 或 外 部 ( 相 对 于 色 谱 柱 ) 体 积, 是 系 统 的 一 部 分, 尤 其 是 各 LC 部 件 色 谱 柱 之 间 的 连 接 管 线 体 积 进 样 体 积 和 流 通 池 体 积 色 谱 柱 越 大, 柱 体 积 (V m ) 就 越 大, 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 就 越 显 得 没 那 么 高 但 是, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 的 高 效 柱, 如 Poroshell 120 和 亚 -2 µm 粒 径 柱, 您 就 要 尽 可 能 地 减 少 柱 外 体 积, 以 免 其 影 响 您 的 色 谱 结 果 不 必 要 的 柱 外 体 积 可 能 导 致 柱 效 损 失, 有 时 还 会 造 成 拖 尾 下 面 的 例 子 就 显 示 了 柱 外 体 积 的 影 响 ( 图 18) 只 有 10 µl 柱 外 体 积 时, 用 4.6 x 30 mm 小 柱 得 到 了 良 好 分 离 使 用 同 样 的 柱 子, 加 上 一 段 管 线, 形 成 50 µl 的 柱 外 体 积, 对 两 张 色 谱 图 的 前 三 个 峰 进 行 比 较 可 以 看 出, 色 谱 峰 变 宽 分 离 度 降 低 在 向 系 统 中 添 加 体 积 不 明 的 管 线 时, 这 种 情 况 经 常 发 生 添 加 一 段 太 长 的 管 线, 或 内 径 较 大 的 短 管 时, 会 使 高 柱 效 色 谱 柱 的 分 离 变 差 所 以, 了 解 您 所 使 用 管 线 的 内 径 和 增 加 了 多 少 体 积 非 常 重 要 另 外, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 体 积 的 色 谱 柱, 需 要 使 用 微 量 或 半 微 量 流 通 池 标 准 流 通 池 会 增 大 柱 外 体 积 原 则 上, 系 统 的 最 大 柱 外 体 积 ( 管 线 体 积 进 样 体 积 和 检 测 器 体 积 ) 不 应 超 过 柱 体 积 的 10% 10 µl 柱 外 体 积 50 µl 柱 外 体 积 峰 归 属 1. 苯 丙 氨 酸 2. 5- 苯 基 -3,6- 二 氧 -2- 哌 嗪 醋 酸 3. 天 冬 氨 酰 - 苯 丙 氨 酸 4. 阿 斯 巴 甜 分 析 条 件 色 谱 柱 : StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 µm 流 动 相 : 含 0.1%TFA 的 H 2 O: 乙 腈 = 85:15 流 速 : 1.0 ml/min 温 度 : 35 C 图 18. 管 线 体 积 对 色 谱 性 能 的 影 响 安 捷 伦 销 售 的 毛 细 管 套 装, 包 含 各 种 规 格 的 毛 细 管 管 线 和 Swagelok 接 头, 您 可 以 根 据 最 小 的 合 适 长 度 配 备 连 接 和 管 线 体 积 管 线 带 有 彩 色 标 记, 以 区 分 管 线 内 径 在 您 改 用 高 效 色 谱 柱 时, 要 用 窄 内 径 红 色 管 线 (0.12 mm 内 径 ) 进 行 连 接, 而 不 能 用 常 规 HPLC 仪 器 上 常 用 的 0.17 mm 内 径 绿 色 管 线 42

实 现 完 美 的 接 头 连 接 使 用 HPLC 和 UHPLC 的 色 谱 工 作 者 常 常 面 临 峰 拖 尾 峰 展 宽 峰 分 叉 以 及 交 叉 污 染 等 问 题 的 挑 战 引 起 这 些 问 题 的 一 个 常 见 原 因 是 管 线 连 接 不 当, 这 一 原 因 通 常 容 易 被 忽 视, 因 此 在 故 障 排 除 方 面 需 要 花 费 大 量 时 间 管 线 连 接 中 的 死 体 积 或 微 漏 可 能 严 重 影 响 色 谱 分 析 的 性 能 和 重 现 性, 采 用 现 代 UHPLC 和 快 速 液 相 色 谱 柱 时 尤 其 如 此 接 头 连 接 要 求 接 头 连 接 对 分 析 物 的 峰 形 具 有 重 要 影 响 理 想 的 接 头 连 接 应 具 备 以 下 特 性 : 管 线 与 接 口 之 间 无 死 体 积 在 超 高 压 和 高 温 下 始 终 避 免 泄 漏 优 异 的 长 期 使 用 稳 定 性, 防 止 管 线 滑 动 简 便 易 用 不 可 调 金 属 接 头 UHPLC 中 最 常 用 的 接 头 为 2 件 式 或 3 件 式 不 可 调 金 属 接 头, 其 组 装 后 即 处 于 不 可 调 的 固 定 状 态 [3] 由 于 不 同 的 色 谱 柱 硬 件 制 造 商 采 用 不 同 的 色 谱 柱 末 端 接 头 设 计 ( 图 19), 因 此 每 个 品 牌 的 色 谱 柱 都 需 要 各 自 装 配 一 组 管 线 和 接 头 这 样 可 确 保 杆 长 (stem length, 即 密 封 垫 圈 底 部 与 管 线 末 端 之 间 的 距 离 ) 实 现 完 全 匹 配 ( 图 20) 43

Waters DŽ ݥ AcquityDž 图 19. HPLC 中使用的色谱柱接头 如果杆长过短 将产生死体积 从而导致峰形变差 分离度下降以及交叉污染 图 20 如果杆长过长 则密封垫圈不能正确就位并容易发生泄漏 图 20 此外 使用扳手时传统接头和密封垫圈通常被拧得过 紧 导致接头永久性卡死在色谱柱中 A 杆长过长 泄漏 B 杆长过短 死体积 C 正确安装的管线 无死体积 图 20. 接头连接正确与错误方式对比 44

可 调 手 紧 式 接 头 为 解 决 传 统 接 头 的 问 题, 我 们 开 发 出 了 可 与 不 同 色 谱 柱 兼 容 的 可 调 手 紧 式 接 头 这 些 接 头 通 常 配 备 聚 合 物 ( 如 PEEK) 密 封 垫 圈, 而 密 封 垫 圈 不 会 永 久 性 连 接 至 管 线, 因 此 接 头 可 以 重 复 使 用 然 而, 许 多 此 类 接 头 仍 有 诸 多 弊 端, 例 如 : 不 借 助 工 具 无 法 获 得 1300 bar 的 超 高 压 需 要 遵 循 严 格 的 精 确 扭 矩 或 转 向 角 范 围 操 作 指 南 以 免 拧 得 过 紧 每 次 重 新 连 接 后 都 需 要 检 查 是 否 存 在 泄 漏 经 常 需 要 重 新 拧 紧 接 头 如 果 聚 合 物 密 封 垫 圈 未 能 充 分 夹 紧 管 线, 后 者 可 能 在 超 高 压 或 压 力 循 环 中 从 接 头 处 滑 落, 产 生 死 体 积 Agilent A-Line 接 头 Agilent A-Line UHPLC 接 头 克 服 了 这 些 缺 陷, 实 现 了 可 重 现 的 无 泄 漏 色 谱 柱 连 接 A-Line 接 头 包 括 两 种 类 型 A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 ( 图 21A) 适 用 于 色 谱 柱 连 接, 能 够 在 1300 bar 下 实 现 密 封 连 接, 且 无 需 使 用 扳 手 A-Line Quick Turn 接 头 ( 图 21B) 适 用 于 各 种 流 路 连 接, 包 括 色 谱 柱 入 口 / 出 口 阀 及 其 他 连 接 这 种 接 头 通 过 手 拧 即 可 在 高 达 600 bar 的 压 力 下 保 持 密 封 ( 取 决 于 用 户 和 连 接 位 置 ), 采 用 扳 手 则 可 达 到 1300 bar 图 21. Agilent A-Line 接 头 A. Quick Connect 快 速 连 接 接 头,B. Quick Turn 接 头 45

两类接头均采用创新的内置弹簧式设计 图 22 确保始终将管线推入接口底部 可实现可重现的零死体积连 接 从而获得一致的色谱性能 通过弹簧即可调节杆长 因此这两类接头均可兼容所有类型的液相色谱柱 此 外 A-Line Quick Connect 快速连接接头采用独特的压杆驱动设计 使弹簧组件 包括压杆 施加恒定压力将密 封垫圈压到管线上 以避免管线滑动 无需使用任何工具 只需施加很小的力即可拧紧接头以用于 1300 bar (18850 psi) 压力之下 用户只需用手拧紧螺帽直至感觉到阻力 然后按下压杆即可 图 23 图 22. Agilent A-Line 接头独特的内置弹簧式设计 用手拧紧蓝色螺帽直至感觉到阻力 按下压杆 紧实压力高达 1300 bar 图 23. Agilent A-Line Quick Connect 快速连接接头的安装 46

200 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 为 评 估 Agilent A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 的 重 复 使 用 性 和 稳 定 性, 我 们 将 该 接 头 断 开 并 重 新 连 接 了 200 次 该 接 头 连 接 在 经 过 200 次 重 新 连 接 后 仍 未 产 生 死 体 积 和 泄 漏 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 不 同 色 谱 柱 制 造 商 的 接 头 连 接 设 计 各 不 相 同, 接 头 的 杆 长 不 当 将 导 致 泄 漏 或 峰 形 不 佳 为 评 估 Agilent A-Line 接 头 对 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性, 如 需 了 解 更 多 有 关 在 实 际 操 作 中 如 何 进 行 连 接 的 技 巧, 请 查 看 液 相 色 谱 故 障 排 除 系 列 以 获 取 详 细 信 息 :www.agilent.com/chem/lctroubleshooting, 您 还 可 查 看 峰 展 宽 视 频 有 关 Agilent A-Line 的 更 多 信 息, 请 访 问 :www.agilent.com/chem/a-line 进 样 量 进 样 量 对 于 分 析 结 果 而 言 非 常 重 要 如 果 进 样 量 过 大, 色 谱 柱 可 能 会 过 载, 从 而 导 致 峰 展 宽, 常 见 的 结 果 是 伸 舌 峰, 在 某 些 情 况 下 也 可 能 引 起 峰 拖 尾 图 24 展 示 了 采 用 1 µl 2 µl 5 µl 和 10 µl 进 样 量 得 到 的 分 析 结 果, 我 们 可 以 看 到 色 谱 峰 随 着 进 样 量 的 增 加 而 变 宽 5σ 2 50 µl 10 µl 40 µl 1 µl 1 µl 2 µl 5 µl 10 µl 条 件 色 谱 柱 : 流 速 : 柱 温 : 流 动 相 : 检 测 器 : 稀 释 剂 : ZORBAX SB-C18, 3.0 50 mm, 1.8 µm 1 ml/min 45 C 30-65% 乙 腈 2.5 分 钟 处 250 nm UV 甲 醇 样 品 : 对 羟 基 苯 甲 酸 甲 酯 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 和 对 羟 基 苯 甲 酸 丁 酯 图 24. 载 样 量 比 较 确 定 进 样 量 之 后, 还 需 确 保 进 样 溶 剂 与 流 动 相 足 够 相 近, 以 减 少 谱 带 展 宽 或 分 叉 47

进 样 溶 剂 和 体 积 都 对 峰 形 有 影 响 在 这 个 例 子 ( 图 25) 中, 甲 醇 溶 剂 中 苯 甲 酸 酯 样 品 进 样 5 µl, 显 示 已 开 始 出 现 峰 带 变 宽 的 现 象 了 反 相 柱 规 格 为 3 x 50 mm, 仪 器 采 用 低 扩 散 配 置 进 样 10 µl, 峰 形 已 经 明 显 不 对 称 了 在 反 相 LC 中, 如 使 用 100% 有 机 溶 剂 或 100% 强 溶 剂 ( 本 例 中 为 甲 醇 ), 大 体 积 进 样 时, 将 使 色 谱 峰 过 早 洗 脱 出 色 谱 柱, 导 致 峰 变 形 如 需 解 决 这 个 问 题 可 以 对 分 析 物 进 行 蒸 发 浓 缩, 从 而 减 少 进 样 体 积 或 者 进 样 溶 剂 改 为 用 水 稀 释, 与 流 动 相 更 为 兼 容, 即 使 进 样 体 积 较 大 也 不 会 出 现 峰 变 形 42 µl 117 µl(10 µl 进 样 ) (1 µl 进 样 ) 1 µl 进 样 2 µl 进 样 5 µl 进 样 10 µl 进 样 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX SB-C18, 3.0 50 mm, 1.8 µm 流 速 : 1 ml/min 温 度 : 45 C 流 动 相 : 30-65% 乙 腈,2.5 分 钟 检 测 : 250 nm UV 样 品 : 苯 甲 酸 甲 酯 苯 甲 酸 丙 酯 和 苯 甲 酸 丁 酯 稀 释 溶 剂 : 甲 醇 图 25. 溶 剂 效 应 : 使 用 强 稀 释 溶 剂,1-10 µl 进 样 设 置 数 据 采 集 速 率 使 用 小 体 积 色 谱 柱 时, 数 据 采 集 速 率 是 人 为 峰 展 宽 的 常 见 原 因 对 于 快 速 洗 脱 的 色 谱 峰, 要 确 保 在 色 谱 峰 上 收 集 到 足 够 的 数 据 点, 数 据 系 统 才 能 准 确 测 定 出 峰 宽 峰 面 积 和 保 留 时 间 如 果 得 到 的 数 据 点 太 少 ( 如, 低 数 据 采 集 速 率 ), 色 谱 峰 就 会 显 得 比 其 实 际 要 宽 您 应 该 检 查 数 据 采 集 速 率, 确 保 其 设 置 正 确, 以 优 化 色 谱 结 果 图 26 说 明 了 数 据 采 集 速 率 的 影 响 如 果 您 对 现 在 的 色 谱 柱 和 梯 度 条 件 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 器, 转 移 器 将 估 算 出 您 所 用 条 件 下 的 期 望 峰 宽 值 (5σ) 这 一 信 息 对 初 始 方 法 设 置 会 有 帮 助 48

分 析 条 件 色 谱 柱 : Poroshell 120 EC-C18, 4.6 100mm 仪 器 : 1200 SL 2 µl 流 通 池 流 速 : 2.00 ml/min 样 品 : 2 µl 进 样 流 动 相 : 乙 腈 : 水 = 60:40 4-5% 15% 图 26. 不 同 数 据 采 集 速 率 对 Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm 上 峰 柱 效 影 响 的 比 较 这 里, 我 们 测 定 了 柱 效, 可 以 看 出, 柱 效 随 采 集 速 率 的 增 大 而 增 加 可 以 通 过 将 检 测 器 设 置 和 / 或 时 间 常 数 调 节 到 不 影 响 信 噪 比 的 最 快 数 值, 对 数 据 采 集 速 率 进 行 优 化 用 化 学 工 作 站 中 的 峰 宽 控 制 可 为 您 的 分 析 选 择 峰 宽 或 响 应 时 间 化 学 工 作 站 软 件 中 峰 宽 的 定 义 是, 半 峰 高 处 的 宽 度 将 峰 宽 设 置 为 样 品 中 色 谱 峰 所 期 望 的 最 窄 值 可 以 不 用 更 快 的 响 应 时 间, 以 免 导 致 基 线 噪 音 增 大 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 低 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 比 例 阀 经 泵 和 其 它 系 统 组 件 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 27) 高 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 各 溶 剂 首 次 接 触, 经 两 个 计 量 泵 再 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 28) 比 例 阀 计 量 泵 自 动 进 样 器 图 27. 驻 留 体 积 : 低 压 混 合 四 元 泵 49

计 量 泵 A 自 动 进 样 器 计 量 泵 B 图 28. 驻 留 体 积 : 高 压 混 合 二 元 泵 在 梯 度 分 离 中, 驻 留 体 积 使 梯 度 开 始 时 出 现 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 驻 留 体 积 除 以 流 速 驻 留 体 积 太 大 的 仪 器 不 能 进 行 窄 径 梯 度 分 离 使 用 窄 径 柱 时, 仪 器 配 置 至 关 重 要 进 行 窄 径 (2.1 mm 内 径 ) 和 微 径 (1 mm 和 < 1 mm 内 径 ) 柱 优 化 时, 必 须 使 驻 留 体 积 和 柱 外 体 积 最 小 化 图 29 中 的 色 谱 图 例 说 明 了 驻 留 体 积 对 分 析 结 果 的 影 响 请 注 意, 前 面 的 洗 脱 峰 较 宽 问 题 在 于 驻 留 体 积 使 前 面 的 峰 出 峰 较 晚, 基 本 上 是 被 等 梯 度 洗 脱 的 如 果 这 种 情 况 影 响 了 分 离 或 检 测, 就 需 要 减 少 驻 留 体 积 或 使 用 另 外 的 系 统 峰 归 属 1. 非 那 西 汀 2. 托 美 汀 3. 酮 洛 芬 4. 非 诺 洛 芬 5. 布 洛 芬 6. 保 泰 松 7. 甲 灭 酸 8. 氟 芬 那 酸 图 29. 驻 留 体 积 对 梯 度 色 谱 结 果 的 影 响 分 析 条 件 色 谱 柱 : 流 动 相 : ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8 A:0.1% TFA 水 B:0.1% TFA 乙 腈 温 度 : 35 C 梯 度 : 例 1: 在 6 分 钟 内 B 由 15% 升 至 60%, 流 速 1.0 ml/min 例 2: 在 6 分 钟 内 B 由 30% 升 至 75%, 流 速 0.2 ml/min 50

测 量 系 统 的 驻 留 体 积 首 先 将 色 谱 柱 替 换 为 一 段 短 HPLC 不 锈 钢 管 线 流 动 相 组 成 如 下 :A 水 ( 无 UV 吸 收 ),B 0.2% 丙 酮 的 水 溶 液 ( 有 UV 吸 收 ) 检 测 波 长 265 nm 以 1mL/min 的 流 速 运 行 梯 度,B 在 10 分 钟 的 时 间 内 由 0 升 至 100% 记 录 后 打 印 出 梯 度 曲 线 ( 如 图 30) 检 测 器 响 应 梯 度 变 化 图 30. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 1 用 尺 子 在 纸 上, 或 在 PowerPoint 中 插 入 线 段, 在 平 行 于 x 或 y 轴 的 下 列 点 上 划 线 : 1. 流 动 相 中 含 90% B 的 零 信 号 点 2. 100% B 的 最 稳 定 信 号 点 3. 在 2.0 分 钟 处 做 垂 线, 图 形 如 图 31 所 示 图 31. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 2 51

三 条 线 段 添 加 完 毕 后, 再 添 加 两 条 线 段 计 算 梯 度 步 骤 50% 处 的 响 应 值, 本 例 中 为 24.5 mau, 在 图 上 划 一 条 水 平 线 然 后 再 划 一 条 垂 线, 与 50% 响 应 线 及 所 见 的 检 测 器 信 号 相 交 新 图 形 见 图 32 时 间 (50%) - 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积 图 32. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 3 沿 x 轴 至 50% B 垂 线 处 ( 在 此 处 的 响 应 是 50%), 确 定 时 间, 并 尽 可 能 准 确 假 设 流 速 为 500 µl/min, 时 间 如 有 0.1 分 钟 的 误 差, 估 算 出 的 延 迟 体 积 将 会 有 50 µl 的 误 差 在 本 例 中, 我 们 估 算 50% 响 应 的 时 间 为 4.04 分 钟 计 算 驻 留 体 积 的 简 单 公 式 是, 时 间 (50%) 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积, 在 本 例 中,(4.04-2.00) 分 钟 500 µl/min = 1020 µl 这 一 测 量 是 在 Agilent 1200 RRLC 系 统 (1200 SL) 上 完 成 的, 用 一 根 内 径 为 0.062 mm(0.0025 英 寸 ) 的 100 cm PEEK 限 流 器 使 反 压 达 到 340 bar, 以 水 作 为 流 量 输 送 压 缩 性 补 偿 的 特 殊 溶 剂 该 系 统 包 括 标 准 混 合 器 和 脉 冲 阻 尼 器, 以 及 自 动 进 样 器, 采 用 普 通 流 路 ( 而 不 是 旁 路 模 式 ), 再 连 接 上 述 的 限 流 器 和 3 mm 2 µl 流 通 池 52

评 估 驻 留 体 积 的 影 响 在 不 同 驻 留 体 积 的 仪 器 上 运 行 同 一 方 法, 可 以 得 到 不 同 的 结 果, 如 图 33 所 示 驻 留 体 积 较 小 的 仪 器 驻 留 体 积 较 大 的 仪 器 图 33. 驻 留 体 积 和 分 离 度 在 这 一 例 子 中, 驻 留 体 积 最 小 和 最 大 的 系 统 都 没 有 得 到 好 的 结 果 这 个 方 法 很 可 能 是 在 驻 留 体 积 处 于 中 等 范 围 的 仪 器 上 开 发 的 要 了 解 驻 留 体 积 对 您 的 梯 度 分 离 有 什 么 影 响, 可 以 在 梯 度 运 行 初 期 延 长 或 缩 短 等 度 运 行 时 间 以 进 行 观 察 要 在 驻 留 体 积 较 小 的 系 统 上 模 拟 较 大 驻 留 体 积, 可 在 梯 度 程 序 初 始 时 设 置 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 两 个 驻 留 体 积 之 差 ( 用 ml 表 示 ) 除 以 流 速 ( 以 ml/min 表 示 ) 要 模 拟 较 小 的 驻 留 体 积, 必 须 修 改 进 样 器 程 序, 使 进 样 延 迟 时 间 等 于 相 同 的 驻 留 时 间 有 些 仪 器 有 这 种 功 能, 而 其 它 的 则 没 有 如 果 要 把 方 法 转 移 到 另 一 实 验 室 的 不 同 仪 器 上, 记 录 方 法 开 发 所 用 仪 器 的 驻 留 体 积, 以 及 驻 留 体 积 对 分 离 有 何 影 响 非 常 重 要 53

驻 留 体 积 与 分 析 时 间 驻 留 体 积 还 包 括 进 样 器 体 积, 所 以, 将 进 样 器 的 内 体 积 和 周 围 的 连 接 管 线 降 至 最 低 非 常 重 要 大 多 数 安 捷 伦 自 动 进 样 器 都 提 供 了 旁 路 模 式 选 项, 或 带 有 自 动 延 迟 体 积 减 少 (ADVR) 功 能, 在 样 品 从 样 品 定 量 环 中 冲 出 后, 将 进 样 器 切 换 回 上 样 位 置 根 据 您 选 择 的 进 样 器, 最 多 可 将 系 统 中 的 体 积 减 少 300 µl 标 准 的 安 捷 伦 1200SL 或 1260 Infinity 二 元 梯 度 仪 器 的 起 始 延 迟 体 积 大 约 为 1100 µl, 通 过 更 换 较 小 内 径 管 线 使 用 自 动 进 样 器 旁 路 功 能 并 拆 除 混 合 器 和 阻 尼 器, 可 减 少 至 280 µl 左 右 可 以 通 过 重 叠 进 样 缩 短 快 速 梯 度 分 离 的 分 析 时 间 在 重 叠 进 样 中, 自 动 进 样 器 在 之 前 的 分 析 过 程 中 吸 取 样 品, 一 旦 系 统 准 备 就 绪 即 可 进 样 这 一 功 能 可 以 将 每 次 分 析 的 时 间 缩 短 30 秒 左 右 如 果 您 正 在 进 行 的 是 快 速 梯 度 组 合 化 学 分 析, 则 最 多 可 节 省 1/3 的 分 析 时 间 如 果 您 要 用 非 常 小 的 色 谱 柱 ( 如 毛 细 管 和 微 径 柱 ) 进 行 大 量 梯 度 分 析,280 µl 的 延 迟 体 积 就 显 得 太 高 了 这 时 就 极 有 必 要 使 用 安 捷 伦 毛 细 管 液 相 色 谱 仪 配 合 这 些 色 谱 柱 了 不 要 忘 记, 使 柱 外 体 积 最 低 和 选 择 适 当 的 样 品 进 样 稀 释 剂 同 样 重 要 这 将 有 助 于 最 大 限 度 地 减 少 峰 展 宽 和 分 离 度 的 降 低 另 外, 正 如 我 们 先 前 讨 论 过 的 一 样, 还 要 确 保 正 确 设 置 检 测 器 响 应 时 间, 在 快 速 洗 脱 峰 上 获 得 足 够 的 数 据 点 ( 后 面 还 要 讨 论 这 个 问 题 ) 否 则, 可 能 会 出 现 变 形 的 人 为 宽 峰 螯 合 物 某 些 分 析 物 具 有 易 于 与 金 属 进 行 螯 合 的 结 构 筛 板 或 柱 壁 上 的 金 属 可 能 与 其 发 生 相 互 所 用, 形 成 螯 合 物 用 磷 酸 冲 洗 有 助 于 解 决 这 一 问 题 这 里 介 绍 一 种 判 断 是 否 存 在 金 属 问 题 的 好 办 法 带 有 孤 对 电 子 的 化 合 物, 加 一 个 金 属 离 子 可 以 形 成 环 状 结 构, 这 可 能 导 致 不 重 复 保 留 或 产 生 峰 形 问 题 ( 图 34) 水 杨 醛 六 元 环 络 合 物 8- 羟 基 喹 啉 五 元 环 络 合 物 a-benzoinoxomine 五 元 环 络 合 物 图 34. 评 估 化 合 物 是 否 有 螯 合 问 题 54