Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

Agilent CrossLab 集安捷伦科的创新实验室服务 软件和消耗品 供应于一体 为您提供了与全球科学技术专家团队直接交流的 途径 他们可针对不同层级的实验室环境提供重要且可执行见 解 从而最大限度提高性能 降低实验室运作的复杂性 助力客户实现更高效的经济 运营 与科学成果 唯有 Agilent CrossLab 独特地结合了创新产品与全面解决方案 可确保实验室效率得到快速 持久的改善 我们愿与全球客户携手前行 不断探索实验室领域的新机遇 如需了解更多信息 请访问 www.agilent.de/crosslab www.agilent.com/chem/lccolumns 查找当地的安捷伦客户中心 www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线 800-820-3278 400-820-3278 手机用户 联系我们 LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 www.agilent.com/chem/erfq-cn 安捷伦科技大学 http://www.lsca-china.com.cn/agilent 浏览和订阅 Access Agilent 电子期刊 www.agilent.com/chem/accessagilent-cn 本文中的信息 说明和指标 如有变更 恕不另行通知 安捷伦对本文可能存在的错误或由于提供 展示或使用本文所造成的间接损 失不承担任何责任 安捷伦科技 中国 有限公司 2016 2016 年 2 月 1 日 中国出版 出版号 5990-7595CHCN 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南 了解更多信息 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南

Agilent 1260 Infinity GPC/SEC 系 统 已 经 过 验 证

液 相 色 谱 手 册 液 相 色 谱 柱 与 方 法 开 发 指 南

目 录 前 言 5 色 谱 的 基 本 概 念 6 柱 效 (N) 7 保 留 因 子 (k) 8 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 8 分 离 度 (R s ) 9 压 力 10 van Deemter 曲 线 11 梯 度 方 程 11 液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 13 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 14 压 力 范 围 14 Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 15 溶 剂 混 合 16 延 迟 体 积 18 柱 外 体 积 18 自 动 进 样 器 操 纵 工 作 流 程 自 动 化 体 系 的 大 脑 19 固 定 样 品 环 和 流 通 式 自 动 进 样 器 19 进 样 精 度 和 准 确 度 21 灵 活 性 和 样 品 容 量 21 进 样 周 期 21 交 叉 污 染 22 新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 23 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 23 检 测 器 感 知 器 官 24 检 测 器 灵 敏 度 26 线 性 范 围 26 数 据 采 集 速 率 27 HPLC 柱 的 选 择 28 HPLC 模 式 29 色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 30 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 31 UHPLC 柱 32 表 面 多 孔 填 料 柱 32 LC/MS 柱 33 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 34 生 物 表 征 柱 34 色 谱 柱 特 性 35 硅 胶 35 键 合 相 35 聚 合 物 35 孔 径 36 粒 径 36 色 谱 柱 规 格 37 卡 套 柱 系 统 38 性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 41 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 42 实 现 完 美 的 接 头 连 接 43 接 头 连 接 要 求 43 不 可 调 金 属 接 头 43 可 调 手 紧 式 接 头 45 Agilent A-Line 接 头 45 200 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 47 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 47 进 样 量 47 2

设 置 数 据 采 集 速 率 48 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 49 测 量 系 统 的 驻 留 体 积 51 评 估 驻 留 体 积 的 影 响 53 驻 留 体 积 与 分 析 时 间 54 螯 合 物 54 ph 和 流 动 相 改 性 剂 55 梯 度 操 作 56 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 57 色 谱 柱 老 化 59 键 合 相 流 失 59 清 洗 反 相 硅 胶 柱 59 清 洗 正 相 硅 胶 柱 61 清 洗 反 相 聚 合 物 柱 61 方 法 开 发 62 方 法 开 发 : 从 何 处 入 手 63 模 式 选 择 63 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 66 选 择 固 定 相 67 反 相 色 谱 的 方 法 开 发 67 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 67 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 70 流 动 相 操 作 70 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 70 流 动 相 混 合 71 流 动 相 脱 气 71 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 71 UV 检 测 器 常 用 的 缓 冲 液 73 LC/MS 的 考 虑 因 素 74 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 76 问 题 排 查 实 例 : 基 线 漂 移 76 问 题 排 查 实 例 : 高 ph 造 成 的 峰 展 宽 和 峰 分 裂 78 问 题 排 查 实 例 : 流 动 相 改 性 剂 和 选 择 性 78 轻 松 可 靠 的 ph 测 试 79 优 化 反 相 色 谱 条 件 80 等 度 优 化 81 梯 度 优 化 84 用 于 反 相 色 谱 的 聚 合 物 色 谱 柱 86 反 相 色 谱 的 等 度 方 法 开 发 上 手 步 骤 指 南 87 从 常 规 柱 向 高 效 柱 进 行 方 法 转 移 的 技 巧 89 自 动 化 方 法 开 发 工 具 91 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 93 HILIC 93 正 相 色 谱 95 离 子 交 换 色 谱 97 凝 胶 渗 透 色 谱 / 体 积 排 阻 色 谱 98 液 质 联 用 仪 基 本 原 理 99 什 么 是 LC/MS? 99 LC/MS 可 提 供 哪 些 信 息? 100 液 质 联 用 仪 的 类 型 101 单 四 极 杆 仪 器 101 三 重 四 极 杆 仪 器 101 飞 行 时 间 和 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 101 匀 场 离 子 淌 度 系 统 102 MS/MS 碎 裂 化 合 物, 获 得 额 外 的 特 异 性 102 化 合 物 的 电 离 103 电 喷 雾 电 离 103 转 下 页 3

大 气 压 化 学 电 离 103 大 气 压 光 电 离 103 利 用 LC/MS 开 发 方 法 的 技 巧 104 ESI-MS 的 溶 剂 选 择 104 APCI-MS 和 APPI-MS 的 溶 剂 选 择 105 离 子 对 色 谱 与 质 谱 联 用 系 统 的 溶 剂 选 择 105 样 品 前 处 理 106 基 质 组 分 106 浓 度 问 题 106 关 于 离 子 抑 制 的 注 意 事 项 106 使 用 配 备 高 效 色 谱 柱 的 LC/MS 时 的 注 意 事 项 107 灵 敏 度 的 提 升 107 质 谱 扫 描 速 率 108 系 统 扩 散 108 LC/MS 软 件 109 扫 描 类 型 比 较 TIC EIC 和 SIM 109 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 110 色 谱 结 果 的 保 护 112 可 扩 展 性 113 使 用 高 纯 度 级 别 溶 剂 的 重 要 性 116 UHPLC 的 特 殊 考 虑 116 在 线 过 滤 器 117 低 体 积 在 线 过 滤 器 117 保 护 柱 118 溶 剂 饱 和 柱 118 色 谱 柱 入 口 筛 板 118 色 谱 柱 保 护 和 保 存 118 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 118 保 存 注 意 事 项 120 疏 通 色 谱 柱 120 色 谱 柱 变 坏 时 的 快 速 检 查 120 确 保 方 法 在 全 球 范 围 内 都 重 现 121 提 高 方 法 的 耐 用 性 121 有 关 驻 留 体 积 的 提 示 122 快 速 故 障 排 查 指 南 123 有 效 排 查 故 障 的 要 点 123 有 用 的 参 考 资 料 129 美 国 药 典 指 定 填 料 129 溶 剂 相 溶 性 135 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 138 固 相 萃 取 吸 附 剂 139 SPE 吸 附 剂 条 件 140 其 它 推 荐 的 读 物 141 其 它 安 捷 伦 资 源 141 词 汇 表 142 索 引 169 安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 175 安 捷 伦 毛 细 管 和 接 头 181 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪 器 用 灯 186 安 捷 伦 溶 剂 安 全 盖 188 安 捷 伦 在 线 过 滤 器 190 Agilent 1200 Infinity 系 列 液 相 色 谱 产 品 组 合 191 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 192 备 注 194 4

前 言 从 何 说 起 呢? 液 相 色 谱 是 一 个 庞 大 而 复 杂 的 话 题, 但 也 是 一 个 我 们 永 不 会 失 去 兴 趣 的 话 题 遍 及 世 界 各 地 的 色 谱 工 作 者 正 在 使 用 HPLC 技 术, 确 保 我 们 食 物 和 水 的 安 全 开 发 挽 救 生 命 的 药 物 保 护 我 们 的 环 境 保 卫 公 共 健 康, 而 这 仅 仅 是 其 应 用 的 一 角 您 对 色 谱 技 术 了 解 得 越 多, 您 能 应 用 这 一 神 奇 技 术 所 能 做 的 工 作 就 越 多 如 今, 有 更 多 的 色 谱 柱 和 填 料 供 您 选 择, 以 适 应 日 益 广 泛 的 应 用 需 求 安 捷 伦 现 在 有 2000 多 种 色 谱 柱 可 供 选 择, 覆 盖 了 最 广 泛 的 应 用 和 条 件 这 就 增 加 了 根 据 您 的 需 要 选 择 最 适 用 色 谱 柱 的 机 会 帮 助 您 得 到 最 好 的 液 相 色 谱 结 果 是 我 们 承 诺 的 一 部 分, 因 此, 我 们 编 制 了 这 本 液 相 色 谱 柱 选 择 手 册, 其 中 包 含 了 大 量 的 提 示 和 技 巧, 让 您 的 工 作 更 轻 松 更 高 效 另 外, 我 们 还 以 40 多 年 积 累 的 经 验 为 基 础, 为 您 提 供 色 谱 柱 和 接 头 日 常 使 用 中 常 见 的 问 题 提 供 建 议 本 指 南 涵 盖 了 液 相 色 谱 中 的 主 要 色 谱 柱, 重 点 是 反 相 高 效 液 相 色 谱 如 何 使 用 本 指 南 : 为 便 于 查 询, 各 章 节 有 不 同 颜 色 标 记 附 加 的 词 汇 表 非 常 全 面 虽 然 限 于 篇 幅, 我 们 没 能 收 录 本 书 中 的 每 个 词 汇 术 语, 但 仍 不 失 为 良 好 的 资 源 虽 然 本 书 也 涉 及 了 其 它 技 术, 但 重 点 是 反 相 HPLC 5

色 谱 的 基 本 概 念 我 们 都 还 记 得 在 学 校 里 学 习 数 学 的 感 觉, 总 是 想 知 道 怎 么 把 它 用 到 实 际 生 活 中 去 科 学 家 们 要 比 专 业 人 员 学 习 更 多 的 数 学, 本 章 将 告 诉 我 们 其 中 的 原 因 这 里, 我 们 将 简 要 概 述 一 下 色 谱 概 念 所 涉 及 的 公 式 和 理 论 对 这 些 概 念 的 理 解 将 帮 助 您 获 得 最 好 的 结 果, 并 在 遇 到 问 题 时 进 行 排 查 我 们 将 从 以 下 的 性 能 基 本 概 念 开 始 : 柱 效 保 留 选 择 性 分 离 度 压 力 这 些 都 是 理 解 如 何 优 化 结 果 成 功 开 发 方 法 的 关 键 我 们 还 将 探 讨 一 些 较 复 杂 的 概 念 : van Deemter 曲 线 梯 度 方 程 这 两 项 内 容 对 方 法 开 发 也 很 重 要 6

柱效 (N) 柱效用于比较不同色谱柱的性能 柱效可能是描述色谱柱性能引用频率最高的参数 以理论塔板数 N 表示 柱效 保留时间 峰底宽 方程 1. 柱效方程 保留时间 半峰宽 方程 2. 计算柱效的变换方程 塔板数高的色谱柱柱效更高 理论塔板数高的色谱柱与理论塔板数低的色谱柱相比 在给定保留时间内的 色谱峰更窄 柱效 N = 16 (tr/wt)2 对于色谱峰 B 16 (4.5 分钟/0.9 分钟) 2 = 400 塔板数 k = (tr-t0)/t0 保留 检测器响应 ka = (2.5-1)/1 = 1.5 kb = (4.6-1)/1 = 3.6 kc = (6.2-1)/1 = 5.2 选择性 (C-B) α = k2/k1 α = kc/kb = 5.2/3.6 = 1.44 α = 1.44 选择性 (B-A) α = k2/k1 α = kb/ka = 3.6/1.5 = 2.4 图 1. 柱效的色谱示意图 α = 2.4 7

如 果 我 们 在 约 4σ 峰 宽 处 做 切 线, 并 测 量 t w 距 离, 就 可 以 用 方 程 1 计 算 色 谱 峰 B 的 理 论 塔 板 数,N = 16 (t R /t W ) 2 有 时,4σ 峰 宽 很 难 测 量 ( 如, 基 线 噪 音 较 大 时 ), 可 以 使 用 变 换 方 程 ( 方 程 2), 测 量 半 峰 宽 (w 1/2 ):N = 5.54 (t R /w 1/2 ) 2 高 柱 效 的 好 处 很 大, 即 使 选 择 性 较 低 也 可 以 分 离 窄 峰 柱 效 受 柱 参 数 ( 内 径 柱 长 粒 度 ) 洗 脱 液 类 型 ( 特 别 是 粘 度 ) 流 速 或 平 均 线 速 度 的 影 响 柱 效 还 受 化 合 物 及 其 保 留 的 影 响 常 使 用 每 米 理 论 塔 板 数 (N/m) 进 行 色 谱 柱 的 比 较, 但 需 要 在 相 同 的 色 谱 温 度 条 件 和 峰 保 留 (k) 下 进 行 对 于 α 较 小 的 固 定 相, 柱 效 对 分 离 更 为 重 要 保 留 因 子 (k) 过 去 称 为 容 量 因 子 或 k (k 值 ), 保 留 因 子 是 指 样 品 组 分 停 留 在 固 定 相 中 相 对 其 驻 留 在 流 动 相 中 的 时 间 之 比 用 保 留 时 间 除 以 峰 不 保 留 时 间 (t 0 ) 进 行 计 算 样 品 峰 的 保 留 时 间 保 留 因 子 峰 不 保 留 时 间 方 程 3. 保 留 因 子 方 程 选 择 性 或 分 离 因 子 (α) 分 离 因 子 是 对 两 个 色 谱 峰 之 间 时 间 或 距 离 的 最 大 测 量 值 如 果 α = 1, 则 两 个 色 谱 峰 具 有 相 同 的 保 留 时 间 并 共 洗 脱 选 择 性 因 子 第 一 个 峰 的 保 留 因 子 第 二 个 峰 的 保 留 因 子 方 程 4. 选 择 性 方 程 8

选 择 性 因 子 的 定 义 是 容 量 因 子 之 比 在 图 1 中, 您 会 看 到, 峰 A 和 峰 B 之 间 的 选 择 性 比 峰 B 和 峰 C 的 选 择 性 更 好 图 中 提 供 了 计 算 说 明 改 变 流 动 相 或 固 定 相 都 可 以 改 变 选 择 性 温 度 也 是 调 节 选 择 性 的 一 个 因 素 分 离 度 (R s ) 分 离 度 代 表 色 谱 柱 分 离 目 标 峰 的 能 力, 因 此, 分 离 度 越 高, 两 峰 之 间 越 容 易 得 到 基 线 分 离 从 方 程 5 中 可 以 看 出, 分 离 度 与 柱 效 选 择 性 和 保 留 值 相 关 可 以 通 过 改 善 这 些 因 素 来 提 高 分 离 度 方 程 5. 分 离 度 方 程 在 图 2 中, 我 们 可 以 看 到 每 个 参 数 在 分 离 过 程 中 的 不 同 作 用 所 有 这 些 参 数 都 呈 效 应 递 减 趋 势 即 取 值 越 大, 对 分 离 度 的 影 响 就 越 小 如 果 将 柱 长 加 倍, 将 得 到 更 多 的 理 论 塔 板 数, 但 分 离 时 间 也 将 延 长 2 倍, 而 分 离 度 只 能 得 到 2 的 平 方 根 即 1.4 倍 的 提 高 如 果 要 对 色 谱 峰 进 行 定 量, 那 么 分 离 度 最 小 应 等 于 1 分 离 度 要 达 到 0.6, 才 能 分 辨 两 个 等 高 峰 间 的 峰 谷 如 需 建 立 耐 用 方 法, 理 想 分 离 度 值 一 般 应 大 于 等 于 1.7 基 线 分 离 并 确 保 最 准 确 定 量 结 果 的 分 离 度 应 为 1.6 9

选择性对分离度的影响主要是通过 改变键合相 改变流动相 塔板数是最容易增加的 分离度 增加 N 增加选择性 增加 k 塔板数 选择性 图 2. 分离度为选择性 柱效和保留值的函数 压力 压力方程 方程 6 包含影响系统压力的 5 个重要参数 溶剂粘度 (h) 流速 (F) 柱长 (L) 色谱柱半径 (r) 和填料粒径 (dp) 熟悉压力方程将能很好地理解这些重要参数对系统压力的影响 压力的改变 粘度 流速 柱长 柱渗透性 柱半径 粒径 方程 6. 压力方程 从公式中可以看出 粒径 (dp) 稍微降低就会对反压造成明显影响 10

van Deemter 曲 线 van Deemter 方 程 是 将 柱 效 作 为 线 速 度 (u) 或 流 速 的 函 数 对 柱 效 ( 用 H 表 示, 见 方 程 7) 进 行 评 价 H 称 为 塔 板 高 度, 或 理 论 塔 板 高 度, 用 柱 长 (L) 除 以 理 论 塔 板 数 进 行 计 算 我 们 的 目 标 是 得 到 小 塔 板 高 度 可 以 通 过 使 用 较 小 填 料 色 谱 柱 优 化 线 速 度, 以 及 使 用 低 粘 度 流 动 相, 更 有 效 地 实 现 这 一 目 标 随 着 粒 径 减 小, 优 化 线 速 度 将 增 大 方 程 7. van Deemter 方 程 塔 板 高 度 (H) 大 粒 径 填 料 小 粒 径 填 料 总 曲 线 :van Deemter 传 质 阻 力 纵 向 扩 散 涡 流 扩 散 线 速 度 (u) 塔 板 高 度 越 小, 塔 板 数 越 大, 色 谱 分 离 度 将 越 大 图 3. van Deemter 方 程 图 示 我 们 经 常 通 过 绘 制 van Deemter 曲 线 评 价 不 同 色 谱 柱 的 性 能, 并 理 解 如 何 根 据 方 法 进 行 线 速 度 的 优 化 (u opt ) 梯 度 方 程 当 样 品 中 存 在 各 种 类 型 的 组 分 时, 我 们 很 难 用 等 度 洗 脱 ( 即, 恒 定 流 动 相 组 成 ) 在 适 当 时 间 内 让 所 有 组 分 都 得 到 分 离 梯 度 洗 脱 是 一 个 随 时 间 提 高 流 动 相 强 度 的 过 程, 最 终 使 分 析 速 度 更 快 峰 形 和 定 量 结 果 更 好 通 过 梯 度 洗 脱, 峰 宽 通 常 将 更 窄, 并 保 持 恒 定 ( 有 关 梯 度 洗 脱 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 55 页 ) 梯 度 方 程 ( 方 程 8) 显 示 了 影 响 分 析 的 关 键 因 素, 如 果 忽 视 它 们, 可 能 会 给 色 谱 分 离 带 来 问 题 该 方 程 显 示 了 流 速 (F) 梯 度 时 间 (t G ) 梯 度 范 围 (DF) 和 柱 体 积 (V M ) 对 保 留 因 子 的 影 响 切 记, 为 保 持 保 留 因 子 恒 定, 如 需 改 变 分 母 则 需 按 比 例 改 变 分 子, 反 之 亦 然 11

增 加 保 留 因 子 k ( 或 k*, 在 梯 度 中 ) 是 提 高 分 离 度 的 简 便 途 径, 但 如 图 2 所 示, 它 并 不 如 增 加 柱 效 和 选 择 性 更 有 效 如 通 过 延 长 梯 度 时 间 增 加 保 留 因 子, 将 使 分 析 时 间 延 长, 如 方 程 8 所 示 梯 度 时 间 流 速 梯 度 保 留 值 色 谱 柱 死 体 积 常 数 B 溶 剂 体 积 变 化 方 程 8. 梯 度 方 程 在 梯 度 方 程 中,S 为 常 数, 与 所 分 离 的 分 子 大 小 有 关 小 分 子 的 S 值 约 为 4 到 6, 多 肽 和 蛋 白 质 的 S 介 于 10 到 1000 之 间 现 在, 经 常 使 用 不 同 尺 寸 的 色 谱 柱, 或 使 其 更 短 ( 例 如, 为 实 现 更 高 通 量 ), 或 使 用 窄 内 径 柱 ( 如, 用 于 质 谱 检 测 ) 必 须 按 比 例 缩 短 梯 度 时 间 (t G ) 或 减 小 流 速 (F), 以 补 偿 柱 体 积 的 减 少 使 用 相 同 色 谱 柱 时, 如 果 想 保 持 相 同 的 梯 度 斜 率 和 k* 值, 则 需 在 梯 度 时 间 (t G ) 内 按 比 例 调 整 梯 度 组 成 (DF) 改 变 速 率 或 流 速 (F) 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 软 件 是 将 方 法 转 移 到 不 同 规 格 色 谱 柱 时 的 绝 佳 方 法 登 录 www.agilent.com 输 入 液 相 色 谱 方 法 转 移 器 (LC Method Translator) 搜 索 得 到 方 法 转 移 器 12

液 相 色 谱 仪 基 本 原 理 HPLC 或 UHPLC 分 离 分 析 物 混 合 物 和 检 测 各 种 化 合 物 采 用 的 典 型 液 相 色 谱 系 统 由 四 个 核 心 组 件 组 成 本 章 将 介 绍 这 些 组 件, 并 着 重 介 绍 它 们 最 重 要 且 最 关 键 的 方 面 在 操 作 或 选 择 液 相 色 谱 系 统 时 对 这 些 方 面 的 慎 重 考 量, 有 助 于 我 们 获 得 稳 定 一 致 的 结 果 和 实 现 效 率 最 大 化 典 型 液 相 色 谱 系 统 中 的 每 个 组 件 或 模 块 在 分 离 和 检 测 过 程 中 都 各 自 发 挥 着 它 们 独 有 的 功 能, 而 这 些 功 能 都 同 等 重 要 为 了 描 述 这 些 功 能, 我 们 将 按 照 系 统 流 路 的 顺 序 ( 从 泵 到 进 样 器 和 色 谱 柱, 再 到 检 测 器 ) 进 行 介 绍, 见 图 4 色 谱 柱 泵 自 动 进 样 器 检 测 器 一 维 色 谱 图 泵 泵 自 动 进 样 器 色 谱 柱 检 测 器 ( 可 选 ) 阀 ( 进 样 器 ) 色 谱 柱 检 测 器 二 维 色 谱 图 图 4. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 的 组 件 13

Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 新 型 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 代 表 UHPLC 的 未 来, 其 拥 有 安 捷 伦 提 供 的 无 与 伦 比 的 可 靠 性 和 稳 定 性, 采 用 了 突 破 性 技 术, 能 够 最 大 程 度 地 提 高 您 的 业 务 效 率 分 析 效 率 最 大 化 : 无 可 比 拟 的 分 离 和 检 测 性 能, 可 提 供 最 高 质 量 的 分 析 数 据, 让 您 对 结 果 充 满 信 心 仪 器 效 率 最 大 化 : 最 高 的 样 品 容 量 最 快 的 进 样 周 期 以 及 前 所 未 有 的 可 用 性 使 仪 器 在 任 何 应 用 中 均 可 实 现 最 高 通 量 泵 液 相 色 谱 系 统 的 心 脏 在 将 流 动 相 输 送 入 系 统 之 前, 泵 将 以 恒 定 的 比 例 ( 等 度 ) 或 变 化 的 比 例 ( 梯 度 ) 混 合 溶 剂 在 梯 度 模 式 下, 泵 逐 渐 提 升 流 动 相 中 第 二 种 组 分 所 占 的 百 分 比 我 们 将 流 动 相 的 第 二 种 组 分 称 为 溶 剂 B, 它 的 洗 脱 强 度 比 流 动 相 的 第 一 种 组 分 ( 溶 剂 A) 更 高 许 多 泵 还 设 有 脱 气 单 元, 用 于 去 除 溶 解 在 溶 剂 中 的 空 气 溶 剂 脱 气 有 助 于 减 少 检 测 器 基 线 波 动 ( 例 如 基 线 漂 移 和 噪 音 ) 压 力 范 围 HPLC 和 UHPLC 的 泵 输 送 流 动 相, 使 其 通 过 装 填 有 固 定 相 的 色 谱 柱 泵 必 须 在 50 bar 至 1300 bar 的 高 压 下 输 送 流 动 相 才 能 克 服 色 谱 柱 中 的 固 定 相 产 生 的 阻 力 标 准 HPLC 色 谱 柱 一 般 装 填 5 µm 硅 胶 基 质 颗 粒 对 于 50 mm 至 300 mm 长 内 径 为 4.6 mm 的 标 准 HPLC 色 谱 柱 而 言, 采 用 能 够 在 400 bar 的 压 力 下 输 送 液 流 的 泵 通 常 就 已 足 够 相 比 之 下, 现 代 UHPLC 所 用 的 色 谱 柱 颗 粒 可 达 到 2 µm 以 下 采 用 小 粒 径 的 全 多 孔 颗 粒 ( 小 于 2 µm) 且 内 径 较 小 ( 小 于 2.1 mm) 柱 长 较 长 ( 例 如 300 mm) 的 色 谱 柱 要 求 泵 具 有 1000 bar 或 更 高 的 输 送 压 力 分 析 型 液 相 色 谱 应 用 常 用 的 典 型 流 速 介 于 100 µl/min 和 10 ml/min 之 间 我 们 根 据 泵 的 能 力 范 围 ( 定 义 为 流 速 和 耐 压 能 力 的 组 合 ) 对 其 进 行 分 类 14

Agilent 1200 Infinity 系 列 泵 的 能 力 范 围 Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 在 高 达 2 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 1300 bar, 在 高 达 5 ml/min 的 流 速 下 可 耐 压 800 bar, 见 图 5 表 1 展 示 了 各 种 泵 适 用 的 色 谱 柱 类 型 bar 1200 1000 1290 Infinity II 1290 Infinity 800 600 400 200 1220/1260 Infinity HPLC 200 bar 10 ml/min 1220 / 1260 Infinity VL 0 0 1 2 3 4 5 ml/min 图 5. 典 型 现 代 液 相 色 谱 系 统 组 件 色 谱 柱 类 型 颗 粒 HPLC 3-5µm HPLC 表 面 多 孔 UHPLC < 2µm (STM) UHPLC 表 面 多 孔 色 谱 柱 柱 长 /mm 50-300 50-250 Short 30-50 Long 100-150 30-150 色 谱 柱 内 径 /mm 3.0-4.6 3.0-4.6 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0-4.6 最 大 压 力 /bar 400 400 1200 1200 600 1200 1200 600 600 600 安 捷 伦 色 谱 柱 类 型 多 种 Poroshell 120 4 µm 1290 高 速 泵 - 1300 bar 1290 全 能 泵 - 1300 bar RRHD RRHD RRHT RRHD RRHD RRHT Poroshell 120 2.7 µm Poroshell 120 2.7 µm 1260 Bin/600 bar 2) 1260Q/1220G - 600 bar 1) 2) 1) 常 规 液 相 色 谱 400 bar 2) 2) 2) 2) 3) 3) 图 示 说 明 最 好 良 好 可 接 受 不 适 用 1) 由 于 延 迟 体 积 的 原 因 2) 由 于 延 迟 体 积 和 压 力 的 原 因 3) 由 于 压 力 的 原 因 STM 短 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 30-50 mm STM 长 型 : 亚 2 µm 颗 粒, 长 100-150 mm HPLC:3-5 µm 颗 粒 表 1. 色 谱 柱 填 料 应 用 条 件 指 南 15

溶 剂 混 合 除 了 输 送 流 动 相, 泵 还 必 须 以 高 准 确 度 和 高 精 度 混 合 溶 剂 泵 必 须 能 够 为 等 度 洗 脱 提 供 比 例 精 确 恒 定 的 溶 剂, 还 必 须 能 够 将 两 种 或 更 多 种 溶 剂 混 合 成 为 比 例 随 时 间 变 化 的 溶 剂 梯 度 泵 精 确 混 合 溶 剂 和 提 供 可 重 现 流 速 的 能 力 决 定 了 泵 的 保 留 时 间 重 现 性 保 留 时 间 是 液 相 色 谱 的 基 本 参 数 之 一, 它 能 指 示 采 用 特 定 的 色 谱 柱 和 流 动 相 组 合 进 行 分 离 时, 物 质 的 保 留 特 性 我 们 通 常 使 用 两 种 不 同 类 型 的 泵, 根 据 泵 混 合 溶 剂 的 方 式 来 区 分 它 们 四 元 泵 在 低 压 下 混 合 溶 剂 最 多 四 条 溶 剂 管 线 通 向 多 通 道 阀, 按 预 设 的 比 例 进 行 混 合 采 用 这 种 方 式, 泵 能 够 形 成 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 溶 剂 混 合 在 泵 的 低 压 侧 进 行, 见 图 6 对 溶 剂 进 行 适 当 的 脱 气 对 于 防 止 溶 剂 配 比 和 混 合 过 程 中 形 成 气 泡 至 关 重 要 通 常, 泵 利 用 内 置 单 元 或 外 部 单 元 对 溶 剂 进 行 脱 气, 然 后 利 用 高 压 泵 腔 将 混 合 好 的 溶 剂 ( 流 动 相 ) 输 送 至 进 样 器 脱 气 单 元 阻 尼 器 比 例 阀 伺 服 驱 动 的 串 联 式 双 活 塞 泵 图 6. 用 于 低 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 脱 气 单 元 比 例 阀 和 泵 腔 自 动 进 样 器 二 元 泵 在 泵 的 高 压 侧 混 合 溶 剂, 通 常 只 能 混 合 两 种 溶 剂 二 元 泵 的 主 要 优 势 在 于, 当 溶 剂 组 分 之 一 所 占 的 比 例 较 小 时, 它 能 够 更 准 确 更 精 密 地 混 合 溶 剂 此 类 混 合 可 在 溶 剂 梯 度 开 始 和 结 束 时 提 供 高 精 度 的 溶 剂 组 成, 见 图 7 高 压 混 合 二 元 泵 的 另 一 个 优 势 是 延 迟 体 积 较 小 我 们 将 延 迟 体 积 定 义 为 混 合 点 到 色 谱 柱 梯 度 启 始 处 之 间 的 流 动 相 体 积 缩 小 延 迟 体 积 有 利 于 加 快 运 行 速 度 和 缩 短 分 析 时 间 对 于 高 压 混 合 而 言, 脱 气 不 再 是 一 个 问 题, 因 为 溶 剂 在 混 合 时 处 于 加 压 状 态 16

脱 气 单 元 阻 尼 器 阻 尼 器 混 合 器 通 道 A 通 道 B 泵 自 动 进 样 器 图 7. 用 于 高 压 梯 度 混 合 的 溶 剂 输 送 系 统 的 示 意 图, 显 示 了 用 于 生 成 二 元 洗 脱 液 梯 度 的 两 个 溶 剂 通 道 与 二 元 泵 相 比, 四 元 泵 更 灵 活, 因 为 它 们 不 仅 能 提 供 二 元 梯 度, 还 能 提 供 三 元 和 四 元 梯 度 另 外, 四 元 泵 还 能 向 流 动 相 中 在 线 混 入 添 加 剂 低 压 混 合 泵 的 价 格 通 常 较 低, 因 为 它 们 只 有 一 个 泵, 而 高 压 混 合 则 需 要 两 个 泵, 见 表 2 等 度 泵 四 元 泵 二 元 泵 溶 剂 1 4 2 混 合 不 混 合 低 压 混 合 高 压 混 合 梯 度 无 梯 度, 仅 等 度 二 元 三 元 和 四 元 梯 度 仅 二 元 梯 度 延 迟 体 积 无 梯 度, 无 延 迟 体 积 延 迟 体 积 较 大 延 迟 体 积 较 小 脱 气 机 必 须 脱 气 建 议 脱 气 梯 度 混 合 性 能 无 梯 度 中 心 处 性 能 良 好, 梯 度 两 端 性 能 较 差 (1290 Infinity II 全 能 泵 除 外 ) 性 能 极 佳 表 2. 液 相 色 谱 泵 的 不 同 混 合 原 理 比 较 17

延 迟 体 积 我 们 将 延 迟 体 积 或 滞 后 体 积 定 义 为 流 动 相 混 合 点 到 色 谱 柱 柱 头 之 间 的 系 统 体 积 延 迟 体 积 会 显 著 影 响 分 析 速 度 会 影 响 延 迟 体 积 的 主 要 系 统 组 件 包 括 样 品 混 合 器 和 阻 尼 器 连 接 毛 细 管 进 样 器 的 液 压 容 积 和 热 交 换 器 的 体 积 因 此, 泵 和 进 样 器 的 设 计 会 极 大 影 响 分 析 速 度 现 代 UHPLC 泵 经 过 专 门 设 计, 力 求 在 不 影 响 混 合 性 能 的 前 提 下 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 的 延 迟 体 积 Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 与 市 面 上 的 其 他 四 元 泵 均 不 同 此 款 泵 的 混 合 性 能 与 高 压 混 合 泵 相 当, 而 且 在 较 低 和 较 高 的 溶 剂 比 例 下 均 能 形 成 高 重 现 性 的 梯 度 相 比 之 下,Agilent 1290 Infinity II 高 速 泵 具 有 极 低 的 延 迟 体 积, 有 利 于 缩 短 运 行 时 间 Agilent 1290 Infinity II 泵 采 用 的 新 技 术 可 最 大 程 度 减 小 延 迟 体 积 Agilent Jet Weaver 和 Inlet Weaver 混 合 器 可 确 保 有 效 混 合 小 体 积 溶 剂,Agilent 1290 Infinity II 全 能 泵 和 高 速 泵 则 采 用 了 主 动 阻 尼 技 术, 在 混 合 过 程 中 将 流 动 相 的 压 缩 特 性 也 考 虑 在 内 这 种 可 实 现 皮 升 水 平 精 密 计 量 的 主 动 阻 尼 技 术 取 代 了 物 理 阻 尼 器 柱 外 体 积 我 们 将 柱 外 体 积 定 义 为 进 样 点 与 检 测 器 出 口 之 间 的 系 统 体 积 导 致 柱 外 体 积 产 生 的 主 要 因 素 包 括 毛 细 管 热 交 换 器 连 接 件 和 接 头, 以 及 检 测 器 流 通 池 如 果 柱 外 体 积 过 大, 会 导 致 样 品 扩 散 和 分 析 物 谱 带 展 宽, 进 而 导 致 分 离 度 下 降 和 灵 敏 度 降 低 使 用 毛 细 管 柱 接 头 或 者 在 系 统 中 安 装 色 谱 柱 时 尤 其 需 要 注 意 接 头 使 用 不 当 常 常 会 导 致 意 料 之 外 且 通 常 不 易 被 察 觉 的 死 体 积, 这 可 能 会 严 重 影 响 分 离 效 果 使 用 小 内 径 (2.1 mm 或 更 小 ) 的 色 谱 柱 进 行 等 度 分 离 时, 必 须 慎 重 考 虑 柱 外 体 积 和 毛 细 管 的 内 径 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 采 用 精 心 设 计 的 系 统 以 及 用 户 友 好 的 接 头 ( 例 如 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 ), 可 基 本 上 消 除 死 体 积, 让 液 相 色 谱 分 析 更 加 稳 定, 并 且 不 受 用 户 操 作 水 平 的 影 响 18

自动进样器 操纵工作流程自动化体系的 大脑 自动液体进样器 又称自动进样器 现在已经取代了手动进样器 因为它们能够在无需用户干预的前提下以 高准确度和高精度进样多个样品 分析型自动进样器 例如那些用于 HPLC 的进样器 可进样的样品体积通 常在 100 nl 至 100 µl 之间 通过一些改动 我们可以提高这些自动进样器可进样的样品量 从而将它们应 用于高度稀释的样品或半制备分析 在 UHPLC 分析中 自动进样器注入的样品量通常较少 因为此类系统 采用小内径色谱柱 为了实现良好的分离 必须避免色谱柱过载 固定样品环和流通式自动进样器 自动进样器可采用两种不同的设计方案 固定样品环和流通式自动进样器 在固定样品环设计中 样品被 吸入或推入一个样品环中 然后该样品环被切换到样品流路中 见图 8 泵 辅助溶剂 计量装置 废液 针座 1 2 10 9 3 8 4 5 自动进样器 色谱柱 6 7 废液 图 8. 采用固定样品环设计的自动进样器 图中所示为样品环被切换到样品流路中的状态 在流通式自动进样器中 流动相将通过样品环以及计量装置和进样针 流通式设计的主要优势在于其进样 量范围更灵活 见图 9 在固定样品环设计中 用户通常必须使样品环过载才能达到最高的重现性 用户 也可以部分填充样品环 但是这种方法的重现性较差 如果用户需要使用固定样品环自动进样器注入较小 或较大体积的样品 通常必须更换样品环 19

泵 样品环 计量装置 废液 针座 4 2 6 自动进样器 3 5 1 色谱柱 图 9. 采用流通式设计的自动进样器 显示液流如何将样品输送入色谱柱中 流通式设计的另一个优势是交叉污染较低 交叉污染是指前一次分析的样品组分出现在下一次运行的色谱 图中的现象 这是由于某些组分粘附到了系统表面 管线 接头或色谱柱材料上 并在下一次分析中被洗 脱下来 在流通式自动进样器设计中 整个梯度将会冲洗自动进样器的所有液压部件 这样可确保在色谱 运行过程中高效地清洁计量装置 样品环和进样针的内表面 表 3 总结了固定样品环和流通式自动进样器 之间的差异 固定样品环自动进样器 流通式自动进样器 原理 样品环被切入和切出溶剂流 样品环 进样针和计量装置被切入和切出溶剂流 样品浪费 高 因为样品环须过量填充 无 不更换硬件前提下的 低 可以部分填充样品环 但精度较低 高 进样量灵活性 进样量线性 差 因为必须使用不同的样品环 极佳 延迟体积 低 高 交叉污染 中等 低 因为在梯度运行过程中将冲洗所有的流路部件 表 3. 固定样品环和流通式自动进样器对比 在 HPLC 或 UHPLC 应用中 为了获得高质量的结果 我们必须考虑多个关键的自动进样器参数 后面的章 节将介绍这些参数 20

进 样 精 度 和 准 确 度 要 在 运 行 之 间 获 得 良 好 的 定 量 重 现 性, 进 样 精 度 至 关 重 要 进 样 精 度 是 指 自 动 进 样 器 在 多 次 运 行 中 保 持 相 同 进 样 量 的 能 力 另 一 方 面, 进 样 准 确 度 则 描 述 了 自 动 进 样 器 达 到 预 设 的 进 样 量 绝 对 值 的 能 力 现 代 UHPLC 仪 器 的 进 样 精 度 通 常 可 达 到 小 于 0.15% RSD 灵 活 性 和 样 品 容 量 如 今, 实 验 室 在 提 高 样 品 通 量 和 降 低 总 成 本 方 面 面 临 着 极 大 的 压 力 另 外,UHPLC 仪 器 也 越 来 越 多 地 应 用 于 多 用 户 环 境, 或 是 在 高 通 量 模 式 下 运 行 由 于 自 动 进 样 器 是 样 品 的 入 口 端, 因 此 该 模 块 需 要 使 用 灵 活 的 样 品 容 器 以 支 持 不 同 的 工 作 流 程, 还 要 避 免 造 成 干 扰 或 产 生 重 组 样 品 的 需 求 用 于 此 类 环 境 的 自 动 进 样 器 必 须 能 够 支 持 多 种 形 式 的 样 品 容 器 另 一 方 面, 通 常 需 要 采 用 大 型 进 样 器 装 置 来 满 足 高 容 量 要 求, 由 于 占 用 的 台 面 空 间 较 大, 通 常 会 导 致 成 本 升 高 Agilent 1200 Infinity 系 列 自 动 进 样 器 Agilent Infinity 系 列 的 大 多 数 自 动 进 样 器 均 采 用 流 通 式 设 计, 具 有 卓 越 的 灵 活 性 新 型 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 完 美 设 计 仅 占 用 极 小 的 台 面 空 间, 同 时 很 好 地 解 决 了 灵 活 性 和 高 样 品 容 量 问 题 用 户 可 使 用 不 同 的 样 品 抽 屉, 并 且 可 对 样 品 抽 屉 进 行 配 置 和 更 改 以 满 足 用 户 的 当 前 需 求 Agilent 1290 Infinity II Multisampler 的 样 品 容 量 已 进 行 优 化 设 计, 使 用 384 孔 微 量 滴 定 板 时, 通 过 单 模 块 堆 叠 即 可 实 现 6000 个 样 品 以 上 的 容 量 进 样 周 期 进 样 周 期 是 液 相 色 谱 分 析 中 容 易 被 忽 视 的 一 个 参 数 现 在, 借 助 新 型 UHPLC 仪 器 和 亚 2 µm 颗 粒 色 谱 柱 技 术, 运 行 时 间 可 缩 短 为 1 分 钟 以 下, 甚 至 仅 30 秒, 而 且 不 会 影 响 分 离 度 从 前 一 次 运 行 结 束 到 吸 取 样 品 并 最 终 进 样 开 始 下 一 次 运 行 所 需 的 时 间 已 接 近 甚 至 超 出 上 述 运 行 时 间 受 高 载 样 量 的 限 制 以 及 鉴 于 快 速 获 得 结 果 的 需 要, 我 们 必 须 将 非 生 产 性 的 额 外 时 间 降 至 最 低 新 型 自 动 进 样 器 设 计 在 前 一 次 运 行 过 程 中 即 开 始 下 一 次 进 样 操 作, 并 将 这 种 运 行 方 式 与 快 速 自 动 装 置 相 结 合, 能 够 很 好 地 满 足 上 述 要 求 这 样 可 最 大 程 度 减 少 运 行 的 额 外 时 间, 将 其 缩 短 至 10 秒 以 下 21

交 叉 污 染 近 年 来, 液 相 色 谱 的 检 测 限 已 经 大 幅 降 低 ( 尤 其 是 与 高 端 质 谱 检 测 相 结 合 时 ) 甚 至 浓 度 极 低 的 杂 质 也 可 轻 松 检 出 要 想 达 到 极 低 的 检 测 限, 必 须 使 用 纯 净 的 溶 剂 和 洁 净 的 仪 器 前 一 次 分 析 中 分 离 和 检 测 的 化 合 物 不 应 出 现 在 下 一 次 或 后 续 的 分 析 中, 否 则 会 影 响 样 品 序 列 的 结 果 和 定 量 分 析 自 动 进 样 器 必 须 精 心 设 计, 力 求 最 大 程 度 减 少 交 叉 污 染 在 自 动 进 样 器 中, 进 样 针 和 针 座 之 间 的 接 口 至 关 重 要 粘 着 力 强 的 化 合 物 容 易 吸 附 到 这 些 部 件 的 表 面, 而 除 去 这 些 痕 量 的 化 合 物 可 能 是 一 项 繁 琐 的 工 作 必 须 对 材 料 表 面 进 行 设 计, 消 除 它 们 与 非 极 性 分 析 物 之 间 的 相 互 作 用 连 接 部 件 时 应 非 常 小 心, 以 避 免 任 何 死 体 积 ( 即 使 非 常 小 ), 以 及 避 免 产 生 任 何 划 痕 或 磨 损, 防 止 其 造 成 机 械 影 响 使 用 强 溶 剂 进 行 进 样 针 清 洗 程 序 通 常 有 助 于 大 幅 减 少 交 叉 污 染 大 多 数 现 代 自 动 进 样 器 均 配 备 有 内 置 的 进 样 针 清 洗 站, 用 于 在 吸 入 样 品 并 将 其 转 移 到 进 样 口 之 前 对 进 样 针 的 外 表 面 进 行 清 洗 如 果 不 进 行 适 当 清 洗, 进 样 针 的 外 表 面 将 成 为 交 叉 污 染 的 主 要 来 源 利 用 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 消 除 交 叉 污 染 新 型 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 具 有 更 先 进 的 交 叉 污 染 消 除 功 能 该 系 列 的 自 动 进 样 器 可 配 置 多 重 清 洗 功 能, 该 功 能 不 仅 能 够 清 洁 进 样 针 的 外 表 面, 还 能 有 效 反 冲 针 座 ( 交 叉 污 染 的 第 二 大 主 要 来 源 ), 可 选 择 的 外 部 清 洗 溶 剂 多 达 三 种 利 用 多 重 清 洗 功 能, 洗 必 泰 的 交 叉 污 染 值 可 降 低 至 10 ppm 以 下, 这 使 得 Multisampler 成 为 了 高 端 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 的 理 想 之 选 清 洗 进 样 针 内 部 应 用 流 通 式 原 理 充 分 清 洗 进 样 针 内 部, 确 保 洗 脱 液 的 一 致 性 清 洗 进 样 针 外 部 可 设 置 进 样 针 外 的 清 洗 程 序, 提 供 多 达 3 种 外 部 清 洗 溶 剂 供 您 选 择 主 动 式 针 座 反 冲 可 选 择 3 种 外 部 溶 剂 反 冲 针 座 22

新 型 进 样 方 法 和 自 动 化 自 动 进 样 器 不 仅 能 够 用 作 简 单 的 进 样 装 置, 用 于 在 无 用 户 干 预 的 情 况 下 引 入 样 品, 它 们 还 具 有 处 理 和 制 备 样 品 或 者 执 行 并 行 任 务 以 节 省 时 间 等 多 种 功 能 另 外, 现 代 自 动 进 样 器 都 采 用 针 对 许 多 经 验 不 足 的 用 户 而 设 计 的 防 呆 界 面 组 合, 让 这 些 用 户 只 需 提 交 样 品 即 可 完 成 分 析, 它 们 同 时 也 是 智 能 的 样 品 组 织 器, 能 够 根 据 企 业 优 先 级 来 安 排 连 续 分 析 运 行 自 动 进 样 器 还 可 帮 助 您 对 独 立 操 作 进 行 编 程 利 用 该 功 能, 您 可 以 混 合 样 品 添 加 内 标 或 执 行 稀 释 步 骤 例 如, 在 氨 基 酸 分 析 中, 您 可 以 利 用 自 动 进 样 器 直 接 进 行 自 动 衍 生 化 Agilent 1200 Infinity 系 列 Multisampler 的 双 针 头 功 能 将 进 样 器 的 功 能 扩 展 到 简 单 进 样 功 能 之 外 的 另 一 个 例 子 是 1200 Infinity 系 列 Multisampler 全 新 的 双 针 头 功 能 两 个 进 样 针 样 品 环 组 件 能 够 以 多 种 不 同 方 式 使 用 在 两 个 经 过 校 准 且 具 有 类 似 容 量 的 进 样 针 之 间 切 换 还 有 助 于 进 一 步 提 高 通 量 第 二 个 进 样 针 在 前 一 次 运 行 还 在 进 行 的 过 程 中 即 可 开 始 进 样 针 清 洗 和 样 品 吸 入 操 作, 如 此 一 来, 前 一 次 运 行 完 成 之 后 即 可 立 即 进 样 或 者, 两 个 进 样 针 可 配 备 不 同 尺 寸 的 样 品 环, 从 而 交 替 地 执 行 小 体 积 进 样 ( 用 于 UHPLC 分 析 ) 和 大 体 积 进 样 ( 用 于 传 统 方 法 或 富 集 分 析 ), 而 不 会 由 于 延 迟 体 积 较 大 而 影 响 分 析 速 度 利 用 双 针 头 配 置, 用 户 还 能 在 特 定 工 作 流 程 中 为 特 定 样 品 或 标 样 保 留 一 个 进 样 针, 从 根 本 上 消 除 产 生 交 叉 污 染 的 可 能 性 柱 温 箱 产 生 热 量 的 肌 肉 柱 温 箱 是 液 相 色 谱 系 统 中 一 个 经 常 被 低 估 的 组 件, 但 事 实 上 该 模 块 对 于 确 保 分 离 柱 运 行 环 境 的 稳 定 性 和 获 得 可 重 现 的 结 果 而 言 至 关 重 要 当 实 验 室 的 室 温 在 一 天 之 中 会 发 生 变 化 或 者 需 要 将 方 法 从 一 个 场 所 转 移 至 另 一 个 场 所 时, 稳 定 的 环 境 尤 其 重 要 温 度 会 影 响 保 留 因 子 k, 还 会 影 响 样 品 的 分 离 度 温 度 还 是 方 法 开 发 过 程 要 使 用 的 参 数 之 一 柱 温 箱 可 以 是 简 单 的 柱 温 箱, 或 者 是 能 够 将 色 谱 柱 周 围 加 热 到 预 设 温 度 ( 通 常 高 达 80 C) 的 加 热 器 现 代 柱 温 箱 配 备 有 溶 剂 热 交 换 器, 还 可 将 溶 剂 加 热 到 预 设 温 度 进 行 方 法 开 发 时, 我 们 可 以 使 用 帕 尔 帖 型 柱 温 箱, 因 为 此 类 装 置 能 够 更 快 速 地 改 变 温 度, 而 温 度 是 开 发 色 谱 方 法 时 可 以 改 变 的 参 数 之 一 另 外, 帕 尔 帖 型 柱 温 箱 不 仅 能 够 加 热 溶 剂 和 色 谱 柱 环 境, 还 能 冷 却 色 谱 柱 或 维 持 定 义 的 室 温 左 右 的 稳 定 温 度 大 多 数 应 用 都 在 约 40 C 下 进 行 分 离 在 较 高 的 温 度 下, 保 留 时 间 将 缩 短, 可 实 现 更 快 速 的 洗 脱 在 较 低 的 温 度 下, 保 留 时 间 通 常 会 增 加, 在 反 相 分 离 中 尤 其 如 此 UHPLC 应 用 通 常 采 用 较 高 的 温 度, 目 的 是 降 低 溶 剂 粘 度 以 及 降 低 由 小 颗 粒 和 高 流 速 引 起 的 背 压 因 此, 用 于 UHPLC 的 柱 温 箱 通 常 需 加 热 至 高 达 100 C 或 更 高 的 温 度 23

柱 温 箱 是 一 个 需 要 用 户 频 繁 干 预 的 液 相 色 谱 模 块 用 户 需 要 不 同 的 选 择 性 或 需 要 达 到 更 出 色 的 分 离 度 时, 必 须 连 接 或 移 除 色 谱 柱 柱 温 箱 通 常 还 可 容 纳 多 根 色 谱 柱 和 / 或 阀, 以 支 持 自 动 化 的 方 法 开 发 色 谱 柱 切 换 富 集 或 交 替 色 谱 柱 再 生 等 功 能 为 确 保 柱 温 箱 便 于 用 户 操 作, 以 及 避 免 安 装 色 谱 柱 时 出 错 ( 如 产 生 死 体 积 或 导 致 泄 漏 ), 易 用 性 具 有 重 要 的 意 义 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 的 灵 活 性 和 易 用 性 Agilent 1290 Infinity II 高 容 量 柱 温 箱 让 用 户 在 几 秒 钟 内 即 可 轻 松 安 装 色 谱 柱 热 交 换 器 和 带 有 多 根 毛 细 管 的 阀 Agilent A-line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头 避 免 了 在 色 谱 柱 连 接 中 意 外 引 入 微 小 泄 漏 点 的 可 能 性 检 测 器 感 知 器 官 液 相 色 谱 系 统 中 可 整 合 各 种 类 型 的 检 测 器 最 常 用 的 检 测 器 类 型 是 光 吸 收 型 检 测 器 荧 光 检 测 器 示 差 折 光 检 测 器 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 本 章 将 重 点 介 绍 光 吸 收 型 检 测 器, 因 为 超 过 三 分 之 二 的 液 相 色 谱 系 统 都 采 用 此 类 检 测 器 不 同 类 型 的 检 测 器 在 灵 敏 度 选 择 性 和 线 性 范 围 方 面 各 有 差 异 灵 敏 度 定 义 了 检 测 器 可 检 出 的 最 低 化 合 物 浓 度 选 择 性 决 定 了 检 测 器 对 特 定 化 合 物 的 特 异 性 线 性 范 围 是 特 定 化 合 物 的 一 个 浓 度 范 围, 在 该 范 围 内 检 测 器 可 提 供 线 性 的 响 应 信 号 检 测 器 还 分 为 破 坏 性 检 测 器 和 无 损 检 测 器 紫 外 吸 收 检 测 器 荧 光 检 测 器 和 示 差 折 光 检 测 器 属 于 无 损 检 测 器 通 过 检 测 池 的 化 合 物 将 保 持 其 完 整 性, 并 且 可 以 进 行 回 收 相 反, 蒸 发 光 散 射 检 测 器 和 质 谱 检 测 器 则 属 于 破 坏 性 检 测 器, 因 为 化 合 物 在 检 测 过 程 中 将 被 破 坏 通 过 紫 外 吸 收 光 度 法 进 行 定 量 分 析 的 基 础 是 朗 伯 - 比 尔 定 律 吸 光 度 A 是 通 过 洗 脱 介 质 前 后 的 光 强 度 对 数 之 比, 它 与 吸 光 化 合 物 的 浓 度 C 光 程 d 和 摩 尔 吸 光 系 数 [ 的 乘 积 成 正 比 l0l=a=[cd 现 代 HPLC 和 UHPLC 中 应 用 最 广 泛 的 检 测 器 类 型 是 基 于 对 紫 外 线 (UV) 和 可 见 光 的 吸 收 此 类 检 测 器 对 许 多 化 合 物 具 有 较 高 的 灵 敏 度, 但 前 提 是 化 合 物 必 须 能 够 吸 收 190 nm 至 600 nm 范 围 内 的 紫 外 或 可 见 光 24

光 吸 收 型 检 测 器 可 采 用 两 种 光 学 技 术 第 一 种 是 采 用 直 接 光 学 元 件, 具 有 目 标 波 长 的 光 将 通 过 检 测 池, 然 后 由 单 个 光 电 二 极 管 捕 获 产 生 的 光 线 配 备 直 接 光 学 元 件 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 固 定 波 长 检 测 器, 见 图 10 第 二 种 是 采 用 反 向 光 学 元 件, 波 长 在 190 nm 至 600 nm 内 的 所 有 光 线 都 将 通 过 流 通 池 产 生 的 光 线 将 由 光 栅 分 离 为 其 组 成 波 长, 然 后 由 光 电 二 极 管 阵 列 采 集 所 得 的 光 谱 信 息 配 备 反 向 光 学 元 件 和 光 电 二 极 管 阵 列 的 光 吸 收 型 检 测 器 被 称 为 二 极 管 阵 列 检 测 器, 见 图 11 二 极 管 阵 列 检 测 器 不 仅 能 够 在 多 个 波 长 下 进 行 检 测, 还 能 生 成 UV 光 谱 用 于 明 确 鉴 定 特 定 的 化 合 物 氘 灯 滤 光 片 组 件 狭 缝 镜 1 光 栅 镜 2 样 品 二 极 管 流 通 池 分 束 器 参 考 二 极 管 检 测 器 (VWD) MCT 图 10. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 光 栅 狭 缝 二 极 管 阵 列 氘 灯 流 通 池 检 测 器 (DAD) MCT 图 11. 配 备 反 向 光 学 元 件 的 二 极 管 阵 列 检 测 器 的 检 测 原 理 25

检 测 器 灵 敏 度 检 测 限 (LOD) 是 指 信 号 能 够 与 检 测 器 噪 音 区 分 的 最 低 化 合 物 浓 度, 见 图 12 LOD 取 决 于 信 号 高 度 和 检 测 器 噪 音, 并 且 根 据 其 比 值 进 行 计 算 :H 信 号 = 3 h 噪 音 信 号 噪 音 图 12. 配 备 直 接 光 学 元 件 的 可 变 波 长 检 测 器 的 检 测 原 理 在 UV 检 测 中, 信 号 高 度 取 决 于 化 合 物 特 有 的 吸 光 系 数 光 程 峰 扩 散 和 检 测 波 长 检 测 器 噪 音 取 决 于 许 多 因 素, 例 如, 光 强 度 泵 脉 动 电 子 元 件 噪 音 数 据 采 集 速 率 RI 效 应 温 度 流 速 和 流 通 池 设 计 增 加 光 程 而 保 持 流 通 池 内 部 体 积 不 变, 同 时 尽 可 能 保 持 最 低 水 平 的 检 测 器 噪 音, 可 获 得 最 高 的 灵 敏 度 与 老 式 流 通 池 ( 检 测 池 的 流 路 通 常 采 用 锥 形 设 计 ) 相 比, 现 代 检 测 器 配 备 的 流 通 池 已 经 能 够 实 现 全 内 反 射 线 性 范 围 当 您 需 要 在 较 宽 的 浓 度 范 围 内 进 行 定 量 分 析 时, 检 测 器 的 线 性 范 围 非 常 重 要 当 目 标 化 合 物 具 有 显 著 不 同 的 浓 度 和 UV 响 应 时, 线 性 范 围 也 非 常 重 要 在 分 析 含 有 大 量 主 要 组 分 和 微 量 杂 质 的 样 品 时 可 能 会 遇 到 上 述 情 况 对 于 此 类 样 品, 我 们 必 须 同 时 采 集 所 有 化 合 物 的 定 量 信 息 目 前 的 液 相 色 谱 UV 检 测 器 具 有 4 到 5 个 数 量 级 的 线 性 范 围 使 用 可 在 单 次 分 析 中 定 量 分 析 低 浓 度 和 高 浓 度 化 合 物 的 检 测 方 案 可 显 著 扩 展 这 一 线 性 范 围 该 方 法 有 助 于 同 时 定 量 分 析 主 要 组 分 微 量 组 分 及 其 杂 质 ( 如 固 定 剂 量 复 方 药 ) 由 于 无 需 进 行 系 列 稀 释 和 多 次 运 行, 可 节 省 大 量 时 间 和 成 本 26

数据采集速率 数据采集速率是检测器每秒能够采集的数据点的数量 常规 UV 检测器的数据采集速率高达 20 Hz 足以用 于标准 HPLC 分析 但 UHPLC 分析要求更高的数据采集速率 因为它需要在快速运行中对窄峰进行精确的定 量分析 配备最大光强流通池的安捷伦二极管阵列检测器 安捷伦最大光强高灵敏度流通池采用了光流波导技术 尽管光程达 60 mm 但扩散体积仅为 4 µl 见图 13 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器采用了这种流通池 因此其灵敏度比之前的检测器高出 10 倍 见图 14 Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器的另一个功能是能够以 240 Hz 的速率采集数据 可确保在仅耗时几秒的快速运行中获得出 色的定量结果 安捷伦高动态范围检测解决方案显著扩展了线性检测范围 见图 15 通过结合分别具有短光程和长光 程的两个检测器 该解决方案通过单次分析即可同时定量分析低浓度和高浓度样品组分 灵敏度比之前的型号高 n 倍 图 13. 配备最大光强流通池的 1260/1290 Infinity DAD 中的光流波导 1050 系列 1100 系列 1200 系列 图 14. DAD 检测灵敏度的发展史 1260/1290 Infinity DAD 的问 世将灵敏度提高了 10 倍以上 灵敏度提高 30 倍 检测器噪音低 10 倍 线性水平的上限提高了 3 倍 信号 0倍 了3 宽 围拓 AD RD D 将H 性范 的线 之前的 DAD 浓度 图 15. 利用 1200 Infinity 系列 DAD-HDR 解决方案扩展线性范围 27

HPLC 柱 的 选 择 色 谱 柱 的 选 择 一 半 是 科 学, 一 半 是 艺 术 我 们 之 所 以 这 么 说, 是 因 为 这 里 有 一 些 确 定 的 明 了 标 准 : 与 应 用 相 适 合 的 色 谱 柱 固 定 相 与 系 统 压 力 限 相 适 应 的 规 格 等 等 在 多 数 情 况 下, 预 定 义 方 法 可 能 规 定 了 特 定 的 固 定 相 或 色 谱 柱 规 格, 所 以, 选 择 色 谱 柱 必 须 符 合 这 些 规 格, 确 保 来 自 可 靠 的 高 质 量 色 谱 柱 供 应 商 ( 我 们 推 荐 安 捷 伦, 您 也 可 以 选 择 别 的 品 牌 ) 此 外, 方 法 开 发 可 能 更 有 技 巧, 在 这 个 过 程 中 要 测 试 各 种 固 定 相 和 流 动 相 的 性 能, 以 获 得 符 合 您 应 用 需 求 的 选 择 性 本 节 首 先 要 回 顾 一 些 基 本 概 念 : HPLC 模 式 常 见 的 HPLC 柱 填 料 接 下 来, 我 们 再 来 专 门 讨 论 现 在 最 常 用 的 主 要 色 谱 柱 类 型 及 其 特 点 : HPLC 柱 UHPLC 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 LC/MS 柱 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 生 物 表 征 色 谱 柱 28

我 们 还 将 解 释 一 些 关 键 柱 参 数 的 重 要 性 : 填 料 硅 胶 键 合 相 聚 合 物 孔 径 粒 径 柱 规 格 在 本 节 的 最 后, 我 们 将 对 现 有 卡 套 式 色 谱 柱 进 行 概 要 介 绍, 包 括 保 护 柱 半 制 备 柱, 以 及 制 备 和 生 产 柱 本 节 资 料 应 与 包 含 更 多 色 谱 柱 固 定 相 和 选 择 性 信 息 的 方 法 开 发 一 节 ( 第 61 页 ) 中 色 谱 柱 选 择 部 分 结 合 使 用 HPLC 模 式 在 开 始 评 估 色 谱 柱 之 前, 最 重 要 的 工 作 是 要 确 定 HPLC 模 式 目 前 有 很 多 常 用 的 HPLC 模 式 或 技 术 : 反 相 HILIC 正 相 离 子 交 换 体 积 排 阻 调 查 显 示, 一 般 而 言 95% 的 色 谱 工 作 者 都 在 其 工 作 中 使 用 反 相 色 谱, 基 于 这 一 原 因, 本 手 册 将 把 这 项 技 术 作 为 重 点 除 此 之 外, 本 手 册 也 会 涉 及 其 它 的 技 术, 指 出 其 主 要 差 别, 并 介 绍 获 取 更 多 信 息 的 来 源 如 需 了 解 各 种 模 式 之 间 差 异 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 62 64 页 29

色 谱 柱 选 择 的 基 本 信 息 : 常 规 柱 液 相 色 谱 柱 采 用 不 锈 钢 或 聚 合 物 制 成, 也 有 极 为 罕 见 的 玻 璃 柱, 柱 中 填 充 键 合 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 有 多 种 尺 寸 规 格 可 供 选 择, 以 适 应 色 谱 工 作 者 及 其 使 用 的 不 同 需 求 从 用 于 高 通 量 LC/MS 的 短 柱 窄 径 柱, 到 50 mm 内 径 的 制 备 柱, 制 备 柱 填 充 内 径 最 大 可 达 600 mm, 适 用 于 小 规 模 制 备 放 大 和 生 产 色 谱 柱 规 格 影 响 着 灵 敏 度 和 柱 效, 决 定 着 柱 载 样 量 例 如, 小 内 径 色 谱 柱 与 大 内 径 柱 相 比, 提 高 了 灵 敏 度, 但 降 低 了 载 样 量 现 代 不 锈 钢 分 析 柱 (1 到 4.6 mm 内 径,20 到 250 mm 柱 长 ) 使 用 非 常 低 或 零 死 体 积 的 接 头 色 谱 柱 填 料 被 柱 两 端 的 不 锈 钢 筛 板 挡 住 来 自 HPLC 的 液 流 入 口 筛 板 HPLC 柱 ( 灰 色 ) 出 口 筛 板 液 流 流 出 至 检 测 器 硅 胶 填 料 图 16. 色 谱 柱 示 意 图 液 流 方 向 色 谱 柱 结 构 材 料 HPLC 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 不 锈 钢 分 析 柱 4.0-4.6 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 传 统 定 量 分 析 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 硅 胶 1.8-5 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 窄 径 柱 2.0-2.1 硅 胶 1.8-5 降 低 溶 剂 消 耗 分 析 型 微 径 柱 1 硅 胶, 聚 合 物 3-5 提 高 灵 敏 度, 可 分 析 ng 到 µg 的 样 品 分 析 型 毛 细 管 柱 0.3-0.5 硅 胶, 聚 合 物 3-5 可 分 析 pg 到 ng 的 样 品 分 析 型 纳 升 柱 0.075-0.1 硅 胶, 聚 合 物 3 可 分 析 < 1 pg 的 样 品 制 备 或 半 制 备 柱 9.4-50 硅 胶, 聚 合 物 5-50 样 品 纯 化 表 4. 液 相 色 谱 柱 的 一 些 性 能 指 标 转 下 页 30

色 谱 柱 结 构 材 料 色 谱 柱 类 型 色 谱 柱 内 径 (mm) 填 料 类 型 填 料 粒 径 (µm) 应 用 LC/MS UHPLC/MS 不 锈 钢 分 析 柱 3 硅 胶 1.8-5 与 安 捷 伦 MS 流 量 匹 配 的 良 好 选 择 分 析 型 窄 径 柱 和 微 径 柱 1-2.1 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 需 要 更 高 选 择 性 或 需 要 特 殊 检 测 器 时 石 英 分 析 型 毛 细 管 柱 0.3-0.5 硅 胶, 聚 合 物 1.8-10 使 用 MS 检 测 器 UHPLC 不 锈 钢 分 析 柱 4.6 Silica 1.8-2.7 分 析 型 溶 剂 节 省 柱 3 Silica 1.8-2.7 分 析 型 窄 径 柱 2.1 Silica 1.8-2.7 用 于 所 有 快 速 和 高 分 离 度 的 分 析 应 用 制 备 柱 不 锈 钢 制 备 柱 10-100 聚 合 物 10-50 化 合 物 分 离 生 产 柱 不 锈 钢 生 产 柱 10 cm 到 聚 合 物 10-50 化 合 物 生 产 100 cm 注 : 某 些 生 物 HPLC 柱 提 供 PEEK 管 线, 确 保 样 品 流 路 中 无 金 属 使 用 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 色 谱 柱 以 及 Poroshell 120 2.7 µm 色 谱 柱, 压 力 上 限 可 达 600 bar 使 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 离 度 (RRHD) 色 谱 柱,1.8 µm, 压 力 上 限 可 达 1300 bar 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 柱 硅 胶 是 正 相 HPLC 常 用 的 固 定 相, 也 是 许 多 化 学 键 合 固 定 相 的 支 持 剂 硅 胶 表 面 覆 盖 着 强 极 性 的 硅 醇 基, 在 非 极 性 流 动 相 中 与 样 品 分 子 发 生 相 互 作 用, 也 可 以 作 为 化 学 键 合 的 反 应 位 点 正 相 HPLC 适 用 于 在 水 中 不 溶 解 的 分 析 物 和 有 机 正 相 溶 剂, 与 反 相 HPLC 中 常 用 的 某 些 缓 冲 液 相 比, 对 质 谱 更 为 友 好 但 是, 这 种 技 术 有 时 保 留 时 间 的 重 现 性 较 差, 因 为 水 或 质 子 有 机 溶 剂 ( 含 有 氢 氧 键 或 氮 氢 键 ) 改 变 了 硅 胶 的 水 合 状 态 反 相 HPLC 中 就 不 会 发 生 这 种 问 题, 因 此 成 为 了 主 要 的 HPLC 技 术 在 反 相 色 谱 系 统 中, 硅 胶 颗 粒 被 化 学 改 性 为 非 极 性 或 疏 水 性, 流 动 相 采 用 极 性 液 体 31

UHPLC 柱 超 高 压 液 相 色 谱 (UHPLC) 一 般 指 在 超 过 400 bar (6000 psi) 压 力 ( 这 一 压 力 是 过 去 几 十 年 来 常 见 的 最 大 系 统 操 作 压 力 ) 下 操 作 的 液 相 色 谱 通 常,UHPLC 柱 装 填 小 粒 径 填 料 (< 3 µm), 与 常 规 HPLC 柱 填 充 的 3 到 5 µm 填 料 相 比, 在 速 度 分 离 度 和 柱 效 方 面 有 很 大 优 势 但 是, 从 压 力 方 程 ( 第 9 页 的 方 程 6) 可 以 看 出, 填 料 粒 径 越 小, 流 动 相 通 过 色 谱 柱 所 需 要 的 反 压 就 越 大, 因 此,UHPLC 柱 采 用 了 在 400 bar (6000 psi) 以 上 压 力 下 工 作 的 设 计 安 捷 伦 为 UHPLC 提 供 了 三 种 类 型 的 色 谱 柱 : 在 600 bar 以 内 操 作 的 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 (RRHT) 1.8 µm 粒 径 柱 填 充 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 的 Poroshell 120 柱 ( 也 可 以 在 600 bar 以 内 操 作 ) 和 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 1.8 µm 柱, 在 1300 bar 下 稳 定 UHPLC 可 以 得 到 非 常 快 的 分 离 速 度 一 般 情 况 下, 10 分 钟 之 内 完 成 的 UHPLC 分 离 为 快 速,1 分 钟 内 完 成 的 分 离 常 称 为 超 快 速 另 一 方 面, 使 用 1.8 µm 填 料 UHPLC 柱, 提 高 了 柱 效 和 峰 容 量 分 析 柱 最 长 150 mm, 内 径 最 大 4.6 mm 现 在 可 以 获 得 差 不 多 300% 的 峰 容 量, 这 对 于 改 善 从 新 药 发 现 到 食 品 安 全 和 环 境 应 用 ( 如 农 药 筛 查 ) 中 的 许 多 复 杂 分 离 非 常 有 用 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 率 (RRHD) 柱 表 面 多 孔 填 料 柱 近 来 表 面 多 孔 填 料 (SPP) 柱 在 小 粒 径 填 料 中 比 早 先 的 薄 壳 型 填 料 柱 更 受 青 睐 如 图 17 所 示,Agilent Poroshell 120 2.7 µm 填 料 包 括 一 个 实 心 核 ( 直 径 1.7 µm) 和 覆 盖 在 外 的 多 孔 硅 胶 层 ( 厚 0.5 µm) Poroshell 120 与 常 规 全 多 孔 柱 相 比, 能 够 为 色 谱 工 作 者 提 供 方 法 开 发 的 明 显 优 势 由 于 扩 散 仅 发 生 在 多 孔 外 壳, 而 实 心 核 没 有, 所 以 与 同 样 粒 径 的 全 多 孔 填 料 相 比, 柱 效 有 所 提 高 事 实 上,2.7 µm SPP 可 提 供 能 与 1.8 µm 全 多 孔 颗 粒 色 谱 柱 媲 美 的 柱 效, 而 4 µm SPP 的 柱 效 大 约 是 全 多 孔 5 µm 颗 粒 色 谱 柱 的 两 倍 由 于 压 力 间 接 地 与 粒 径 成 比 例, 因 此 粒 径 较 大 的 2.7 µm SPP 色 谱 柱 产 生 的 压 力 远 低 于 亚 2 µm 色 谱 柱, 让 色 谱 工 作 者 能 够 提 高 流 速 并 加 快 分 析 速 度, 同 时 获 得 出 色 的 分 离 度 Poroshell 120 柱 装 配 2 µm 筛 板, 这 一 点 非 常 重 要, 这 样 使 其 对 于 较 脏 的 样 品 具 有 更 高 的 忍 耐 性, 而 不 会 像 装 配 更 小 筛 板 的 色 谱 柱 那 样 容 易 堵 塞 样 品 过 滤 32

1.7 µm 实心核 0.5 µm 多孔壳 图 17. Poroshell 120 2.7 µm 填料 生物分子 例如蛋白质和肽 的分离具有一定的挑战性 因为它们扩散较慢 所以我们通常都必须保持较低 的流速以防止峰展宽 安捷伦提供多种基于表面多孔颗粒的色谱柱 Poroshell 300 5 µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 300Å 孔径 AdvanceBio RP-mAb 3.5 µm 颗粒 0.25 µm 多孔层 450Å 孔径 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 120Å 孔径 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱 2.7 µm 颗粒 0.5 µm 多孔层 100Å 孔径 该技术缩短了扩散距离 能够对 500 Da 至 1000 kda 的生物分子进行快速 HPLC 分离 LC/MS 柱 根据不同的样品类型 有许多种色谱柱适用于 LC/MS 对于简单的分析样品 使用短柱 高分离度 可以 缩短分析时间 实现高通量 LC/MS 如果需要更高分离度 则可使用较长的色谱柱 流速也是影响色谱柱选择的因素 LC/MS 系统一般操作流速范围为 1 µl/min 到 1 ml/min 因而 要进行高 灵敏度 快速分析 宜选择较小内径柱 如安捷伦的溶剂节省柱 3.0 mm 内径 窄径柱 2.1 mm 内径 和毛细管柱与纳流柱 见第 29 页 表 4 键合相的最好选择是高效并封端的 C18 键合相 在宽 ph 范围内稳定 与 LC/MS 使用的挥发性流 动相添加剂 包括甲酸和乙酸 兼容 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统是药物 ADME/DMPK 研究 生物标记物验证 临床研究 食品安全 法医学 毒理学以及环境分析的定量领 域的可靠选择 Agilent 6400 系列三重四极杆液质联用系统 33

凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 柱 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 柱 和 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 柱 以 分 子 大 小 为 基 础 的 分 离 通 常 采 用 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 进 行 这 种 色 谱 类 型 在 分 离 聚 合 物, 包 括 生 物 聚 合 物 时 使 用 通 常 用 来 表 征 聚 合 物 分 子 量 及 分 子 量 分 布 色 谱 柱 一 般 采 用 不 锈 钢, 填 充 凝 胶, 交 联 键 合 聚 合 物 或 孔 径 经 过 严 格 控 制 的 硅 胶 颗 粒 分 离 机 理 与 其 他 色 谱 类 型 不 同, 溶 质 颗 粒 与 固 定 相 间 不 应 有 化 学 相 互 作 用, 而 是 依 据 分 子 在 溶 液 中 的 大 小 而 进 行 的 我 们 用 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 描 述 有 机 聚 合 物 ( 如 塑 料 ) 在 有 机 溶 剂 中 的 分 离, 而 使 用 水 相 SEC 描 述 主 要 使 用 水 相 流 动 相 对 水 溶 性 有 机 聚 合 物 ( 如 聚 乙 烯 醇 ) 和 水 溶 性 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 核 酸 和 多 糖 ) 进 行 的 分 离 凝 胶 过 滤 色 谱 (GFC) 以 前 用 来 描 述 生 物 聚 合 物 ( 如 蛋 白 质 ) 在 低 压 下 的 分 离 GPC/SEC 仪 器 色 谱 柱 和 标 准 品 我 们 向 您 推 荐 GPC/SEC 的 综 合 指 南, 安 捷 伦 的 凝 胶 渗 透 色 谱 和 体 积 排 阻 色 谱 说 明 ( 出 版 号 5990-6969EN) 生 物 表 征 柱 生 物 色 谱 柱, 或 生 物 柱, 是 分 离 生 物 化 合 物 ( 如 蛋 白 质 和 多 肽 寡 核 苷 酸 和 多 聚 核 苷 酸, 以 及 其 它 生 物 分 子 和 复 合 物, 包 括 病 毒 颗 粒 ) 的 色 谱 柱 生 物 柱 在 设 计 上 大 大 减 少 或 消 除 了 样 品 与 填 料 之 间 的 不 可 逆 或 非 特 异 性 结 合, 并 保 留 了 其 生 物 功 能 ( 酶 活 性 ) 通 常, 在 生 物 柱 上 样 品 不 能 与 活 性 金 属 接 触 因 此 生 物 柱 可 以 用 聚 合 物 ( 如 PEEK) 石 英 和 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 或 外 镀 金 属 部 件 制 成, 以 使 色 谱 柱 具 有 生 物 兼 容 性 生 物 色 谱 柱 系 列 34

色 谱 柱 特 性 硅 胶 硅 胶 是 理 想 的 色 谱 填 料, 数 十 年 来 是 键 合 相 HPLC 柱 的 主 要 基 础 填 料 硅 胶 为 刚 性 颗 粒, 可 抵 抗 液 流 造 成 的 挤 压, 当 填 料 粒 径 在 5 µm 或 更 低 时, 需 要 加 更 高 压 力 的 情 况 下 显 得 尤 为 重 要 其 极 大 的 比 表 面 积 能 够 满 足 HPLC 和 UHPLC 所 需 的 吸 附 容 量, 填 料 表 面 的 硅 醇 基 或 Si-OH 基 团 是 功 能 性 碳 链 的 理 想 键 合 位 点 毫 不 奇 怪, 用 作 柱 填 料 的 硅 胶 颗 粒 有 各 种 粒 径 纯 度 和 酸 性 最 现 代 的 填 料 是 B 型 硅 胶, 痕 量 金 属 含 量 极 低, 比 以 前 的 A 型 硅 胶 酸 性 更 低 低 酸 性 硅 胶 意 味 着 碱 性 分 析 物 与 硅 胶 表 面 硅 醇 基 的 相 互 作 用 更 小, 有 助 于 改 善 峰 形 用 高 纯 度 硅 胶 制 成 的 色 谱 柱, 是 目 前 色 谱 工 作 者 最 常 选 择 的 柱 子 键 合 相 反 相 色 谱 最 常 用 的 键 合 相 是 C18( 十 八 烷 基 硅 烷 化,ODS) 这 只 是 硅 胶 颗 粒 表 面 众 多 连 接 烷 烃 或 碳 链 类 型 的 一 种 其 它 常 用 的 线 性 烷 烃 硅 烷 化 固 定 相 选 择 还 有 C8 和 C4 苯 基, 包 括 苯 基 己 基 与 联 苯 和 AQ CN 以 及 PFP 固 定 相, 能 够 提 供 与 直 链 烷 烃 固 定 相 明 显 不 同 的 选 择 性, 以 实 现 成 功 分 离 还 有 不 断 增 加 的 针 对 某 些 高 水 相 流 动 相 或 其 它 应 用 的 键 合 相 选 择 一 般 来 说, 较 大 的 溶 质, 如 蛋 白 质, 最 好 用 键 合 到 大 孔 硅 胶 ( 孔 径 :300Å) 的 短 链 反 相 柱 (C3 CN 二 醇 ) 分 离 多 肽 和 小 分 子 用 长 链 柱 (C8 C18) 分 离 但 在 许 多 情 况 下, 这 种 规 律 并 不 适 用 因 此, 最 好 在 开 始 时 选 择 处 于 疏 水 谱 中 间 位 置 的 固 定 相 ( 如 C8), 然 后 根 据 初 步 分 离 结 果 和 样 品 的 溶 解 性, 再 采 用 疏 水 性 更 强 或 亲 水 性 更 强 固 定 相 还 可 以 考 虑 其 它 选 择, 如 离 子 交 换 凝 胶 过 滤 / 体 积 排 阻 或 HILIC 色 谱 我 们 将 在 后 面 第 92 97 页 讨 论 这 些 内 容 聚 合 物 当 需 要 在 非 常 低 和 高 的 ph 下 使 用 色 谱 柱 时, 除 了 硅 胶 基 质 填 料 还 可 以 选 择 聚 合 物 填 料 聚 合 物 填 料 是 小 规 模 色 谱 分 析 的 理 想 选 择, 特 别 是 LC/MS, 因 为 其 化 学 性 质 稳 定, 不 会 出 现 可 溶 性 物 质 或 发 生 沉 淀 例 如, RLRP-S 柱 中 所 用 的 反 相 球 形 聚 合 物 填 料, 是 以 带 天 然 疏 水 性 表 面 的 聚 苯 乙 烯 / 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 为 基 质 的 用 聚 合 物 颗 粒 作 为 反 相 色 谱 填 料 不 需 要 键 合 相 对 这 种 刚 性 的 多 孔 颗 粒 可 以 进 行 涂 层 和 衍 生 化, 加 上 各 种 功 能 基, 包 括 弱 和 强 阳 离 子 和 阴 离 子 交 换 剂 35

孔 径 孔 径 的 选 择 取 决 于 待 分 析 组 分 的 分 子 量 对 于 小 分 子 的 反 相 分 离, 选 择 小 孔 径 (60-120Å) 填 料 柱 对 于 小 分 子 和 多 肽, 使 用 80-150Å, 对 于 聚 合 多 肽 和 多 数 蛋 白 质 选 择 200-450Å 和 1000Å, 对 于 分 子 量 很 高 的 蛋 白 和 疫 苗 选 择 4000Å 对 于 GPC/SEC 分 离, 分 离 的 分 子 量 范 围 一 般 会 和 孔 径 信 息 一 起 给 出, 以 便 选 择 合 适 的 色 谱 柱 这 些 信 息 与 色 谱 柱 选 择 一 起 列 于 表 中 粒 径 HPLC 柱 在 很 长 的 一 段 时 期 内 都 采 用 5 µm 作 为 标 准 粒 径, 直 到 二 十 世 纪 九 十 年 代 中 期 3.5 µm 粒 径 柱 才 在 方 法 开 发 中 得 以 广 泛 使 用 近 来, 随 着 对 更 快 速 度 和 / 或 更 高 分 离 度 需 求 的 增 加, 色 谱 工 作 者 开 始 使 用 填 充 亚 2-3 µm 粒 径 填 料, 包 括 安 捷 伦 生 产 的 1.8 µm 填 料 使 用 这 些 填 料 可 在 更 短 的 色 谱 柱 上 获 得 更 快 的 高 分 离 度 分 离 3.5 µm 粒 径 柱 是 在 常 规 操 作 压 力 下 操 作 的, 可 以 在 所 有 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 包 括 400 bar 操 作 压 力 上 限 的 仪 器 1.8 µm 短 柱 (50 mm 及 更 短 ) 可 以 在 优 化 的 标 准 液 相 色 谱 仪 上 使 用, 而 长 柱 则 需 要 更 高 压 力 的 液 相 色 谱 仪 ( 如, 快 速 分 离 液 相 色 谱 或 UHPLCs), 在 600 到 1300 bar 压 力 范 围 下 操 作 近 来, 我 们 开 发 了 更 新 的 技 术 ( 如 表 面 多 孔 填 料 ), 性 能 类 似 于 亚 2 µm 柱, 但 产 生 的 反 压 较 低, 从 而 使 其 能 够 在 常 规 HPLC 上 使 用 ( 表 面 多 孔 填 料, 见 第 31 页 ) 如 果 色 谱 柱 的 填 料 粒 径 减 小 一 半, 塔 板 数 将 增 加 一 倍 ( 假 设 柱 长 保 持 不 变 ) 但 如 果 粒 径 减 半, 柱 反 压 则 将 增 大 4 倍 (~1/d 2 p ) 如 果 柱 长 加 倍, 塔 板 数 和 分 析 时 间 也 会 加 倍 随 着 柱 长 增 加, 反 压 将 呈 线 性 增 加 例 如, 一 根 填 充 3.5 µm 填 料 的 2.1 x 100 mm 柱, 理 论 塔 板 数 大 约 为 12000-14000, 这 一 柱 效 足 以 使 许 多 样 品 得 到 分 离 如 果 将 粒 径 从 3.5 µm 减 小 到 1.8 µm, 同 样 是 2.1 x 100 mm 柱, 其 柱 效 将 增 加 一 倍, 约 为 24000 理 论 塔 板 数 但 是, 该 色 谱 柱 产 生 的 反 压 将 比 填 充 3.5 µm 填 料 的 柱 子 大 4 倍 我 们 通 常 并 不 需 要 24000 塔 板 数 的 色 谱 柱, 所 以, 可 以 把 柱 长 减 半 到 50 mm, 得 到 期 望 的 12000 塔 板 数 柱 效 用 这 种 较 短 的 色 谱 柱, 分 析 时 间 将 缩 短 一 半, 反 压 也 仅 为 3.5 µm 填 料 粒 径 100 mm 色 谱 柱 的 两 倍 36

色 谱 柱 规 格 多 年 来, 用 于 分 析 方 法 开 发 推 荐 最 多 的 色 谱 柱 规 格 都 是 5 µm 填 料 粒 径 的 4.6 x 150 mm 或 4.6 x 100 mm 色 谱 柱 如 果 需 要 更 高 的 分 离 度, 则 推 荐 使 用 4.6 x 250 mm 色 谱 柱 但 现 在 随 着 色 谱 柱 选 择 范 围 的 扩 大, 我 们 推 荐 使 用 3.5 µm 4.6 x 100 mm 色 谱 柱, 或 2.7 µm 表 面 多 孔 填 料 色 谱 柱 作 为 分 析 方 法 开 发 的 起 点 在 方 法 开 发 过 程 中, 色 谱 柱 内 径 ( 如 2.1 或 3.0 mm) 的 选 择 也 要 适 应 应 用 目 标 ( 如 灵 敏 度 溶 剂 消 耗 ) 或 与 某 些 仪 器 类 型 相 兼 容 ( 毛 细 管 纳 流 或 制 备 柱 ) 当 需 要 提 高 灵 敏 度 或 样 品 量 极 为 有 限 时, 使 用 纳 流 柱 毛 细 管 柱 或 微 径 柱 样 品 量 低 于 1 pg 时, 使 用 纳 流 柱, 流 速 为 nl/min 样 品 量 在 pg 到 ng 范 围 内 时, 使 用 毛 细 管 柱, 流 速 为 4 µl/min 左 右 样 品 量 为 ng 到 µg 时, 使 用 微 径 柱, 流 速 一 般 为 40 µl/min 左 右 应 用 目 标 柱 内 径 (mm) 极 高 灵 敏 度 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.1, 0.075 极 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 多 肽 和 蛋 白 质 0.3, 0.5 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 LC/MS 1.0 节 省 溶 剂 ; 特 殊 的 低 体 积 仪 器 2.1 特 殊 检 测 器, 如 MS 2.1 高 灵 敏 度 样 品 量 有 限 2.1 节 省 溶 剂 ; 标 准 HPLC 仪 器 LC/MS 3.0 标 准 分 离 4.6 小 规 模 (mg) 制 备 性 分 离 9.4 中 等 规 模 制 备 分 离 (100 mg 到 g) 或 半 制 备 21.2 大 规 模 实 验 室 制 备 性 分 离 ( 最 多 100 g) 30, 50 中 试 和 生 产 100 mm 到 1 m 表 5. 应 用 与 柱 内 径 在 需 要 建 立 常 规 方 法 时, 应 考 虑 将 柱 尺 寸 降 至 分 析 方 法 和 仪 器 可 容 许 的 最 小 规 格 ; 较 小 的 色 谱 柱 通 常 价 格 比 较 便 宜, 溶 剂 消 耗 也 较 少 在 某 些 例 子 中, 如 果 柱 尺 寸 减 小 一 半, 灵 敏 度 将 提 高 4 到 5 倍 ( 假 设 进 样 质 量 保 持 不 变 ) 例 如, 在 优 化 的 液 相 色 谱 上, 使 用 2.1 mm 内 径 柱 进 样 时, 色 谱 峰 的 峰 高 将 比 使 用 4.6 mm 内 径 柱 及 同 样 进 样 量 时 提 高 3 到 5 倍 如 果 仪 器 针 对 低 体 积 柱 进 行 了 优 化, 只 要 保 持 流 量 线 速 度 不 变, 减 少 色 谱 柱 直 径 不 会 对 柱 效 理 论 塔 板 数 反 压 带 来 明 显 影 响 37

用 不 同 的 方 法 开 发 柱 数 据, 可 以 很 容 易 计 算 出 较 短 色 谱 柱 是 否 能 得 到 与 长 柱 同 样 的 结 果 通 过 简 单 计 算 得 出 的 结 论 将 为 您 节 省 大 量 时 间 可 以 使 用 安 捷 伦 的 方 法 转 换 软 件 ( 登 录 www.chem.agilent.com, 搜 索 LC 方 法 转 换 软 件 ) 帮 助 您 完 成 计 算 卡 套 柱 系 统 卡 套 柱 芯 是 安 装 在 已 有 的 柱 硬 件 上, 所 以 卡 套 系 统 具 有 经 济 灵 活 的 特 点 分 析 系 统 的 卡 套 式 柱 芯 是 预 填 充 的, 而 制 备 和 半 制 备 应 用 则 可 以 用 购 买 的 散 装 填 料 填 充 柱 芯 类 型 特 点 优 点 分 析 柱 和 分 析 / 保 护 柱 组 合 安 捷 伦 HPLC 卡 套 式 柱 芯 可 倒 装 柱 端 接 头, 添 加 保 护 柱 经 济 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 使 用 2, 3, 4 和 4.6 mm 柱 芯 ChromSep: 包 含 柱 套 分 析 柱 芯 和 保 护 柱 的 独 立 系 统 ZORBAX 快 速 分 离 和 快 速 分 离 高 通 量 卡 套 柱 : 1.8 和 3.5 µm 填 料 的 独 立 系 统 保 护 柱 ZORBAX 卡 套 型 保 护 柱 : 独 立 式 卡 套 柱 芯 的 两 端 都 有 独 特 的 滤 垫 和 筛 板 有 各 种 柱 长 和 内 径 组 合 有 各 种 填 料 的 柱 芯 和 保 护 柱 无 需 特 殊 工 具 适 用 于 高 通 量 LC/MS LC/MS/MS 和 组 合 分 离 填 充 Eclipse XDB,pH 范 围 2-9 填 充 StableBond, 低 ph 条 件 下 使 用 单 支 销 售 或 三 支 套 装 高 效 独 立 低 死 体 积 柱 芯 设 计 独 特 的 高 聚 物 柱 芯, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 接 头 可 重 复 使 用 有 助 于 防 止 阻 塞 模 块 式 灵 活 性 经 济 使 用 方 便 适 用 于 各 种 分 析 类 型 适 用 于 各 种 分 析 类 型 低 流 失 适 用 于 各 种 分 析 类 型 密 封 耐 压 高 达 340 bar 无 需 垫 圈 适 合 与 1/16 英 寸 LC 接 头 连 接 表 6. 卡 套 系 统 转 下 页 38

柱 芯 类 型 特 点 优 点 半 制 备 保 护 柱 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱 的 卡 套 : 独 立 式 ZORBAX 和 Agilent Prep 卡 套 型 制 备 柱 与 保 护 柱 : 独 立 式 和 内 置 式 选 件 制 备 轴 向 压 缩 制 备 柱 和 装 柱 机 : 能 提 供 动 态 轴 向 压 缩 和 静 态 锁 定 轴 向 压 缩 的 独 立 系 统 简 单 低 死 体 积 组 件 设 计 独 特 的 聚 苯 基 砜 管 线, 在 与 金 属 表 面 连 接 时 无 渗 漏 可 重 复 使 用 的 接 头 简 单 低 死 体 积 组 件 可 重 复 使 用 的 接 头 用 于 内 部 和 外 部 保 护 柱 的 硬 件 选 件 适 用 于 实 验 室 级 和 生 产 级 纯 化, 有 三 种 高 质 量 和 高 容 量 的 柱 规 格 可 供 选 择, 内 径 最 高 可 达 24 英 寸 移 动 式 装 柱 机 使 用 压 缩 空 气 几 分 钟 内 快 速 安 装 和 卸 载 密 封 耐 压 高 达 2000 psi (135 bar, 13.5 MPa) 无 需 垫 圈 适 合 连 接 至 1/16 英 寸 LC 接 头 延 长 了 柱 寿 命 可 快 速 更 换 色 谱 柱 可 与 21.2 和 30 mm 内 径 柱 配 合 使 用 很 方 便 地 从 克 级 放 大 到 几 公 斤 级 可 在 各 处 使 用 在 危 险 环 境 下 安 全 使 用 效 率 最 高 Dynamax 制 备 卡 套 柱 和 保 护 柱 : 独 立 的 动 态 轴 向 压 缩 系 统 模 块 式 设 计, 接 头 可 重 复 使 用 降 低 了 硬 件 成 本 10, 21.4 和 41.4 mm 内 径 便 于 放 大 一 体 式 保 护 柱 选 件 延 长 了 复 杂 样 品 制 备 的 柱 寿 命 生 产 聚 合 物 型 PLRP-S, PL-SAX 和 PL-SCX 各 种 孔 径 和 粒 径, 得 到 高 样 品 通 量 良 好 的 化 学 和 热 稳 定 性 可 实 现 适 当 净 化 适 合 生 产 过 程 硬 件 的 稳 定 填 充 方 法 提 高 效 率 延 长 柱 寿 命 提 高 填 充 柱 性 能 39

保护柱卡套 内径 (mm) 固定相 卡套柱卡套 保护柱芯 一体化系统 2.0 Asahipak 5021-1845 卡套 3.0 LiChrospher 5021-1845 4.0 Nucleosil 4.6 Purospher 柱型 柱芯/保护柱芯系统兼容性指南* Superspher ZORBAX 标准接头 快速分离柱卡套 保护柱 独立 2.1 ZORBAX 卡套 3.0 820888-901 4.6 无保护柱卡套 4.6 ZORBAX 半制备保护柱 独立 卡套 9.4 ZORBAX 21.2 ZORBAX 820555-901 半制备柱 840140-901 PrepHT 无图片 保护柱芯 820444-901 Agilent Prep * 独立保护柱芯可用于安捷伦提供的所有卡套柱和标准接头色谱柱 表 7. 卡套柱/保护柱卡套系统兼容性指南 40

性 能 的 关 键 : 色 谱 柱 的 配 置 和 设 置 在 许 多 关 于 色 谱 的 论 著 中 论 述 的 性 能 的 关 键 比 我 们 这 里 所 涉 及 的 要 多 得 多 我 们 的 目 的 是 强 调 常 被 忽 视 或 容 易 造 成 混 淆 的 几 个 方 面 让 我 们 从 系 统 和 机 理 问 题 开 始 : 减 少 柱 外 体 积 进 行 良 好 的 连 接 进 样 理 解 并 测 量 系 统 延 迟 体 积 为 获 得 高 效 柱 设 置 数 据 采 集 速 率 接 下 来, 我 们 再 把 话 题 转 向 色 谱 分 析 和 方 法 开 发 过 程 中 需 要 做 的 其 他 一 些 工 作 : 了 解 螯 合 化 合 物 ph 的 影 响 使 用 梯 度 洗 脱 优 化 色 谱 柱 的 再 平 衡 在 本 节 的 最 后, 我 们 还 将 了 解 一 下 在 应 用 过 程 中 您 可 能 需 要 做 的 几 项 工 作 : 色 谱 柱 老 化 色 谱 柱 清 洗 反 相 ( 硅 胶 基 质 与 聚 合 物 固 定 相 ) 和 正 相 41

减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 柱 外 体 积 是 指 额 外 或 外 部 ( 相 对 于 色 谱 柱 ) 体 积, 是 系 统 的 一 部 分, 尤 其 是 各 LC 部 件 色 谱 柱 之 间 的 连 接 管 线 体 积 进 样 体 积 和 流 通 池 体 积 色 谱 柱 越 大, 柱 体 积 (V m ) 就 越 大, 减 少 柱 外 体 积 的 重 要 性 就 越 显 得 没 那 么 高 但 是, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 的 高 效 柱, 如 Poroshell 120 和 亚 -2 µm 粒 径 柱, 您 就 要 尽 可 能 地 减 少 柱 外 体 积, 以 免 其 影 响 您 的 色 谱 结 果 不 必 要 的 柱 外 体 积 可 能 导 致 柱 效 损 失, 有 时 还 会 造 成 拖 尾 下 面 的 例 子 就 显 示 了 柱 外 体 积 的 影 响 ( 图 18) 只 有 10 µl 柱 外 体 积 时, 用 4.6 x 30 mm 小 柱 得 到 了 良 好 分 离 使 用 同 样 的 柱 子, 加 上 一 段 管 线, 形 成 50 µl 的 柱 外 体 积, 对 两 张 色 谱 图 的 前 三 个 峰 进 行 比 较 可 以 看 出, 色 谱 峰 变 宽 分 离 度 降 低 在 向 系 统 中 添 加 体 积 不 明 的 管 线 时, 这 种 情 况 经 常 发 生 添 加 一 段 太 长 的 管 线, 或 内 径 较 大 的 短 管 时, 会 使 高 柱 效 色 谱 柱 的 分 离 变 差 所 以, 了 解 您 所 使 用 管 线 的 内 径 和 增 加 了 多 少 体 积 非 常 重 要 另 外, 如 果 您 使 用 的 是 较 小 体 积 的 色 谱 柱, 需 要 使 用 微 量 或 半 微 量 流 通 池 标 准 流 通 池 会 增 大 柱 外 体 积 原 则 上, 系 统 的 最 大 柱 外 体 积 ( 管 线 体 积 进 样 体 积 和 检 测 器 体 积 ) 不 应 超 过 柱 体 积 的 10% 10 µl 柱 外 体 积 50 µl 柱 外 体 积 峰 归 属 1. 苯 丙 氨 酸 2. 5- 苯 基 -3,6- 二 氧 -2- 哌 嗪 醋 酸 3. 天 冬 氨 酰 - 苯 丙 氨 酸 4. 阿 斯 巴 甜 分 析 条 件 色 谱 柱 : StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 µm 流 动 相 : 含 0.1%TFA 的 H 2 O: 乙 腈 = 85:15 流 速 : 1.0 ml/min 温 度 : 35 C 图 18. 管 线 体 积 对 色 谱 性 能 的 影 响 安 捷 伦 销 售 的 毛 细 管 套 装, 包 含 各 种 规 格 的 毛 细 管 管 线 和 Swagelok 接 头, 您 可 以 根 据 最 小 的 合 适 长 度 配 备 连 接 和 管 线 体 积 管 线 带 有 彩 色 标 记, 以 区 分 管 线 内 径 在 您 改 用 高 效 色 谱 柱 时, 要 用 窄 内 径 红 色 管 线 (0.12 mm 内 径 ) 进 行 连 接, 而 不 能 用 常 规 HPLC 仪 器 上 常 用 的 0.17 mm 内 径 绿 色 管 线 42

实 现 完 美 的 接 头 连 接 使 用 HPLC 和 UHPLC 的 色 谱 工 作 者 常 常 面 临 峰 拖 尾 峰 展 宽 峰 分 叉 以 及 交 叉 污 染 等 问 题 的 挑 战 引 起 这 些 问 题 的 一 个 常 见 原 因 是 管 线 连 接 不 当, 这 一 原 因 通 常 容 易 被 忽 视, 因 此 在 故 障 排 除 方 面 需 要 花 费 大 量 时 间 管 线 连 接 中 的 死 体 积 或 微 漏 可 能 严 重 影 响 色 谱 分 析 的 性 能 和 重 现 性, 采 用 现 代 UHPLC 和 快 速 液 相 色 谱 柱 时 尤 其 如 此 接 头 连 接 要 求 接 头 连 接 对 分 析 物 的 峰 形 具 有 重 要 影 响 理 想 的 接 头 连 接 应 具 备 以 下 特 性 : 管 线 与 接 口 之 间 无 死 体 积 在 超 高 压 和 高 温 下 始 终 避 免 泄 漏 优 异 的 长 期 使 用 稳 定 性, 防 止 管 线 滑 动 简 便 易 用 不 可 调 金 属 接 头 UHPLC 中 最 常 用 的 接 头 为 2 件 式 或 3 件 式 不 可 调 金 属 接 头, 其 组 装 后 即 处 于 不 可 调 的 固 定 状 态 [3] 由 于 不 同 的 色 谱 柱 硬 件 制 造 商 采 用 不 同 的 色 谱 柱 末 端 接 头 设 计 ( 图 19), 因 此 每 个 品 牌 的 色 谱 柱 都 需 要 各 自 装 配 一 组 管 线 和 接 头 这 样 可 确 保 杆 长 (stem length, 即 密 封 垫 圈 底 部 与 管 线 末 端 之 间 的 距 离 ) 实 现 完 全 匹 配 ( 图 20) 43

Waters DŽ ݥ AcquityDž 图 19. HPLC 中使用的色谱柱接头 如果杆长过短 将产生死体积 从而导致峰形变差 分离度下降以及交叉污染 图 20 如果杆长过长 则密封垫圈不能正确就位并容易发生泄漏 图 20 此外 使用扳手时传统接头和密封垫圈通常被拧得过 紧 导致接头永久性卡死在色谱柱中 A 杆长过长 泄漏 B 杆长过短 死体积 C 正确安装的管线 无死体积 图 20. 接头连接正确与错误方式对比 44

可 调 手 紧 式 接 头 为 解 决 传 统 接 头 的 问 题, 我 们 开 发 出 了 可 与 不 同 色 谱 柱 兼 容 的 可 调 手 紧 式 接 头 这 些 接 头 通 常 配 备 聚 合 物 ( 如 PEEK) 密 封 垫 圈, 而 密 封 垫 圈 不 会 永 久 性 连 接 至 管 线, 因 此 接 头 可 以 重 复 使 用 然 而, 许 多 此 类 接 头 仍 有 诸 多 弊 端, 例 如 : 不 借 助 工 具 无 法 获 得 1300 bar 的 超 高 压 需 要 遵 循 严 格 的 精 确 扭 矩 或 转 向 角 范 围 操 作 指 南 以 免 拧 得 过 紧 每 次 重 新 连 接 后 都 需 要 检 查 是 否 存 在 泄 漏 经 常 需 要 重 新 拧 紧 接 头 如 果 聚 合 物 密 封 垫 圈 未 能 充 分 夹 紧 管 线, 后 者 可 能 在 超 高 压 或 压 力 循 环 中 从 接 头 处 滑 落, 产 生 死 体 积 Agilent A-Line 接 头 Agilent A-Line UHPLC 接 头 克 服 了 这 些 缺 陷, 实 现 了 可 重 现 的 无 泄 漏 色 谱 柱 连 接 A-Line 接 头 包 括 两 种 类 型 A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 ( 图 21A) 适 用 于 色 谱 柱 连 接, 能 够 在 1300 bar 下 实 现 密 封 连 接, 且 无 需 使 用 扳 手 A-Line Quick Turn 接 头 ( 图 21B) 适 用 于 各 种 流 路 连 接, 包 括 色 谱 柱 入 口 / 出 口 阀 及 其 他 连 接 这 种 接 头 通 过 手 拧 即 可 在 高 达 600 bar 的 压 力 下 保 持 密 封 ( 取 决 于 用 户 和 连 接 位 置 ), 采 用 扳 手 则 可 达 到 1300 bar 图 21. Agilent A-Line 接 头 A. Quick Connect 快 速 连 接 接 头,B. Quick Turn 接 头 45

两类接头均采用创新的内置弹簧式设计 图 22 确保始终将管线推入接口底部 可实现可重现的零死体积连 接 从而获得一致的色谱性能 通过弹簧即可调节杆长 因此这两类接头均可兼容所有类型的液相色谱柱 此 外 A-Line Quick Connect 快速连接接头采用独特的压杆驱动设计 使弹簧组件 包括压杆 施加恒定压力将密 封垫圈压到管线上 以避免管线滑动 无需使用任何工具 只需施加很小的力即可拧紧接头以用于 1300 bar (18850 psi) 压力之下 用户只需用手拧紧螺帽直至感觉到阻力 然后按下压杆即可 图 23 图 22. Agilent A-Line 接头独特的内置弹簧式设计 用手拧紧蓝色螺帽直至感觉到阻力 按下压杆 紧实压力高达 1300 bar 图 23. Agilent A-Line Quick Connect 快速连接接头的安装 46

200 次 重 复 连 接 后 的 稳 定 性 为 评 估 Agilent A-Line Quick Connect 快 速 连 接 接 头 的 重 复 使 用 性 和 稳 定 性, 我 们 将 该 接 头 断 开 并 重 新 连 接 了 200 次 该 接 头 连 接 在 经 过 200 次 重 新 连 接 后 仍 未 产 生 死 体 积 和 泄 漏 与 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性 不 同 色 谱 柱 制 造 商 的 接 头 连 接 设 计 各 不 相 同, 接 头 的 杆 长 不 当 将 导 致 泄 漏 或 峰 形 不 佳 为 评 估 Agilent A-Line 接 头 对 不 同 品 牌 色 谱 柱 的 兼 容 性, 如 需 了 解 更 多 有 关 在 实 际 操 作 中 如 何 进 行 连 接 的 技 巧, 请 查 看 液 相 色 谱 故 障 排 除 系 列 以 获 取 详 细 信 息 :www.agilent.com/chem/lctroubleshooting, 您 还 可 查 看 峰 展 宽 视 频 有 关 Agilent A-Line 的 更 多 信 息, 请 访 问 :www.agilent.com/chem/a-line 进 样 量 进 样 量 对 于 分 析 结 果 而 言 非 常 重 要 如 果 进 样 量 过 大, 色 谱 柱 可 能 会 过 载, 从 而 导 致 峰 展 宽, 常 见 的 结 果 是 伸 舌 峰, 在 某 些 情 况 下 也 可 能 引 起 峰 拖 尾 图 24 展 示 了 采 用 1 µl 2 µl 5 µl 和 10 µl 进 样 量 得 到 的 分 析 结 果, 我 们 可 以 看 到 色 谱 峰 随 着 进 样 量 的 增 加 而 变 宽 5σ 2 50 µl 10 µl 40 µl 1 µl 1 µl 2 µl 5 µl 10 µl 条 件 色 谱 柱 : 流 速 : 柱 温 : 流 动 相 : 检 测 器 : 稀 释 剂 : ZORBAX SB-C18, 3.0 50 mm, 1.8 µm 1 ml/min 45 C 30-65% 乙 腈 2.5 分 钟 处 250 nm UV 甲 醇 样 品 : 对 羟 基 苯 甲 酸 甲 酯 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 和 对 羟 基 苯 甲 酸 丁 酯 图 24. 载 样 量 比 较 确 定 进 样 量 之 后, 还 需 确 保 进 样 溶 剂 与 流 动 相 足 够 相 近, 以 减 少 谱 带 展 宽 或 分 叉 47

进 样 溶 剂 和 体 积 都 对 峰 形 有 影 响 在 这 个 例 子 ( 图 25) 中, 甲 醇 溶 剂 中 苯 甲 酸 酯 样 品 进 样 5 µl, 显 示 已 开 始 出 现 峰 带 变 宽 的 现 象 了 反 相 柱 规 格 为 3 x 50 mm, 仪 器 采 用 低 扩 散 配 置 进 样 10 µl, 峰 形 已 经 明 显 不 对 称 了 在 反 相 LC 中, 如 使 用 100% 有 机 溶 剂 或 100% 强 溶 剂 ( 本 例 中 为 甲 醇 ), 大 体 积 进 样 时, 将 使 色 谱 峰 过 早 洗 脱 出 色 谱 柱, 导 致 峰 变 形 如 需 解 决 这 个 问 题 可 以 对 分 析 物 进 行 蒸 发 浓 缩, 从 而 减 少 进 样 体 积 或 者 进 样 溶 剂 改 为 用 水 稀 释, 与 流 动 相 更 为 兼 容, 即 使 进 样 体 积 较 大 也 不 会 出 现 峰 变 形 42 µl 117 µl(10 µl 进 样 ) (1 µl 进 样 ) 1 µl 进 样 2 µl 进 样 5 µl 进 样 10 µl 进 样 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX SB-C18, 3.0 50 mm, 1.8 µm 流 速 : 1 ml/min 温 度 : 45 C 流 动 相 : 30-65% 乙 腈,2.5 分 钟 检 测 : 250 nm UV 样 品 : 苯 甲 酸 甲 酯 苯 甲 酸 丙 酯 和 苯 甲 酸 丁 酯 稀 释 溶 剂 : 甲 醇 图 25. 溶 剂 效 应 : 使 用 强 稀 释 溶 剂,1-10 µl 进 样 设 置 数 据 采 集 速 率 使 用 小 体 积 色 谱 柱 时, 数 据 采 集 速 率 是 人 为 峰 展 宽 的 常 见 原 因 对 于 快 速 洗 脱 的 色 谱 峰, 要 确 保 在 色 谱 峰 上 收 集 到 足 够 的 数 据 点, 数 据 系 统 才 能 准 确 测 定 出 峰 宽 峰 面 积 和 保 留 时 间 如 果 得 到 的 数 据 点 太 少 ( 如, 低 数 据 采 集 速 率 ), 色 谱 峰 就 会 显 得 比 其 实 际 要 宽 您 应 该 检 查 数 据 采 集 速 率, 确 保 其 设 置 正 确, 以 优 化 色 谱 结 果 图 26 说 明 了 数 据 采 集 速 率 的 影 响 如 果 您 对 现 在 的 色 谱 柱 和 梯 度 条 件 使 用 安 捷 伦 方 法 转 移 器, 转 移 器 将 估 算 出 您 所 用 条 件 下 的 期 望 峰 宽 值 (5σ) 这 一 信 息 对 初 始 方 法 设 置 会 有 帮 助 48

分 析 条 件 色 谱 柱 : Poroshell 120 EC-C18, 4.6 100mm 仪 器 : 1200 SL 2 µl 流 通 池 流 速 : 2.00 ml/min 样 品 : 2 µl 进 样 流 动 相 : 乙 腈 : 水 = 60:40 4-5% 15% 图 26. 不 同 数 据 采 集 速 率 对 Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm 上 峰 柱 效 影 响 的 比 较 这 里, 我 们 测 定 了 柱 效, 可 以 看 出, 柱 效 随 采 集 速 率 的 增 大 而 增 加 可 以 通 过 将 检 测 器 设 置 和 / 或 时 间 常 数 调 节 到 不 影 响 信 噪 比 的 最 快 数 值, 对 数 据 采 集 速 率 进 行 优 化 用 化 学 工 作 站 中 的 峰 宽 控 制 可 为 您 的 分 析 选 择 峰 宽 或 响 应 时 间 化 学 工 作 站 软 件 中 峰 宽 的 定 义 是, 半 峰 高 处 的 宽 度 将 峰 宽 设 置 为 样 品 中 色 谱 峰 所 期 望 的 最 窄 值 可 以 不 用 更 快 的 响 应 时 间, 以 免 导 致 基 线 噪 音 增 大 驻 留 体 积 及 其 对 色 谱 的 影 响 低 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 比 例 阀 经 泵 和 其 它 系 统 组 件 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 27) 高 压 混 合 系 统 的 驻 留 体 积 等 于 从 各 溶 剂 首 次 接 触, 经 两 个 计 量 泵 再 到 柱 头 的 体 积 总 和 ( 见 图 28) 比 例 阀 计 量 泵 自 动 进 样 器 图 27. 驻 留 体 积 : 低 压 混 合 四 元 泵 49

计 量 泵 A 自 动 进 样 器 计 量 泵 B 图 28. 驻 留 体 积 : 高 压 混 合 二 元 泵 在 梯 度 分 离 中, 驻 留 体 积 使 梯 度 开 始 时 出 现 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 驻 留 体 积 除 以 流 速 驻 留 体 积 太 大 的 仪 器 不 能 进 行 窄 径 梯 度 分 离 使 用 窄 径 柱 时, 仪 器 配 置 至 关 重 要 进 行 窄 径 (2.1 mm 内 径 ) 和 微 径 (1 mm 和 < 1 mm 内 径 ) 柱 优 化 时, 必 须 使 驻 留 体 积 和 柱 外 体 积 最 小 化 图 29 中 的 色 谱 图 例 说 明 了 驻 留 体 积 对 分 析 结 果 的 影 响 请 注 意, 前 面 的 洗 脱 峰 较 宽 问 题 在 于 驻 留 体 积 使 前 面 的 峰 出 峰 较 晚, 基 本 上 是 被 等 梯 度 洗 脱 的 如 果 这 种 情 况 影 响 了 分 离 或 检 测, 就 需 要 减 少 驻 留 体 积 或 使 用 另 外 的 系 统 峰 归 属 1. 非 那 西 汀 2. 托 美 汀 3. 酮 洛 芬 4. 非 诺 洛 芬 5. 布 洛 芬 6. 保 泰 松 7. 甲 灭 酸 8. 氟 芬 那 酸 图 29. 驻 留 体 积 对 梯 度 色 谱 结 果 的 影 响 分 析 条 件 色 谱 柱 : 流 动 相 : ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8 A:0.1% TFA 水 B:0.1% TFA 乙 腈 温 度 : 35 C 梯 度 : 例 1: 在 6 分 钟 内 B 由 15% 升 至 60%, 流 速 1.0 ml/min 例 2: 在 6 分 钟 内 B 由 30% 升 至 75%, 流 速 0.2 ml/min 50

测 量 系 统 的 驻 留 体 积 首 先 将 色 谱 柱 替 换 为 一 段 短 HPLC 不 锈 钢 管 线 流 动 相 组 成 如 下 :A 水 ( 无 UV 吸 收 ),B 0.2% 丙 酮 的 水 溶 液 ( 有 UV 吸 收 ) 检 测 波 长 265 nm 以 1mL/min 的 流 速 运 行 梯 度,B 在 10 分 钟 的 时 间 内 由 0 升 至 100% 记 录 后 打 印 出 梯 度 曲 线 ( 如 图 30) 检 测 器 响 应 梯 度 变 化 图 30. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 1 用 尺 子 在 纸 上, 或 在 PowerPoint 中 插 入 线 段, 在 平 行 于 x 或 y 轴 的 下 列 点 上 划 线 : 1. 流 动 相 中 含 90% B 的 零 信 号 点 2. 100% B 的 最 稳 定 信 号 点 3. 在 2.0 分 钟 处 做 垂 线, 图 形 如 图 31 所 示 图 31. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 2 51

三 条 线 段 添 加 完 毕 后, 再 添 加 两 条 线 段 计 算 梯 度 步 骤 50% 处 的 响 应 值, 本 例 中 为 24.5 mau, 在 图 上 划 一 条 水 平 线 然 后 再 划 一 条 垂 线, 与 50% 响 应 线 及 所 见 的 检 测 器 信 号 相 交 新 图 形 见 图 32 时 间 (50%) - 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积 图 32. 计 算 驻 留 ( 延 迟 ) 体 积, 步 骤 3 沿 x 轴 至 50% B 垂 线 处 ( 在 此 处 的 响 应 是 50%), 确 定 时 间, 并 尽 可 能 准 确 假 设 流 速 为 500 µl/min, 时 间 如 有 0.1 分 钟 的 误 差, 估 算 出 的 延 迟 体 积 将 会 有 50 µl 的 误 差 在 本 例 中, 我 们 估 算 50% 响 应 的 时 间 为 4.04 分 钟 计 算 驻 留 体 积 的 简 单 公 式 是, 时 间 (50%) 时 间 ( 步 骤 ) 流 速 = 驻 留 体 积, 在 本 例 中,(4.04-2.00) 分 钟 500 µl/min = 1020 µl 这 一 测 量 是 在 Agilent 1200 RRLC 系 统 (1200 SL) 上 完 成 的, 用 一 根 内 径 为 0.062 mm(0.0025 英 寸 ) 的 100 cm PEEK 限 流 器 使 反 压 达 到 340 bar, 以 水 作 为 流 量 输 送 压 缩 性 补 偿 的 特 殊 溶 剂 该 系 统 包 括 标 准 混 合 器 和 脉 冲 阻 尼 器, 以 及 自 动 进 样 器, 采 用 普 通 流 路 ( 而 不 是 旁 路 模 式 ), 再 连 接 上 述 的 限 流 器 和 3 mm 2 µl 流 通 池 52

评 估 驻 留 体 积 的 影 响 在 不 同 驻 留 体 积 的 仪 器 上 运 行 同 一 方 法, 可 以 得 到 不 同 的 结 果, 如 图 33 所 示 驻 留 体 积 较 小 的 仪 器 驻 留 体 积 较 大 的 仪 器 图 33. 驻 留 体 积 和 分 离 度 在 这 一 例 子 中, 驻 留 体 积 最 小 和 最 大 的 系 统 都 没 有 得 到 好 的 结 果 这 个 方 法 很 可 能 是 在 驻 留 体 积 处 于 中 等 范 围 的 仪 器 上 开 发 的 要 了 解 驻 留 体 积 对 您 的 梯 度 分 离 有 什 么 影 响, 可 以 在 梯 度 运 行 初 期 延 长 或 缩 短 等 度 运 行 时 间 以 进 行 观 察 要 在 驻 留 体 积 较 小 的 系 统 上 模 拟 较 大 驻 留 体 积, 可 在 梯 度 程 序 初 始 时 设 置 一 段 等 度 时 间, 相 当 于 两 个 驻 留 体 积 之 差 ( 用 ml 表 示 ) 除 以 流 速 ( 以 ml/min 表 示 ) 要 模 拟 较 小 的 驻 留 体 积, 必 须 修 改 进 样 器 程 序, 使 进 样 延 迟 时 间 等 于 相 同 的 驻 留 时 间 有 些 仪 器 有 这 种 功 能, 而 其 它 的 则 没 有 如 果 要 把 方 法 转 移 到 另 一 实 验 室 的 不 同 仪 器 上, 记 录 方 法 开 发 所 用 仪 器 的 驻 留 体 积, 以 及 驻 留 体 积 对 分 离 有 何 影 响 非 常 重 要 53

驻 留 体 积 与 分 析 时 间 驻 留 体 积 还 包 括 进 样 器 体 积, 所 以, 将 进 样 器 的 内 体 积 和 周 围 的 连 接 管 线 降 至 最 低 非 常 重 要 大 多 数 安 捷 伦 自 动 进 样 器 都 提 供 了 旁 路 模 式 选 项, 或 带 有 自 动 延 迟 体 积 减 少 (ADVR) 功 能, 在 样 品 从 样 品 定 量 环 中 冲 出 后, 将 进 样 器 切 换 回 上 样 位 置 根 据 您 选 择 的 进 样 器, 最 多 可 将 系 统 中 的 体 积 减 少 300 µl 标 准 的 安 捷 伦 1200SL 或 1260 Infinity 二 元 梯 度 仪 器 的 起 始 延 迟 体 积 大 约 为 1100 µl, 通 过 更 换 较 小 内 径 管 线 使 用 自 动 进 样 器 旁 路 功 能 并 拆 除 混 合 器 和 阻 尼 器, 可 减 少 至 280 µl 左 右 可 以 通 过 重 叠 进 样 缩 短 快 速 梯 度 分 离 的 分 析 时 间 在 重 叠 进 样 中, 自 动 进 样 器 在 之 前 的 分 析 过 程 中 吸 取 样 品, 一 旦 系 统 准 备 就 绪 即 可 进 样 这 一 功 能 可 以 将 每 次 分 析 的 时 间 缩 短 30 秒 左 右 如 果 您 正 在 进 行 的 是 快 速 梯 度 组 合 化 学 分 析, 则 最 多 可 节 省 1/3 的 分 析 时 间 如 果 您 要 用 非 常 小 的 色 谱 柱 ( 如 毛 细 管 和 微 径 柱 ) 进 行 大 量 梯 度 分 析,280 µl 的 延 迟 体 积 就 显 得 太 高 了 这 时 就 极 有 必 要 使 用 安 捷 伦 毛 细 管 液 相 色 谱 仪 配 合 这 些 色 谱 柱 了 不 要 忘 记, 使 柱 外 体 积 最 低 和 选 择 适 当 的 样 品 进 样 稀 释 剂 同 样 重 要 这 将 有 助 于 最 大 限 度 地 减 少 峰 展 宽 和 分 离 度 的 降 低 另 外, 正 如 我 们 先 前 讨 论 过 的 一 样, 还 要 确 保 正 确 设 置 检 测 器 响 应 时 间, 在 快 速 洗 脱 峰 上 获 得 足 够 的 数 据 点 ( 后 面 还 要 讨 论 这 个 问 题 ) 否 则, 可 能 会 出 现 变 形 的 人 为 宽 峰 螯 合 物 某 些 分 析 物 具 有 易 于 与 金 属 进 行 螯 合 的 结 构 筛 板 或 柱 壁 上 的 金 属 可 能 与 其 发 生 相 互 所 用, 形 成 螯 合 物 用 磷 酸 冲 洗 有 助 于 解 决 这 一 问 题 这 里 介 绍 一 种 判 断 是 否 存 在 金 属 问 题 的 好 办 法 带 有 孤 对 电 子 的 化 合 物, 加 一 个 金 属 离 子 可 以 形 成 环 状 结 构, 这 可 能 导 致 不 重 复 保 留 或 产 生 峰 形 问 题 ( 图 34) 水 杨 醛 六 元 环 络 合 物 8- 羟 基 喹 啉 五 元 环 络 合 物 a-benzoinoxomine 五 元 环 络 合 物 图 34. 评 估 化 合 物 是 否 有 螯 合 问 题 54

在 本 例 中, 磷 酸 冲 洗 有 益 于 解 决 这 一 问 题 注 意, 在 前 面 的 色 谱 图 中, 化 合 物 2 拖 尾 因 子 较 高 ( 图 35) 经 过 酸 洗 后, 我 们 得 到 了 一 个 较 尖 锐 的 色 谱 峰, 化 合 物 2 的 拖 尾 因 子 得 到 了 改 善 ZORBAX StableBond 柱 可 以 接 受 1% 的 磷 酸 冲 洗, 因 为 该 色 谱 柱 采 用 了 在 酸 性 条 件 下 稳 定 的 设 计 如 果 您 使 用 的 是 Eclipse-XDB Eclipse Plus, 或 其 它 为 中 等 ph 范 围 而 设 计 的 封 端 柱, 酸 浓 度 应 减 为 0.5% 酸 洗 之 前 酸 洗 之 后 50-100mL 1% 磷 酸 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX SB-Phenyl, 4.6 x 150 mm 进 样 量 : 5 µl 流 动 相 : 75% 25 mm 磷 酸 铵 缓 冲 液 : 25% 乙 腈 流 速 : 1.0 ml/min 温 度 : 室 温 图 35. 用 磷 酸 冲 洗 恢 复 产 生 螯 合 化 合 物 的 柱 性 能 ph 和 流 动 相 改 性 剂 流 动 相 的 ph 和 样 品 会 对 方 法 开 发 产 生 很 大 影 响 ( 如 需 了 解 更 多 信 息 可 参 见 流 动 相 操 作 和 方 法 开 发 等 章 节 ) 应 尽 可 能 避 免 使 用 极 端 ph 不 论 是 过 高 或 过 低 因 为 在 这 种 极 端 条 件 下 工 作 将 缩 短 色 谱 柱 的 寿 命 检 查 一 下 您 所 用 色 谱 柱 的 推 荐 ph 范 围, 以 确 定 最 佳 ph 范 围 大 多 数 分 离 在 ph 2 到 8 之 间 进 行 酸 性 和 碱 性 ( 可 离 子 化 ) 分 析 物 的 保 留 对 ph 非 常 敏 感, 常 随 ph 改 变 而 发 生 显 著 变 化 评 估 分 离 的 最 佳 ph 是 方 法 开 发 的 重 要 内 容, 详 见 方 法 开 发 一 节 55

梯 度 操 作 样 品 越 复 杂, 使 用 梯 度 洗 脱 方 法 的 可 能 性 就 越 大 梯 度 洗 脱 对 极 性 差 异 大 或 高 分 子 量 的 化 合 物 ( 如 多 肽 和 蛋 白 质 ) 非 常 有 用 虽 然 等 度 洗 脱 方 法 使 用 方 便, 但 由 于 峰 宽 随 保 留 时 间 延 长 而 增 大, 后 洗 脱 的 峰 会 变 宽 梯 度 洗 脱 缩 短 了 后 洗 脱 峰 的 保 留 时 间, 可 以 解 决 这 个 问 题 梯 度 洗 脱 的 优 点 包 括, 由 于 梯 度 压 缩 效 应 得 到 窄 峰 由 于 不 断 增 加 色 谱 柱 洗 脱 溶 剂 的 强 度, 从 而 降 低 了 污 染 物 的 堆 积 图 36 显 示 了 等 度 与 梯 度 洗 脱 方 法 的 比 较 使 用 等 度 洗 脱 分 离 时, 用 70 分 钟 也 没 有 将 8 种 除 草 剂 化 合 物 完 全 分 开, 并 且 组 分 1 和 组 分 2 共 洗 脱 降 低 有 机 相 比 例 可 以 分 离 峰 1 和 峰 2, 但 保 留 时 间 无 法 接 受, 并 且 峰 8 的 检 出 限 也 无 法 接 受 使 用 20-60% 的 梯 度, 在 30 分 钟 内 即 可 分 离 全 部 8 个 组 分, 并 具 有 相 等 的 检 测 限 如 果 提 高 起 始 梯 度 洗 脱 液 的 有 机 相 百 分 比, 分 析 时 间 还 可 以 进 一 步 缩 短 如, 可 以 进 行 有 机 相 25-65% 的 梯 度 洗 脱 反 相 色 谱 的 梯 度 分 离 可 以 用 2 到 4 种 流 动 相 组 分 完 成 在 二 元 梯 度 中 为 A 和 B A 溶 剂 较 弱 ( 常 为 水 或 缓 冲 溶 液 ), 使 分 析 物 缓 慢 地 从 色 谱 柱 上 洗 脱 下 来 B 溶 剂 较 强, 使 分 析 物 的 洗 脱 速 度 更 快 B 是 可 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂, 如 乙 腈 (ACN) 甲 醇 (MeOH) 四 氢 呋 喃 (THF), 或 异 丙 醇 (IPA) 梯 度 洗 脱 方 法 开 发 应 从 测 试 开 始 以 下 是 建 立 梯 度 洗 脱 方 法 的 关 键 步 骤 : 1. 先 进 行 测 试, 在 一 定 时 间 内 有 机 相 的 浓 度 从 5-10% 之 间 线 性 梯 度 变 化 至 100% 如 果 缓 冲 液 与 溶 剂 B 不 互 溶 的 话, 梯 度 中 有 机 相 的 浓 度 上 限 为 70% 2. 用 最 后 的 比 例 持 续 洗 脱 一 段 时 间, 确 保 所 有 样 品 组 分 都 已 洗 出 3. 查 看 色 谱 图, 以 确 定 恰 当 的 起 始 梯 度 组 成 和 梯 度 曲 线 大 多 数 梯 度 洗 脱 分 离 都 是 用 线 性 梯 度 完 成 的, 即 有 机 相 组 成 的 变 化 速 率 保 持 恒 定 但 也 可 以 用 其 它 类 型 的 梯 度 例 如, 根 据 所 需 要 的 分 离 和 保 留 时 间, 某 些 梯 度 程 序 在 不 同 时 间 的 斜 率 不 同, 或 A 和 B 的 相 对 浓 度 发 生 急 剧 变 化 如 需 了 解 更 多 梯 度 洗 脱 的 内 容 和 实 例, 请 参 见 方 法 开 发 一 节 如 需 缩 短 分 离 时 间 改 善 色 谱 峰 形 的 检 测, 应 保 持 梯 度 简 单 ( 使 用 较 短 的 梯 度 时 间 ) 并 使 用 较 短 的 色 谱 柱 (50-75 mm) 56

峰归属 1. 丁噻隆 2. 扑灭通 3. 扑草净 4. 阿特拉津 5. 噻草平 6. 扑灭津 7. 敌稗 8. 异丙草甲胺 分析条件 色谱柱 流动相 流速 温度 图 36. 等度和梯度分析的比较 ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm A 含 0.1% TFA 的水溶液 ph 2 B 乙腈 1.0 ml/min 35 C 优化色谱柱的再平衡 在方法开发或转换过程中 要保证足够的色谱柱平衡时间 保留时间才可重现 从葡萄汁的梯度分析分离 图 37 中可以看出 色谱柱死体积和色谱柱的再平衡消耗的时间 梯度曲线 压力曲线 橙皮苷 梯度曲线 A. 初始的等度维持 B. 线性梯度洗脱 C. 高有机相冲洗 D. 再平衡 分析条件 LC 配备 DAD 的 Agilent 1290 Infinity 色谱柱 Agilent RRHD SB-C18 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 部件号 859700-902 温度 1 µl 葡萄汁过 0.2 um 滤膜 40 C 检测 UV, 276 nm 溶剂 A 水 溶剂 B 乙腈 进样 = 1 个柱死体积 Vm 图 37. 梯度实例 : 葡萄汁分析 这是在前面的梯度运行后 回到初始流动相条件所用的时间 在本例中 再平衡时间为 1.4 分钟 相当于该 柱的 4 个柱体积 57

找 出 色 谱 图 中 基 线 第 一 次 波 动 的 时 间, 将 这 段 时 间 ( 以 min 表 示 ) 乘 以 流 速 ( 以 ml/min 表 示 ), 即 为 死 体 积 的 ml 数 也 可 以 用 安 捷 伦 方 法 转 换 器 计 算 死 体 积 依 据 经 验 来 看, 在 方 法 开 发 过 程 中, 需 要 用 10 个 柱 体 积 进 行 平 衡, 但 对 于 已 建 立 的 方 法, 平 衡 时 间 可 以 估 算 并 缩 短, 如, 在 本 例 中 为 4 个 柱 体 积 平 衡 时 间 的 最 小 值 是 经 过 反 复 摸 索 确 定 的, 通 过 重 复 运 行 梯 度 并 记 录 保 留 的 改 变 如 果 经 过 多 次 进 样 结 果 都 能 重 复, 如 图 38, 平 衡 时 间 就 足 够 了 时 间 进 样 1 进 样 2 进 样 3 进 样 4 进 样 5 进 样 6 分 析 条 件 LC: 色 谱 柱 : 进 样 : 温 度 : 40 C 检 测 器 : UV, 276 nm 溶 剂 A: 水 溶 剂 B: 乙 腈 样 品 : 葡 萄 汁 带 DAD 的 Agilent 1290 Infinity Agilent RRHD SB-C18 2.1 x 150 mm, 1.8 µm PN 959759-902 1 µl 葡 萄 汁 过 0.2 µm 滤 膜 图 38. 确 认 色 谱 平 衡 重 叠 图 为 什 么 要 反 复 实 验 不 断 摸 索 呢? 固 定 相 通 过 再 平 衡 回 到 起 始 条 件 的 速 度 不 同 快 慢 程 度 取 决 于 所 用 的 流 动 相 溶 剂 缓 冲 液 和 梯 度 范 围 这 就 是 方 法 开 发 时 建 议 使 用 10 个 柱 体 积 的 原 因, 这 样 可 以 确 保 固 定 相 已 达 到 再 平 衡, 能 够 进 行 下 一 次 运 行 只 要 能 够 完 成 您 所 需 要 的 分 离, 都 可 以 考 虑 缩 短 再 平 衡 的 时 间 由 于 平 衡 体 积 包 括 仪 器 的 驻 留 体 积, 而 该 体 积 可 能 随 仪 器 的 不 同 而 不 同 驻 留 体 积 对 等 梯 度 方 法 的 保 留 没 有 影 响, 但 在 梯 度 方 法 中, 却 对 保 留 有 显 著 影 响 如 果 您 不 清 楚 系 统 的 驻 留 体 积, 则 可 能 会 出 现 严 重 问 题, 因 为 您 的 驻 留 体 积 可 能 比 柱 体 积 还 大 如 果 您 要 将 梯 度 方 法 从 一 台 仪 器 转 移 到 另 一 台 仪 器 上, 由 于 两 个 系 统 的 驻 留 体 积 不 同, 保 留 时 间 则 会 发 生 偏 移 流 路 体 积 越 相 近, 保 留 时 间 的 吻 合 程 度 就 越 高 提 示 : 可 以 通 过 观 察 在 线 信 号 窗 的 压 力 曲 线 变 化 进 行 确 认 压 力 随 流 动 相 组 成 变 化 而 变 化 当 压 力 曲 线 回 到 初 始 值 时, 色 谱 柱 差 不 多 就 达 到 再 平 衡 了 58

提 示 : 您 需 要 了 解 您 系 统 的 驻 留 时 间! 方 法 见 50 页 查 看 您 的 系 统 说 明 书 或 向 安 捷 伦 技 术 支 持 寻 求 帮 助 见 本 书 中 安 捷 伦 资 源 一 节 色 谱 柱 老 化 在 您 使 用 色 谱 柱 时, 会 用 其 分 析 各 种 目 标 物 使 用 各 种 流 动 相 并 分 离 不 同 的 样 品 基 质, 经 过 长 时 间 的 使 用, 色 谱 柱 会 受 到 这 些 物 质 的 影 响 发 生 一 些 微 妙 的 变 化, 从 而 引 起 保 留 的 改 变 在 使 用 新 色 谱 柱 时 保 留 其 测 试 样 品 色 谱 图 非 常 重 要, 在 使 用 一 段 时 间 后 进 行 比 较, 就 能 发 现 性 能 上 的 变 化 如 果 分 离 度 下 降 导 致 不 能 进 行 良 好 定 量, 这 根 色 谱 柱 就 应 该 丢 弃 并 更 换 了 键 合 相 流 失 虽 然 色 谱 柱 污 染 是 硅 胶 基 色 谱 柱 性 能 下 降 的 最 常 见 原 因 之 一, 但 随 时 间 推 移 发 生 的 键 合 相 流 失 也 会 改 变 保 留 如 果 在 流 动 相 中 使 用 了 某 种 不 兼 容 溶 剂, 键 合 相 可 能 从 硅 胶 基 体 上 脱 离 下 来, 导 致 分 离 度 和 保 留 时 间 的 改 变, 并 增 加 了 峰 拖 尾 在 ph 2 以 下 键 合 相 的 流 失 最 为 严 重 可 以 通 过 使 用 稳 定 键 合 相 色 谱 柱 减 小 这 种 影 响, 或 在 ph 2 到 ph 7 之 间 60 C 以 下 操 作 在 高 ph 条 件 下, 硅 胶 基 质 将 发 生 溶 解, 从 而 导 致 填 料 流 失, 形 成 空 洞 峰 形 变 差 如 果 一 定 要 在 ph 值 大 于 9 的 条 件 下 进 行 分 析, 应 确 保 使 用 适 合 这 种 工 作 条 件 的 特 殊 键 合 相 色 谱 柱 或 可 以 轻 松 耐 受 高 ph 流 动 相 的 聚 合 物 类 色 谱 柱 如 需 确 定 色 谱 柱 是 否 已 损 坏, 应 该 监 测 并 观 察 其 容 量 因 子 选 择 性 和 拖 尾 因 子 的 变 化 这 同 时 也 有 助 于 您 预 测 何 时 需 要 更 换 色 谱 柱 清 洗 反 相 硅 胶 柱 有 时, 可 以 通 过 清 洗 色 谱 柱 缓 解 柱 压 高 或 峰 拖 尾 问 题 在 清 洗 色 谱 柱 之 前, 我 们 建 议 断 开 色 谱 柱 与 检 测 器 的 连 接, 让 清 洗 溶 剂 流 入 烧 杯 或 其 它 容 器 中 在 某 些 情 况 下, 可 反 冲 色 谱 柱 进 行 清 洗 使 污 染 物 从 柱 中 流 出 在 进 行 此 项 操 作 前, 应 向 色 谱 柱 厂 商 咨 询, 或 查 阅 色 谱 柱 所 附 说 明 书 清 洗 色 谱 柱 需 要 使 用 比 流 动 相 更 强 的 溶 剂 清 洗 分 析 柱 时, 每 种 溶 剂 至 少 应 使 用 10 个 柱 体 积 ( 见 图 39) 清 洗 反 相 柱 的 步 骤 如 下 清 洗 完 成 后, 按 厂 商 建 议 的 液 流 方 向 装 回 色 谱 柱 柱 压 过 高 问 题 可 能 不 是 柱 阻 塞 造 成 的, 而 是 系 统 中 的 密 封 垫 损 坏, 以 及 颗 粒 沉 积 在 在 线 滤 头 上 造 成 的, 在 清 洗 色 谱 柱 前, 应 尝 试 更 换 在 线 滤 头 59

不要试图更换色谱柱的进样口筛板 因为现在填充色谱柱采用的是高效工艺 这样做可能为色谱柱带 来不可恢复的损坏 ዹ ओ ዹ ओ 2.5mLx -65% 没有装填的柱体积 = 1.5 ml = 1 个柱体积 图 39. 计算柱体积 提示 为避免沉淀 如果系统中不含非挥发性缓冲液 在纯有机溶剂进入系统之前 首先用不含缓冲 液的水相流动相进行冲洗 反冲或清洗色谱柱的步骤 1. 断开色谱柱与检测器的连接 将管线留在色谱柱末端 将其放入接收液体的烧杯中 2. 先用不含缓冲液盐的流动相冲洗 水/有机相 3. 然后用 100% 有机相 甲醇和乙腈 冲洗 4. 检查压力是否回归正常 如果没有 再进行下一步操作 5. 丢弃色谱柱或考虑用更强的条件清洗 75% 乙腈/25% 异丙醇 6. 100% 异丙醇 7. 100% 二氯甲烷 * 8. 100% 己烷* * 无论是使用己烷还是二氯甲烷 使用之前或恢复使用反相流动相之前必须用异丙醇进行冲洗 60

缓 冲 液 盐 可 能 发 生 沉 淀 并 造 成 色 谱 柱 内 反 压 发 生 这 种 情 况 时, 应 用 热 水 缓 慢 通 入 色 谱 柱, 以 去 除 沉 淀 含 丙 醇 的 冲 洗 溶 液 因 粘 度 增 大 将 产 生 更 高 的 操 作 压 力 在 清 洗 过 程 中 需 要 降 低 流 速, 以 保 持 安 全 的 操 作 压 力 清 洗 正 相 硅 胶 柱 对 于 正 相 色 谱 柱 只 能 使 用 有 机 溶 剂, 如 果 您 的 色 谱 柱 是 传 统 的 分 析 型 4.6 x 250 mm 色 谱 柱, 那 么 每 种 溶 剂 至 少 需 要 用 50 ml( 相 当 于 20 个 柱 体 积 ) 尝 试 下 列 强 度 递 增 的 溶 剂 进 行 清 洗 : 1. 50% 甲 醇 :50% 氯 仿 2. 100% 醋 酸 乙 酯 清 洗 正 相 模 式 色 谱 柱 还 取 决 于 样 品 类 型 如 果 用 这 些 溶 剂 的 清 洗 效 果 不 佳, 请 与 安 捷 伦 联 系, 以 便 我 们 可 以 根 据 您 的 应 用 和 样 品 基 质 推 荐 更 有 效 的 溶 剂 清 洗 反 相 聚 合 物 柱 当 使 用 聚 合 物 类 反 相 柱 时, 我 们 强 烈 建 议 流 动 相 中 最 少 含 有 1% 的 有 机 改 性 剂 长 期 使 用 100% 水 相 洗 脱 液 后 再 使 用 有 机 流 动 相 时 可 能 影 响 柱 效, 同 时 也 不 能 用 100% 的 水 相 缓 冲 液 冲 洗 色 谱 柱 可 以 进 行 反 向 冲 洗, 如 果 起 始 压 力 高, 可 降 低 流 速 下 面 是 反 相 聚 合 物 柱 的 清 洗 步 骤 : 1. 使 用 当 前 流 动 相 运 行 清 洗 梯 度, 再 用 高 比 例 有 机 溶 剂 (95%) 清 洗 数 个 柱 体 积 重 复 2 到 3 次 由 于 缓 冲 液 可 能 在 高 有 机 相 中 发 生 沉 淀, 因 此 如 果 您 的 流 动 相 含 缓 冲 液, 有 机 相 比 例 不 要 超 过 70%, 或 者 在 清 洗 之 前 用 不 含 缓 冲 液 的 流 动 相 将 缓 冲 液 清 洗 掉 2. 尝 试 使 用 较 高 强 度 的 有 机 改 性 剂, 如 TFA, 去 除 发 生 疏 水 键 合 的 污 染 物 3. 有 时 用 含 1.0% TFA 的 水 / 乙 腈 (v/v) 可 以 去 除 多 肽 或 蛋 白 污 染 物 4. 用 强 酸 和 强 碱 ( 包 括 1 M 氢 氧 化 钠 ) 适 当 清 洗 而 不 会 发 生 热 降 解 提 示 : 过 滤 样 品 将 增 加 色 谱 柱 的 使 用 寿 命, 也 可 减 少 仪 器 磨 损 61

方 法 开 发 如 果 您 还 没 有 建 立 HPLC 方 法, 要 进 行 稳 定 而 重 复 的 分 析, 就 需 要 进 行 方 法 开 发 了 具 备 进 行 成 功 方 法 开 发 的 技 能, 对 解 决 将 来 可 能 遇 到 的 复 杂 分 析 极 有 帮 助 在 本 章 中, 首 先 我 们 将 向 您 介 绍 对 所 有 HPLC 模 式 都 适 用 的 概 要 性 的 内 容 : 方 法 开 发 的 关 键 步 骤 模 式 选 择 色 谱 柱 填 料 和 规 格 固 定 相 的 选 择 接 下 来, 我 们 将 着 重 介 绍 反 相 方 法 的 开 发 : 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 流 动 相 操 作 要 点 涉 及 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 的 故 障 排 查 实 例 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 与 ph 相 关 的 故 障 排 查 实 例 聚 合 物 色 谱 柱 的 反 相 方 法 开 发 将 常 规 柱 上 的 现 有 方 法 转 移 到 表 面 多 孔 填 料 柱 的 要 点 方 法 开 发 的 步 骤 指 南 自 动 化 方 法 开 发 62

本 章 的 最 后, 我 们 还 将 讨 论 其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 : HILIC 正 相 色 谱 离 子 交 换 色 谱 凝 胶 渗 透 / 体 积 排 阻 色 谱 LC/MS 方 法 开 发 : 从 何 处 入 手 方 法 开 发 的 总 体 目 标 是 在 尽 可 能 短 的 时 间 内 优 化 目 标 物 的 分 离 度 当 您 开 始 考 虑 进 行 方 法 开 发 时, 最 好 先 回 顾 一 下 分 离 度 的 关 键 影 响 因 素 可 以 复 习 色 谱 基 本 概 念 一 章 ( 第 5-11 页 ) 典 型 的 方 法 开 发 流 程 包 含 以 下 步 骤, 同 时 也 是 本 章 内 容 的 主 线 : 1. 选 择 分 离 模 式 2. 选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 3. 选 择 固 定 相 填 料 4. 选 择 流 动 相 溶 剂 5. 如 果 分 离 模 式 需 要, 调 节 流 动 相 的 ph 6. 进 行 等 度 或 梯 度 初 步 实 验, 以 确 定 边 界 条 件 7. 优 化 实 验 条 件 模 式 选 择 您 应 该 做 的 第 一 件 事 就 是 选 择 HPLC 模 式 通 常 分 离 模 式 是 由 以 下 因 素 决 定 的 : 目 标 物 的 类 型 和 溶 解 度 目 标 物 分 子 量 (MW) 样 品 基 质 以 及 可 使 用 的 固 定 相 和 色 谱 柱 图 40 和 41 根 据 化 合 物 分 子 量 和 将 使 用 的 溶 剂, 列 出 了 评 价 分 离 模 式 最 佳 选 择 的 步 骤 63

溶 剂 分 离 模 式 己 烷 使 用 未 修 饰 硅 胶 的 正 相 色 谱 ( 吸 附 ) 使 用 键 合 相 硅 胶 的 正 相 色 谱 有 机 相 甲 醇 和 甲 醇 : 水 或 乙 腈 和 乙 腈 : 水 反 相 (RP) HILIC( 对 于 在 反 相 条 件 下 弱 保 留 的 物 质 ) 分 子 量 < 2000 THF 凝 胶 渗 透 ( 小 分 子 ) 非 离 子 型 反 相 HILIC( 对 于 在 反 相 条 件 下 弱 保 留 的 物 质 ) 水 相 离 子 型 使 用 离 子 控 制 的 反 相 色 谱 使 用 离 子 对 试 剂 的 反 相 色 谱 使 用 未 修 饰 硅 胶 的 反 相 色 谱 离 子 交 换 有 机 相 凝 胶 渗 透 分 子 量 > 2000 水 相 凝 胶 过 滤 使 用 大 孔 填 料 的 离 子 交 换 色 谱 使 用 大 孔 填 料 的 反 相 色 谱 图 40. 按 溶 剂 和 分 离 模 式 选 择 LC 和 LC/MS 色 谱 柱 64

分 子 大 小 溶 剂 化 合 物 类 型 分 离 机 制 小 水 相 / 有 机 相 脂 类 银 离 子 络 合 多 环 芳 烃 有 机 酸 单 糖 和 二 糖 低 聚 糖 糖 醇 正 相 碱 性 极 性 氢 键 结 合 位 置 异 构 体 芳 香 族 化 合 物 或 结 构 相 似 物 强 极 性 极 端 条 件 反 相 C18 配 位 相 互 所 用 反 相 离 子 对 配 位 相 互 所 用 正 相 氨 基 离 子 交 换 配 位 相 互 作 用 和 离 子 交 换 配 位 相 互 所 用 正 相 氨 基 / 氰 基 / 二 醇 极 性 反 相 C8 或 C18 或 HILIC 反 相 C18 离 子 抑 制 反 相 C8 或 C18 反 相 C8 反 相 苯 基 / 苯 基 - 己 基 / 二 苯 基 反 相 其 它 或 HILIC 反 相 聚 合 物 有 机 相 非 极 性 正 相 Si 极 性 正 相 氨 基 / 氰 基 / 二 醇 图 41. 按 分 析 物 和 分 离 机 制 选 择 LC 和 LC/MS 色 谱 柱 有 时, 一 组 特 定 分 析 物 可 以 用 一 种 以 上 的 模 式 分 离 例 如, 离 子 型 化 合 物 可 以 用 树 脂 或 硅 胶 基 色 谱 柱 进 行 离 子 交 换 色 谱 分 离, 也 可 以 用 反 相 柱 进 行 反 相 离 子 对 分 配 色 谱 分 离 许 多 色 谱 工 作 者 都 是 以 反 相 HPLC 开 始 分 离, 因 为 反 相 色 谱 已 发 表 了 许 多 应 用 文 章 可 供 参 考 用 反 相 色 谱 可 以 分 析 非 极 性 非 离 子 型 离 子 型 和 极 性 化 合 物, 选 择 适 当 的 流 动 相 和 分 析 条 件, 有 时 整 个 分 析 都 可 以 仅 用 这 一 种 模 式 完 成 继 反 相 色 谱 之 后, 我 们 还 将 在 本 章 的 最 后 讨 论 其 它 分 离 模 式 65

选 择 色 谱 柱 和 填 料 规 格 图 42 显 示 了 评 价 色 谱 柱 固 定 相 和 色 谱 柱 规 格 时 考 虑 的 部 分 参 数 要 进 行 高 通 量 分 析, 小 粒 径 短 柱 ( 如 亚 2 µm) 是 最 佳 选 择 如 果 您 要 对 包 含 多 种 组 分 的 样 品 进 行 复 杂 的 分 离, 可 以 选 择 填 充 小 粒 径 填 料 的 长 柱, 切 记, 这 种 色 谱 柱 的 操 作 压 力 可 能 会 显 著 增 加 如 果 您 要 进 行 质 谱 分 析, 窄 内 径 柱 ( 如 2.1 mm 内 径 ) 是 最 佳 选 择, 因 为 与 质 谱 检 测 器 联 用 需 要 较 低 流 速 制 备 色 谱 常 使 用 填 充 较 大 粒 径 填 料 (5 或 10 µm) 的 大 内 径 柱 对 于 这 种 色 谱 柱, 高 流 速 正 好 与 制 备 柱 的 流 量 需 求 相 匹 配 填 料 的 孔 径 非 常 重 要, 因 为 待 测 分 子 必 须 与 多 孔 结 构 相 匹 配, 才 能 与 固 定 相 发 生 相 互 作 用 较 小 孔 径 的 填 料 ( 孔 径 80 到 120Å) 最 适 合 分 离 分 子 量 2000 以 下 的 小 分 子 对 于 分 子 量 超 过 2000 的 较 大 分 子, 需 要 使 用 较 大 孔 填 料 ; 例 如, 分 离 蛋 白 质 的 常 用 孔 径 是 300Å 对 大 多 数 分 离 来 说, 都 可 以 使 用 不 锈 钢 柱 硬 件 但 是, 如 果 您 要 分 析 的 是 可 能 与 金 属 表 面 发 生 相 互 所 用 的 敏 感 分 子, 如 某 些 类 型 的 生 物 分 子, 则 需 要 使 用 PEEK 或 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 等 柱 材 料 对 于 痕 量 阳 离 子 的 分 离, PEEK 柱 的 惰 性 最 高 请 注 意,PEEK 柱 的 压 力 上 限 为 400 bar HPLC 色 谱 柱 固 定 相 色 谱 柱 规 格 表 面 类 型 孔 径 填 料 粒 径 长 度 内 径 化 学 性 质 化 学 寿 命 / 灵 敏 度 保 留 因 子 物 理 性 质 柱 效 速 度 图 42. 部 分 色 谱 柱 及 固 定 相 影 响 66

选 择 固 定 相 有 包 含 各 种 分 离 模 式 的 多 种 固 定 相 可 供 选 择 许 多 色 谱 工 作 者 都 以 最 通 用 的 十 八 烷 基 硅 烷 化 (C18) 固 定 相 开 始 进 行 反 相 色 谱 分 离, 尤 其 是 对 小 分 子 的 分 离 下 面 我 们 将 着 重 讨 论 反 相 分 离 的 问 题, 本 章 后 面 部 分 再 涉 及 其 它 分 离 模 式 反 相 色 谱 的 方 法 开 发 反 相 色 谱 是 到 目 前 为 止 最 通 用 的 HPLC 方 法 大 约 占 所 有 方 法 的 60%, 将 近 95% 的 色 谱 工 作 者 都 在 使 用 在 反 相 色 谱 中, 分 析 物 在 极 性 流 动 相 和 非 极 性 固 定 相 之 间 分 配 与 正 相 色 谱 相 反 通 常, 分 析 物 与 疏 水 固 定 相 之 间 发 生 非 极 性 非 特 异 性 相 互 作 用, 即, 样 品 分 配 入 固 定 相 我 们 使 用 C18 C8 苯 基 或 C3 等 固 定 相, 产 生 极 性 差 异 和 / 或 基 于 分 子 芳 香 结 构 的 差 异 极 性 较 强 的 分 析 物 比 非 极 性 分 析 物 在 反 相 固 定 相 中 的 保 留 弱 保 留 与 分 析 物 的 疏 水 性 基 本 上 成 正 比 具 有 大 疏 水 基 团 和 带 较 长 烷 烃 链 的 同 系 物, 比 结 构 中 带 极 性 基 团 的 分 子 ( 如 氨 基 羟 基 ) 保 留 更 强 如 果 有 一 系 列 脂 肪 酸, 如 C12 C14 C16 和 C18, 则 C12 保 留 最 弱,C18 保 留 最 强 流 动 相 主 要 由 两 部 分 组 成 : 1. 水, 可 含 缓 冲 液, 或 用 酸 或 碱 调 节 ph 2. 可 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂 反 相 色 谱 有 多 种 用 途, 有 时 在 同 一 色 谱 分 析 中 就 可 以 分 离 非 极 性 极 性 可 离 子 化 的 和 离 子 型 分 子 一 般 来 说, 对 于 可 离 子 化 的 化 合 物, 为 了 增 加 保 留 和 改 善 峰 形, 我 们 会 在 流 动 相 中 加 入 改 性 剂, 以 抑 制 离 子 化, 减 弱 其 极 性, 使 其 保 留 更 强 反 相 色 谱 固 定 相 的 选 择 下 面 我 们 要 讨 论 如 何 开 发 反 相 方 法 图 43 显 示 了 如 何 根 据 特 定 分 析 物 的 分 子 量 选 择 合 适 固 定 相 的 一 般 流 程 首 先, 必 须 选 择 孔 径, 以 确 保 目 标 分 子 能 够 进 入 填 料, 在 孔 隙 中 与 疏 水 固 定 相 发 生 相 互 作 用 然 后, 选 择 固 定 相, 多 数 情 况 下 是 从 C18 固 定 相 开 始 根 据 方 法 的 最 终 目 标 不 同, 可 以 选 择 常 规 分 析 柱, 如 果 需 要 进 行 高 通 量 分 析, 可 以 选 择 快 速 分 析 反 相 色 谱 柱 67

小 分 子 分 子 量 < 2000 大 分 子 分 子 量 > 2000 80-120Å 填 料 孔 径 300Å 首 先 根 据 待 分 析 物 的 分 子 大 小 选 择 填 料 的 孔 径 通 常 小 分 子 可 轻 易 扩 散 进 出 80-120Å 孔 径 的 填 料, 但 较 大 的 多 肽 和 蛋 白 质 则 不 能 基 于 这 个 原 因, 建 议 用 300Å 孔 径 的 填 料 (300SB) 进 行 多 肽 和 蛋 白 质 的 等 度 或 梯 度 分 离 Eclipse Plus C18 起 始 色 谱 柱 键 合 相 StableBond 300SB-C18 对 于 大 多 数 样 品 来 说, 建 议 将 C18 作 为 开 始 分 析 的 固 定 相, 因 为 其 可 以 最 大 限 度 地 保 留 中 等 极 性 到 非 极 性 化 合 物 如 果 用 C18 固 定 相 不 能 优 化 分 离 度, 或 您 要 分 析 的 是 蛋 白 质, 或 用 常 规 反 相 溶 剂 很 难 从 C18 上 洗 脱 的 强 疏 水 化 合 物, 可 以 考 虑 使 用 短 链 固 定 相 小 分 子 大 分 子 标 准 分 析 快 速 分 析 标 准 分 析 快 速 分 析 Eclipse Plus C18 Poroshell 120 EC-C18 ZORBAX 300SB-C18 ZORBAX 300SB-C18 4.6 x 150 mm, 3.5 µm 4.6 x 100 mm, 2.7 µm 4.6 x 150 mm, 5 µm 4.6 x 50 mm, 3.55 µm 部 件 号 959963-902 ( 表 面 多 孔 型 ) 部 件 号 889395-902 部 件 号 8656973-902 Poroshell 120 EC-C18 部 件 号 695975-902 Poroshell 300SB-C18 4.6 x 7.5 mm, 2.7 µm 部 件 号 697975-902 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 离 度 Eclipse Plus C18, 1200 bar 2.1 x 75 mm, 5 µm 部 件 号 660750-902 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 部 件 号 959757-902 图 43. 反 相 色 谱 : 固 定 相 选 择 概 览 大 多 数 色 谱 工 作 者 是 从 C18 固 定 相 开 始, 但 如 图 44 所 示, 如 果 C18 不 能 进 行 有 效 分 离, 其 它 固 定 相 也 可 以 提 供 不 同 的 选 择 性 在 本 例 中, 我 们 在 含 不 同 亚 2 µm 填 料 的 快 速 分 离 高 通 量 短 柱 上 分 离 了 心 血 管 药 物, 使 用 含 70% 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 3.0) 和 30% 乙 腈 的 等 度 缓 冲 流 动 相 68

虽 然, 所 有 色 谱 柱 都 使 样 品 中 的 5 种 药 物 得 到 了 完 全 或 部 分 分 离, 但 SB-CN 柱 不 仅 分 离 度 足 够, 而 且 分 离 速 度 最 快 峰 归 属 1. 心 得 乐 2. Diisopyridamide 3. 心 得 安 4. 双 嘧 达 莫 5. 地 尔 硫 卓 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX RRHT, 4.6 x 50 mm, 1.8 µm 流 动 相 : A:25 mm NaH 2 PO 4, ph 3.0 B: 乙 腈 流 动 相 组 成 : 30% B 流 速 : 2.0 ml/min 温 度 : 30 C 检 测 : UV 240 nm 样 品 : 心 血 管 药 物 图 44. 反 相 色 谱 中 键 合 相 的 选 择 性 差 异 原 则 上, 应 该 选 择 符 合 样 品 需 求 的 固 定 相 疏 水 性 小 分 子 应 首 选 较 长 链 烷 烃 键 合 相, 如 C18 如 果 在 C18 固 定 相 上 保 留 过 强, 再 选 择 较 短 链 的 C8 或 C3 固 定 相 C8 固 定 相 与 C18 具 有 相 似 的 选 择 性, 但 保 留 稍 弱 对 于 疏 水 性 很 强 的 分 子, 最 好 使 用 短 链 固 定 相, 如 C3 如 果 待 分 析 物 分 子 具 有 芳 香 结 构, 在 烷 烃 固 定 相 上 不 能 完 全 分 离, 可 以 使 用 芳 香 键 合 相, 如 苯 基 或 二 苯 基 在 本 例 中, 目 标 分 析 物 具 有 强 极 性, 在 一 般 的 反 相 色 谱 填 料 上 不 保 留 或 保 留 很 弱, 可 以 考 虑 换 一 种 HPLC 分 离 模 式, 用 亲 水 相 互 作 用 色 谱 (HILIC)( 参 见 92 页 的 HILIC 部 分 ) 如 果 在 方 法 开 发 过 程 中, 必 须 使 用 高 ph 条 件, 就 要 选 择 为 高 ph 下 操 作 而 设 计 的 固 定 相, 如 Extend-C18, 或 聚 合 物 固 定 相, 如 PLRP-S 短 链 固 定 相 在 高 ph 值 下 不 稳 定, 可 能 发 生 硅 胶 溶 解 69

反 相 色 谱 流 动 相 的 选 择 一 般 来 说, 反 相 LC 的 流 动 相 包 括 水 和 作 为 改 性 剂 的 乙 腈 或 甲 醇 不 太 常 用 的 改 性 剂 还 有 四 氢 呋 喃 (THF) 和 异 丙 醇 我 们 建 议 一 定 要 使 用 色 谱 级 以 上 的 溶 剂 和 改 性 剂 对 于 UHPLC, 安 捷 伦 建 议 只 使 用 LC/MS 级 以 上 的 溶 剂 选 择 性 差 异 和 样 品 的 保 留 都 会 因 流 动 相 不 同 而 明 显 改 变 样 品 溶 解 度 也 很 可 能 不 同, 需 要 使 用 特 殊 的 溶 剂 或 多 种 溶 剂 在 反 相 色 谱 中, 流 动 相 中 水 相 的 ph 和 离 子 强 度 在 开 发 对 条 件 微 小 变 化 不 敏 感 的 耐 用 方 法 中 非 常 重 要 对 于 离 子 型 化 合 物, 典 型 样 品 的 保 留 随 ph 改 变 而 明 显 变 化 在 这 类 反 相 系 统 中, 控 制 ph 对 于 保 留 和 选 择 性 的 稳 定 非 常 重 要 通 常 在 ph 2 到 4 条 件 下, 保 留 时 间 对 ph 的 微 小 改 变 稳 定 性 最 高, 因 此 建 议 将 这 一 ph 范 围 作 为 大 多 数 样 品 方 法 开 发 的 起 始 ph, 包 括 碱 性 化 合 物 和 一 般 的 弱 酸 考 虑 到 重 现 性, 所 用 的 ph 应 高 于 或 低 于 待 分 离 溶 质 pk a 或 pk b 上 下 一 个 ph 单 位 您 可 能 不 清 楚 分 析 物 的 pk a, 因 此, 测 试 一 种 以 上 流 动 相 ph 可 提 供 最 好 结 果 大 多 数 反 相 柱 都 可 以 在 ph 2-8 条 件 下 使 用, 为 您 的 分 离 选 择 最 佳 流 动 相 ph 提 供 了 较 宽 的 范 围 请 注 意, 测 定 流 动 相 ph 时, 要 在 水 相 与 有 机 改 性 剂 混 合 之 前 在 水 相 中 进 行 测 定, 以 确 保 得 到 准 确 而 可 重 复 的 结 果 流 动 相 操 作 当 您 开 始 启 用 刚 从 包 装 盒 中 取 出 的 新 柱 时, 只 能 使 用 与 柱 内 装 运 溶 剂 兼 容 的 溶 剂 为 防 止 缓 冲 液 在 色 谱 柱 内 沉 淀, 反 相 操 作 时 不 能 将 缓 冲 液 泵 入 用 100% 有 机 溶 剂 装 运 的 色 谱 柱 我 们 的 建 议 是, 先 用 不 含 缓 冲 液 的 流 动 相 平 衡 色 谱 柱, 然 后 再 用 含 缓 冲 液 的 流 动 相 平 衡 氰 基 和 氨 基 柱 都 既 可 以 使 用 正 相 溶 剂, 也 可 以 使 用 反 相 溶 剂, 因 此, 在 平 衡 前 需 要 检 查 您 的 溶 剂 是 否 与 装 运 溶 剂 混 溶 如 果 想 把 一 根 正 相 柱 变 为 反 相 柱, 要 先 用 彼 此 混 溶 的 溶 剂 冲 洗, 如 异 丙 醇 然 后 再 用 您 的 流 动 相 平 衡 溶 剂 的 混 溶 性 图 表 见 有 用 的 参 考 资 料 一 章 请 注 意, 流 动 相 是 可 能 使 HPLC 柱 产 生 问 题 的 潜 在 来 源 为 避 免 这 些 问 题, 请 查 看 134 页 参 考 资 料 一 章 中 的 常 用 溶 剂 性 质 及 混 溶 性 信 息 流 动 相 和 流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 在 图 45 的 实 例 中, 开 始 在 一 根 较 旧 的 色 谱 柱 ( 柱 1) 上 进 行 分 析, 性 能 尚 可 但 色 谱 操 作 者 改 用 一 根 新 柱 ( 柱 2) 进 行 分 离, 关 键 组 分 的 分 离 度 明 显 变 差, 于 是 便 认 为 新 柱 较 差 当 色 谱 操 作 者 用 新 配 制 的 流 动 相 缓 冲 液 进 行 分 析 时, 分 离 度 又 恢 复 了 正 常, 见 右 侧 的 色 谱 图 在 本 例 中, 问 题 就 出 在 溶 剂 瓶 中 坏 了 的 TFA 或 磷 酸 上 这 些 溶 剂 使 用 了 一 段 时 间 后, 已 产 生 了 变 化 或 被 污 染 在 下 一 章 中, 我 们 还 将 讨 论 更 多 使 用 缓 冲 液 或 流 动 相 改 性 剂 方 面 的 问 题 使 用 与 流 动 相 相 同 的 溶 剂 进 行 样 品 配 置 非 常 重 要 从 30 页 的 例 子 中 可 以 看 出, 当 进 样 溶 剂 比 流 动 相 强 时, 可 能 出 现 峰 变 宽 或 分 裂 70

柱 1 柱 2 柱 2 新 配 制 流 动 相 图 45. 流 动 相 的 变 化 可 能 对 结 果 有 显 著 影 响 流 动 相 混 合 有 时, 流 动 相 会 因 为 实 验 室 中 的 混 合 方 式 而 不 同 例 如, 如 果 要 配 制 甲 醇 / 水 = 50/50 的 混 合 溶 剂, 应 先 量 取 各 自 的 体 积, 分 别 置 于 洁 净 的 玻 璃 容 器 中, 然 后 再 将 其 混 合, 因 为 甲 醇 和 水 混 合 溶 剂 的 总 体 积 大 于 各 自 体 积 之 和 如 果 在 同 一 个 容 器 中 混 合, 混 合 溶 剂 的 总 体 积 就 会 不 同 因 此, 这 两 份 以 不 同 方 式 配 制 的 流 动 相 组 成 存 在 差 异 流 动 相 脱 气 流 动 相 脱 气 也 很 重 要 在 流 路 中, 溶 解 在 溶 剂 中 的 气 体 可 能 逸 出, 形 成 气 泡, 并 有 可 能 干 扰 泵 或 检 测 器 的 性 能 幸 运 的 是, 现 在 大 多 数 液 相 色 谱 系 统 都 配 备 在 线 脱 气 机, 但 如 果 脱 气 机 被 设 为 旁 路, 没 有 脱 气 机 或 不 能 正 常 工 作, 一 定 要 通 氦 气, 或 用 其 它 方 法 脱 气 用 流 动 相 改 性 剂 控 制 ph 流 动 相 ph 对 色 谱 分 离 的 影 响 有 多 种 方 式 根 据 您 所 分 析 的 化 合 物,pH 可 能 影 响 选 择 性 峰 形 和 保 留 如 果 是 非 极 性 较 强 或 中 性 的 化 合 物,pH 对 分 离 度 和 保 留 的 影 响 一 般 不 明 显 图 46 显 示 了 一 个 ph 是 如 何 影 响 分 离 度 的 简 单 实 例 左 侧, 是 一 个 分 别 在 ph 3 和 7 条 件 下 分 离 的 非 极 性 样 品 的 例 子 请 注 意, 两 张 色 谱 图 没 有 区 别 可 以 看 出, 中 间 的 极 性 化 合 物 在 C18 柱 上 保 留 较 弱 请 注 意,pH 对 两 个 化 合 物 的 保 留 时 间 和 峰 形 几 乎 没 有 影 响 71

如 果 是 可 离 子 化 的 化 合 物, 如 酸 或 碱, 可 以 看 出 保 留 因 子 和 选 择 性 随 ph 改 变 变 化 非 常 明 显 请 看 右 侧 中 苯 甲 酸 和 苯 酰 苯 胺 的 例 子, 保 留 因 子 随 ph 改 变 而 变 化 苯 酰 苯 胺 是 中 性 化 合 物, 保 留 几 乎 不 变, 而 苯 甲 酸 的 保 留 在 ph 从 3 变 为 7 时 变 化 非 常 明 显 在 ph 7 条 件 下, 大 大 高 于 苯 甲 酸 的 pk a, 苯 甲 酸 是 以 阴 离 子 的 形 式 存 在 这 种 偏 离 子 形 态 与 水 相 流 动 相 的 亲 和 性 较 好, 比 ph 3 时 从 色 谱 柱 中 洗 脱 更 快, 在 ph 3 条 件 下, 其 主 要 是 以 离 子 抑 制 形 式 存 在 非 极 性 萘 二 氢 苊 极 性 苯 甲 醇 硝 基 苯 可 离 子 化 苯 甲 酸 苯 酰 苯 胺 可 离 子 化 的 化 合 物 酸 和 碱 的 保 留 和 选 择 性 随 ph 变 化 而 发 生 明 显 改 变 图 46. ph 与 分 离 度 在 开 发 可 离 子 化 分 析 物 的 分 析 方 法 时, 重 要 的 是 要 清 楚 非 离 子 化 形 态 的 分 析 物 比 离 子 化 形 态 的 分 析 物 保 留 更 好 如 果 是 酸 性 分 析 物, 应 选 择 低 ph 缓 冲 液 流 动 相, 以 防 止 分 析 物 离 子 化 了 解 分 析 物 的 pk a, 才 能 够 有 效 地 选 择 流 动 相 ph 缓 冲 范 围 应 在 其 缓 冲 液 离 子 pk 值 的 +/-1 ph 单 位, 使 流 动 相 的 优 化 具 有 一 定 的 灵 活 性 例 如, 醋 酸 盐 的 pk a 为 4.8, 缓 冲 范 围 从 ph 3.8-5.8 甲 酸 盐 的 酸 性 较 大, 缓 冲 范 围 为 ph 2.8-4.8 如 果 您 的 酸 性 分 析 物 在 低 ph 下 不 能 发 生 离 子 化, 还 可 以 选 择 其 它 缓 冲 液 如 需 了 解 有 关 缓 冲 液 的 更 多 信 息, 可 参 见 137 页 上 的 图 表 对 于 碱 性 化 合 物 而 言, 在 高 ph 条 件 下 才 能 得 到 其 非 离 子 化 形 态, 但 这 对 色 谱 柱 不 利 但 许 多 碱 性 化 合 物 在 低 ph 条 件 下 的 保 留 就 已 经 足 够 了 因 此, 虽 然 非 离 子 化 形 态 能 得 到 更 高 的 保 留, 但 这 对 与 所 有 的 碱 性 化 合 物 并 不 是 实 用 和 必 要 的 * 一 般 而 言, 非 离 子 化 一 词 可 与 离 子 抑 制 一 词 互 换 72

另 一 个 影 响 酸 性 和 碱 性 化 合 物 保 留 的 问 题 是 在 中 性 ph 条 件 下 硅 胶 表 面 的 硅 醇 基 可 能 发 生 离 子 化 通 常, 这 些 硅 醇 基 都 发 生 去 质 子 化, 带 负 电 荷 从 而 使 带 正 电 荷 的 碱 性 离 子 保 留 更 强 这 会 导 致 离 子 交 换 相 互 作 用, 一 种 次 级 相 互 作 用 由 于 与 反 相 柱 之 间 发 生 了 相 互 作 用 而 不 是 分 配, 导 致 峰 展 宽 或 峰 拖 尾 这 种 情 况 在 低 ph 条 件 下 不 会 发 生, 这 也 是 反 相 色 谱 中 酸 性 流 动 相 更 适 合 分 离 离 子 型 化 合 物 的 另 一 个 原 因 缓 冲 液 选 择 要 点 : 成 功 的 HPLC 分 离 不 必 完 全 抑 制 离 子 化 通 常, 在 流 动 相 缓 冲 容 量 足 够 的 情 况 下,90% 的 抑 制 即 可 流 动 相 的 缓 冲 容 量 与 配 制 的 摩 尔 浓 度, 以 及 洗 脱 液 的 ph 与 缓 冲 离 子 pk 的 接 近 程 度 有 关 通 常 在 高 于 或 低 于 缓 冲 离 子 pk 1 个 ph 单 位 内, 可 以 起 到 缓 冲 效 果 常 用 缓 冲 液 pk 和 ph 范 围 参 见 参 考 资 料 一 章 第 110 页 上 的 图 表 色 谱 操 作 者 也 可 以 选 择 非 缓 冲 的 流 动 相 进 行 ph 调 节 这 对 于 酸 性 分 析 物 而 言 也 不 是 不 常 用 的, 用 单 一 的 酸 溶 液 进 行 色 谱 分 离, 酸 的 浓 度 应 足 以 使 ph 比 需 要 值 低 得 多 对 于 碱 性 物 质 的 分 离, 选 择 是 比 较 有 限 的 TEA( 三 乙 胺 ) 不 能 完 全 溶 于 水, 而 且 pk (11) 很 高, 氨 本 身 可 以 完 全 溶 于 水, 但 对 大 多 数 色 谱 柱 来 说 pk 值 过 高 UV 检 测 器 常 用 的 缓 冲 液 缓 冲 液 的 选 择 对 检 测 方 式 有 很 大 影 响 对 于 使 用 UV 检 测 器 的 色 谱 操 作 者 来 说, 在 目 标 波 长 下 缓 冲 液 应 完 全 透 光 缓 冲 液 的 UV 截 止 波 长 最 好 低 于 220 nm 许 多 常 用 的 缓 冲 液 都 符 合 UV 透 光 率 的 要 求, 尤 其 是 色 谱 级 或 以 上 的 缓 冲 液 例 如, 磷 酸 及 其 盐 类 具 有 良 好 的 低 UV 透 光 率, 和 乙 腈 一 起, 成 为 许 多 方 法 开 发 工 作 者 的 首 选 对 碱 的 分 离, 可 以 选 择 TEA- 磷 酸 盐 磷 酸 盐 在 有 机 相 比 例 高 的 溶 剂 中 溶 解 度 较 低, 针 对 这 一 缺 陷, 建 议 磷 酸 盐 缓 冲 液 与 有 机 溶 剂 混 合 时, 有 机 相 不 要 超 过 70% 所 幸 这 些 需 要 离 子 化 控 制 的 化 合 物 通 常 极 性 都 较 强, 不 需 要 用 高 比 例 有 机 溶 剂 对 其 进 行 洗 脱, 甚 至 在 其 离 子 抑 制 状 态 醋 酸 盐 正 如 甲 酸 盐 和 TEA 一 样, 在 240 nm 以 下 波 长 都 有 UV 背 景 吸 收, 很 难 在 210 nm 以 下 达 到 有 效 使 用 浓 度 由 于 方 法 开 发 工 作 者 都 依 赖 于 UV 检 测, 通 常 是 从 低 UV 波 长 开 始 获 取 2D 通 道 和 3D 光 谱 图, 所 以 乙 腈 / 磷 酸 盐 组 合 可 以 满 足 方 法 开 发 的 许 多 需 要 提 示 : 在 参 考 资 料 一 章, 第 137 页, 我 们 用 列 出 了 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 表 随 着 波 长 降 低, 逐 渐 接 近 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长, 您 将 会 发 现 检 测 方 面 的 问 题 73

LC/MS 的 考 虑 因 素 当 使 用 质 谱 检 测 器,LC/MS 离 子 源 时, 极 其 重 要 的 一 点 是 流 动 相 中 不 能 含 非 挥 发 性 物 质, 有 时 甚 至 样 品 中 也 不 能 有, 这 样 做 是 因 为 某 些 物 质 会 在 离 子 源 中 变 干, 可 以 防 止 流 动 相 雾 化 时 污 染 离 子 源 例 如, 溶 剂 前 沿 中 有 一 定 量 样 品 基 质 中 的 无 机 盐, 可 能 进 入 离 子 源 由 于 用 LC/UV 进 行 的 方 法 开 发 可 能 以 后 还 需 要 应 用 于 LC/MS, 所 以 许 多 工 作 者 不 再 使 用 磷 酸 磷 酸 盐 不 挥 发 的 反 离 子, 以 及 在 离 子 源 中 可 造 成 离 子 抑 制 的 挥 发 性 改 性 剂 (TFA 和 TEA 就 是 最 常 见 的 例 子 ) 因 此, 如 今 的 趋 势 是 使 用 甲 酸 盐 和 醋 酸 盐, 及 其 挥 发 性 铵 盐, 成 为 主 要 的 离 子 改 性 剂 虽 然 它 们 能 完 全 溶 解 于 有 机 溶 剂, 具 有 挥 发 性 和 高 色 谱 级 或 质 谱 级 纯 度, 但 却 不 能 在 低 波 长 下 使 用 光 学 检 测 器 (UV 或 二 极 管 阵 列 UV) 改 性 剂 必 须 加 入 水 相 和 有 机 相 中, 有 机 相 中 改 性 剂 的 浓 度 略 低 ( 通 常 为 水 相 中 浓 度 的 85%), 因 为 有 机 溶 剂 的 吸 收 性 质 不 同 另 外,ELSD( 蒸 发 光 散 射 检 测 器 ) 也 需 要 完 全 挥 发 的 流 动 相, 可 以 代 替 UV 和 / 或 RID( 示 差 折 光 检 测 器 ) 进 行 许 多 分 析, 不 再 使 用 常 用 的 前 -MS 改 性 剂 浓 缩 试 剂 1 分 子 量 密 度 2 大 致 强 度 摩 尔 浓 度 (M) 当 量 浓 度 (N) 配 制 1000 ml 3 溶 液 需 要 的 体 积 (ml) 1 M 1 N 醋 酸 (CH 3 COOH) 60.062 1.05 99.8% 17.4 17.4 57.5 57.5 甲 酸 (HCOOH) 46.026 1.13 90% 23.6 23.6 42.5 42.5 氢 氧 化 铵 (NH 4 OH) 35.046 0.90 56.5% 4 14.5 14.5 69 69 1. 基 于 原 子 量 表 (32 C = 12) 2. 代 表 值,w/w%. 3. 精 确 到 0.5 ml 4. 相 当 于 28.0% w/w NH 3 表 8. 用 于 LC/MS 的 流 动 相 改 性 剂 使 用 Agilent Captiva 增 强 型 注 射 式 过 滤 器 过 滤 样 品, 萃 取 物 含 量 低, 经 认 证, 可 用 于 液 相 质 谱 图 47. 注 射 式 过 滤 器 74

有 关 ph 的 几 点 注 意 事 项 : 离 子 抑 制 形 态 下 的 分 析 物 具 有 更 好 的 保 留 ( 例 如, 低 ph 下 的 酸 和 高 ph 下 的 碱 ) 在 中 性 和 较 高 ph 下, 硅 胶 上 的 硅 醇 基 发 生 离 子 化, 增 加 了 碱 性 分 析 物 的 保 留 ( 例 如, 可 能 发 生 离 子 交 换 相 互 作 用 ) 在 方 法 开 发 过 程 中, 可 选 择 流 动 相 ph 对 保 留 和 选 择 性 进 行 优 化 为 延 长 柱 寿 命, 避 免 使 用 极 端 ph 值 极 高 或 极 低 可 以 使 用 缓 冲 液 帮 助 调 节 ph 值 缓 冲 液 可 以 保 持 ph 不 变, 提 高 重 现 性 选 择 流 动 相 改 性 剂 时, 一 定 要 考 虑 检 测 器 与 UV 检 测 器 匹 配 良 好 的 改 性 剂 不 一 定 与 MS 检 测 器 兼 容 Eclipse Plus 可 在 宽 ph 范 围 (ph 2-9) 内 使 用 其 它 选 择 包 括, 高 ph(poroshell HPH,Extend-C18, 聚 合 物 型 固 定 相 ) 和 低 ph(stablebond 和 聚 合 物 型 固 定 相 ) 当 混 合 醋 酸 三 乙 胺 或 磷 酸 三 乙 胺 时, 应 先 加 入 磷 酸 盐 或 醋 酸 盐, 然 后 再 加 入 三 乙 胺, 因 为 纯 三 乙 胺 可 能 不 溶 于 水 混 合 缓 冲 液 的 良 好 习 惯 : 1. 使 用 正 常 工 作 的 ph 计 按 照 目 标 ph 值 校 正 ph 计 用 ph 计 对 ph 进 行 可 靠 的 测 量 非 常 重 要 2. 确 保 试 剂 尽 可 能 新 鲜 3. 先 把 固 体 溶 解 在 非 常 接 近 终 体 积 的 液 体 中 调 节 ph 到 目 标 值 后, 再 添 加 液 体 使 溶 液 达 到 目 标 体 积 4. ph 调 节 应 在 加 入 有 机 溶 剂 之 前 的 水 相 中 进 行, 加 入 有 机 溶 剂 后 再 测 ph 不 可 靠 5. 缓 冲 液 配 制 完 成 后, 在 HPLC 系 统 上 使 用 之 前 要 进 行 过 滤, 去 除 水 或 盐 中 可 能 存 在 的 颗 粒 大 多 数 HPLC 应 用 都 使 用 0.45 µm 滤 膜,UHPLC 则 使 用 0.22 µm 滤 膜 提 示 : 某 些 盐, 如 醋 酸 铵 和 甲 酸 铵, 吸 湿 性 较 强, 如 果 将 其 长 期 放 在 试 剂 架 上, 开 瓶 并 使 用 较 长 时 间 后, 将 吸 收 水 分 所 以, 在 方 法 开 始 时 最 好 实 验 确 定 这 些 盐 的 不 同 摩 尔 浓 度, 确 保 方 法 对 这 类 不 可 避 免 的 波 动 具 有 足 够 的 耐 受 性 75

流 动 相 改 性 剂 问 题 排 查 可 尝 试 改 变 流 动 相 ph 以 确 定 峰 形 或 保 留 的 问 题 是 否 是 次 级 相 互 作 用 造 成 的 添 加 三 氟 醋 酸 (TFA) 会 有 帮 助, 但 请 记 住, 混 合 溶 剂 中 多 加 任 何 成 分 都 可 能 增 加 出 错 机 率 在 添 加 前 应 先 尝 试 使 用 低 ph 使 用 ph 改 性 流 动 相 出 发 点 的 关 键 是 保 持 简 单 大 家 喜 欢 用 乙 腈 的 原 因 之 一 是 乙 腈 具 有 低 UV 截 止 波 长 190 nm 而 甲 醇 是 205 nm,thf 是 212 nm 实 际 上 THF 在 215 nm 处 已 具 有 较 强 的 吸 收, 很 难 在 梯 度 中 使 用 ( 注 意, 不 含 氧 的 新 鲜 THF 很 好, 但 很 难 保 持 开 瓶 一 段 UV 吸 收 极 易 升 高 ) 根 据 您 采 用 的 梯 度 范 围,THF 的 吸 收 波 动 可 能 高 达 2 AU 但 在 较 高 的 波 长 下, 如 254 nm, 将 不 会 发 生 这 一 问 题 认 真 考 虑 溶 剂 的 选 择 和 改 性 剂 非 常 重 要 1% 醋 酸 的 UV 截 止 波 长 是 230 nm,0.1% TFA 是 205 nm 更 多 信 息 可 参 见 第 5 页 的 色 谱 基 本 概 念 过 去, 许 多 色 谱 操 作 者 都 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 或 稀 磷 酸 无 论 在 酸 性 还 是 在 中 性 ph 条 件 下, 都 有 非 常 好 的 UV 透 光 率 但 是 磷 酸 盐 可 能 发 生 溶 解 度 问 题, 而 且 是 非 挥 发 性 的, 因 此 并 不 适 合 在 质 谱 中 使 用 使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 时 应 避 免 浓 度 超 过 25-50 mm, 特 别 是 在 有 机 相 比 例 较 高 的 流 动 相 中, 否 则 可 能 发 生 沉 淀 在 流 动 相 A 和 B 中 最 好 含 有 同 样 浓 度 的 缓 冲 液 或 改 性 剂 换 言 之, 在 梯 度 洗 脱 过 程 中, 只 有 有 机 相 溶 剂 浓 度 发 生 改 变 才 能 得 到 最 好 的 色 谱 结 果 当 然, 也 有 例 外 有 时 您 可 能 不 需 要 使 用 缓 冲 液, 磷 酸 就 足 够 了 问 题 排 查 实 例 : 基 线 漂 移 对 某 些 流 动 相 来 说, 改 性 剂 在 水 中 的 吸 收 与 在 乙 腈 中 不 同, 当 进 行 梯 度 洗 脱 时 可 能 出 现 漂 移 ( 图 48), TFA 就 是 这 种 情 况 使 用 TFA 时, 可 尝 试 在 溶 剂 A 中 使 用 0.1% TFA, 而 在 溶 剂 B 中 使 用 0.09% 左 右 的 TFA 在 图 49 中, 流 动 相 A 和 B 中 都 含 有 0.1% TFA 时, 用 215 nm 检 测, 进 行 梯 度 洗 脱 时 基 线 向 上 漂 移 如 果 降 低 B 中 的 TFA 浓 度, 如 0.09%, 可 以 使 基 线 平 稳, 从 而 解 决 了 这 一 问 题 使 用 较 高 波 长, 如 254 nm, 也 可 以 解 决 这 个 问 题, 但 基 于 检 测 能 力 方 面 的 原 因, 有 时 不 能 采 用 76

215-254 nm B TFA 图 48. TFA 对 基 线 的 影 响 峰 归 属 1. 非 那 西 汀 2. 托 美 汀 3. 酮 洛 芬 4. 非 诺 洛 芬 5. 异 丙 酚 6. 保 泰 松 7. 甲 灭 酸 8. 氟 灭 酸 分 析 条 件 色 谱 柱 : Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm 溶 剂 A: 含 0.1% TFA 的 水 溶 液 溶 剂 B: 含 0.1% TFA 的 乙 腈 温 度 : 35 C 梯 度 : B 在 30 分 钟 内 由 5% 升 至 100% 流 速 : 2.0 ml/min 这 张 色 谱 图 ( 图 49) 显 示 的 是 我 们 期 望 的 状 态 良 好 平 稳 的 基 线 注 意, 这 是 与 图 48 中 实 例 不 同 的 分 析 峰 归 属 1. 亮 氨 酸 脑 啡 肽 2. 血 管 紧 张 素 3. 核 糖 核 酸 酶 A 4. 胰 岛 素 5. 细 胞 色 素 C 6. 溶 菌 酶 7. 肌 红 蛋 白 8. 碳 酸 酐 酶 图 49. 具 有 期 望 的 平 稳 基 线 的 梯 度 分 离 分 析 条 件 : 色 谱 柱 : ZORBAX 300SB-C3 4.6 x 150 mm, 5 µm 梯 度 : B 在 19 分 钟 内 由 15% 升 至 35% 流 动 相 : A:95:5 水 : 含 0.1% TFA 的 乙 腈 B:5:95 水 : 含 0.085% 的 乙 腈 TFA 这 里 显 示 的 是 对 不 同 分 子 量 的 多 肽 / 蛋 白 进 行 的 典 型 梯 度 洗 脱 我 们 在 流 动 相 A 中 加 入 了 0.1% TFA,B 中 加 入 了 0.085% 结 果 得 到 了 平 稳 的 基 线, 不 仅 结 果 更 好, 而 且 有 助 于 积 分 在 基 线 漂 移 可 以 忽 略 不 计 的 情 况 下, 如 果 色 谱 峰 大 小 合 适, 就 可 以 进 行 精 确 积 分 了 77

问 题 排 查 实 例 : 高 ph 造 成 的 峰 展 宽 和 峰 分 裂 在 图 50 中, 可 以 看 到 用 ZORBAX StableBond 柱 ( 不 是 为 在 高 ph 下 使 用 而 设 计 的 ) 得 到 的 两 个 截 然 不 同 的 结 果 色 谱 操 作 者 配 制 了 含 0.2% TEA 的 流 动 相, 但 却 忘 记 了 将 ph 调 低, 因 此 其 流 动 相 实 际 上 ph 高 达 11 他 开 始 过 夜 连 续 运 行 直 到 第 二 天, 进 样 30 次 后 得 到 右 侧 的 色 谱 图 ph 11 使 硅 胶 发 生 溶 解, 并 形 成 死 体 积, 从 而 造 成 灾 难 性 的 峰 展 宽 只 能 换 新 柱 了 分 析 条 件 流 动 相 : 50% 乙 腈 :50% H 2 O 含 0.2% TEA (~ph 11) 初 始 30 次 进 样 后 图 50. 在 高 ph 下 使 用 硅 胶 柱 的 后 果 因 此, 由 于 ph 对 保 留 和 柱 均 一 性 都 有 很 大 影 响, 应 该 将 其 作 为 方 法 开 发 的 重 要 参 数 我 们 建 议 使 用 缓 冲 液, 以 控 制 ph 值 并 使 其 保 持 稳 定 问 题 排 查 实 例 : 流 动 相 改 性 剂 和 选 择 性 选 择 流 动 相 改 性 剂 或 缓 冲 液 时, 要 确 保 其 处 于 缓 冲 范 围 内 应 查 看 缓 冲 液 的 有 效 范 围, 然 后 应 用 这 一 范 围 通 常, 比 缓 冲 液 的 pk 值 高 或 低 1 个 ph 单 位 典 型 缓 冲 范 围 见 参 考 资 料 后 的 图 表 让 我 们 来 看 一 些 低 ph 下 方 法 开 发 的 实 例 ( 图 51) 该 例 使 用 ZORBAX Eclipse Plus C18 柱, 在 低 ph 条 件 下 进 行 分 离 我 们 可 以 使 用 缓 冲 液 也 可 以 用 弱 酸 溶 液 作 为 流 动 相, 同 时 我 们 可 以 通 过 调 节 有 机 相 的 百 分 比 调 节 色 谱 峰 保 留 中 性 ph (~4-7) 具 有 更 好 的 选 择 性, 可 能 与 您 的 样 品 兼 容 性 更 强 中 性 ph 条 件 下 的 方 法 开 发 过 程 与 低 ph 相 同 Eclipse Plus 柱 在 中 性 ph 下 具 有 卓 越 性 能 如 果 需 要 改 善 选 择 性 的 话 也 可 以 使 用 其 他 键 合 相 Eclipse Plus 柱 是 方 法 开 发 的 理 想 选 择 它 拥 有 ph 2-9 这 一 极 宽 的 ph 范 围, 适 用 于 在 低 和 中 性 ph 范 围 内 进 行 方 法 开 发 可 提 供 良 好 的 峰 形 和 柱 效 78

峰 归 属 1. 扑 热 息 痛 2. 咖 啡 因 3. 乙 酰 水 杨 酸 4. 未 知 分 析 条 件 色 谱 柱 : Eclipse Plus C8 4.6 x 50 mm, 5 µm, PN 959946-906 梯 度 : 在 3 分 钟 内 由 10% 升 至 60% ph 2.7 A:0.1% 甲 酸 B:0.1% FA 的 乙 腈 ph 7.0 A:20 mm 磷 酸 钠, 用 磷 酸 调 至 ph 7.0 B: 乙 腈 样 品 : 非 专 利 Excedrin 片 图 51. ph 2 和 ph 7 条 件 下 的 选 择 性 具 有 很 大 差 异 如 果 您 在 中 性 ph 范 围 内 仍 不 能 得 到 满 意 的 分 离 度, 还 可 以 考 虑 尝 试 更 高 ph 这 是 因 为 有 时 在 低 ph 和 中 性 ph 条 件 下 的 分 离 效 果 不 佳, 不 能 得 到 您 希 望 的 保 留 在 高 ph 条 件 下 对 碱 性 化 合 物 进 行 离 子 抑 制 形 态 下 的 分 析, 可 以 增 加 其 保 留 还 可 以 提 高 选 择 性 ZORBAX Extend-C18 是 一 款 双 配 位 色 谱 柱, 能 够 耐 受 严 苛 的 高 流 动 相 ph 条 件,Poroshell HPH-C18 和 HPH-C8 化 学 键 合 相 是 使 用 专 利 工 艺 对 Poroshell 120 填 料 颗 粒 进 行 化 学 改 性 而 制 得, 提 高 了 它 们 的 ph 稳 定 性 ZORBAX 和 Poroshell 色 谱 柱 均 可 用 于 ph 高 达 11 的 条 件,Poroshell HPH 还 具 有 出 色 的 使 用 寿 命 和 在 低 ph 下 进 行 方 法 开 发 一 样, 可 以 调 节 有 机 改 性 剂 浓 度 对 分 离 度 进 行 优 化 下 面 我 们 将 更 为 深 入 地 讨 论 我 们 提 出 的 反 相 色 谱 方 法 开 发 流 程 79

低 ph < 3 中 性 ph 7 高 ph > 9 A 区 B 区 C 区 方 法 开 发 从 低 ph 开 始, 此 时 反 相 HPLC 柱 上 的 硅 醇 基 发 生 质 子 化, 通 过 消 除 硅 醇 基 / 碱 的 相 互 作 用 最 大 限 度 地 减 少 了 峰 拖 尾 现 象 在 低 ph 条 件 下, 碱 性 化 合 物 带 正 电 荷, 其 保 留 可 能 减 弱 在 至 少 高 于 或 低 于 其 pk a 1 个 ph 单 位 的 条 件 下 进 行 方 法 开 发, 这 样 可 以 把 ph 略 有 变 化 时 对 保 留 的 影 响 降 至 最 低 在 ph 4 到 5 以 上 时, 部 分 硅 胶 表 面 SiOH 基 团 变 为 SiO ; 导 致 峰 拖 尾 的 相 互 作 用 可 能 存 在 碱 性 化 合 物 可 能 以 其 游 离 碱 的 形 态 存 在 可 能 增 加 碱 性 化 合 物 的 保 留 和 分 离 度 酸 性 化 合 物 发 生 质 子 化, 保 留 增 加 选 择 设 计 良 好 的 封 端 色 谱 柱, 用 TEA( 三 乙 胺 ) 等 添 加 剂 或 使 用 极 性 - 交 联 键 合 相, 可 最 大 限 度 地 减 少 相 互 作 用 在 这 一 区 域 保 留 基 本 不 变, 可 开 发 耐 用 的 方 法 ph 略 有 变 化 时 保 留 时 间 通 常 很 稳 定, 可 以 开 发 耐 用 的 方 法 挥 发 性 流 动 相 添 加 剂, 如 甲 酸 或 TFA, 常 用 于 ph 条 件 的 LC/MS 分 析 通 过 采 用 创 新 的 键 合 化 学 坚 实 封 端, 并 使 用 酸 性 更 低 的 高 纯 度 硅 胶, 降 低 了 金 属 含 量 (Rx-SIL), 避 免 了 硅 胶 的 断 裂 通 过 采 用 创 新 的 双 配 位 柱 化 学 坚 实 封 端 使 用 Rx-SIL, 并 优 化 流 动 相, 避 免 了 硅 胶 的 断 裂 氢 氧 化 铵 是 高 ph 下 良 好 的 挥 发 性 流 动 相 改 性 剂 表 9. 使 用 硅 胶 柱 在 不 同 ph 条 件 下 的 方 法 开 发 优 化 反 相 色 谱 条 件 在 确 定 了 色 谱 柱 规 格 合 适 的 固 定 相 柱 填 料 流 动 相 溶 剂 和 改 性 剂 后, 即 可 开 始 优 化 方 法 方 法 的 优 化 是 根 据 最 终 目 标 决 定 的 如 果 要 开 发 质 量 控 制 方 法, 您 可 能 会 需 要 像 等 度 分 离 这 种 可 变 因 素 较 少 的 方 法 如 果 目 标 是 得 到 最 高 分 离 度, 节 省 分 析 时 间 并 不 是 首 要 问 题, 可 以 选 择 长 柱 使 所 有 组 分 都 得 到 最 大 分 离 度 如 果 分 离 速 度 很 重 要, 则 应 使 用 短 柱 和 高 流 速 对 于 含 许 多 保 留 不 同 的 目 标 化 合 物 的 复 杂 样 品, 用 等 度 分 离 可 能 不 能 解 决 问 题, 应 开 发 并 优 化 梯 度 方 法 下 面 我 们 要 讨 论 两 种 方 法 的 条 件 优 化 : 1. 等 度 ( 流 动 相 组 成 不 变 ) 2. 梯 度 ( 流 动 相 强 度 随 时 间 变 化 ) 80

在 我 们 的 讨 论 中, 主 要 涉 及 二 元 溶 剂 系 统, 但 同 样 的 方 法 也 可 以 用 于 三 元 或 四 元 流 动 相 系 统 中 我 们 按 约 定 俗 成 将 水 相 溶 剂 和 反 相 色 谱 中 较 弱 的 溶 剂 称 为 流 动 相 A, B 溶 剂 是 有 相 组 成 较 高 和 较 强 的 溶 剂 在 反 相 色 谱 模 式 中, 当 增 加 B 的 百 分 比 时, 通 常 保 留 将 减 少 请 注 意, 在 还 没 有 开 发 出 样 品 的 实 际 分 析 方 法 前, 大 部 分 人 开 发 HPLC 方 法 都 是 采 用 反 复 实 验 的 方 法, 即, 尝 试 各 种 不 同 流 动 相 条 件, 以 找 出 最 佳 条 件 等 度 优 化 等 度 优 化 的 一 般 方 法 是 不 断 改 变 流 动 相 强 度 (% B), 直 到 获 得 适 当 的 保 留 范 围 这 种 方 法 有 时 也 称 为 溶 剂 筛 查 对 于 简 单 的 分 离,k 值 应 在 1 到 10 之 间 如 果 k 值 太 低 ( 比 如,< 1), 早 洗 脱 的 色 谱 峰 可 能 不 发 生 保 留 峰 或 融 入 基 质 组 分, 因 此 对 其 进 行 定 量 将 非 常 困 难 而 且 不 可 重 复 另 外, 低 k 值 峰 受 柱 外 效 应 影 响 很 大, 可 能 会 使 峰 展 宽 如 果 k 值 太 大 ( 比 如,> 10), 分 析 时 间 将 变 得 过 长, 检 测 限 会 因 峰 展 宽 而 提 高 对 于 反 相 色 谱 中 的 等 度 方 法 开 发 是 从 流 动 相 有 机 改 性 剂 最 高 比 例 开 始, 然 后 逐 渐 降 低 在 降 低 流 动 相 强 度 之 前, 先 要 确 定 所 有 组 分 都 已 从 柱 中 洗 出 如 果 组 分 保 留 在 色 谱 柱 中, 以 后 可 能 在 B 相 比 例 较 低 的 流 动 相 中 洗 脱, 成 为 无 法 解 释 的 鬼 峰 通 常, 流 动 相 以 +/-10%( 如,90% B 80% B 70% B 等 ) 或 +/-20% 的 幅 度 改 变 利 用 一 些 现 代 软 件 ( 如,ChromSword 的 ChromSword,ACD 的 AutoChrom), 显 示 保 留 变 化 曲 线, 系 统 进 行 自 动 调 节, 更 快 得 到 优 化 条 件 当 接 近 最 佳 等 度 条 件 时, 进 行 手 动 调 节, 幅 度 应 减 为 5% 或 3% 请 注 意, 如 果 流 动 相 A 中 含 高 浓 度 缓 冲 液 ( 比 如, 大 于 25 mm), 则 不 能 使 用 100% 的 B, 因 为 当 两 种 溶 剂 系 统 开 始 混 合, 随 着 B 相 百 分 比 的 减 少, 可 能 发 生 沉 淀 一 旦 建 立 优 化 条 件, 如 果 目 标 还 没 有 得 到 完 全 分 离, 则 需 继 续 提 高 选 择 性 (α) 如 需 分 离 两 个 相 邻 的 色 谱 峰 会 涉 及 到 许 多 实 验 参 数 的 调 节 温 度 可 以 作 为 一 个 变 量 大 多 数 现 代 仪 器 都 具 有 某 种 类 型 的 柱 温 控 制 器, 大 部 分 反 相 柱 可 以 承 受 高 达 60 C 的 温 度, 有 些 甚 至 更 高 一 般 来 说, 升 高 温 度 可 以 缩 短 所 有 峰 的 保 留 时 间, 但 对 有 些 峰 的 影 响 可 能 与 对 其 它 峰 不 同, 从 而 导 致 选 择 性 发 生 变 化 其 它 用 于 改 变 选 择 性 的 变 量 如 下 : 1. ph( 对 于 可 离 子 化 的 化 合 物 ) 2. 缓 冲 液 ( 离 子 ) 强 度 3. 缓 冲 液 类 型 ( 比 如, 磷 酸 盐 醋 酸 盐 或 甲 酸 盐, 取 决 于 需 要 的 ph 范 围 ) 4. 流 动 相 有 机 改 性 剂 ( 比 如, 从 乙 腈 变 为 甲 醇 或 两 者 的 混 合 液 ; 可 使 用 三 元 和 四 元 流 动 相 混 合 溶 剂 ) 5. 流 速 ( 一 般 而 言, 由 于 提 高 了 柱 效, 较 低 的 流 速 可 能 对 分 离 略 有 改 善, 但 也 有 例 外 见 下 面 的 提 示 ) 6. 离 子 对 试 剂 浓 度 ( 如 果 使 用 离 子 对 RPC) 81

如 果 调 节 这 些 参 数 还 不 能 改 善 分 离, 那 么 最 好 的 解 决 办 法 就 是 改 变 色 谱 柱 或 固 定 相 更 长 的 色 谱 柱 具 有 更 多 塔 板 数, 因 此 有 助 于 分 离, 但 切 记, 分 离 度 只 能 增 加 长 度 的 平 方 根 柱 长 加 倍 使 分 析 时 间 和 溶 剂 消 耗 加 倍, 而 灵 敏 度 降 低, 但 只 能 使 分 离 度 提 高 约 40% 改 用 较 小 粒 度 色 谱 柱 也 能 增 加 塔 板 数, 但 柱 压 上 升 1/d 2 p 使 用 新 的 固 定 相 ( 如 C18 换 成 苯 基 柱 ) 需 要 进 行 一 套 新 的 溶 剂 筛 选 实 验, 耗 费 更 多 时 间, 但 可 能 得 到 最 佳 的 分 离 结 果 但 需 要 额 外 购 买 具 有 不 同 固 定 相 的 反 相 柱 随 着 粒 径 变 小, 最 佳 流 速 升 高, 用 亚 2 µm 色 谱 柱 时, 流 速 可 以 比 用 常 规 柱 优 化 分 离 时 使 用 的 流 速 更 高 让 我 们 来 看 一 个 优 化 5 组 分 简 单 样 品 最 佳 等 度 分 离 条 件 的 筛 选 实 验 图 52 显 示 了 三 张 以 10% 幅 度 递 增 的 色 谱 图 分 别 为 40% 30% 和 20% 有 机 相 高 百 分 比 有 机 相 洗 脱 过 快 速, 在 死 体 积 内 洗 脱 ( 未 显 示 ), 而 有 机 相 低 于 20% 则 太 费 时 ( 未 显 示 ) 30% 有 机 相 时,5 个 组 分 分 离 良 好, 且 分 析 可 迅 速 完 成 如 果 需 要, 可 在 30% 左 右 进 行 1-2% 有 机 相 比 例 的 微 调, 以 进 一 步 优 化 分 离 这 些 步 骤 未 在 这 里 显 示 请 注 意 进 行 这 些 实 验 时, 所 有 其 它 条 件 不 变, 仅 改 变 有 机 相 百 分 比 进 行 该 等 度 方 法 优 化 即 可 使 用 Eclipse Plus C18 4.6 x 50 mm,1.8 µm 柱, 所 有 实 验 均 可 快 速 进 行, 方 法 开 发 筛 选 过 程 高 效 率 完 成 分 离 度 良 好 分 析 速 度 快 不 浪 费 时 间 峰 归 属 1. 吲 哚 洛 尔 2. Diisopyridamide 3. 心 得 安 4. 双 嘧 达 莫 5. 地 尔 硫 卓 分 析 条 件 色 谱 柱 : ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm,1.8 µm 流 动 相 : A:25 mm NaH 2 PO 4,pH 3.0 B: 乙 腈 流 速 : 2.0 ml/min 温 度 : 30 C 检 测 : UV 240 nm 图 52. 通 过 调 节 有 机 改 性 剂 比 例 对 等 度 方 法 进 行 优 化 的 实 例 82

为 了 进 一 步 说 明 优 化 得 到 更 高 分 离 度 的 方 法, 图 53 显 示 了 使 用 不 同 固 定 相 的 对 比 每 一 根 色 谱 柱 上 都 使 用 相 同 的 最 佳 流 动 相, 只 是 键 合 相 不 同 这 个 例 子 中, 在 传 统 的 C18 柱 上 没 有 得 到 最 佳 分 离 度, 而 改 变 固 定 相 则 达 到 了 目 的 这 种 方 法 有 时 称 为 固 定 相 筛 选, 可 以 用 一 种 或 更 多 不 同 固 定 相 完 成 许 多 实 验 室 都 用 液 相 色 谱 仪 和 LC/MS 系 统 通 过 这 种 方 式 进 行 无 人 值 守 的 方 法 开 发, 流 动 相 不 变, 通 过 色 谱 柱 选 择 阀, 以 等 度 或 梯 度 洗 脱 开 发 或 优 化 不 同 固 定 相 的 分 离 峰 归 属 1. 雌 三 醇 2. 炔 雌 醇 3. 乙 炔 基 雌 二 醇 4. 己 烯 雌 酚 (DES) 5. 己 二 烯 雌 酚 分 析 条 件 流 动 相 : 流 速 : 监 测 器 : 雌 三 醇 乙 炔 基 雌 二 醇 60% MeOH,40% 水 1 ml/min, DAD = 220 nm 3.5 µm 30% 图 53. 等 梯 度 方 法 的 选 择 性 筛 选 83

梯 度 优 化 对 于 含 各 种 组 分 的 样 品 混 合 物 来 说, 选 择 单 一 流 动 相 组 分 可 能 得 不 到 满 意 的 解 决 方 案 ( 比 如, 一 般 洗 脱 问 题 ) 例 如, 某 些 样 品 组 分, 如 强 极 性 分 析 物, 可 能 很 快 从 反 相 柱 上 被 洗 脱 下 来, 而 疏 水 性 组 分 可 能 在 疏 水 性 的 C8 或 C18 上 吸 附 非 常 强, 洗 脱 不 下 来 对 这 一 问 题 的 解 决 方 案 是 随 时 间 改 变 流 动 相 组 成 ( 梯 度 洗 脱 ) 在 绝 大 多 数 例 子 中, 初 始 流 动 相 非 常 弱 ( 比 如, 含 水 量 高 ), 随 时 间 的 推 移, 有 机 溶 剂 的 百 分 比 通 常 是 以 线 性 形 式 增 加 ( 图 54) 增 加 溶 剂 强 度 = 增 加 流 动 相 中 有 机 相 百 分 比 线 性 溶 剂 强 度 梯 度 = 每 分 钟 的 变 化 百 分 比 是 恒 定 的 图 54. 梯 度 洗 脱 : 在 本 例 中, 乙 腈 每 十 分 钟 升 高 20% 两 种 情 况 下 要 使 用 梯 度 洗 脱 的 方 法 开 发 过 程 一 种 是 用 梯 度 预 测 反 相 分 离 的 最 佳 起 始 等 度 条 件 大 多 数 方 法 开 发 软 件 ( 如,DryLab ChromSword AutoChrom) 都 具 有 这 项 功 能, 最 少 进 行 两 次 梯 度 分 离, 然 后 预 测 出 最 佳 等 度 条 件 接 下 来 就 可 以 用 这 些 条 件 进 一 步 进 行 等 度 分 离 优 化 了 第 二 种 情 况 是 开 发 梯 度 方 法, 并 使 用 了 宽 范 围 的 快 速 梯 度 ( 比 如,10 分 钟 内 B 由 5% 变 到 95%), 确 定 目 标 化 合 物 的 最 佳 梯 度 范 围 实 际 上, 某 些 软 件 系 统 可 以 通 过 色 谱 数 据 系 统 / 控 制 器 之 间 的 相 互 作 用 来 设 置 最 佳 梯 度, 对 分 离 进 行 优 化 但 是, 手 动 操 作 也 可 以 完 成 同 样 的 工 作, 找 到 目 标 峰 洗 脱 的 流 动 相 比 例, 然 后 通 过 下 一 次 梯 度, 调 节 k*( 梯 度 等 于 k) 范 围, 让 梯 度 分 离 在 合 理 的 时 间 内 完 成 然 后, 与 等 度 优 化 一 样, 当 分 离 时 间 合 理 后 进 行 选 择 性 的 确 定 84

我们以一种相对复杂的含 10 种磺胺药物的混合物为例 简述优化过程 见图 55 57 首先 运行一个相对 快速的宽范围梯度 如图 55 所示 这里我们运行的梯度是 B 在 20 分钟内从 8% 变到 90% 使用 250 mm 色谱柱 从这张初始色谱图上 我们可以得到以下信息 首先 12.5 分钟后再无色谱峰 说明 90% B 太强 还可以看出 峰 5 和峰 6 峰 7 和峰 8 这两对色谱峰没有分开 峰归属 1. 磺胺哒嗪 2. 磺胺噻唑 3. 磺胺吡啶 12.5 分钟后无色谱峰洗脱 4. 磺胺甲基嘧啶 5. 磺胺间二甲嘧啶 6. 磺胺二甲恶唑 7. 磺胺甲氧哒嗪 8. 磺胺氯哒嗪 9. 磺胺甲恶唑 10. 磺胺多辛 图 55. 磺胺药物分析的初始梯度 分析条件 色谱柱 4.6 x 250 mm Eclipse Plus 流速 1 ml/min C18, 5 µm 监测器 254 nm 进样 5 µl 流动相 A 0.1% 甲酸的水溶液 B 0.1% 甲酸的甲醇溶液 下一个步骤是缩小有机相范围 延长梯度时间 以增加梯度保留 k* 得到的优化分离结果见图 56 我们 还采取了几个中间步骤 未显示 优化该梯度 剩下的事情就是调节梯度时间和 B 相百分比 直到获得最佳 分离 此时 10 种化合物都得到了基线分离 但分析时间是 30 分钟 考虑到柱规格和流速 我们可以对梯度方法 进一步优化 切记 调节柱规格和流速时 需要对梯度进行相应调节 我们已在第一章 即 10 页讨论过 两种最难分离的组分 峰归属 峰归属请参见图 55 分析条件 色谱柱 4.6 x 250 mm Eclipse Plus 流速 1 ml/min C18, 5 µm 监测器 254 nm 进样 5 µl 流动相 A 0.1% 甲酸的水溶液 B 0.1% 甲酸的甲醇溶液 图 56. 对 250 mm 柱的梯度优化 85

峰 归 属 峰 归 属 请 参 见 图 55 图 57. 从 250 mm 到 100 mm Poroshell 120 柱 所 进 行 的 进 样 体 积 和 梯 度 调 节 分 析 条 件 色 谱 柱 : 4.6 x 100 mm Poroshell 120 EC-C18, 2.7 µm 流 速 : 1 ml/min 监 测 器 : 254 nm 进 样 : 2 µl 流 动 相 : A:0.1% 甲 酸 的 水 溶 液 B:0.1% 甲 酸 的 甲 醇 溶 液 本 例 中, 我 们 使 用 的 是 Poroshell 120 柱, 柱 长 100 mm, 分 析 时 间 缩 短 到 十 几 分 钟, 仍 有 良 好 的 分 离 度 如 果 进 一 步 优 化 流 速, 分 析 时 间 还 可 以 再 缩 短 用 于 反 相 色 谱 的 聚 合 物 色 谱 柱 聚 合 物 柱 在 分 析 复 杂 样 品 时 具 有 明 显 优 势 其 化 学 稳 定 性 高 并 能 在 极 端 ph 保 持 稳 定 这 类 色 谱 柱 由 于 其 聚 合 物 特 性, 没 有 反 应 位 点, 在 极 端 ph 环 境 下 固 定 相 不 会 发 生 溶 解 用 聚 合 物 柱 进 行 反 相 梯 度 分 离 的 一 个 良 好 起 点 是 使 用 乙 腈 / 水 + 0.1% TFA 流 动 相 筛 选 梯 度, 比 如, 乙 腈 从 5% 升 至 95% 然 后 再 根 据 分 析 物 的 洗 脱 情 况 对 梯 度 进 行 调 节, 改 善 所 有 组 分 的 分 离 度 聚 合 物 填 料 可 以 使 用 酸 性 中 性 和 碱 性 洗 脱 液 例 如, 可 以 用 乙 腈 洗 脱 剂 在 四 种 不 同 ph 条 件 下 筛 选 合 成 多 肽 的 分 离 条 件, 包 括 0.1% TFA 20 mm 醋 酸 铵 (ph 5.5) 20 mm 醋 酸 铵 (ph 9.5) 和 20 mm 氢 氧 化 铵 (ph 10.5) 对 于 更 复 杂 的 样 品, 由 于 溶 解 度 不 够 或 共 洗 脱 等 问 题, 可 能 很 难 得 到 希 望 的 纯 度 或 回 收 率, 或 者 都 无 法 得 到 多 肽 上 的 净 电 荷 取 决 于 缓 冲 液 的 ph, 在 其 等 电 点 (pi) 时 净 电 荷 为 零 因 此, 在 反 相 HPLC 中, 改 变 ph 可 改 变 样 品 及 相 关 组 分 的 净 电 荷, 从 而 改 变 分 离 的 保 留 和 选 择 性 86

反 相 色 谱 的 等 度 方 法 开 发 上 手 步 骤 指 南 方 法 开 发 过 程 最 常 用 的 是 上 手 法 图 58 列 出 了 用 这 一 方 法 进 行 方 法 开 发 的 流 程 在 本 方 案 中, 可 遵 循 首 选 的 方 法 开 发 流 程, 选 择 合 适 的 色 谱 柱 或 键 合 相 通 过 调 节 ph 或 尝 试 不 同 的 有 机 改 性 剂 对 流 动 相 进 行 改 变 也 可 以 使 用 方 法 开 发 软 件, 进 行 一 些 实 验 性 操 作, 对 最 佳 方 法 进 行 预 测 可 以 选 择 用 手 动 或 自 动 方 式 对 多 种 色 谱 柱 或 流 动 相 进 行 评 价 在 本 方 案 中, 可 以 将 几 根 不 同 色 谱 柱 与 不 同 流 动 相 结 合 在 一 起, 尝 试 不 同 组 合 提 示 :ZORBAX Eclipse Plus 柱 具 有 良 好 的 耐 用 性 和 灵 活 性, 可 在 宽 ph 范 围 内 使 用 步 骤 1 步 骤 2 步 骤 3 步 骤 4 从 低 ph 开 始 选 择 Eclipse Plus C18 低 ph 调 节 乙 腈 百 分 比, 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 有 机 相 百 分 比 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 流 动 相 改 性 剂 调 节 有 机 相 百 分 比, 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 键 合 相 Eclipse Plus C8, SB-C18, -CN, -Phenyl, 其 它 反 相 键 合 相 首 先 选 择 高 质 量 的 C18 或 C8 键 合 相, 以 使 一 般 酸 性 碱 性 和 中 性 样 品 得 到 良 好 峰 形 保 留 和 分 离 度 请 注 意 短 柱 能 最 大 限 度 地 缩 短 开 发 时 间,Poroshell 120 EC-C18 等 新 技 术 可 以 通 过 降 低 操 作 压 力 和 改 善 峰 形 提 高 柱 效, 改 善 结 果 从 可 用 于 多 种 样 品 的 可 靠 流 动 相 改 性 剂 开 始, 如 在 水 相 部 分 选 择 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 3) TFA 或 甲 酸, 有 机 改 性 剂 选 择 乙 腈 或 甲 醇 要 使 所 有 峰 都 有 足 够 的 保 留,Rs > 2.0 第 一 个 峰 的 保 留 至 少 应 满 足 k = 2( 更 多 信 息 请 参 见 第 7-8 页 ) 优 化 流 动 相 的 有 机 组 分, 以 改 变 选 择 性 如 果 需 要, 可 选 择 另 一 种 固 定 相, 对 方 法 进 行 全 面 优 化 ph 1-2 条 件 下 可 选 择 ZORBAX StableBond SB-C18 87

步 骤 5 步 骤 6 从 低 ph 到 中 性 ph ZORBAX Eclipse Plus C18 ph 7 (6-9) 20-50 mm 缓 冲 液 调 节 乙 腈 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 如 果 保 留 不 够, 然 后... 改 变 有 机 相 百 分 比 中 性 ph 可 提 供 更 好 的 选 择 性 : 可 能 与 样 品 更 加 兼 容 在 中 性 ph 条 件 下 方 法 开 发 的 过 程 与 低 ph 相 同 ZORBAX Eclipse Plus 和 Poroshell 120 柱 在 中 性 ph 下 具 有 卓 越 性 能 如 果 需 要 改 善 选 择 性, 也 应 考 虑 改 变 键 合 相, 同 时 选 择 适 当 的 缓 冲 液 ( 在 中 性 ph 下 使 用 醋 酸 铵 或 甲 酸 铵, 而 在 低 ph 下 使 用 的 是 磷 酸 盐 缓 冲 液 磷 酸 甲 酸 或 TFA) 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 7 改 变 有 机 改 性 剂 (MeOH) 调 节 有 机 相 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 重 复 进 行 第 6 步 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 8 尝 试 Eclipse Plus Phenyl-Hexyl, Eclipse XDB-CN, XDB-Phenyl 或 Bonus-RP 重 复 进 行 第 5 步 步 骤 9 从 中 性 ph 到 高 ph ZORBAX Extend-C18 ph 10.5 (9-12) 5 mm 氨 或 TEA, 或 10-50 mm 有 机 或 硼 酸 盐 缓 冲 液 T = 25 C ( 室 温 40 C) 调 节 MeOH 百 分 比, 以 达 到 0.5 < k < 20 选 择 高 ph 的 理 由 : 分 析 不 带 电 荷 的 碱 性 化 合 物, 以 增 加 其 保 留 提 高 选 择 性 如 果 保 留 不 够, 然 后... 步 骤 10 改 变 有 机 改 性 剂 ( 乙 腈 或 THF) 调 节, 使 达 到 0.5 < k < 20 尝 试 不 同 的 HPLC 模 式 图 58. 方 法 开 发 流 程 图 在 高 ph 下 使 用 缓 冲 液 时 应 注 意 : 缓 冲 液 可 能 吸 收 CO 2, 因 碳 酸 盐 的 加 入 使 ph 发 生 变 化 ( 取 决 于 缓 冲 容 量 ) 防 止 这 一 现 象 出 现 的 唯 一 办 法 是 给 流 动 相 瓶 加 盖, 使 其 隔 绝 空 气, 或 使 用 烧 碱 石 棉 捕 集 器 88

从 常 规 柱 向 高 效 柱 进 行 方 法 转 移 的 技 巧 使 用 UHPLC/ 快 速 LC 和 高 效 柱 将 帮 助 您 提 高 分 析 速 度 和 分 离 度 根 据 您 使 用 的 仪 器 配 置, 要 使 这 类 色 谱 柱 最 大 限 度 地 发 挥 作 用, 还 需 要 对 您 所 用 的 仪 器 进 行 一 些 调 节 Poroshell 120 柱 填 料 外 径 为 2.7 µm, 是 一 种 具 有 实 心 核 和 多 孔 外 壳 的 表 面 多 孔 型 填 料 由 于 分 析 物 在 多 孔 外 壳 内 外 扩 散 速 度 更 快, 并 具 有 非 常 均 匀 的 填 充 柱 床, 所 以 这 种 色 谱 柱 能 在 2.7 µm 填 料 的 柱 压 下 提 供 与 亚 2 µm 填 料 相 媲 美 的 柱 效 最 高 耐 压 可 达 600 bar, 因 此,Poroshell 120 柱 可 用 于 优 化 UHPLC 性 能 而 亚 2 µm 柱 则 可 以 在 高 达 1300 bar 的 压 力 下 使 用 由 于 具 有 高 柱 效, 洗 脱 速 度 相 当 快, 峰 形 也 很 窄 现 代 HPLC 仪 器 和 数 据 系 统 可 以 应 用 这 类 填 料 的 优 势, 但 要 注 意, 仪 器 配 置 对 获 得 最 佳 结 果 非 常 重 要 这 类 色 谱 柱 的 选 择 性 与 其 它 相 似 固 定 相 极 为 类 似, 所 以 可 以 很 方 便 地 进 行 方 法 转 移, 以 获 得 优 异 的 结 果 您 仅 需 注 意 的 是 如 何 对 常 规 液 相 色 谱 仪 进 行 优 化 方 法 转 移 步 骤 : 查 阅 仪 器 附 带 的 说 明 书 和 仪 器 性 能 指 标 确 定 仪 器 已 针 对 高 效 色 谱 柱 进 行 了 配 置 如 果 尚 未 进 行 配 置, 继 续 下 一 步 优 化 数 据 采 集 速 率 ( 采 用 快 速 响 应 时 间 的 检 测 器 采 集 频 率 至 少 40 Hz) 使 用 Poroshell 120 柱 和 更 高 流 速, 得 到 类 似 于 亚 2 µm 柱 所 得 的 窄 峰 将 检 测 器 设 为 最 快 采 集 速 率, 然 后 设 为 第 二 快 采 集 速 率, 比 较 二 者 的 分 离 度 是 否 不 同 更 多 信 息 参 见 第 47 页 使 用 半 微 量 或 微 量 流 通 池 安 捷 伦 1200 的 标 准 流 通 池 体 积 为 10 mm/13 µl( 注 意, 并 非 所 有 检 测 器 都 用 相 同 的 流 通 池 ) 这 可 能 会 降 低 使 用 Poroshell 120 柱 所 获 得 的 性 能 建 议 使 用 更 小 体 积 的 流 通 池, 如 半 微 量 (6 mm/5 µl) 或 微 量 (3 mm/2 µl) 流 通 池, 以 获 得 最 佳 性 能 通 常, 流 通 池 越 小, 光 程 越 短, 可 能 降 低 UV 方 法 的 灵 敏 度 注 意, 某 些 低 体 积 流 通 池 就 是 通 过 缩 短 光 程 实 现 的, 这 将 降 低 绝 对 峰 高 最 大 限 度 减 少 仪 器 管 线 体 积 用 红 色 (0.12 mm 内 径 ) 管 线 代 替 绿 色 管 线 (0.17 mm 内 径 ), 因 为 可 以 使 样 品 流 经 体 积 减 少 一 半 这 样 就 能 降 低 柱 外 体 积 和 峰 带 变 宽 确 保 连 接 尽 可 能 短 ( 更 多 信 息 请 参 见 第 40 页 ) 以 下 是 3 到 4 处 可 能 需 要 您 更 换 管 线 的 地 方, 请 注 意 所 需 要 的 连 接 管 线 长 度 : 自 动 进 样 器 针 座 自 动 进 样 器 到 柱 温 箱 或 TCC TCC 到 色 谱 柱 色 谱 柱 到 流 通 池, 包 括 一 体 式 流 通 池 入 口 毛 细 管 的 内 径 89

如 果 您 的 方 法 不 用 升 高 柱 温, 可 以 采 用 快 捷 连 接, 自 动 进 样 器 直 接 连 接 色 谱 柱, 然 后 从 色 谱 柱 连 接 流 通 池, 减 少 了 柱 外 体 积 根 据 分 析 化 合 物 的 具 体 情 况, 如 果 不 控 制 温 度, 这 种 操 作 可 能 出 现 问 题 所 有 特 殊 毛 细 管 都 可 以 按 需 要 的 长 度 单 独 从 安 捷 伦 订 购 注 意 接 头 连 接 安 捷 伦 建 议 使 用 带 前 后 垫 圈 的 Swagelok 接 头, 该 接 头 可 使 整 个 LC 系 统 的 密 封 性 能 最 佳 ( 在 仪 器 连 接 处 使 用, 比 如, 阀 和 加 热 器 等 ) 在 最 高 操 作 压 力 600 bar 时, 我 们 强 烈 推 荐 使 用 A-line 接 头 与 Poroshell 120 柱 连 接 时 使 用 这 种 接 头 ( 部 件 号 5042-8957) 更 多 接 头 的 相 关 信 息 请 参 见 第 27 页 优 化 流 速 使 用 Poroshell 120 柱 时, 如 果 您 使 用 的 柱 内 径 为 2.1 mm, 建 议 初 始 流 速 为 0.42 ml/min, 对 于 3.0 mm 内 径 的 Poroshell 120 柱, 我 们 建 议 初 始 流 速 为 0.85 ml/min, 对 于 4.6 mm 内 径 色 谱 柱, 我 们 建 议 初 始 流 速 为 2 ml/min 图 59. van Deemter 曲 线 重 叠 图 :Poroshell 120 的 最 佳 流 速 比 5 或 3.5 µm 柱 更 快 90

按 比 例 调 整 梯 度 曲 线 和 进 样 体 积 如 果 用 梯 度 洗 脱 优 化 色 谱 结 果, 您 应 确 保 针 对 新 的 较 小 色 谱 柱 按 比 例 正 确 调 整 梯 度 曲 线 和 进 样 体 积, 以 便 进 行 快 速 方 法 转 移 并 避 免 过 载 安 捷 伦 网 站 可 提 供 免 费 的 方 法 转 移 软 件, 帮 助 您 选 择 正 确 条 件 ( 参 见 140 页 上 的 其 它 安 捷 伦 资 源 ) 对 于 等 度 和 梯 度 洗 脱, 应 确 保 按 比 例 调 整 后 的 进 样 体 积 与 整 个 色 谱 柱 体 积 相 匹 配 最 大 限 度 地 减 少 样 品 进 样 的 柱 扩 散 应 使 用 与 流 动 相 溶 剂 强 度 相 当 或 更 弱 的 进 样 溶 剂, 特 别 是 在 使 用 等 度 方 法 时 这 对 任 何 色 谱 柱 都 是 良 好 的 通 行 做 法, 对 高 效 柱 尤 为 重 要 相 关 的 步 骤 视 频, 请 访 问 www.agilent.com/chem/poroshell120video 自 动 化 方 法 开 发 工 具 许 多 实 验 室 仍 在 使 用 手 动 或 上 手 方 法 开 发 方 法 但 自 动 化 方 法 有 很 多 优 势, 有 助 于 让 LC 方 法 开 发 更 加 轻 松 新 的 方 法 开 发 软 件, 如 安 捷 伦 1200 Infinity 系 列 多 方 法 解 决 方 案, 为 自 动 方 法 开 发 过 程 的 许 多 步 骤 提 供 了 特 殊 硬 件 和 专 用 的 软 件 解 决 方 案 Agilent 1200 Infinity 系 列 多 方 法 解 决 方 案 The 1290 Infinity II LC 的 流 量 和 压 力 范 围 较 宽 再 加 上 较 小 的 梯 度 延 迟 体 积, 有 利 于 开 发 其 它 HPLC 或 UHPLC 系 统 的 方 法 根 据 分 离 的 复 杂 性, 可 在 软 件 输 入 不 同 需 要 以 支 持 不 同 的 实 验 设 置 新 软 件, 如 安 捷 伦 化 学 工 作 站 方 法 筛 选 向 导, 可 提 供 工 具 用 于 设 定 序 列 和 全 部 方 法, 以 便 色 谱 柱 溶 剂 梯 度 和 温 度 多 维 筛 选 实 验 的 完 成 Agilent 1290 Infinity II 最 多 可 使 用 三 个 TCC 模 块, 而 无 需 考 虑 系 统 使 用 的 是 1260 Infinity 还 是 1290 Infinity 模 块 快 速 更 换 阀 可 让 用 户 方 便 地 操 作 毛 细 管 接 头, 有 助 于 直 接 安 装 和 维 护 91

系 统 概 况 检 测 器 TCC TCC 进 样 器 泵 溶 剂 1. 可 选 择 多 达 12 种 外 加 溶 剂 的 外 接 溶 剂 选 择 阀 2. 用 于 色 谱 柱 选 择 的 8 位 /9 通 出 口 阀 3. 用 于 色 谱 柱 选 择 的 8 位 /9 通 入 口 阀 所 有 阀 均 适 用 于 不 同 压 力 范 围 图 60. 灵 活 的 自 动 化 方 法 开 发 用 一 个 或 两 个 外 接 12 通 道 选 择 阀 可 以 扩 展 溶 剂 数 量 用 户 可 以 从 计 算 机 屏 幕 上 的 列 表 中 选 择 其 溶 剂, 实 现 自 动 化 用 阀 安 装 辅 助 程 序 和 管 线 工 具 包 可 实 现 有 条 不 紊 的 优 化 设 置 使 用 系 统 中 的 二 元 泵, 可 实 现 多 达 169 种 二 元 溶 剂 组 合 四 元 泵 可 多 达 193 种 组 合 安 装 8 根 色 谱 柱 时, 可 全 自 动 筛 选 1000 多 种 独 特 的 分 离 条 件 在 安 捷 伦 系 统 上 可 以 使 用 各 种 规 格 的 分 析 柱 提 示 : 如 需 了 解 自 动 化 方 法 开 发 解 决 方 案 的 更 多 信 息, 请 在 安 捷 伦 网 站 上 搜 寻 出 版 物 5990-6226EN 92

其 它 HPLC 模 式 的 方 法 开 发 HILIC 亲 水 相 互 作 用 液 相 色 谱 (HILIC) 有 时 也 被 称 为 水 相 正 相 (ANP) 是 一 项 已 发 展 了 数 十 年 的 技 术 由 于 这 项 技 术 能 够 对 反 相 柱 上 不 保 留 或 保 留 较 差 的 极 性 化 合 物 进 行 分 析, 近 年 来 又 重 新 受 到 了 重 视 而 且, 这 项 技 术 很 容 易 与 MS 和 MS/MS 检 测 技 术 兼 容 当 HILIC 分 离 使 用 高 有 机 相 流 动 相 时, 与 水 相 缓 冲 系 统 相 比 由 于 具 有 较 低 的 离 子 抑 制, 从 而 提 高 了 MS 灵 敏 度 HILIC 使 用 极 性 固 定 相, 如 硅 胶 氨 基 混 合 模 式 两 性 离 子 等, 以 及 水 溶 性 的 非 极 性 流 动 相, 由 少 量 水 ( 至 少 2.5% 体 积 比 ) 和 高 比 例 有 机 相 组 成 在 HILIC 方 法 中, 亲 水 极 性 和 带 电 荷 化 合 物 比 疏 水 中 性 化 合 物 更 容 易 保 留 与 反 相 液 相 色 谱 完 全 相 反 在 流 动 相 中 加 水 会 降 低 保 留 HILIC 与 正 相 色 谱 相 比, 能 得 到 强 极 性 溶 质 的 良 好 峰 形 是 反 相 色 谱 的 补 充 方 法, 由 于 保 留 了 亲 水 性 化 合 物, 因 此 常 使 洗 脱 顺 序 倒 置 开 发 HILIC 方 法 时, 需 要 优 化 下 列 参 数 : 固 定 相 有 机 溶 剂 浓 度 缓 冲 液 类 型 缓 冲 液 ( 盐 ) 浓 度 ph 温 度 HILIC 方 法 中 常 用 的 色 谱 柱 : 硅 胶 柱 氨 基 柱 混 合 型 柱 ( 烷 基 - 二 醇 烷 基 - 羧 基 C18- 酰 胺 芳 香 - 氰 基 烷 基 - 羟 基 C18- SCX 和 聚 羟 乙 基 天 冬 酰 胺 ) 氢 化 物 衍 生 氢 化 物 柱 两 性 柱 ( 如, 四 烷 基 铵 - 磺 酸 ) 专 利 固 定 相 柱 93

在 图 61-63 中 显 示 了 两 种 药 物 的 分 离 雷 尼 替 丁 和 帕 罗 西 汀 使 用 反 相 色 谱, 然 后 用 HILIC 方 法, 以 及 MS 数 据 结 果 显 示 了 HILIC 模 式 的 主 要 优 势 在 HILIC 中 雷 尼 替 丁 保 留 更 强,MS 灵 敏 度 更 高 吸 光 值 分 析 条 件 仪 器 Agilent 系 列 1100 液 相 色 谱 仪 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Rx-SIL 2.1 150 mm, 5 µm 流 动 相 : A:8 mm HCOONH 4 的 水 溶 液 B:8 mm HCOONH 4 的 95% 乙 腈 (ACN) /5% 水 梯 度 : B 在 10 分 钟 内 由 5% 升 至 90% 柱 温 : 40 C 样 品 体 积 : 5 µl 流 速 : 0.3 ml/min 图 61. 在 ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱 上 对 帕 罗 西 汀 和 雷 尼 替 丁 进 行 的 LC/MS/MS 分 离 ( 反 相 HPLC 模 式 ) 分 析 条 件 色 谱 柱 : 梯 度 : ZORBAX Rx-SIL, 2.1 x 150 mm, 5 µm B 在 10 分 钟 内 由 100% 降 至 50% 吸 光 值 图 62. 在 ZORBAX Rx-Sil 柱 上 对 帕 罗 西 汀 和 雷 尼 替 丁 进 行 的 LC/MS/MS 分 离 (HILIC 模 式 ) 100 ppb 水 平 94

帕 罗 西 汀 MS 条 件 仪 器 : 1100 系 列 LC/MSD 离 子 阱 电 离 : 正 离 子 ESI 扫 描 范 围 : 100-500 m/z SIM 离 子 : m/z = 315, 330 干 燥 气 体 : 350 C 下 10 L/min 雾 化 气 体 : 45 psi 裂 解 电 压 : 0.25 V 雷 尼 替 丁 二 次 裂 解 选 择 的 母 离 子 图 63. 药 物 标 准 品 的 MS/MS 图 谱 正 相 色 谱 正 相 或 吸 附 色 谱 的 出 现 早 于 反 相 色 谱 正 的 叫 法 源 自 其 原 本 概 念, 即, 固 定 相 为 极 性 流 动 相 为 非 极 性 极 性 化 合 物 保 留 更 强 在 正 相 色 谱 中, 使 用 硅 胶 或 另 一 种 极 性 固 定 相, 如 短 链 氨 基 或 二 醇 流 动 相 为 非 极 性 通 常 为 烃 类 二 氯 甲 烷 乙 酸 乙 酯, 或 另 一 种 水 溶 性 的 溶 剂 在 正 相 色 谱 中, 极 性 组 分 保 留 更 强 随 流 动 相 极 性 增 大 极 性 组 分 保 留 减 弱 使 用 的 流 动 相 极 性 越 强, 分 析 物 的 洗 脱 越 快 在 硅 胶 柱 上 进 行 正 相 梯 度 分 离 时, 可 以 从 己 烷 等 非 极 性 溶 剂 开 始, 然 后 逐 渐 加 入 极 性 溶 剂, 如 乙 酸 乙 酯, 比 如, 乙 酸 乙 酯 从 5% 到 95% 根 据 目 标 物 的 洗 脱 位 置, 可 以 调 节 梯 度 以 改 善 所 有 组 分 的 分 离 有 时 加 入 一 定 量 的 水 或 少 量 异 丙 醇, 可 以 调 节 硅 胶 填 料 的 表 面 活 性 键 合 相 色 谱 柱 可 能 不 需 要 水 的 存 在, 并 常 使 用 醇 类 作 为 改 性 剂 如 果 检 测 器 为 UV 或 荧 光 检 测 器, 可 参 考 溶 剂 UV 截 止 波 长 表 在 本 书 参 考 章 节, 第 137 页 上, 可 以 查 到 某 些 最 常 用 溶 剂 的 UV 截 止 波 长 95

我 们 使 用 正 相 色 谱 的 原 因 之 一 是 使 更 多 的 极 性 化 合 物 得 到 保 留 也 可 以 用 这 种 模 式 洗 脱 在 反 相 色 谱 中 高 度 保 留 的 疏 水 化 合 物 正 相 色 谱 有 许 多 用 途, 适 合 分 离 几 何 异 构 体 和 位 置 异 构 体, 可 得 到 比 反 相 色 谱 更 高 的 分 辨 率 当 我 们 没 有 水 溶 性 的 溶 剂 时, 可 以 使 用 正 相 色 谱 也 可 以 用 于 制 备 分 离, 流 动 相 不 含 水, 易 于 蒸 发 总 结 : 正 相 柱 填 料 为 极 性 : 硅 胶 ( 最 强 )> 氨 基 > 二 醇 > 氰 基 ( 最 弱 ) 流 动 相 为 非 极 性 : 己 烷 异 辛 烷 二 氯 甲 烷 乙 酸 乙 酯 等 极 性 化 合 物 保 留 更 强 随 流 动 相 极 性 增 大 保 留 减 弱 选 择 正 相 的 目 的 : 分 离 高 度 保 留 的 疏 水 样 品 分 离 异 构 体 样 品 进 样 溶 剂 为 非 极 性 和 / 或 非 水 溶 性 的 使 用 非 极 性 溶 剂 进 行 回 收 96

离 子 交 换 色 谱 离 子 交 换 色 谱 可 以 分 离 离 子 型 化 合 物 和 可 离 子 化 的 化 合 物 在 这 种 模 式 中, 我 们 使 用 带 有 离 子 型 官 能 团 的 填 料, 其 所 带 电 荷 与 分 析 物 相 反 在 强 阳 离 子 交 换 (SCX) 色 谱 中, 我 们 要 分 析 带 正 电 荷 的 分 子 或 阳 离 子, 因 此 使 用 的 是 阴 离 子 型 或 带 负 电 荷 的 固 定 相 如 果 我 们 要 分 析 带 负 电 荷 的 分 子 或 阴 离 子, 应 使 用 阳 离 子 型 或 带 正 电 荷 的 固 定 相 在 离 子 交 换 色 谱 中, 流 动 相 通 常 含 水 量 较 高, 并 含 有 缓 冲 液 或 盐 通 过 连 续 或 阶 梯 梯 度 增 加 离 子 强 度 ( 盐 浓 度 ) 进 行 洗 脱 常 用 于 对 生 物 大 分 子 的 分 离, 也 用 于 小 分 子 的 分 离, 如 氨 基 酸 无 机 阳 离 子 和 阴 离 子, 以 及 氨 类 或 羧 酸 等 可 离 子 化 的 化 合 物 在 图 64 的 实 例 中, 我 们 分 离 了 蛋 白 质, 由 于 其 具 有 两 种 离 子 官 能 团 ( 即 能 带 正 电 荷 又 能 带 负 电 荷 ), 肯 定 带 电 荷 根 据 其 所 带 的 净 电 荷, 蛋 白 质 和 多 肽 可 以 用 阳 离 子 交 换 柱 或 阴 离 子 交 换 柱 进 行 分 离 离 子 交 换 色 谱 小 结 : 柱 填 料 含 离 子 基 团 ( 如, 磺 酸 盐 四 烷 基 铵 ) 流 动 相 为 水 相 缓 冲 液 ( 如, 磷 酸 盐 甲 酸 盐 TRIS 等 ) 比 反 相 色 谱 用 得 少 与 离 子 对 色 谱 相 似 ( 更 多 信 息 请 参 见 词 汇 表 ) 峰 归 属 1. RNA 聚 合 酶 2. 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 3. 溶 菌 酶 图 64. 用 强 阳 离 子 交 换 柱 (-SO 3 ) 分 离 碱 性 蛋 白 97

凝 胶 渗 透 色 谱 / 体 积 排 阻 色 谱 在 GPC/SEC 中, 样 品 分 子 与 填 料 之 间 不 存 在 相 互 作 用, 并 通 过 扩 散 进 入 多 孔 聚 合 物 基 质 或 硅 胶 基 质 的 孔 隙 中 根 据 分 子 的 体 积 大 小 和 相 应 填 料 孔 隙 大 小 进 行 分 离 体 积 比 填 料 孔 隙 大 的 分 子 不 能 扩 散 进 入 填 料, 而 体 积 比 填 料 孔 隙 小 的 分 子 则 可 以 进 入 填 料, 因 此 样 品 得 到 分 离 与 反 相 色 谱 不 同 的 是, 大 分 子 先 洗 脱 出 来, 小 分 子 后 洗 脱 出 来 通 常, 较 大 分 子 被 排 阻 在 孔 隙 之 外, 从 而 快 速 从 色 谱 柱 中 洗 脱 出 来, 为 完 全 排 阻 体 积 最 小 的 分 子 可 以 渗 透 入 色 谱 柱 的 所 有 孔 隙, 最 后 洗 脱 出 来, 为 完 全 渗 透 体 积 其 它 所 有 分 子 在 这 两 者 之 间 按 分 子 大 小 洗 脱 出 来 如 果 要 测 定 单 个 组 分 的 分 子 量 (MW) 或 整 体 分 布, 需 要 先 用 已 知 分 子 量 的 标 样 以 洗 脱 体 积 对 log MW 建 立 校 正 曲 线 然 后, 在 与 标 样 相 同 的 条 件 下 分 析 聚 合 物 样 品, 即 可 测 定 该 聚 合 物 的 分 子 量 和 分 子 量 分 布 主 要 选 用 流 动 相 溶 解 分 析 物 主 要 化 合 物 小 的 低 聚 物 和 单 体 分 析 条 件 : 色 谱 柱 : 流 动 相 : PLgel MIXED-D 四 氢 呋 喃 (THF) 单 体 在 聚 合 物 之 后 洗 脱 出 来 示 差 折 光 图 65. 用 非 水 相 GPC/SEC 柱 分 离 聚 丁 二 烯 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 GPC/SEC 小 结 : 两 种 模 式 : 非 水 相 GPC 和 水 相 SEC( 也 称 凝 胶 过 滤 色 谱, 或 GFC) 在 体 积 排 阻 色 谱 中, 样 品 分 子 与 填 料 之 间 无 相 互 作 用, 并 通 过 扩 散 进 入 多 孔 聚 合 物 基 质 的 孔 隙 中 根 据 分 子 的 体 积 大 小 和 相 应 填 料 孔 隙 大 小 进 行 分 离 在 不 同 溶 剂 或 流 动 相 中 可 能 得 到 不 同 的 流 体 动 力 学 半 径 主 要 选 用 流 动 相 溶 解 分 析 物 GPC box 色 谱 柱 主 要 用 于 聚 合 物 表 征 聚 合 物 分 子 量 测 定 和 蛋 白 质 分 离 98

液 质 联 用 仪 基 本 原 理 哪 种 仪 器 的 化 合 物 分 析 能 力 能 够 超 越 液 相 色 谱? 接 下 来 我 们 就 将 为 您 介 绍 什 么 是 LC/MS? 将 液 相 色 谱 (LC) 与 质 谱 (MS) 的 分 离 能 力 相 结 合, 用 于 分 析 复 杂 样 品 中 的 单 一 化 合 物 或 多 种 组 分 的 仪 器 被 称 为 液 质 联 用 仪 (LC/MS) 符 号 LC/MS 代 表 两 种 不 同 分 离 技 术 的 结 合, 先 通 过 液 相 色 谱 进 行 分 离, 然 后 再 按 化 合 物 的 质 量 ( 或 更 精 确 地, 按 质 荷 比 (m/z)) 对 其 进 行 分 离 为 了 使 该 技 术 具 有 分 析 实 用 性, 在 液 相 中 分 离 出 的 组 分 必 须 通 过 电 离 过 程 转 换 为 带 电 的 离 子 形 态 该 过 程 在 质 谱 仪 的 离 子 源 中 进 行, 它 是 连 接 液 相 色 谱 仪 和 质 谱 仪 的 接 口 一 般 来 说,LC/MS 的 灵 敏 度 比 UV 检 测 更 高, 其 选 择 性 和 特 异 性 也 更 加 出 色 在 过 去 几 十 年 中,LC/MS 的 应 用 大 幅 增 长 技 术 的 进 步 使 得 LC/MS 越 来 越 简 单 易 用, 可 轻 松 添 加 到 任 何 实 验 室 电 离 技 术 的 改 进 拓 宽 了 LC/MS 可 分 析 的 化 合 物 范 围 如 今,LC/MS 已 成 为 了 诸 多 领 域 ( 例 如 药 代 动 力 学 法 医 学 毒 理 学 和 蛋 白 质 组 学 等 ) 的 标 准 分 析 工 具 液 质 联 用 仪 现 在 几 乎 已 经 应 用 到 了 每 一 个 需 要 进 行 化 学 分 析 的 行 业 中 ; 制 药 食 品 安 全 环 境 化 学 和 能 源 领 域 的 实 验 室 都 部 署 了 LC/MS 以 应 对 分 析 挑 战 基 本 样 品 电 离 之 后 被 转 移 到 检 测 器 中 99

LC/MS 可 提 供 哪 些 信 息? LC/MS 分 析 所 产 生 的 数 据 为 多 维 数 据 根 据 组 分 在 各 种 溶 剂 和 色 谱 柱 条 件 下 的 液 相 色 谱 保 留 特 性 及 其 在 气 相 中 的 质 荷 比 进 行 分 离 和 检 测 最 高 级 别 的 结 果 是 总 离 子 流 色 谱 图 (TIC) TIC 展 示 的 是 色 谱 运 行 过 程 中 检 测 到 的 离 子 的 总 强 度 TIC 中 的 每 个 采 样 点 都 可 进 行 进 一 步 分 析, 因 为 每 个 点 都 与 特 定 的 质 谱 图 相 关 联 质 谱 图 可 显 示 某 个 色 谱 保 留 时 间 处 出 现 了 哪 些 质 量 数 的 离 子, 以 及 它 们 相 应 的 强 度 图 66. 聚 丁 二 烯 聚 合 物 在 非 水 性 GPC/SEC 色 谱 柱 上 分 离 得 到 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 质 谱 峰 的 分 辨 率 和 准 确 度 是 质 谱 仪 的 重 要 性 能 标 准 对 于 能 够 以 大 约 ± 0.1 Da 的 准 确 度 识 别 质 量 的 仪 器, 我 们 称 其 具 有 标 称 质 量 准 确 度 或 单 位 质 量 准 确 度 此 类 仪 器 通 常 是 基 于 四 极 杆 的 仪 器, 例 如 单 四 极 杆 或 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 具 有 标 称 质 量 准 确 度 的 质 谱 仪 与 液 相 色 谱 仪 联 用 通 常 已 经 足 够 用 于 多 种 应 用 高 分 辨 率 精 确 质 量 质 谱 仪 能 够 更 精 确 地 测 量 离 子 的 质 荷 比, 准 确 度 可 达 ± 0.1 mda 质 量 准 确 度 的 提 升 大 大 提 高 了 化 合 物 鉴 定 的 可 信 度 另 外, 更 高 的 质 量 分 辨 能 力 还 能 以 足 够 的 精 度 测 量 化 合 物 的 同 位 素, 有 助 于 对 化 合 物 分 子 量 和 结 构 表 征 结 果 进 行 额 外 的 验 证 此 类 仪 器 基 于 飞 行 时 间 (TOF) 技 术 或 离 子 阱 液 质 联 用 仪 记 录 不 断 增 加 的 化 合 物 丰 度 的 能 力 被 称 为 线 性 动 态 范 围 线 性 范 围 对 于 实 现 准 确 测 量 而 言 非 常 重 要, 在 对 样 品 中 的 化 合 物 进 行 定 量 分 析 时 尤 其 如 此 100

液 质 联 用 仪 的 类 型 液 质 联 用 仪 有 多 种 类 型, 它 们 分 别 采 用 不 同 的 技 术, 具 有 不 同 的 分 析 能 力 和 性 能 水 平 单 四 极 杆 仪 器 单 四 极 杆 液 质 联 用 仪 可 提 供 具 有 标 称 质 量 准 确 度 的 数 据, 并 且 通 常 是 实 验 室 初 次 引 入 液 质 联 用 仪 作 为 与 液 相 色 谱 仪 联 用 的 检 测 器 时 的 首 选 单 四 极 杆 仪 器 利 用 四 极 杆 质 量 过 滤 器 测 定 样 品 所 产 生 的 离 子 的 m/z, 还 能 扫 描 一 定 范 围 内 的 质 量 进 行 筛 选 分 析, 或 者 选 择 具 有 特 定 m/z 值 的 特 定 离 子 进 行 目 标 分 析 此 类 液 质 联 用 仪 采 用 先 进 的 仪 器 设 计 并 且 易 于 操 作, 因 此 非 常 适 用 于 常 规 的 质 量 分 析 三 重 四 极 杆 仪 器 三 重 四 极 杆 液 质 联 用 仪 是 应 用 最 广 泛 的 类 型, 有 时 也 被 称 为 串 联 质 谱 仪, 因 为 同 一 台 仪 器 配 备 有 两 个 质 量 过 滤 器 这 种 设 计 可 通 过 分 离 母 离 子 碎 裂 母 离 子 然 后 分 析 所 得 的 碎 片 离 子 来 生 成 MS/MS 数 据 多 反 应 监 测 (MRM) 是 实 验 设 置 中 最 常 用 的 三 重 四 极 杆 仪 器 类 型, 因 为 它 能 够 提 供 极 高 的 灵 敏 度, 重 现 性 高, 并 具 有 出 色 的 选 择 性 飞 行 时 间 和 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 飞 行 时 间 和 三 重 四 极 杆 飞 行 时 间 液 质 联 用 仪 的 原 理 是 : 对 于 动 能 一 定 的 离 子, 其 飞 行 时 间 会 根 据 其 质 量 和 电 荷 数 的 不 同 而 有 所 差 异 精 确 测 量 而 得 的 飞 行 时 间 可 用 于 准 确 测 定 样 品 中 存 在 的 离 子 的 质 荷 比 此 类 仪 器 可 提 供 高 质 谱 分 辨 率, 且 测 量 的 质 量 准 确 度 在 5 ppm 以 内 在 碎 片 离 子 进 入 飞 行 管 进 行 分 析 之 前, 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 还 能 通 过 分 离 和 碎 裂 母 离 子 提 供 MS/MS 数 据 Agilent 6000 系 列 液 质 联 用 解 决 方 案 安 捷 伦 提 供 可 改 善 定 量 和 定 性 分 析 可 信 度 的 全 套 液 质 联 用 解 决 方 案, 涵 盖 这 几 页 所 述 的 所 有 类 型 的 系 统 右 侧 展 示 了 外 观 不 同 的 三 重 四 极 杆 系 统 以 及 Q-TOF 系 统 Agilent 6100 系 列 单 四 极 杆 液 质 联 用 系 统 Agilent 6470 三 重 四 极 杆 液 质 联 用 系 统 Agilent 6550 ifunnel Q-TOF 液 质 联 用 系 统 101

匀 场 离 子 淌 度 系 统 匀 场 离 子 淌 度 系 统 兼 具 离 子 淌 度 和 质 谱 的 分 离 能 力 该 技 术 可 直 接 准 确 测 量 碰 撞 截 面, 从 而 提 供 额 外 的 分 离 维 度 它 还 能 保 留 分 子 构 象 的 结 构 特 征, 扩 展 了 对 复 杂 样 品 的 覆 盖 率 安 捷 伦 离 子 淌 度 质 谱 Agilent 6560 IMS-Q-TOF 液 质 联 用 仪 能 够 在 没 有 同 类 型 校 准 标 准 品 的 情 况 下, 实 现 高 性 能 的 离 子 淌 度 分 析 和 精 密 准 确 的 碰 撞 截 面 (CCS) 测 量 前 端 漏 斗 捕 集 门 捕 集 漏 斗 漂 移 管 后 端 漏 斗 MS/MS 碎 裂 化 合 物, 获 得 额 外 的 特 异 性 某 些 液 质 联 用 仪 会 有 意 碎 裂 母 分 子, 然 后 根 据 碎 片 离 子 的 质 量 获 取 关 于 化 合 物 结 构 组 成 的 信 息 施 加 相 同 的 碰 撞 能 量 时, 化 合 物 将 可 重 现 地 碎 裂 因 此, 通 过 研 究 完 整 质 量 数 和 生 成 的 不 同 碎 片 离 子 的 质 量 数, 我 们 可 以 查 找 特 定 的 化 合 物 该 技 术 提 升 了 化 合 物 鉴 定 的 特 异 性, 通 常 被 称 为 LC/MS-MS, 表 示 分 析 时 要 进 行 多 个 阶 段 的 质 量 分 析 图 67. 聚 丁 二 烯 聚 合 物 在 非 水 性 GPC/SEC 色 谱 柱 上 分 离 得 到 的 凝 胶 渗 透 色 谱 图 三 重 四 极 杆 仪 器 使 用 一 个 四 极 杆 来 分 离 初 始 离 子 或 母 离 子, 然 后 在 另 一 个 区 域 中 碎 裂 该 离 子, 接 下 来 再 分 析 第 三 个 四 极 杆 中 生 成 的 碎 片 离 子 使 用 这 些 仪 器 时, 我 们 通 过 被 称 为 多 反 应 监 测 (MRM) 的 实 验 来 采 集 数 据 MRM 实 验 主 要 监 测 第 一 个 四 极 杆 中 的 母 离 子, 以 及 第 三 个 四 极 杆 中 的 一 种 或 多 种 碎 片 离 子 ( 或 子 离 子 ) 碎 裂 过 程 可 快 速 完 成, 因 此 可 同 时 监 测 多 个 MRM 该 方 法 常 用 于 农 药 食 品 和 毒 理 学 分 析, 这 些 分 析 可 能 涉 及 多 个 不 同 的 目 标 化 合 物 MRM 实 验 的 重 现 性 很 高, 并 且 可 达 到 极 高 的 灵 敏 度 动 态 MRM (dmrm) 是 一 种 更 先 进 的 MRM, 它 能 确 保 在 单 次 LC/MS 分 析 中 对 多 种 分 析 物 (200 多 种 化 合 物 ) 进 行 高 灵 敏 度 的 定 量 分 析 某 些 精 确 质 量 液 质 联 用 系 统 也 能 执 行 MS/MS 级 别 的 实 验 此 类 仪 器 包 括 四 极 杆 飞 行 时 间 仪 器 和 某 些 离 子 阱 仪 器 它 们 可 提 供 给 定 化 合 物 的 精 确 质 量 同 位 素 信 息 和 碎 片 离 子 信 息, 具 有 LC/MS 所 能 达 到 的 最 高 特 异 性 102

化合物的电离 为了进行分析 所有质谱仪都要求化合物处于气相状态并且带有电荷 因此 必须通过某种方法将液态的 中性分子转换为气态的离子 可采用多种不同的技术进行电离 电喷雾电离 电喷雾电离 (ESI) 是如今应用最广泛的 LC/MS 电离技术 它是一种软电离技术 有助于保留被电离分子的结 构 它能够分析范围极宽的化合物 包括完整蛋白质和寡核苷酸等大分子以及热不稳定化合物 不粘液滴的毛细管 层流超声 液相色谱洗脱液雾化器 进入质谱仪的离子 雾滴 高密度离子形成区域 用于容纳液滴与脱溶剂的 加热 N2 鞘气 图 68. 安捷伦喷射流 ESI 离子源 大气压化学电离 大气压化学电离 (APCI) 技术使用高度带电荷的探头电离中性化合物 进而生成离子 它适用于偏非极性的 化合物 如类固醇 芳香结构和某些脂类 大气压光电离 大气压光电离 (APPI) 技术利用高强度灯产生的光子使样品电离 生成离子 高度非极性的化合物适合采用 APPI 进行电离 安捷伦离子源 采用以上三种关键技术的还有多种其他类型的电离技术 安捷伦喷射流离子源是一种高度增强版的电喷雾离子源 它利用额外的加热气源来改善蒸发并协助 LC/MS 入口前方的离子聚焦 安捷伦组合离子源可同时使用 ESI 和 APCI 进行电离 拓宽了单个样品中所能电离的化合物范围 纳流电喷雾离子源和 Chip Cube 离子源可用于纳流 HPLC 应 用 使用极少的溶剂即可提高信号强度 103

利 用 LC/MS 开 发 方 法 的 技 巧 ESI-MS 的 溶 剂 选 择 LC/UV 流 动 相 通 常 采 用 能 够 在 MS 离 子 源 中 积 聚 的 非 挥 发 性 缓 冲 液 配 制 换 用 具 有 相 同 ph 的 挥 发 性 缓 冲 液 通 常 是 一 种 简 单 的 方 法 理 想 的 ESI-MS 缓 冲 液 浓 度 应 低 于 25 mm, 最 理 想 的 情 况 下 应 低 于 10 mm 流 速 通 常 也 应 保 持 较 低 水 平, 一 般 而 言 应 低 于 0.5 ml/min 但 如 果 采 用 安 捷 伦 喷 射 流 热 梯 度 聚 焦 技 术, 可 采 用 5 µl/min 至 最 高 2 ml/min 范 围 内 的 流 速 通 常 应 避 免 使 用 金 属 离 子 缓 冲 液, 因 为 它 们 会 干 扰 电 离 过 程 例 如, 用 甲 酸 盐 缓 冲 液 替 代 磷 酸 盐 缓 冲 液 同 样 能 将 流 动 相 的 ph 调 节 为 3, 而 且 与 质 谱 仪 配 合 良 好 由 于 质 谱 检 测 需 要 形 成 离 子, 因 此 应 当 利 用 流 动 相 使 分 析 物 带 上 电 荷 这 意 味 着 流 动 相 ph 和 样 品 的 pka 信 息 至 关 重 要, 为 了 获 得 稳 定 的 方 法,pH 应 当 与 分 析 物 的 pka 相 差 1 至 2 个 单 位 选 择 可 生 成 带 正 电 荷 或 带 负 电 荷 的 分 析 物 的 流 动 相 将 有 利 于 提 高 灵 敏 度 较 低 的 ph 通 常 用 于 碱 性 化 合 物 的 离 子 化 对 于 酸 性 化 合 物, 我 们 需 要 更 仔 细 地 选 择 流 动 相 ph, 因 为 它 们 的 pka 值 很 有 可 能 在 ph 2 至 5 的 范 围 内 酸 性 流 动 相 通 常 更 适 用 于 正 离 子 模 式 电 离, 并 且 应 含 有 0.1% 至 1% 的 甲 酸 0.1% 至 1% 的 乙 酸 和 0.05% 至 0.2% 的 三 氟 乙 酸 (TFA) TFA 会 引 起 离 子 抑 制, 但 如 果 样 品 浓 度 足 够 高, 也 可 以 使 用 TFA 碱 性 流 动 相 通 常 更 适 用 于 负 离 子 模 式 电 离 氢 氧 化 铵 三 乙 胺 二 乙 胺 哌 啶 和 碳 酸 氢 铵 常 被 用 于 负 ESI 模 式 当 中 性 化 合 物 与 缓 冲 液 中 的 乙 酸 根 或 铵 根 离 子 络 合 时, 也 可 对 其 进 行 分 析 向 电 喷 雾 探 头 施 加 电 压 可 形 成 离 子, 而 选 择 合 适 的 流 动 相 形 成 预 离 子 化 的 分 子 能 够 显 著 促 进 离 子 形 成, 从 而 改 善 灵 敏 度 对 于 有 机 流 动 相 组 分, 通 常 优 选 乙 腈 而 不 是 甲 醇 尽 管 甲 醇 也 可 用 于 LC/MS, 但 是 乙 腈 - 水 混 合 物 的 粘 度 和 表 面 张 力 比 甲 醇 - 水 混 合 物 更 低 较 低 的 粘 度 有 利 于 在 离 子 源 中 形 成 更 小 的 液 滴, 使 其 更 易 于 蒸 发 这 些 可 兼 容 质 谱 的 流 动 相 适 用 于 反 相 HILIC 和 正 相 色 谱 图 69 所 示 的 例 子 在 使 用 EIS 分 析 茶 叶 的 方 法 中 应 用 了 若 干 种 可 兼 容 LC/MS 的 流 动 相, 旨 在 对 它 们 进 行 筛 选 无 论 使 用 哪 种 流 动 相, 选 择 性 和 峰 形 均 保 持 一 致 因 此, 我 们 根 据 分 析 物 的 信 号 强 度 来 选 择 最 佳 流 动 相 使 用 乙 酸 铵 缓 冲 液 和 三 氟 乙 酸 流 动 相 时, 出 现 了 明 显 的 离 子 抑 制 效 应 两 个 最 有 力 的 竞 争 者 是 甲 酸 和 乙 酸, 其 中 甲 酸 产 生 的 信 号 略 强 一 点 将 灵 敏 度 最 高 的 乙 酸 流 动 相 与 灵 敏 度 最 低 的 乙 酸 铵 流 动 相 相 比, 使 用 乙 酸 时 的 灵 敏 度 比 使 用 乙 酸 铵 时 的 灵 敏 度 高 五 倍 104

10 2 1 1 0.2% HCOOH S/N = 111 0.5 0 10 2 1 1 0.2% CH 3 COOH S/N = 155 0.5 响应 0 10 2 1 1 0.02% CF3 COOH S/N = 68 0.5 0 10 2 1 1 10 mm CH3 COONH4 ph 3.6 使用 10 mm CH3COOH 调节 ph S/N = 33 0.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 采集时间 (min) 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 图 69. 筛选可兼容 LC/MS 的流动相用于采用 ESI 和 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色谱柱的茶叶分析法 APCI-MS 和 APPI-MS 的溶剂选择 APCI 和 APPI 通常用于 ESI-MS 无法充分电离的弱极性分子 某些液相色谱流动相 如乙腈 可能不适用于 此类离子源 甲醇是分析时可以尝试的首选溶剂 与 ESI 类似 APCI 和 APPI 不兼容非挥发性缓冲液 然而 与 ESI 不同的是 APCI 和 APPI 可采用更宽范围的缓冲液浓度 最高可达 100 mm 以及更高的流速 最高 可达 1.5 ml/min 当采用 0.75 ml/min 以上的流速时 APCI 和 APPI 的灵敏度比 ESI 更高 而且噪音更低 出 于安全考虑 应避免使用高度易燃的溶剂 离子对色谱与质谱联用系统的溶剂选择 使用离子对色谱和液质联用系统时 流动相中必须包含非挥发性离子对试剂 如烷基磺酸盐或四烷基铵盐 常用的流动相包括七氟丁酸 (HFBA) 和三丁胺 (TBA) 离子对试剂可能会干扰电离过程 如果这种干扰会影 响分析结果 那么可以转而使用 HILIC 进行色谱分析 105

样 品 前 处 理 如 前 文 所 述, 适 当 选 择 流 动 相 缓 冲 液 和 ph 对 于 获 得 稳 定 灵 敏 的 质 谱 性 能 至 关 重 要 样 品 前 处 理 对 于 成 功 实 施 HPLC-UV-MS 分 析 也 非 常 重 要, 样 品 前 处 理 不 当 可 能 导 致 离 子 信 号 抑 制 或 干 扰 在 进 行 ESI-MS 分 析 之 前 需 要 考 虑 的 主 要 因 素 是 基 质 组 分 和 浓 度 问 题 基 质 组 分 盐 类 会 抑 制 电 离 过 程, 表 面 活 性 剂 会 干 扰 蒸 发 过 程, 而 高 分 析 物 浓 度 会 导 致 检 测 器 饱 和 一 些 可 清 除 基 质 效 应 盐 类 和 表 面 活 性 剂 效 应 的 典 型 技 术 包 括 超 滤 溶 剂 萃 取 或 脱 盐 液 液 萃 取 固 相 萃 取 (SPE) 免 疫 亲 和 柱 上 浓 缩 和 色 谱 柱 切 换 (LC/LC) 如 果 无 法 避 免 盐 类 和 表 面 剂, 可 使 用 色 谱 法 ( 使 用 短 色 谱 柱 即 可 ) 或 截 止 过 滤 器 将 其 去 除 浓 度 问 题 为 了 解 决 浓 度 问 题, 应 使 用 液 相 色 谱 方 法 中 一 开 始 就 存 在 的 溶 剂 组 分 对 样 品 进 行 稀 释 关 于 离 子 抑 制 的 注 意 事 项 离 子 抑 制 是 目 标 化 合 物 离 子 化 效 率 下 降 对 LC/MS 检 测 器 造 成 的 不 良 结 果 产 生 信 号 抑 制 的 原 因 可 能 是 流 动 相 或 样 品 基 质 中 的 组 分 与 分 析 物 产 生 了 竞 争, 或 是 抑 制 了 分 析 物 的 离 子 化 尽 管 引 起 离 子 抑 制 效 应 的 确 切 化 学 和 物 理 原 因 尚 不 明 确, 但 我 们 仍 然 应 该 尽 可 能 地 避 免 目 标 分 析 物 与 其 他 潜 在 的 抑 制 物 质 发 生 共 洗 脱 在 LC/MS 分 析 之 前 对 复 杂 样 品 进 行 色 谱 分 离 是 避 免 离 子 抑 制 效 应 的 一 种 有 效 方 法 另 外, 稀 释 样 品 和 降 低 流 速 也 可 减 少 电 离 过 程 中 会 产 生 抑 制 效 应 的 物 质 的 数 量 106

使 用 配 备 高 效 色 谱 柱 的 LC/MS 时 的 注 意 事 项 灵 敏 度 的 提 升 LC/MS 是 一 种 灵 敏 的 技 术, 非 常 适 合 分 析 低 浓 度 化 合 物 将 LC/MS 与 高 效 UHPLC 色 谱 柱 联 用 能 够 进 一 步 提 升 灵 敏 度 图 70 显 示 了 吗 啡 代 谢 物 (M3G, M6G) 的 分 析 结 果, 与 传 统 5 µm 色 谱 柱 相 比, 高 效 亚 2 µm UHPLC 色 谱 柱 生 成 了 更 高 更 尖 锐 的 峰 这 些 分 析 采 用 的 方 法 参 数 ( 包 括 固 定 相 化 学 性 质 ) 均 相 同, 唯 一 的 变 量 是 粒 径 M3G 和 M6G 为 同 量 异 位 物 质, 因 此 在 同 一 质 量 数 (m/z 462) 处 被 检 出 将 这 些 EIC 调 整 为 相 同 的 刻 度 之 后, 我 们 不 仅 能 够 更 明 显 地 看 出 小 粒 径 色 谱 柱 带 来 的 峰 宽 改 善, 还 能 看 到 峰 高 的 差 异 比 较 灵 敏 度 最 低 的 M6G 峰 的 信 噪 比 之 后 我 们 发 现, 与 传 统 5 µm 色 谱 柱 相 比, 高 效 亚 2 µm UHPLC 色 谱 柱 能 够 将 质 谱 灵 敏 度 提 高 五 倍 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,2.1 100 mm,5 µm 压 力 :90 bar 响 应 (%) 响 应 (%) 响 应 (%) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,2.1 100 mm,3.5 µm 压 力 :160 bar Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18,2.1 100 mm,1.8 µm 压 力 :480 bar 采 集 时 间 (min) 图 70. 吗 啡 代 谢 物 的 分 析 结 果, 表 明 使 用 填 充 亚 2 µm 颗 粒 的 高 效 UHPLC 色 谱 柱 能 够 提 高 灵 敏 度 107

质 谱 扫 描 速 率 为 了 充 分 利 用 液 质 联 用 系 统, 我 们 必 须 仔 细 优 化 各 个 方 法 参 数 使 用 高 效 色 谱 柱 时, 通 过 适 当 设 置 较 快 的 数 据 采 集 速 率 以 采 集 足 可 覆 盖 整 个 窄 峰 的 数 据 点 对 于 生 成 可 靠 的 结 果 至 关 重 要 图 71 显 示 了 快 速 分 离 茶 叶 中 的 10 种 常 见 儿 茶 酚 的 结 果 图 中 显 示 了 各 种 数 据 采 集 速 率 对 色 谱 分 析 ( 包 括 UV MS 扫 描 MS SIM 和 MS/MS 检 测 模 式 ) 质 量 的 影 响 在 所 有 模 式 下 都 可 以 看 到 相 同 的 特 征 质 谱 仪 的 数 据 采 集 速 率 超 出 了 该 快 速 分 析 所 需 的 采 集 速 率, 以 致 于 过 快 的 数 据 采 集 速 率 采 集 了 过 多 的 数 据 点, 给 分 析 带 来 了 负 面 影 响 最 快 的 数 据 采 集 速 率 生 成 了 最 窄 的 峰, 然 而, 最 快 的 数 据 采 集 速 率 产 生 的 基 线 噪 音 也 最 多, 导 致 信 噪 比 下 降 如 果 对 分 析 而 言 灵 敏 度 是 最 重 要 因 素, 则 应 当 使 用 稍 低 的 数 据 采 集 速 率, 尽 管 这 样 意 味 着 峰 宽 会 略 有 增 加 UV 数 据 采 集 速 率 质 谱 扫 描 速 率 MS SIM 驻 留 时 间 MS/MS dmrm 分 析 周 期 图 71. 使 用 Agilent ZORBAX RRHD SB-C18 色 谱 柱 分 析 茶 叶 中 常 见 的 10 种 儿 茶 酚 系 统 扩 散 为 了 实 现 理 想 的 LC/MS 分 析, 除 了 优 化 方 法 参 数 之 外, 还 应 考 虑 仪 器 硬 件 系 统 柱 外 体 积 会 显 著 影 响 小 体 积 高 效 色 谱 柱 ( 如 内 径 2.1 mm 的 亚 2 µm 色 谱 柱 ) 的 分 离 效 果 图 72 显 示 了 吗 啡 及 其 代 谢 物 的 LC/MS/MS 分 析 结 果, 分 析 时 分 别 使 用 的 是 配 备 0.12 mm 内 径 毛 细 管 的 标 准 液 相 色 谱 仪 以 及 配 备 0.075 mm 内 径 短 毛 细 管 的 低 扩 散 优 化 仪 器 低 扩 散 液 质 联 用 系 统 所 得 的 色 谱 峰 明 显 更 高 更 窄 由 于 低 扩 散 系 统 的 样 品 流 路 体 积 更 小, 因 此 其 保 留 时 间 略 有 缩 短 提 取 MRM 色 谱 图 突 出 显 示 了 通 过 最 大 程 度 减 小 LC/MS 分 析 的 系 统 扩 散 来 优 化 UHPLC 色 谱 柱 性 能 的 重 要 性 尽 管 质 谱 一 般 都 能 分 离 共 洗 脱 峰, 但 在 本 例 中,M6G 和 M3G 为 同 量 异 位 物 质, 而 且 具 有 相 同 的 定 量 和 定 性 离 子 对, 因 此 我 们 需 要 使 其 实 现 色 谱 基 线 分 离 将 柱 外 体 积 减 小 60% 能 够 将 这 两 个 峰 的 分 离 度 提 高 37%, 并 且 将 灵 敏 度 提 高 30% 108

默 认 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 系 统 与 Agilent 6410A 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 压 力 最 大 = 230 bar 响 应 优 化 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 系 统 与 Agilent 6410A 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 压 力 最 大 = 240 bar 采 集 时 间 (min) 响 应 采 集 时 间 (min) 图 72. 使 用 标 准 及 优 化 的 Agilent 1290 Infinity 液 相 色 谱 对 吗 啡 及 其 代 谢 物 进 行 LC/MS/MS 分 析 的 结 果 比 较 标 准 1290 Infinity 液 相 色 谱 配 置 0.12 mm 内 径 的 毛 细 管, 而 经 过 优 化 的 超 低 扩 散 1290 Infinity 液 相 色 谱 配 置 0.075 mm 内 径 的 短 毛 细 管, 将 柱 外 体 积 减 小 了 60% 分 流 阀 用 法 和 价 值 所 有 安 捷 伦 液 质 联 用 仪 均 配 备 分 流 阀 液 相 色 谱 流 动 相 在 到 达 离 子 源 之 前 将 通 过 分 流 阀 不 应 使 流 动 相 绕 过 分 流 阀 直 接 到 达 雾 化 器, 因 为 该 阀 具 有 非 常 重 要 的 作 用 当 运 行 的 LC/MS 方 法 洗 脱 大 量 的 非 目 标 化 合 物 时, 您 可 以 将 这 些 化 合 物 引 入 废 液 瓶 分 析 人 员 不 希 望 这 些 化 合 物 进 入 离 子 源, 将 它 们 引 至 废 液 瓶 可 降 低 离 子 源 需 要 清 洁 的 频 率 此 外, 分 析 人 员 可 能 不 需 要 采 集 这 些 化 合 物 的 质 谱 数 据, 此 时 可 关 闭 保 存 谱 图 功 能 以 节 省 磁 盘 空 间 这 些 功 能 位 于 软 件 的 时 间 段 选 项 卡 中 LC/MS 软 件 扫 描 类 型 比 较 TIC EIC 和 SIM 总 离 子 流 色 谱 图 (TIC) 将 扫 描 仪 器 范 围 内 用 户 所 选 的 整 个 分 子 量 范 围 如 果 化 合 物 的 分 子 量 已 知, 可 使 用 提 取 离 子 色 谱 图 (EIC) 从 复 杂 的 TIC 色 谱 图 中 分 离 出 特 定 的 分 析 物, 得 到 仅 含 特 定 分 子 量 的 离 子 的 简 化 色 谱 图 图 73 显 示 了 在 0.4 分 钟 内 快 速 分 离 15 种 镇 痛 化 合 物 的 结 果 分 析 设 置 了 足 够 快 的 质 谱 扫 描 速 率, 目 的 是 采 集 足 以 覆 盖 这 些 窄 峰 的 数 据 点 ( 即 使 是 存 在 共 洗 脱 峰 的 情 况 下 ), 以 确 保 得 到 可 靠 的 数 据 上 方 的 TIC 中 有 多 个 部 分 共 洗 脱 峰 ( 特 别 是 托 美 汀 周 围 ), 以 红 色 箭 头 标 出 由 于 各 化 合 物 是 通 过 其 独 有 的 质 量 数 进 行 鉴 定 的, 因 此 分 析 人 员 可 通 过 EIC 单 独 查 看 各 种 组 分, 如 下 方 色 谱 图 中 仅 针 对 托 美 汀 的 EIC (m/z 257) 所 示 通 过 单 独 查 看 EIC, 分 析 人 员 能 够 轻 松 地 对 任 何 化 合 物 进 行 积 分 和 定 量 分 析 109

响 应 TIC 扫 描 P = 1072 bar 最 大 采 集 时 间 (min) 所 有 15 种 化 合 物 的 EIC 叠 加 图 响 应 采 集 时 间 (min) 图 73. 使 用 填 充 1.8 µm 颗 粒 的 Agilent ZORBAXRRHD Eclipse Plus C18 色 谱 柱 在 0.4 分 钟 内 快 速 分 离 15 种 镇 痛 化 合 物 的 结 果 m/z 257( 托 美 汀 ) 的 单 独 EIC TIC 模 式 在 分 析 复 杂 样 品 时 ( 尤 其 是 可 能 存 在 未 知 物 时 ) 很 有 用 当 方 法 以 某 种 已 知 的 分 析 物 为 目 标 时, 我 响 应 们 可 以 将 LC/MS 设 置 为 选 择 离 子 监 测 (SIM) 模 式, 该 模 式 仅 采 集 目 标 分 析 物 的 数 据, 可 得 到 类 似 于 EIC 的 色 谱 图 SIM 模 式 可 同 时 监 测 多 种 离 子, 并 且 数 据 可 显 示 为 复 合 色 谱 图 或 单 独 EIC 在 SIM 模 式 下 使 用 LC/MS 采 集 时 间 (min) 的 优 势 与 通 过 TIC 模 式 提 取 EIC 相 反,SIM 模 式 能 够 为 用 户 提 供 针 对 目 标 分 析 物 的 更 高 的 灵 敏 度 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 在 执 行 非 目 标 筛 查 时, 化 合 物 鉴 定 给 我 们 带 来 了 一 定 的 挑 战 我 们 可 通 过 购 买 标 样 建 立 谱 图 来 协 助 化 合 物 的 鉴 定 然 而, 许 多 实 验 室 缺 少 购 买 和 测 试 新 标 样 的 资 源 或 时 间 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 (PCDL) 能 够 利 用 精 确 质 量 MS/MS 谱 库 更 可 靠 地 鉴 定 目 标 化 合 物, 以 及 更 灵 活 地 创 建 可 定 制 的 PCD 和 PCDL 第 三 方 PCDL 的 实 例 包 括 METLIN 代 谢 组 学 数 据 库 以 及 由 Broecker Herre 和 Pragst 发 布 的 法 医 和 毒 理 学 PCD/PCDL 安 捷 伦 还 与 研 究 人 员 合 作 开 发 有 用 的 PCDL 用 于 热 点 污 染 物 ( 如 真 菌 毒 素 和 化 学 合 成 毒 品 ) 的 检 测 110

图 74. MassHunter 定 性 分 析 软 件, 常 用 的 MassHunter 工 作 站 软 件 套 装 中 的 组 件, 其 使 用 精 确 质 量 保 留 时 间 同 位 素 模 式 和 MS/MS 数 据 实 现 高 可 信 度 的 代 谢 物 鉴 定 111

色 谱 结 果 的 保 护 重 现 性 是 色 谱 最 重 要 的 性 质 之 一 要 获 得 良 好 的 重 现 性 首 先 要 有 高 质 量 的 色 谱 柱 和 耐 用 的 HPLC 方 法 有 一 些 能 帮 助 您 提 高 重 现 性, 并 延 长 柱 寿 命 的 方 法 在 本 章 中, 我 们 将 按 工 作 流 程 的 顺 序 对 这 些 方 法 进 行 讨 论 : 可 扩 展 性 使 用 高 纯 度 溶 剂 UHPLC 溶 剂 的 特 殊 注 意 事 项 在 线 滤 头 入 口 筛 板 保 护 柱 溶 剂 饱 和 柱 然 后, 我 们 将 讨 论 如 何 保 护 色 谱 柱 : 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 如 需 获 取 安 捷 伦 样 品 前 处 理 手 册 (5991-3326CHCN) 的 副 本, 请 访 问 www.agilent.com/chem/sampleprepbook 疏 通 色 谱 柱 色 谱 柱 受 损 的 警 告 信 号 我 们 将 用 几 个 字 来 概 括 当 在 实 验 室 间 进 行 转 移 时 如 何 进 行 保 护 : 如 需 了 解 安 捷 伦 样 品 前 处 理 产 品 系 列 的 更 多 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/sampleprep 确 保 方 法 在 世 界 范 围 的 重 现 性 批 间 保 留 或 选 择 性 的 变 化 112

可 扩 展 性 过 去 5 到 7 年 以 来, 随 着 越 来 越 多 的 用 户 开 始 在 分 析 方 法 中 应 用 表 面 多 孔 色 谱 柱 (SPP), 这 类 色 谱 柱 发 展 非 常 迅 猛 许 多 用 户 都 体 会 到 了 此 类 色 谱 柱 与 传 统 全 多 孔 色 谱 柱 相 比 的 优 势 在 开 发 新 方 法 时, 人 们 更 倾 向 于 采 用 SPP 色 谱 柱, 因 为 它 们 的 普 适 性 已 经 超 越 了 亚 2 µm 色 谱 柱 SPP 色 谱 柱 的 这 种 优 势 得 益 于 其 高 稳 定 性 高 效 低 背 压 的 特 点 然 而, 也 有 许 多 用 户 选 择 使 用 现 代 2.7 µm SPP 色 谱 柱, 原 因 是 考 虑 到 此 类 色 谱 柱 相 比 传 统 5 µm 填 料 色 谱 柱 的 柱 压 更 高 安 捷 伦 最 近 推 出 了 Poroshell 120 4 µm 色 谱 柱 系 列 该 系 列 产 品 丰 富 了 Poroshell 120 平 台, 为 色 谱 工 作 者 和 方 法 开 发 人 员 提 供 了 可 扩 展 的 解 决 方 案 这 一 平 台 扩 展 最 初 包 括 EC-C18 EC-C8 Phenyl-Hexyl PFP 和 HILIC 化 学 键 合 相, 让 用 户 能 够 非 常 轻 松 地 开 始 应 用 Poroshell 120 系 列 产 品 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 的 柱 压 仅 为 2.7 µm Poroshell 120 色 谱 柱 的 50%, 效 率 却 几 乎 是 传 统 全 多 孔 色 谱 柱 的 两 倍, 对 于 想 要 适 当 提 升 分 析 性 能 的 用 户 而 言, 在 方 法 中 应 用 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 是 一 个 简 单 有 效 的 解 决 方 案 将 方 法 转 换 至 Poroshell 120 系 列 相 比 而 言 更 加 直 观 简 便 的 关 键 在 于 转 换 过 程 非 常 简 单, 可 扩 展 性 和 方 法 转 换 的 简 便 性 是 关 键 所 在 Poroshell 120 的 固 定 相 化 学 组 成 可 扩 展 为 其 他 ZORBAX 固 定 相 化 学 组 成, 因 此 从 原 来 的 全 多 孔 5 µm 色 谱 柱 进 行 方 法 转 换 的 过 程 尤 为 直 观 图 75 展 示 了 Eclipse Plus C18 与 Poroshell 120 EC- C18 相 比 的 可 扩 展 性 条 件 1. 抗 坏 血 酸 2. 安 赛 蜜 3. 糖 精 4. 对 羟 基 苯 甲 酸 5. 咖 啡 因 6. 苯 甲 酸 图 75. 从 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,5 µm 色 谱 柱 ( 上 图 ) 到 Poroshell 120,4 µm( 下 图 ) 的 可 扩 展 性 (0.2% 甲 酸, 甲 醇 35%, 两 种 色 谱 柱 均 为 4.6 x 100 mm, 流 速 :Eclipse Plus 1.45 ml/min,poroshell 120 1.2 ml/min) 这 表 明 方 法 转 换 的 简 便 性 得 到 了 极 大 提 升, 我 们 可 将 现 有 的 方 法 从 原 来 的 Eclipse Plus 系 列 色 谱 柱 轻 松 转 换 至 更 加 现 代 化 性 能 更 出 色 的 Poroshell 120 系 列 进 行 方 法 转 换 时, 从 一 种 固 定 相 到 另 一 种 固 定 相 的 可 扩 展 性 固 然 重 要, 粒 径 之 间 的 可 扩 展 性 也 不 容 小 觑 分 析 方 法 在 机 构 中 乃 至 全 球 各 地 进 行 转 换 时, 可 能 需 要 在 各 种 不 同 的 仪 器 上 运 行 因 此, 色 谱 工 作 者 通 常 都 需 要 确 保 某 种 色 谱 柱 固 定 相 有 多 种 粒 径 可 选 Poroshell 120 化 学 键 合 相 提 供 2.7 µm 和 4 µm 规 格 供 用 户 选 择, 不 同 粒 径 之 间 可 轻 松 实 现 扩 展, 从 而 增 强 了 Poroshell 120 系 列 的 灵 活 性 实 例 见 图 76 113

条件 流动相 50:49:1 MeCH:H20: 乙酸 流速 1.2 ml/min 采用传统方法分析萘普生 N = 10639 Rs = 13.7 mau 60 50 40 Eclipse Plus C18 5 µm 4.6 x 150 mm USP 规定使用的色谱柱 30 96 bar 20 10 0 0 mau 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 N = 19054 Rs = 16.9 1 压力仅增加约 50% 2 3 4 5 6 N = 13186 Rs = 14.2 mau 60 50 40 20 9 min 1. 萘普生 2. 丁酰苯 7 8 165 bar 9 min Poroshell 120 4 µm 4.6 x 100 mm 效率更高 30 8 Poroshell 120 4 µm 4.6 x 150 mm 效率提升 2 倍 0 7 相同的背压 98 bar 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min 图 76. Agilent Poroshell 120 4 µm 可随时替换传统的 5 µm 色谱柱 采用本方法对萘普生进行 USP 分析时 过去通常使用 5 µm 全多孔色谱柱 但在本例中 我们使用 4.6 x 150 mm 5 µm 的 C18 代表传统方法 使用 5 µm Eclipse Plus C18 色谱柱进行分析时 您可以看到所有的方法 要求均轻松满足 将方法转换到 4 µm Poroshell 120 EC-C18 色谱柱时 不仅维持了原来的选择性 还将效率 提升了近 2 倍 因此 我们使用稍短的色谱柱即可实现更快的分析 4 µm Poroshell 120 色谱柱的分析速度 虽然不如 2.7 µm Poroshell 120 色谱柱 但它仅采用 2.6 或 2.7 µm 表面多孔色谱柱约 50% 的背压 可实现比 5 µm 色谱柱更高的分离度和效率 图 77 展示了使用 2.7 µm 和 4 µm Poroshell 120 色谱柱代替 5 µm 色谱柱进行分析的另一个例子 这个例子 分析了牛奶中的喹诺酮类物质 114

初 始 压 力 : 309 bar R3,4+1.97 PW: 0.0648 min Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7 µm 0 2 4 6 8 10 12 14 min 初 始 压 力 : 173 bar R3,4+1.63 PW: 0.0819 min Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 4 µm 0 2 4 6 8 10 12 14 min 图 77. 使 用 Agilent Poroshell 120 EC-C18,4 µm 和 2.7 µm 色 谱 柱 分 析 牛 奶 中 的 喹 诺 酮 类 物 质 采 用 这 种 梯 度 和 方 法,2.7 µm 和 4 µm Poroshell 120 色 谱 柱 之 间 的 可 扩 展 性 是 可 预 见 的 此 外, 对 于 这 一 特 定 的 分 析, 我 们 可 以 看 到 2.7 µm Poroshell 120 色 谱 柱 增 大 了 峰 宽 和 分 离 度, 但 4 µm 色 谱 柱 的 背 压 更 低 可 扩 展 性 对 于 提 升 方 法 开 发 的 灵 活 性 而 言 非 常 重 要 色 谱 柱 产 品 系 列 稳 定 可 预 见 的 可 扩 展 性 有 助 于 我 们 在 不 同 粒 径 的 色 谱 柱 之 间 无 缝 地 进 行 方 法 转 换, 同 时 在 适 用 的 系 统 中 维 持 最 佳 的 性 能 对 于 未 经 优 化 的 旧 系 统,Poroshell 120 4 µm 是 提 高 分 离 性 能 的 理 想 解 决 方 案, 而 且 方 法 可 在 未 来 轻 松 转 换 至 Poroshell 120 2.7 µm 色 谱 柱, 性 能 和 选 择 性 均 可 预 测, 能 够 将 方 法 优 化 和 方 法 转 换 的 难 度 降 至 最 低 115

使 用 高 纯 度 级 别 溶 剂 的 重 要 性 一 般 来 讲,HPLC 应 用 中 只 应 使 用 色 谱 级 及 以 上 级 别 的 溶 剂 过 滤 所 有 缓 冲 液, 最 好 使 用 0.22 µm 滤 膜, 特 别 是 对 于 UHPLC 应 用, 标 准 HPLC 应 用 可 使 用 0.45 µm 滤 膜 色 谱 级 及 以 上 的 有 机 溶 剂 一 般 不 需 要 过 滤, 如 果 过 滤 使 用 的 滤 膜 和 玻 璃 容 器 不 是 色 谱 级 的, 过 滤 反 而 可 能 带 来 污 染 物 记 住, 要 适 当 冲 洗 色 谱 柱 一 天 分 析 结 束 时, 将 缓 冲 液 从 系 统 中 冲 洗 出 去, 使 其 处 于 水 / 有 机 流 动 相 环 境 使 用 与 样 品 溶 剂 相 溶 的 流 动 相 ( 参 见 本 指 南 封 底 的 参 考 流 程 ) 如 果 流 动 相 A 只 用 水 或 最 多 含 5% 的 乙 醇, 将 其 留 在 系 统 中 较 长 一 段 时 间 后, 将 会 长 菌 这 将 带 来 压 力 问 题, 并 很 难 去 除, 因 此, 一 定 要 确 保 每 天 或 至 少 每 两 天 新 配 缓 冲 液 UHPLC 的 特 殊 考 虑 由 于 高 效 柱 中 填 料 粒 径 太 小, 色 谱 柱 两 端 需 要 用 更 小 的 筛 板 阻 挡 它 们 同 时 筛 板 也 能 起 到 阻 止 颗 粒 物 进 入 系 统 的 作 用, 避 免 引 起 压 力 升 高 所 以, 对 于 更 高 压 力 的 UHPLC 应 用 而 言, 防 止 污 染 物 进 入 系 统 变 得 更 为 重 要 安 捷 伦 建 议 在 UHPLC 应 用 中 只 使 用 认 证 的 色 谱 / 质 谱 级 溶 剂 一 定 要 检 查 溶 剂 供 应 商 是 否 提 供 以 下 证 书 : 低 溶 剂 和 金 属 杂 质, 以 减 少 对 痕 量 或 未 知 样 品 的 干 扰 痕 量 金 属 指 标 极 低 不 超 过 5 ppb 正 离 子 模 式 和 负 离 子 模 式 性 能 指 标 LC-MS 测 试 和 其 它 QC 测 试 (QC 测 试 项 目 越 多, 溶 剂 越 好!) 溶 剂 和 缓 冲 液 使 用 提 示 : 过 滤 水 性 流 动 相 ( 包 括 缓 冲 液 ) 0.45 µm 用 于 标 准 HPLC,0.2 µm 用 于 UHPLC 使 用 缓 冲 液 会 增 加 色 谱 柱 堵 塞 的 风 险 务 必 确 保 缓 冲 液 浓 度 不 会 导 致 溶 剂 中 的 缓 冲 盐 析 出 制 备 流 动 相 时, 一 定 要 始 终 严 格 遵 循 操 作 程 序, 比 如 溶 剂 的 加 入 顺 序 水 性 流 动 相 会 生 长 藻 类 和 细 菌, 尤 其 当 ph 在 4-8 范 围 时 定 期 更 换 缓 冲 液 ( 建 议 每 2 天 更 换 一 次 ), 始 终 使 用 干 净 的 器 皿 使 用 棕 色 瓶 盛 装 水 性 流 动 相 116

在 线 过 滤 器 在 自 动 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 安 装 在 线 过 滤 器 可 以 捕 集 颗 粒 物, 防 止 其 流 入 柱 头, 阻 塞 筛 板 如 果 您 使 用 的 是 3.5 µm 柱, 应 配 置 2 µm 筛 板 1.8 µm 柱 使 用 0.5 µm 筛 板 安 装 在 1290 Infinity 液 相 色 谱 上 的 1290 在 线 过 滤 器 低 体 积 在 线 过 滤 器 过 滤 器 可 用 于 所 有 色 谱 柱, 以 保 护 色 谱 柱 不 被 颗 粒 物 堵 塞 在 线 过 滤 器 通 过 防 止 颗 粒 物 ( 来 自 未 过 滤 的 样 品 和 洗 脱 液, 或 两 者 ) 堵 塞 柱 筛 板 而 延 长 分 析 柱 寿 命 使 用 保 护 柱 可 能 影 响 柱 体 积 极 低 和 粒 径 极 小 色 谱 柱 的 柱 效 对 于 这 些 色 谱 柱, 强 烈 建 议 使 用 低 体 积 在 线 过 滤 器 Agilent 1290 Infinity LC (PN 5067-4638) 的 在 线 过 滤 器 含 为 低 交 叉 污 染 而 设 计 的 0.3 µm 滤 膜 可 以 在 高 达 1300 bar 压 力 下 使 用, 死 体 积 1.3 µl 该 过 滤 器 也 可 用 于 Agilent 1260 和 1220 Infinity LC, 以 及 1200 RRLC 117

保 护 柱 脏 样 品 多 次 进 样 到 不 带 保 护 柱 的 分 析 柱 上 时, 会 缩 短 分 析 柱 的 寿 命 根 据 进 样 次 数 和 样 品 类 型, 色 谱 工 作 者 可 选 择 经 济 的 保 护 柱 在 分 析 柱 之 前 的 溶 剂 流 路 中 配 置 一 根 保 护 柱 保 护 柱 避 免 了 由 颗 粒 物 和 强 吸 附 物 质 造 成 的 损 坏 为 保 持 对 样 品 杂 质 有 足 够 的 容 量, 应 选 择 内 径 与 色 谱 柱 内 径 相 似 的 保 护 柱 理 想 情 况 下, 保 护 柱 的 填 料 应 与 分 析 柱 相 同, 从 而 使 分 析 柱 的 色 谱 性 能 不 发 生 改 变 保 护 柱 参 与 分 离, 因 此 在 方 法 开 发 时 就 应 在 线 安 装 保 护 柱 判 断 何 时 更 换 保 护 柱 可 能 比 较 困 难, 最 好 根 据 经 验 如 果 说 作 为 粗 略 判 断 标 准 的 话, 那 么 塔 板 数 压 力 或 分 离 度 的 改 变 超 过 10%, 就 需 要 更 换 保 护 柱 了 您 需 要 根 据 应 用 类 型 对 更 换 保 护 柱 的 频 率 做 出 判 断 尽 早 更 换 保 护 柱 总 比 晚 更 换 好 UHPLC 的 快 速 保 护 柱 保 护 分 析 柱 溶 剂 饱 和 柱 如 果 您 使 用 的 是 极 端 流 动 相 条 件, 如 在 ph 7, 温 度 在 40 C 以 上, 以 及 缓 冲 盐 浓 度 超 过 50 mm 时, 可 以 使 用 溶 剂 或 硅 胶 饱 和 柱 对 分 析 柱 进 行 保 护 溶 剂 饱 和 柱 安 装 于 泵 和 进 样 器 之 间, 流 动 相 流 过 时 释 放 硅 胶, 在 这 一 过 程 中 使 流 动 相 饱 和 这 样 可 以 防 止 分 析 柱 中 的 硅 胶 溶 解, 延 长 柱 寿 命 溶 剂 饱 和 柱 会 增 加 驻 留 体 积, 对 梯 度 有 延 迟 作 用, 使 用 梯 度 时 这 是 个 缺 点 在 方 法 转 换 过 程 中 应 将 这 一 增 加 的 驻 留 体 积 考 虑 在 内, 以 确 保 重 现 性 色 谱 柱 入 口 筛 板 如 果 没 有 保 护 柱 或 在 线 柱 前 过 滤 器, 在 使 用 HPLC 柱 时, 分 析 柱 可 能 发 生 堵 塞 由 于 现 在 使 用 的 是 高 效 装 柱 工 艺, 不 建 议 更 换 色 谱 柱 入 口 筛 板, 在 许 多 色 谱 柱 上 也 不 可 能 更 换 如 果 更 换 筛 板, 可 能 影 响 柱 效 色 谱 柱 保 护 和 保 存 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 现 代 色 谱 柱 都 很 耐 用, 采 用 的 设 计 在 常 用 色 谱 条 件 下 都 可 长 期 使 用 在 其 性 能 指 标 范 围 内 操 作 可 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 在 确 定 最 终 方 法 时 一 定 要 再 查 验 一 下 这 些 性 能 指 标 118

提 示 使 用 保 护 柱 和 / 或 0.5 µm 在 线 过 滤 器 附 加 信 息 参 见 第 117 页 保 护 柱 章 节 经 常 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 使 用 100% B 溶 剂, 如 果 怀 疑 压 力 升 高, 使 用 更 强 溶 剂 参 见 第 58 页 的 色 谱 柱 清 洗 指 南 对 脏 样 品 进 行 预 处 理, 最 大 限 度 减 少 强 保 留 组 分 和 颗 粒 按 照 色 谱 柱 生 产 商 的 温 度 上 限 指 标 进 行 操 作 使 用 固 相 萃 取 液 - 液 萃 取 用 0.45 µm 滤 膜 (UHPLC 用 0.22 µm 滤 膜 ) 过 滤 样 品, 或 高 速 离 心 许 多 新 方 法 都 要 求 较 高 温 度, 某 些 色 谱 柱 可 以 承 受 高 温, 理 想 情 况 下, 应 在 温 度 上 限 指 标 之 下 操 作 色 谱 柱 在 压 力 上 限 之 下 使 用 色 谱 柱 选 择 使 压 力 低 于 压 力 上 限 的 流 速, 最 好 低 10% 按 标 注 方 向 操 作 色 谱 柱, 查 阅 色 谱 柱 说 明 书 或 咨 询 厂 商, 以 确 定 色 谱 柱 是 否 可 以 反 冲 使 用 ph 2-7 的 流 动 相, 可 最 大 限 度 地 延 长 柱 寿 命 使 用 新 鲜 溶 剂, 以 防 止 细 菌 生 长 贮 存 色 谱 柱 时, 应 先 冲 出 盐 和 缓 冲 液 柱 内 只 保 留 纯 乙 腈, 或 纯 水 与 乙 腈 50/50 混 合 溶 剂 使 用 高 温 时 一 定 要 逐 渐 升 高 柱 温, 而 且 仅 在 用 流 动 相 洗 脱 时 进 行 色 谱 柱 接 入 仪 器 时, 两 端 接 头 不 要 拧 得 过 紧 使 用 短 柄 扳 手, 以 防 两 端 接 头 过 紧 如 果 您 有 问 题, 一 定 要 询 问 厂 商 如 果 您 需 要 在 超 过 此 ph 范 围 的 条 件 下 工 作, 可 使 用 StableBond 柱 ( 用 于 低 ph 条 件 ) 或 为 高 ph 而 设 计 的 色 谱 柱 ( 如,Eclipse Extend-C18) 或 聚 合 物 色 谱 柱 为 防 止 细 菌 生 长, 可 配 制 流 动 相 贮 备 液, 并 将 其 保 存 在 冰 箱 中, 需 要 时 每 天 使 用 用 叠 氮 钠 也 可 以 防 止 细 菌 生 长, 但 其 具 有 致 癌 性, 须 小 心 使 用 这 样 可 以 防 止 缓 冲 盐 在 柱 内 沉 淀 乙 腈 是 色 谱 柱 保 存 的 良 好 溶 剂, 因 为 水 和 醇 类 流 动 相 可 能 提 高 固 定 相 水 解 速 率 分 析 完 成 后, 让 流 动 相 继 续 洗 脱, 直 到 回 到 室 温 由 于 色 谱 柱 的 柱 端 螺 母 为 3/8 英 寸, 应 使 用 3/8 英 寸 短 扳 手 将 色 谱 柱 接 入 仪 器, 不 要 将 柱 端 接 头 拧 得 过 紧 表 10. 延 长 柱 寿 命 的 提 示 119

保 存 注 意 事 项 为 防 止 金 属 腐 蚀, 应 避 免 将 色 谱 柱 长 期 保 存 在 含 卤 素 溶 剂 中 ( 如, 丁 酰 氯 二 氯 甲 烷 等 ) 如 果 使 用 了 含 缓 冲 液 的 流 动 相, 应 使 用 20 到 30 倍 柱 体 积 的 乙 腈 和 水 冲 洗 色 谱 柱, 然 后 用 同 样 体 积 的 纯 有 机 溶 剂 冲 洗 缓 冲 液 残 留 在 色 谱 柱 内, 将 促 使 细 菌 生 长, 使 色 谱 柱 或 筛 板 堵 塞, 或 导 致 鬼 峰 的 出 现 可 以 用 大 多 数 其 他 溶 剂 保 存 未 键 合 的 硅 胶 柱 但 不 能 保 存 在 容 易 发 生 降 解 的 溶 剂 中, 如,THF TEA 或 TFA 如 需 过 夜 保 存, 不 要 将 色 谱 柱 停 止 运 行, 您 可 以 使 流 动 相 流 经 色 谱 柱, 保 持 流 速 在 0.1 到 0.2 ml/min 这 样 还 可 以 缩 短 第 二 天 的 平 衡 时 间 如 需 长 期 保 存, 应 使 用 厂 商 推 荐 的 溶 剂, 通 常 是 新 柱 装 运 时 所 用 的 溶 剂 疏 通 色 谱 柱 如 果 反 压 升 高, 您 怀 疑 发 生 了 色 谱 柱 堵 塞 时, 可 以 进 行 反 冲 断 开 色 谱 柱 与 检 测 器 之 间 的 连 接, 将 流 动 相 从 反 方 向 泵 入 色 谱 柱 ( 如 果 厂 商 说 明 这 样 操 作 没 有 问 题 的 话 ) 如 需 了 解 清 洗 色 谱 柱 的 更 多 信 息, 请 参 见 第 60 页 色 谱 柱 变 坏 时 的 快 速 检 查 除 了 保 存 色 谱 柱 刚 刚 使 用 时 的 柱 性 能 测 试 色 谱 图 ( 见 第 122 页 ) 外, 您 还 可 以 根 据 色 谱 的 基 本 概 念, 以 评 估 色 谱 柱 是 否 需 要 更 换 : 参 数 理 论 塔 板 数,N( 柱 效 ) 保 留 因 子,k 选 择 性 因 子,α 拖 尾 因 子,Tf 柱 反 压,P 警 告 信 号 长 时 间 使 用 造 成 的 色 谱 柱 空 洞 和 污 染 将 降 低 柱 效 峰 展 宽 是 柱 效 降 低 的 信 号 通 过 监 测 N, 可 以 检 测 出 这 些 问 题 更 多 信 息 请 参 见 第 6 页 保 留 因 子 与 流 速 和 柱 尺 寸 无 关 k 值 改 变 说 明 可 能 由 于 未 洗 脱 化 合 物 出 现 了 键 合 相 流 失 或 柱 污 染 等 问 题 该 值 也 可 能 与 流 动 相 的 变 化 相 关, 造 成 色 谱 柱 出 问 题 的 假 象 详 见 第 7 页 选 择 性 因 子 的 偏 移 与 k 一 起, 是 键 合 相 流 失 柱 污 染 或 流 动 相 条 件 改 变 的 另 一 个 标 志, 详 见 第 7 页 拖 尾 因 子 是 用 来 说 明 峰 对 称 性 的 拖 尾 因 子 增 大 说 明 色 谱 柱 出 现 了 空 洞 问 题, 但 也 可 能 是 键 合 相 流 失 造 成 极 性 溶 质 和 硅 醇 基 位 点 相 互 作 用 的 结 果 柱 压 升 高 通 常 是 颗 粒 堵 塞 色 谱 柱 入 口 筛 板 造 成 的 但 柱 填 料 塌 陷 所 引 起 的 色 谱 柱 空 洞 也 可 以 引 起 压 力 的 较 大 波 动, 详 见 第 9 页 表 11. 有 助 于 监 测 柱 性 能 的 参 数 120

确 保 方 法 在 全 球 范 围 内 都 重 现 如 果 色 谱 柱 的 使 用 背 景 不 同 那 么 它 们 的 保 留 就 很 可 能 不 一 样, 如 果 在 方 法 开 发 时 使 用 的 色 谱 柱 被 另 一 根 色 谱 柱 代 替, 那 么 将 会 产 生 不 同 的 结 果 这 是 由 于 第 二 根 色 谱 柱 可 能 没 有 经 历 过 与 第 一 根 柱 相 似 的 使 用 背 景 在 开 发 方 法 的 过 程 中, 可 能 存 在 平 衡 不 足 或 不 一 致 的 情 况, 又 没 有 给 重 复 实 验 的 其 他 工 作 人 员 明 确 的 提 示 每 个 工 作 人 员 平 衡 其 色 谱 柱 的 时 间 可 能 不 同, 很 可 能 使 结 果 产 生 波 动 当 采 用 与 方 法 开 发 人 员 相 同 的 方 式 平 衡 色 谱 柱 后, 将 得 到 相 同 的 结 果 引 起 保 留 改 变 的 其 它 因 素 包 括, 由 于 方 法 可 能 不 耐 用, 导 致 色 谱 柱 / 流 动 相 组 合 不 好 ; 流 动 相 流 速 以 及 其 它 仪 器 参 数 发 生 改 变 ; 以 及 色 谱 柱 之 间 柱 床 体 积 略 有 不 同 等 提 高 方 法 的 耐 用 性 不 同 批 次 的 色 谱 柱 可 能 对 特 定 化 合 物 的 分 析 结 果 产 生 波 动 不 同 批 次 的 试 剂 也 可 能 存 在 影 响 色 谱 结 果 的 变 化 开 发 方 法 时, 良 好 的 习 惯 做 法 是 对 多 个 批 次 * 进 行 分 析, 并 评 估 分 析 条 件 是 否 可 以 承 受 不 同 批 次 的 微 小 变 化 生 产 厂 商 都 试 图 确 保 不 同 批 次 之 间 的 重 复 性, 但 差 异 的 存 在 不 可 避 免 谨 慎 的 方 法 开 发 将 有 助 于 避 免 将 来 出 现 的 相 关 问 题 评 估 批 次 之 间 的 变 化 时, 首 先 要 确 定 您 已 经 解 决 了 柱 与 柱 之 间 的 问 题 然 后 再 考 核 方 法 的 耐 用 性 如 果 您 分 析 的 是 可 离 子 化 的 化 合 物, 要 确 定 您 使 用 了 缓 冲 液, 其 ph 不 能 接 近 分 析 物 的 pk a 另 外, 要 检 查 样 品 和 色 谱 柱 对 ph 的 敏 感 性, 以 及 次 级 相 互 作 用 如 果 您 已 确 定 存 在 ph 敏 感 性 的 问 题, 可 能 需 要 对 方 法 进 行 重 新 评 价 在 本 例 中 ( 图 78), 批 次 之 间 的 变 化 与 ph 有 关 方 法 用 批 次 1 在 ph 4.5 条 件 下 开 发 回 想 一 下 前 面 讲 过 的 内 容, 硅 醇 基 对 ph 4.5 左 右 的 碱 性 化 合 物 具 有 活 性 ( 详 见 第 70 页 上 的 ph 与 方 法 ) 您 可 以 看 到 两 个 碱 性 化 合 物 都 具 有 良 好 峰 形 使 用 批 次 2 时, 碱 性 化 合 物 2 发 生 明 显 偏 移, 峰 形 不 再 尖 锐 可 以 通 过 加 入 TEA 或 降 低 ph 解 决 这 个 问 题 在 本 例 中, 采 用 降 低 ph 的 方 法 在 ph 3 条 件 下, 批 次 1 的 选 择 性 发 生 了 改 变, 但 仍 可 以 得 到 良 好 的 基 线 分 离 另 外, 在 ph 3 条 件 下, 批 次 1 和 批 次 2 的 重 复 性 很 好 在 这 个 特 例 中, 峰 4 降 低, 但 这 是 由 于 样 品 降 解 造 成 的 * 安 捷 伦 拥 有 200 多 种 便 捷 的 一 体 式 工 具 包, 三 批 独 立 方 法 验 证 色 谱 柱 让 您 唾 手 可 得 121

图 78. ph 水 平 所 引 起 的 批 次 之 间 的 保 留 变 化 批 次 之 间 保 留 变 化 小 结 : 消 除 引 起 柱 间 选 择 性 改 变 的 全 部 因 素 重 新 评 估 方 法 耐 用 性, 并 修 改 方 法 测 定 ph 敏 感 性, 并 再 次 修 改 方 法 将 不 同 的 选 择 性 变 化 分 类, 并 联 系 生 产 厂 商 有 关 驻 留 体 积 的 提 示 驻 留 体 积 与 实 验 室 之 间 的 方 法 转 移 密 切 相 关 ( 如 需 了 解 驻 留 体 积 的 更 多 信 息 可 参 见 第 48 页 ) 如 果 一 个 实 验 室 中 使 用 的 HPLC 仪 器 与 另 一 个 实 验 室 仪 器 的 驻 留 体 积 不 同, 即 使 两 个 实 验 室 使 用 相 同 的 方 法, 运 行 结 果 也 很 有 可 能 不 完 全 相 同 这 种 不 匹 配 的 原 因 就 在 于 在 两 种 ( 或 更 多 ) 流 动 相 混 合 形 成 梯 度 后, 经 仪 器 管 路 到 达 柱 头 的 时 间 不 同 因 此, 分 析 物 进 样 后, 将 通 过 不 同 的 流 动 相 组 成 ( 时 间 的 函 数 ) 进 行 分 离, 其 保 留 和 分 离 度 都 可 能 受 到 影 响 所 以, 应 对 驻 留 体 积 较 小 的 仪 器 增 加 体 积 来 调 整 驻 留 体 积 或 者, 减 少 驻 留 体 积 大 的 仪 器 的 管 线 内 径 和 长 度, 使 其 与 驻 留 体 积 小 的 仪 器 相 匹 配 另 一 个 办 法 是 在 方 法 中 设 置 一 段 梯 度 延 迟, 对 流 路 系 统 中 不 同 的 驻 留 时 间 进 行 补 偿 但 是, 某 些 认 证 方 法 可 能 不 允 许 分 析 中 使 用 这 种 改 变 122

快 速 故 障 排 查 指 南 我 们 知 道 这 是 怎 么 回 事 您 需 要 一 次 读 完 整 本 书, 但 谁 有 这 么 多 时 间? 您 可 能 在 遇 到 问 题 时, 才 来 读 这 本 书 我 们 有 一 张 快 速 指 南 表, 其 中 包 含 了 我 们 的 技 术 支 持 团 队 从 行 业 中 色 谱 工 作 人 员 那 里 了 解 到 的 最 常 见 问 题, 帮 助 您 快 速 确 定 可 能 的 原 因, 并 提 供 省 时 的 技 巧 用 以 找 到 问 题 所 在 更 多 有 关 特 定 问 题 的 细 节 信 息, 可 参 考 本 指 南 的 其 它 部 分 有 效 排 查 故 障 的 要 点 要 记 住 一 条 原 则, 您 事 先 需 要 知 道 正 常 情 况 是 什 么 样, 那 么 您 才 能 判 断 是 否 出 了 问 题 实 验 室 中 应 该 做 到 以 下 两 点, 对 故 障 排 查 会 很 有 帮 助 : 每 根 新 柱 都 要 保 留 一 张 测 试 样 品 的 色 谱 图 从 查 看 随 色 谱 柱 一 起 提 供 的 测 试 色 谱 图 开 始 多 数 情 况 下, 测 试 样 品 都 是 很 容 易 找 到 的 化 学 药 品, 或 在 实 验 室 中 常 用, 或 可 以 从 化 学 试 剂 供 应 商 处 买 到 配 制 测 试 样 品 ( 各 组 分 的 起 始 浓 度 0.1 mg/ml 是 一 个 良 好 的 选 择 ), 在 您 的 仪 器 上 用 新 柱 对 其 分 析, 然 后 进 行 比 较 最 初 的 测 试 样 品 进 样 将 有 助 于 确 定, 是 否 存 在 妨 碍 您 获 得 最 佳 结 果 的 系 统 问 题 有 些 人 更 愿 意 用 他 们 自 己 的 样 品 或 标 准 品, 因 为 测 试 混 标 可 能 与 他 们 的 应 用 无 关 最 好 使 用 等 度 条 件, 因 为 有 时 梯 度 会 压 缩 峰 而 掩 盖 不 良 柱 效, 使 这 些 峰 人 为 地 显 得 尖 锐 一 段 时 间 后, 将 您 自 己 的 测 试 色 谱 图 与 这 张 最 初 的 色 谱 图 进 行 比 较, 可 以 帮 助 您 判 断 柱 效 是 否 降 低, 或 是 否 有 影 响 柱 效 的 其 它 变 化 用 第 5 到 11 页 中 讨 论 的 公 式 对 柱 效 选 择 性 分 离 度 和 压 力 等 参 数 进 行 定 量 分 析 也 是 个 好 办 法 通 过 色 谱 柱 的 性 能 对 比, 可 以 开 始 分 辨 问 题 的 来 源 制 造 厂 商 的 仪 器 针 对 测 试 色 谱 柱 进 行 了 优 化 以 获 得 最 佳 的 色 谱 柱 性 能 因 此 实 际 塔 板 数 会 比 制 造 厂 商 提 供 的 测 试 色 谱 图 的 数 字 要 低 保 留 优 化 仪 器 的 系 统 图 安 装 仪 器 并 优 化 方 法 时, 详 细 记 录 您 的 仪 器 是 如 何 叠 放 的, 所 有 附 件 的 部 件 号 和 所 有 连 接 管 线 的 长 度, 以 及 所 有 电 子 连 接 如 果 有 问 题 时 这 张 图 可 作 为 便 捷 的 参 考, 用 以 确 保 配 置 没 有 改 变, 从 而 改 变 的 是 结 果 或 仪 器 性 能 123

问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 压 力 高 反 压 ( 如 需 更 多 信 息 请 参 见 第 9 页 上 的 压 力 方 程 ) 色 谱 柱 入 口 筛 板 堵 塞 反 冲 色 谱 柱 ( 见 58 页 ) 色 谱 柱 堵 塞 ( 化 学 污 染 ) 用 溶 剂 清 洗 色 谱 柱, 如 果 不 能 改 善 则 更 换 色 谱 柱 色 谱 柱 粒 径 太 小 参 考 色 谱 柱 的 选 择 ( 见 12 页 ) 在 线 过 滤 器 或 保 护 柱 堵 塞 管 线 堵 塞 聚 合 物 色 谱 柱 : 溶 剂 改 变 导 致 溶 胀 流 动 相 粘 度 过 高 盐 / 缓 冲 液 沉 淀 检 查 在 线 过 滤 器 的 滤 头, 必 要 时 更 换 拆 卸 管 线 以 便 确 证, 必 要 时 更 换 咨 询 厂 商, 了 解 溶 剂 兼 容 性 信 息 使 用 粘 度 较 低 的 溶 剂, 或 升 高 温 度 确 保 流 动 相 与 缓 冲 液 的 兼 容 性 压 力 波 动 泵 中 有 气 泡 溶 剂 脱 气 ( 见 70 页 ); 溶 剂 中 充 氦 气 或 使 用 在 线 脱 气 机 压 力 下 降 或 低 压 峰 形 单 向 阀 或 密 封 垫 渗 漏 泵 流 量 不 够 泵 单 向 阀 或 密 封 垫 渗 漏 泵 内 有 气 泡 更 换 或 清 洗 单 向 阀 ; 更 换 泵 密 封 垫 放 空 流 动 相 容 器, 更 换 容 器 中 的 进 样 口 在 线 过 滤 头 ; 检 查 管 线 是 否 被 挤 压 ; 检 查 流 量 设 置 ; 全 系 统 检 漏 更 换 或 清 洗 单 向 阀 ; 更 换 泵 密 封 垫 ; 检 查 是 否 有 盐 析 出 残 留 溶 剂 脱 气 ; 检 查 溶 剂 瓶 到 泵 的 管 路 是 否 阻 塞 ; 更 换 进 样 口 在 线 滤 头 无 峰 仪 器 问 题 确 定 所 有 HPLC 组 件 都 已 开 启 并 运 行 ; 检 查 检 测 器 出 口 管 路 流 动 相 或 固 定 相 组 合 错 误 是 否 有 液 体 流 出 ; 进 样 不 保 留 化 合 物 以 确 保 系 统 适 用 性 ; 提 高 溶 剂 强 度 或 使 用 梯 度 洗 脱 意 外 峰 或 鬼 峰 在 之 前 分 析 中 未 洗 脱 的 分 析 物 流 动 相 污 染 样 品 制 备 / 样 品 制 备 污 染 使 用 快 速 梯 度, 如 在 10 到 15 分 钟 的 时 间 内 乙 腈 由 10% 升 至 90%, 弄 清 样 品 中 的 组 分 数 量 及 其 相 对 保 留 从 强 流 动 相 开 始, 如 75% 甲 醇 和 / 或 更 高 流 速, 让 组 分 更 快 流 出 色 谱 柱 只 使 用 高 纯 度 色 谱 级 及 以 上 的 (LC/MS 或 梯 度 级 ) 溶 剂 使 用 内 部 纯 水 系 统 的 高 纯 度 水 水 相 流 动 相 中 使 用 TFA, 有 机 流 动 相 溶 剂 中 使 用 较 低 浓 度 的 TFA( 即, 水 中 含 0.1% TFA/ 乙 腈 中 含 0.086% TFA); 使 用 更 长 的 检 测 波 长, 这 样 TFA 的 吸 收 较 弱 ( 见 75 页 ) 使 用 降 低 污 染 的 常 用 样 品 制 备 方 法 过 滤 SPE 液 液 萃 取 离 心 等 表 12. 快 速 故 障 排 查 技 巧 转 下 页 124

问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 峰 形, 续 意 外 峰, 或 鬼 峰, 续 系 统 污 染 色 谱 柱 污 染 ( 注 : 较 少 引 起 鬼 峰 ) 进 样 样 品 溶 剂, 确 保 样 品 溶 剂 没 有 问 题 ; 在 多 次 运 行 过 程 中 进 行 空 白 进 样, 证 明 没 有 交 叉 污 染 引 起 的 鬼 峰 从 流 路 中 拆 除 自 动 进 样 器, 运 行 空 白 程 序, 检 查 鬼 峰 是 否 消 失 如 果 消 失, 清 洗 自 动 进 样 器 如 果 没 有, 再 检 查 流 路 中 的 其 它 系 统 组 件, 以 查 找 来 源 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话, 查 看 厂 商 的 信 息 ); 清 洗 色 谱 柱 ( 见 58 页 ) 前 伸 峰 色 谱 柱 沟 流 更 换 色 谱 柱, 使 用 保 护 柱 拖 尾 峰 色 谱 柱 过 载 硅 醇 基 相 互 作 用 ( 硅 胶 类 色 谱 柱 ) 柱 外 效 应 色 谱 柱 在 高 温 下 降 解 ( 硅 胶 基 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 在 高 ph 下 降 解 ( 硅 胶 类 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 空 洞 干 扰 共 洗 脱 峰 使 用 更 高 容 量 的 色 谱 柱 ( 增 加 柱 长 或 内 径 ); 减 少 样 品 量 使 用 封 端 或 专 用 柱 ; 增 大 缓 冲 液 浓 度 ; 降 低 流 动 相 ph 以 抑 制 硅 醇 基 相 互 作 用 ; 使 用 竞 争 碱 ; 采 用 改 变 极 性 相 互 作 用 的 衍 生 化 解 决 方 案 ; 如 果 没 有 效 果, 尝 试 反 向 运 行 色 谱 柱 ; 如 果 结 果 改 善, 则 说 明 很 可 能 是 柱 污 染 所 致 ; 清 洗 或 更 换 色 谱 柱 检 查 系 统, 各 部 件 的 连 接 管 线 是 否 过 长, 并 更 换 为 较 短 管 线 ; 如 果 使 用 的 是 高 效 柱, 将 内 径 0.18 mm 的 绿 色 管 线 换 成 内 径 0.12 mm 的 红 色 管 线 将 温 度 降 低 到 40 C 以 下, 特 别 是 使 用 高 ph 流 动 相 时 ; 使 用 高 温 兼 容 色 谱 柱, 如 立 体 保 护 的 硅 胶 柱 混 合 型 柱 聚 合 物 柱 氧 化 锆 柱 等 使 用 特 别 适 合 在 较 高 ph 下 操 作 的 高 覆 盖 率 或 双 交 联 固 定 相 ( 比 如,ZORBAX Extend-C18), 或 使 用 聚 合 物 混 合 型 或 氧 化 锆 反 相 柱 反 方 向 运 行 ; 如 果 所 有 峰 的 峰 形 都 差 或 出 现 双 峰, 说 明 可 能 存 在 色 谱 柱 空 洞 ; 弃 用 色 谱 柱 调 节 流 动 相 以 改 善 选 择 性 ( 见 69 页 ) 或 选 择 新 的 固 定 相, 改 善 样 品 净 化 峰 裂 分 / 双 峰 干 扰 组 分 通 过 样 品 制 备 净 化 样 品 ; 改 变 流 动 相 或 固 定 相 以 调 节 选 择 性 如 果 怀 疑 该 组 分 来 自 以 前 的 进 样, 分 析 后 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 ; 在 梯 度 中 增 加 强 溶 剂 浓 度 ; 延 长 洗 脱 时 间 转 下 页 125

问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 峰 形, 续 峰 分 裂 / 双 峰, 续 色 谱 柱 筛 板 部 分 堵 塞 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话 )( 见 58 页 ); 在 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 使 用 0.2 µm 或 0.5 µm (UHPLC) 在 线 过 滤 器 ; 过 滤 样 品 使 用 保 护 柱 ( 见 117 页 ) 色 谱 柱 空 洞 更 换 色 谱 柱 ; 以 后 使 用 保 护 柱 以 保 护 分 析 柱 ( 见 117 页 ); 使 用 较 少 凝 聚 的 流 动 相 条 件 进 样 溶 剂 效 应 使 用 流 动 相 或 较 弱 的 进 样 溶 剂 ( 见 46-47 页 ) 样 品 体 积 过 载 使 用 较 小 的 样 品 进 样 体 积 ( 见 46 页 ) 样 品 溶 剂 与 流 动 相 不 兼 容 进 样 器 转 子 损 坏 使 用 流 动 相 或 与 进 样 溶 剂 相 溶 的 较 弱 溶 剂 更 换 进 样 器 转 子 峰 展 宽 / 宽 峰 接 头 / 连 接 不 合 适 确 保 您 的 接 头 正 确 安 装 ( 见 45 页 ) 系 统 中 的 管 线 外 体 积 确 保 管 线 细 并 尽 量 短, 避 免 柱 外 体 积 ( 见 41 页 ) 进 样 体 积 过 大 降 低 进 样 体 积 ( 见 46 页 ) 系 统 设 置 ( 比 如, 数 据 采 集 速 率 过 低 ) 检 查 数 据 采 集 速 率 调 节 检 测 器 设 置 和 / 或 时 间 常 数, 在 不 降 低 信 噪 比 的 情 况 下 用 最 快 的 采 集 速 率 ( 见 47 页 ) 样 品 稀 释 度 过 高 降 低 稀 释 强 度 ( 见 47 页 ) 对 于 梯 度 洗 脱 : 驻 留 体 积 降 低 初 始 梯 度 浓 度, 以 进 行 峰 浓 缩, 或 者 在 样 品 进 样 前 使 用 进 样 器 程 序 开 始 梯 度 ( 见 49 页 ) 注 意 峰 是 在 梯 度 阶 段 被 洗 脱 出 来 而 不 是 等 度 洗 脱 的 保 留 保 留 时 间 漂 移 色 谱 柱 逐 渐 陈 旧 与 测 试 色 谱 图 ( 见 122 页 ) 进 行 比 较, 发 现 色 谱 柱 的 变 化 ; 使 用 保 护 柱 以 延 长 柱 寿 命 色 谱 柱 规 格 和 流 速 变 化 确 保 您 的 方 法 参 数 根 据 流 速 和 柱 规 格 的 变 化 ( 见 36-37 页 ) 而 调 节 这 对 于 梯 度 洗 脱 尤 为 重 要 对 您 的 分 析 物 而 言 色 谱 柱 / 流 动 相 的 搭 配 不 对 ( 对 于 键 合 相 保 留 太 低,pH 过 于 接 近 pk a, 色 谱 柱 的 ph 范 围 与 流 动 相 的 不 兼 容 等 ) 对 于 流 动 相 : 色 谱 柱 的 再 平 衡 时 间 不 够 您 的 流 动 相 很 可 能 不 能 保 持 一 致 确 保 您 每 次 使 用 的 流 动 相 都 是 一 样 的 缓 冲 液 和 溶 剂 应 该 分 别 用 干 净 的 玻 璃 器 皿 测 量, 然 后 混 合 ; 流 动 相 脱 气 ; 更 换 老 化 流 动 相 ( 见 79-82 页 ) 对 您 柱 的 死 体 积 和 系 统 的 驻 留 体 积 进 行 测 量, 以 便 优 化 平 衡 时 间 和 方 法 ( 见 56 和 83 页 ) 转 下 页 126

问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 保 留, 续 保 留 时 间 缩 短 色 谱 柱 填 料 的 活 性 位 点 使 用 流 动 相 改 性 剂, 竞 争 碱 ( 碱 性 化 合 物, 如 三 乙 胺 ) 或 增 加 缓 冲 液 强 度, 使 用 高 覆 盖 率 的 柱 填 料 样 品 过 载 键 合 相 或 硅 胶 基 流 失 色 谱 柱 老 化 减 少 样 品 量 或 使 用 较 大 内 径 或 更 长 的 色 谱 柱 使 用 ph 2 到 8 之 间 的 流 动 相 ; 使 用 高 ph 或 低 ph 专 用 硅 胶 柱, 聚 合 物 柱 或 其 它 高 / 低 ph 柱 使 用 保 护 柱, 或 高 稳 定 性 键 合 相 聚 合 物 混 合 型 或 高 稳 定 性 柱 ( 如, 氧 化 锆 钛 石 墨 碳 ) 保 留 时 间 延 长 流 速 降 低 检 查 并 重 新 设 置 流 速 ; 检 查 泵 是 否 有 气 泡 ; 检 查 泵 密 封 垫 是 否 渗 漏, 以 及 单 向 阀 和 其 它 系 统 渗 漏 流 动 相 组 成 改 变 键 合 相 流 失 补 足 溶 剂 瓶 ; 确 保 梯 度 系 统 比 例 正 确 ; 预 混 合 流 动 相 进 行 等 梯 度 洗 脱 ( 见 69 页 ) 对 于 常 用 硅 胶 型 色 谱 柱, 要 保 持 流 动 相 ph 在 2-8 之 间 ; 对 于 极 高 ph (> 10) 或 极 低 ph (< 2) 的 工 作, 使 用 高 稳 定 性 固 定 相, 聚 合 物 或 高 稳 定 性 固 定 相 柱 基 线 基 线 漂 移 对 于 梯 度 洗 脱 : 流 动 相 A 或 B 的 吸 收 不 同 波 动 室 温 变 化 正 向 LC/MS, 固 定 相 流 失 正 向 MS 污 染 色 谱 柱 污 染 ( 色 谱 柱 流 失 ) 对 于 持 续 性 问 题 : 检 查 检 测 器 光 源 或 流 通 池 对 于 负 漂 移 : 使 用 无 UV 吸 收 的 流 动 相 溶 剂 ; 使 用 色 谱 级 流 动 相 溶 剂 ; 把 流 动 相 A 中 的 UV 吸 收 添 加 剂 加 至 流 动 相 B 中, 用 于 平 衡 / 补 偿 漂 移 对 于 正 漂 移 : 使 用 分 析 物 仍 有 吸 收 的 更 高 UV 吸 收 检 测 器 波 长 ; 使 用 无 UV 吸 收 的 流 动 相 溶 剂 ; 减 少 流 动 相 B 中 UV 吸 收 化 合 物 的 量, 用 以 平 衡 / 补 偿 漂 移 ( 见 75 页 ) 隔 离 色 谱 柱 或 使 用 柱 温 箱 ; 遮 蔽 示 差 折 光 检 测 器 或 使 其 隔 绝 空 气 流 使 用 低 流 失 MS 兼 容 或 高 稳 定 性 固 定 相 色 谱 柱 清 洗 质 谱 接 口, 避 免 使 用 THF 和 含 卤 素 溶 剂, 使 用 PEEK 管 线 柱 用 强 溶 剂 冲 洗 色 谱 柱 ; 改 善 样 品 净 化 ; 使 用 / 更 换 保 护 柱 ; 更 换 分 析 柱 更 换 UV 灯 ; 清 洁 并 冲 洗 流 通 池 转 下 页 127

问 题 可 能 的 原 因 解 决 办 法 基 线, 续 基 线 漂 移, 续 梯 度 或 等 度 : 缺 乏 溶 剂 混 合 使 用 适 当 混 合 装 置 ; 通 过 将 一 种 含 UV 吸 收 的 化 合 物 加 入 溶 剂 并 监 测 UV 吸 收 检 测 器 的 输 出, 检 查 比 例 阀 精 密 度 梯 度 或 等 度 比 例 比 例 阀 故 障 清 洗 并 更 换 比 例 阀 ; 部 分 地 预 混 合 溶 剂 ( 如,A 中 含 5% B, 和 / 或 反 之 亦 然 ) 偶 然 尖 峰 外 部 电 信 号 干 扰 LC 系 统 使 用 稳 压 器 / 恒 电 压 电 源 ; 检 查 是 否 有 局 部 干 扰 源, 如, 循 环 炉, 使 用 独 立 电 流 周 期 性 泵 脉 冲 维 修 或 更 换 阻 尼 器 ; 排 除 泵 中 的 空 气 ; 清 洁 或 更 换 单 向 阀 ; 流 动 相 脱 气 随 机 积 聚 污 染 尖 刺 峰 检 测 器 中 的 气 泡 用 强 溶 剂 ( 见 58 页 ) 冲 洗 或 反 冲 色 谱 柱 ( 如 果 可 以 反 冲 的 话 ); 净 化 样 品 ; 使 用 色 谱 级 溶 剂 流 动 相 脱 气 ( 见 70 页 ); 检 测 器 出 口 处 使 用 反 压 限 流 器 ; 确 保 所 有 接 头 都 紧 密 无 渗 漏 ( 见 44 页 ) 128

有 用 的 参 考 资 料 这 里 还 有 一 个 您 随 身 携 带 这 本 书 的 理 由 我 们 列 出 了 一 些 对 方 法 开 发 有 用 的 表 格 : 美 国 药 典 指 定 填 料 溶 剂 性 质 表, 包 括 极 性 指 数 值 和 UV 截 止 波 长 溶 剂 相 溶 性 表 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 固 相 萃 取 (SPE) 填 料 概 况 SPE 吸 附 剂 使 用 条 件 美 国 药 典 指 定 填 料 美 国 药 典 (USP) 指 定 色 谱 柱 填 料, 而 不 是 生 产 厂 家 在 大 多 数 规 定 中, 都 列 出 了 几 种 不 同 类 型 的 色 谱 柱, 具 有 不 同 粒 径 不 同 填 料 颗 粒 形 状, 可 能 还 有 碳 载 量 或 比 表 面 积 在 这 些 例 子 中,USP 色 谱 柱 性 能 指 标 相 当 宽 泛, 几 种 柱 类 型 都 能 符 合 其 基 本 性 能 指 标 例 如,L1 性 能 指 标 要 求 十 八 烷 基 硅 烷 化 键 合 到 多 孔 硅 胶 陶 瓷 微 粒 ( 直 径 1.5 到 10 µm) 或 整 体 柱 上 许 多 商 品 化 的 色 谱 柱 都 符 合 这 些 基 本 性 能 指 标, 但 可 能 采 用 不 同 类 型 的 填 料, 包 括 全 多 孔 型 表 面 多 孔 型 和 整 体 型 但 是, 并 非 所 有 C18 柱 都 相 同, 实 际 上 只 有 有 限 的 几 种 C18 柱 能 够 进 行 要 求 的 分 离 为 了 提 高 柱 效 和 分 离 度, 我 们 推 荐 球 形 全 多 孔 或 表 面 多 孔 1.5-3.5 µm 直 径 填 料 USP 特 意 让 您 能 灵 活 决 定 能 满 足 需 要 的 最 好 色 谱 柱 ( 表 11) 129

美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L1 十 八 烷 基 硅 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 陶 瓷 微 粒 ( 直 径 1.5 到 10 µm) 或 整 体 柱 上 Poroshell 120 EC-C18 2.7 120 Poroshell 120 SB-C18 2.7 120 Poroshell HPH-C18 2.7 100 ZORBAX Eclipse Plus C18 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX Eclipse XDB-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX SB-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX Rx-C18 3.5, 5 80 ZORBAX Extend-C18 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX ODS 3.5, 5, 7 70 ZORBAX ODS Classic 5 70 ZORBAX 300SB-C18 ZORBAX 300 Extend C18 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱 AdvanceBio 寡 核 苷 酸 色 谱 柱 Pursuit XRs C18 3, 5, 10 100 Pursuit C18 3, 5, 10 200 Polaris C18-A 3, 5, 10 180 Polaris C18-Ether 3, 5 200 SepTech ST60 C18 10 60 SepTech ST150 C18 10 150 L3 5 到 10 µm 直 径 多 孔 硅 胶 颗 粒, 或 整 体 硅 胶 柱 ZORBAX SIL 5 70 ZORBAX Rx-Sil 3.5, 5 80, 300 Pursuit XRs Si 3, 5, 10 100 Polaris Si-A 5, 10 180 表 13. 美 国 药 典 指 定 的 填 料 和 安 捷 伦 色 谱 柱 转 下 页 130

美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L7 L8 L9 L10 辛 基 硅 烷 化 学 键 合 到 1.5 到 10 µm 直 径 的 全 多 孔 硅 胶 颗 粒 或 整 体 硅 胶 柱 上 氨 丙 基 硅 烷 单 分 子 层 形 式 化 学 键 合 到 全 多 孔 硅 胶 载 体 上, 粒 径 为 3 到 10 µm 具 有 化 学 键 合 的 强 酸 性 阳 离 子 交 换 涂 层 的 3 到 10 µm 不 规 则 全 多 孔 硅 胶 腈 基 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 为 3 到 10 µm Poroshell 120 EC-C8 2.7 120 Poroshell 120 SB-C8 2.7 120 Poroshell HPH-C8 2.7 100 ZORBAX Eclipse Plus C8 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX Eclipse XDB-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX SB-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX Rx-C8 1.8, 3.5, 5, 7 80 ZORBAX C8 5 70 Pursuit XRs C8 3, 5, 10 100 Pursuit C8 3, 5, 10 200 Polaris C8-A 3, 5 180 Polaris C8-Ether 3, 5 200 ZORBAX 300SB-C8 AdvanceBio RP-mAb SB-C8 ZORBAX NH2 5 70 Polaris NH2 5 180 ZORBAX SCX 5 球 形 300 ZORBAX CN 5 70 ZORBAX SB-CN 3.5, 5, 7 80, 300 ZORBAX 300SB-CN ZORBAX Eclipse XDB-CN 3.5, 5 80 Poroshell 120 EC-CN 2.7 120 L11 苯 基 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 为 1.5 到 10 µm ZORBAX Eclipse XDB 苯 基 5 70 ZORBAX Eclipse Plus 苯 基 - 己 基 1.8, 3.5, 5 95 ZORBAX SB 苯 基 3.5 80 ZORBAX 300 二 苯 基 1.8 300 Poroshell 120 苯 基 - 己 基 2.7 120 Pursuit XRs 二 苯 基 3, 5, 10 100 Pursuit 二 苯 基 3, 5, 10 200 转 下 页 131

美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L13 L14 L17 三 甲 基 硅 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒, 粒 径 3 到 10 µm 具 有 化 学 键 合 的 强 碱 性 季 铵 盐 阴 离 子 交 换 涂 层 的 硅 胶, 粒 径 为 5 到 10 µm 以 氢 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 7 到 11 µm ZORBAX TMS 5 70 ZORBAX SAX 5 70 IonoSpher A 5 120 Hi-Plex H 8 N/A Bio SCX NP10 L19 以 钙 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 9 µm Hi-Plex Ca 8 N/A Hi-Plex Ca (Duo) 8 N/A L20 L21 二 羟 基 丙 烷 化 学 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 为 3 到 10 µm 刚 性 球 形 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物, 粒 径 为 5 到 10 µm LiChrospher Diol 5 N/A PLRP-S 3, 5, 8, 10, 100 10-15, 15-20, 50 PLRP-S 3, 5, 8, 10, 10-15, 15-20, 50 PLRP-S 5, 8, 10, 30, 50 PLRP-S 5, 8, 10, 30, 50 300 1000 4000 L22 由 具 有 磺 酸 基 的 多 孔 聚 苯 乙 烯 凝 胶 制 成 的 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 约 为 10 µm PLgel 3, 5, 10, 20 50, 100, 500, 103, 104, 105, 106, MIXED Hi-Plex H 8 N/A 转 下 页 132

美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L25 填 料 具 有 分 离 分 子 量 范 围 1000 到 5000 道 尔 顿 化 合 物 的 能 力 ( 按 照 使 用 环 氧 乙 烷 所 测 定 ), 适 用 于 中 性 含 阴 离 子 和 阳 离 子 型 水 溶 性 聚 合 物 填 料 以 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯 树 脂 为 载 体, 交 联 聚 羟 基 醚 ( 表 面 含 一 些 羧 基 官 能 团 ) PL aquagel-oh 5, 8 30 L26 L33 AdvanceBio RP-mAb C4 具 有 分 离 4000 到 500000 da 分 子 量 范 围 蛋 白 质 的 能 力 为 球 形 硅 胶 基, 经 处 理 后 可 提 供 ph 稳 定 性 ZORBAX GF-250 4 150 Bio SEC-3 3 100, 150, 300 Bio SEC-5 5 100, 150, 300, 500, 1000, 2000 ProSEC 5 300 L34 以 铅 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 9 µm Hi-Plex Pb 8 N/A L35 L43 L45 L50 氧 化 锆 稳 定 化 的 球 形 硅 胶 材 料, 具 有 亲 水 性 ( 二 醇 类 ) 分 子 单 层 键 合 固 定 相, 孔 径 150Å 五 氟 苯 酚 基 化 学 键 合 到 硅 胶 填 料 颗 粒 上, 粒 径 为 5 到 10 µm β- 环 糊 精 键 合 到 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 5 到 10 µm 具 有 反 相 保 留 和 强 阴 离 子 交 换 功 能 的 多 功 能 树 脂 该 树 脂 由 乙 烯 基 乙 苯 与 55% 的 二 乙 烯 基 苯 交 联 而 成 的 共 聚 物, 粒 径 3 到 15 µm, 比 表 面 积 不 小 于 350 m 2 /g 基 质 是 具 有 季 胺 官 能 团 涂 层 的 乳 胶 填 料 颗 粒 乳 胶 颗 粒 由 含 聚 苯 乙 烯 交 联 二 乙 烯 基 苯 交 联 而 成 ZORBAX GF-250 4 150 ZORBAX GF-450 6 300 Pursuit PFP 3, 5 200 Poroshell 120 PFP 2.7 120 ChiraDex Chiral 5 100 ZORBAX 300SCX 5 300 转 下 页 133

美 国 药 典 指 定 填 料 (12/2010) USP 方 法 USP 填 料 色 谱 柱 粒 径 (µm) 孔 径 (Å) L52 L53 L56 L57 由 具 有 磺 丙 基 的 多 孔 硅 胶 制 成 的 弱 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 为 5 到 10 µm 由 使 用 二 乙 烯 基 苯 55% 交 联 的 乙 基 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 弱 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 3 到 15 µm 基 质 表 面 接 羧 酸 和 / 或 磷 酸 功 能 基 化 单 体 容 量 不 低 于 400 µeq/ 柱 丙 基 硅 烷 化 学 键 合 到 全 多 孔 硅 胶 颗 粒 上, 粒 径 3 到 10 µm 手 性 识 别 蛋 白 ( 卵 类 粘 蛋 白 ), 化 学 键 合 到 硅 胶 颗 粒, 粒 径 5 µm, 孔 径 120Å IonSpher C 5 120 Bio SAX 3, 5, 10 300 ZORBAX SB-C3 1.8, 3.5, 7 80, 300 ZORBAX 300 SB-C3 Ultron ES-OVM 5 120 L58 以 钠 形 式 存 在 的 磺 化 交 联 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 组 成 的 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 粒 径 6 到 30 µm Hi-Plex Na 10 N/A Hi-Plex Na (Octo) 8 N/A L60 球 形 多 孔 硅 胶,10 µm, 表 面 用 烷 基 酰 胺 进 行 了 共 价 修 饰 和 封 端 Bonus-RP 1.8, 3.5, 4.6, 5 80 Poroshell 120 Bonus-RP 2.7 120 Polaris Amide-C18 3, 5 180 L68 糖 谱 分 析 色 谱 柱 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 2.7, 1.8 N/A 134

溶 剂 相 溶 性 对 于 液 相 色 谱 分 析, 了 解 各 种 溶 剂 的 相 溶 性 非 常 重 要, 因 为, 如 果 系 统 中 使 用 不 兼 容 的 溶 剂, 可 能 会 得 到 不 可 靠 的 色 谱 结 果 相 溶 性 是 指 一 种 溶 液 与 另 一 种 溶 液 按 任 意 比 例 混 合 成 为 新 的 均 匀 溶 液 的 能 力 对 于 有 机 化 合 物, 溶 剂 的 极 性 决 定 了 什 么 类 型 的 化 合 物 可 以 溶 解 在 其 中, 并 可 以 与 何 种 其 它 溶 剂 或 液 体 化 合 物 相 溶 通 常, 极 性 溶 剂 最 好 溶 解 极 性 化 合 物, 非 极 性 溶 剂 最 好 溶 解 非 极 性 化 合 物 : 相 似 者 相 溶 因 此, 水 ( 强 极 性 ) 和 己 烷 ( 强 非 极 性 ) 不 能 彼 此 混 溶, 充 分 振 摇 以 后 也 会 迅 速 分 成 两 层 对 于 无 机 化 合 物, 碳 链 长 度 常 常 决 定 其 相 对 于 同 系 物 的 相 溶 性 例 如, 在 醇 类 中, 乙 醇 有 两 个 碳 原 子, 可 以 与 水 混 溶, 而 丁 醇 有 四 个 碳 原 子, 则 不 能 与 水 混 溶 常 用 HPLC 溶 剂 的 性 质 溶 剂 粘 度 (20 C 下 cp) 沸 点 ( C) UV 截 止 波 长 (nm) 极 性 指 数 (P') 相 溶 数 (M) 丙 酮 0.36 56.29 330 5.1 15. 17 乙 腈 0.38* 81.60 190 5.8 11, 17 乙 酸 正 丁 酯 0.74 126.11 254 4.0 22 正 丁 醇 2.98 117.50 215 3.9 15 正 氯 丁 烷 0.45 78.44 220 1.0 氯 苯 0.80 131.69 287 2.7 21 氯 仿 0.57 61.15 245 4.1 19 环 己 烷 1.00 80.72 200 0.2 28 环 戊 烷 0.44 49.26 198 0.1 邻 - 二 氯 苯 1.32** 180.48 295 2.7 二 氯 甲 烷 0.44 39.75 233 3.1 20 二 甲 基 乙 酰 胺 2.14 166.10 268 6.5 N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 0.92 153.00 268 6.4 12 二 甲 基 亚 砜 2.24 189.00 268 7.2 9 1,4- 二 烷 1.37 101.32 215 4.8 17 乙 酸 乙 酯 0.45 77.11 256 4.4 19 乙 醇 1.10 78.32 210 乙 醚 0.24 34.55 215 2.8 23 二 氯 乙 烯 0.79 83.48 228 3.5 庚 烷 0.42 98.43 200 0.1 29 表 14. 溶 剂 特 性 转 下 页 135

常 用 HPLC 溶 剂 的 性 质 溶 剂 粘 度 (20 C 下 cp) 沸 点 ( C) UV 截 止 波 长 (nm) 极 性 指 数 己 烷 0.31 68.70 195 0.1 29 异 辛 烷 0.50 99.24 215 0.1 29 异 丁 醇 107.70 220 4.0 15 异 丙 醇 2.40 82.26 205 3.9 15 十 四 酸 异 丙 酯 192.60 甲 醇 0.59 64.70 205 5.1 12 甲 基 叔 丁 基 醚 0.27 55.20 210 2.5 甲 乙 酮 0.43 79.64 329 4.7 17 甲 基 异 丁 基 酮 0.58 117.40 334 4.2 N- 甲 基 吡 咯 烷 酮 1.67** 202.00 285 6.7 戊 烷 0.23 36.07 190 0.0 石 油 醚 0.1 正 丙 醇 2.30 97.20 210 4.0 丙 烯 碳 酸 酯 241.70 220 6.1 吡 啶 0.95 115.25 5.3 16 四 氢 呋 喃 0.55 66.00 212 4.0 17 甲 苯 0.59 110.62 284 2.4 23 1,2,4- 三 氯 苯 213.50 308 三 乙 胺 0.36** 89.50 三 氟 乙 酸 0.93 71.80 210 水 1.00 100.00 190 10.2 邻 - 二 甲 苯 0.81 144.41 288 2.5 * 15 C 下 cp ** 25 C 下 cp 缺 失 值 表 示 没 有 检 测 数 据 (P') 相 溶 数 (M) 相 溶 (M) 数 : 1. M 数 相 差 15 个 单 位 或 以 下 的 所 有 溶 剂 对, 在 15 C 下 能 够 以 任 意 比 例 混 溶 2. M 数 相 差 16 的 每 对 溶 剂 在 25 到 75 C 之 间, 通 常 为 50 C, 形 成 临 界 溶 液 3. 相 差 17 或 更 多 的 溶 剂 不 混 溶, 或 在 75 C 以 上 形 成 临 界 溶 液 本 图 表 由 Honeywell Burdick & Jackson 提 供,www.honeywell.com/contactbandj 136

溶 剂 相 溶 性 表 丙 酮 乙 腈 (ACN) 正 丁 醇 氯 仿 环 己 烷 二 氯 甲 烷 (DCM) N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 1,4 二 噁 烷 乙 酸 乙 酯 乙 醇 乙 醚 二 氯 乙 烯 庚 烷 己 烷 异 辛 烷 异 丙 醇 (IPA) 甲 醇 甲 基 叔 丁 基 醚 甲 乙 酮 戊 烷 四 氢 呋 喃 (THF) 甲 苯 水 邻 二 甲 苯 丙 酮 乙 腈 (ACN) 正 丁 醇 氯 仿 环 己 烷 二 氯 甲 烷 (DCM) N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 1,4 二 烷 乙 酸 乙 酯 乙 醇 乙 醚 二 氯 乙 烯 庚 烷 正 己 烷 异 辛 烷 异 丙 醇 (IPA) 甲 醇 甲 基 叔 丁 基 醚 甲 乙 酮 戊 烷 四 氢 呋 喃 (THF) 甲 苯 水 邻 - 二 甲 苯 不 相 溶 相 溶 表 15. 溶 剂 相 溶 性 本 表 中 将 两 种 溶 剂 能 以 任 意 比 例 混 合 在 一 起 不 分 层, 归 为 相 溶 表 中 信 息 由 Honeywell Burdick & Jackson 提 供, 如 有 问 题 请 联 系 B&J www.honeywell.com/contactbandj 137

流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 流 动 相 改 性 剂 的 选 择 需 要 达 到 各 种 需 求 之 间 的 平 衡 分 析 溶 液 的 稳 定 ph 是 否 在 色 谱 柱 的 安 全 范 围 内, 并 且 还 能 适 当 控 制 离 子 化 ( 通 过 离 子 抑 制 离 子 对 或 两 者 结 合 )? 是 否 对 检 测 器 性 能 没 有 明 显 干 扰, 包 括 不 同 的 挥 发 性 MS 离 子 抑 制 和 UV 透 光 性? 现 在 的 问 题 是 符 合 要 求 的 改 性 剂 很 少, 要 提 高 特 定 分 析 物 的 选 择 性, 经 常 需 要 分 析 人 员 尝 试 各 种 固 定 相 ( 除 了 常 用 的 烷 基 键 合 固 定 相, 如 C8 和 C18 之 外, 还 有 内 嵌 极 性 基 团 烷 基 苯 基 氟 取 代 RP 等 ) 下 表 提 供 了 常 用 HPLC 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 v/v 25 C 下 pk a 最 大 ph 范 围 UV 截 止 波 长 (nm) 三 氟 醋 酸 (TFA) 0.1% 0.3 210 0.05% 0.3 210 0.01% 0.3 210 磷 酸 盐, pk 1 2.1 1.1. 3.1 < 200 磷 酸 盐, pk 2 7.2 5.2 8.2 < 200 磷 酸 盐, pk 3 12.3 11.3 13.3 < 200 柠 檬 酸 盐, pk 1 3.1 2.1 4.1 230 柠 檬 酸 盐, pk 2 4.7 3.7 5.7 230 柠 檬 酸 盐, pk 3 6.4 5.4 7.4 230 碳 酸 盐, pk 1 6.1 5.1 7.1 < 200 碳 酸 盐, pk 2 10.3 9.3 11.3 < 200 甲 酸 盐 3.8 2.8 4.8 210 (10 mm) 醋 酸 (HAC) 1.0% 4.8 3.8 5.8 210 醋 酸 盐 4.8 3.8 5.8 210 (10 mm) 氨 水 9.2 8.2 10.2 200 (10 mm) 硼 酸 盐 9.2 8.2 10.2 n/a 三 乙 胺 (TEA) 10.8 9.8 11.8 < 200 TRIS-HCl 8.3 7.3 9.3 205 (120 mm) 阴 影 部 分 表 示 LC/MS 应 用 中 常 用 的 缓 冲 液 表 16. 常 用 流 动 相 改 性 剂 的 UV 截 止 波 长 138

固 相 萃 取 吸 附 剂 分 离 机 理 典 型 固 定 相 结 构 无 机 ( 吸 附 ) 氧 化 铝 AlOH Florisil Mg 2SiO 3 正 相 ( 极 性 键 合 相 硅 胶 基 ) 硅 胶 Si-OH 氰 基 -CN 氨 基 -NH 2 二 醇 -CH(OH)-CH(OH)- 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 强 疏 水 性 硅 胶 基 ) 十 八 烷 基 硅 氧 烷 (C18) (-CH 2-) 17 CH 3, 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 中 等 疏 水 性 硅 胶 基 ) 辛 基 硅 氧 烷 (C8) (-CH2-) 7CH 3 环 己 基 苯 基 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 弱 疏 水 性 硅 胶 基 ) 乙 基 (C2) -C2H 5 甲 基 (C1) -CH 3 聚 合 物 型 反 相 ( 经 亲 水 修 饰 ) PS-DVB PS-DVB DVB DVB WAX( 弱 阴 离 子 交 换 ) 氨 基 (-CH 2-) 3NH 2 1, 2 - 氨 基 (-CH 2-) 3 NHCH 2CH 2NH 2 SAX( 强 阴 离 子 交 换 ) 季 铵 (-CH 2-) 3N+(CH 3) 3 WCX( 弱 阳 离 子 交 换 ) 羧 酸 (-CH2-) 3COOH SCX( 强 阳 离 子 交 换 ) 烷 基 磺 酸 (-CH2-) 3SO 3H 芳 香 族 磺 酸 SO 3H 表 17. 固 相 萃 取 (SPE) 固 定 相 概 况 139

SPE 吸 附 剂 条 件 分 离 机 理 用 于 以 下 分 析 物 : 载 样 溶 剂 洗 脱 溶 剂 无 机 ( 吸 附 ) 弱 极 性 到 中 等 极 性 弱 极 性 (P ), 例 如 正 己 烷 CHCl 3 正 相 ( 极 性 键 合 相 硅 胶 基 ) 中 等 极 性 到 强 极 性 弱 极 性, 例 如 正 己 烷 强 极 性 (P ), 例 如 甲 醇 乙 醇 强 极 性, 例 如 甲 醇 乙 醇 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 强 疏 水 性 硅 胶 基 ) CHCl 3 疏 水 性 ( 完 全 非 极 性 ) 强 极 性, 例 如 H 2O CH 3OH/H 2O CH 3CN/H 2O 弱 极 性, 例 如 正 己 烷 CHCl 3 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 中 等 非 极 性 强 极 性, 例 如 H2O 中 等 极 性, 例 如 二 氯 甲 烷 中 等 疏 水 性 硅 胶 基 ) CH 3OH/H 2O CH 3CN/H 2O 乙 酸 乙 酯 反 相 ( 非 极 性 键 合 相 弱 极 性 到 中 等 非 极 性 强 极 性 ( 例 如 H2O) 到 中 强 极 性, 例 如 乙 腈 甲 醇 弱 疏 水 性 硅 胶 基 ) 等 极 性 ( 例 如 乙 酸 乙 酯 ) 聚 合 物 型 反 相 ( 经 亲 水 修 饰 ) 酸 性 碱 性 中 性 水 或 缓 冲 液 强 极 性, 例 如 乙 腈 甲 醇 WAX( 弱 阴 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 酸 性 SAX( 强 阴 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 酸 性 WCX( 弱 阳 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 碱 性 SCX( 强 阳 离 子 交 换 ) 离 子 型 ( 可 离 子 化 ) 碱 性 水 或 缓 冲 液 (ph 约 为 1-2) 水 或 缓 冲 液 (ph = pk a + 2) 水 或 缓 冲 液 (ph 约 为 6-7) 水 或 缓 冲 液 (ph = pk a 2) A. 碱 性 有 机 溶 剂 B. 吸 附 剂 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 采 用 有 机 溶 剂 配 制 的 缓 冲 液 (ph = pk a - 2) B. 分 析 物 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 酸 性 有 机 溶 剂 B. 吸 附 剂 或 分 析 物 为 中 性 时 的 ph C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 A. 采 用 有 机 溶 剂 配 制 的 缓 冲 液 (ph = pk a + 2) B. 分 析 物 为 中 性 时 的 ph 值 C. 高 离 子 强 度 缓 冲 液 表 18. SPE 吸 附 剂 条 件 指 南 140

其 它 推 荐 的 读 物 色 谱 样 品 前 处 理 的 基 本 知 识, 安 捷 伦 科 技 公 司 2013 年, 出 版 号 5991-3326CHCN Snyder, Lloyd R, Kirkland, Joseph J. and Dolan, John W., Introduction to Modern Liquid Chromatography( 现 代 液 相 色 谱 导 论 ),John Wiley & Sons Inc., 2010. 第 三 版 An Introduction to Gel Permeation Chromatography and Size Exclusion Chromatography( 凝 胶 过 滤 色 谱 与 体 积 排 阻 色 谱 导 论 ), 安 捷 伦 科 技 公 司,2011, 出 版 号 5990-6969EN Meyer, Veronika R., Practical High-Performance Liquid Chromatography( 实 用 高 效 液 相 色 谱 法 ) 第 四 版, John Wiley & Sons, Inc., 1999 Snyder, Lloyd R. and Dolan, John W., High-Performance Gradient Elution( 高 效 梯 度 洗 脱 ),John Wiley & Sons, Inc., 2007 Snyder, Lloyd R. Kirkland, Joseph J. and Glajch, Joseph L., Practical HPLC Method Development( 实 用 HPLC 方 法 开 发 ),John Wiley & Sons, Second Edition, 1997 Cunico, Robert L.; Gooding, Karen M. and Wehr, Tim, Basic HPLC and CE of Biomolecules( 生 物 分 子 的 HPLC 和 CE 分 析 基 础 导 论 ),Bay Bio 分 析 柱 Laboratory, Inc., 1998 Neue, Uwe D., HPLC Columns: Theory, Technology and Practice(HPLC 色 谱 柱 : 理 论 技 术 与 实 践 ), John Wiley & Sons, Inc., 1997 其 它 安 捷 伦 资 源 以 下 介 绍 一 些 获 取 更 多 信 息 的 好 去 处 : 资 源 详 细 介 绍 液 相 色 谱 柱 和 样 品 前 处 理 导 航 器 LC 方 法 转 换 器 LC 流 速 计 算 器 应 用 程 序 一 款 互 动 的 在 线 工 具, 可 为 您 的 应 用 提 供 最 佳 的 液 相 色 谱 柱 和 样 品 制 备 产 品 建 议 www.agilent.com/chem/navigator 这 款 在 线 工 具 帮 助 您 在 柱 长 柱 内 径 系 统 流 速 等 因 素 改 变 时, 快 速 计 算 方 法 中 相 应 因 子 的 调 整 对 准 确 调 节 梯 度 方 法 尤 为 有 用 请 访 问 www.chem.agilent.com, 并 搜 索 LC Method Translator(LC 方 法 转 换 器 ) 如 果 您 有 一 部 智 能 手 机, 将 可 以 在 其 中 安 装 免 费 的 应 用 程 序, 让 您 根 据 方 法 的 其 他 变 化 调 整 流 速 登 录 www.agilent.com/chem/lcapp 查 找 该 应 用 程 序 Agilent CrossLab 选 择 工 具 仅 需 要 回 答 在 线 工 具 上 的 几 个 问 题, 我 们 便 可 以 针 对 您 的 非 安 捷 伦 仪 器, 推 荐 最 佳 的 消 耗 品 www.agilent.com/chem/selectcrosslab 样 品 瓶 选 择 向 导 产 品 选 择 如 此 之 多, 要 想 为 您 的 应 用 选 择 匹 配 的 样 品 瓶 瓶 盖 隔 垫 将 费 时 又 费 力 使 用 该 互 动 工 具 可 使 这 一 过 程 简 单 无 比 www.agilent.com/chem/selectvials 注 射 式 过 滤 器 选 择 指 南 使 用 该 工 具, 可 快 速 简 便 地 选 择 适 合 您 应 用 的 注 射 式 过 滤 器 www.agilent.com/chem/selectfilters www.agilent.com/chem/ 我 们 根 据 本 指 南 制 作 了 一 系 列 视 频 说 明 其 中 某 些 要 点, 过 一 段 时 间, 我 们 还 将 lctroubleshooting 添 加 新 的 其 它 视 频 表 19. 其 它 安 捷 伦 资 源 141

词 汇 表 A a: 见 分 离 因 子 A solvent( 溶 剂 A): 通 常 指 二 元 洗 脱 或 梯 度 洗 脱 分 离 中 较 弱 的 溶 剂 在 反 相 液 相 色 谱 (LC) 中, 溶 剂 A 一 般 为 水 或 含 水 量 较 大 的 混 合 物 A term(a 项 ): van Deemter 方 程 中 的 第 一 项 参 见 涡 流 扩 散 项 和 van Deemter 方 程 Accurate mass( 精 确 质 量 ): 在 适 当 的 准 确 度 和 精 度 水 平 下, 经 实 验 测 定 而 得 的 离 子 质 量 数, 可 用 于 确 定 或 限 定 离 子 对 应 的 分 子 式 Adapter( 适 配 接 头 ): 每 端 螺 纹 不 同 的 两 通 接 头 ; 通 常 用 于 将 两 种 不 同 类 型 的 管 线 连 在 一 起 Absorption( 吸 附 ): 保 留 的 过 程, 其 中 溶 质 分 配 到 液 体 状 态 的 表 层 中 Activity( 活 性 ): 吸 附 色 谱 填 料 表 面 的 相 对 强 度 对 硅 胶 来 说, 硅 醇 基 越 多, 表 面 活 性 越 强 可 以 通 过 加 水 或 其 它 极 性 改 性 剂 与 活 性 位 点 发 生 氢 键 结 合, 对 活 性 进 行 控 制, 使 表 面 活 性 降 低 Additive( 添 加 剂 ): 添 加 到 流 动 相 中 改 善 分 离 或 检 测 特 征 的 物 质 ; 例 如, 掩 蔽 硅 醇 基 作 用 的 竞 争 性 碱 封 闭 金 属 位 点 的 螯 合 剂, 或 用 于 间 接 光 度 检 测 的 UV 吸 收 化 合 物 等 Adjusted retention time (t R')( 调 整 保 留 时 间 t R'): 扣 除 滞 留 时 间 后 的 保 留 时 间 :t R' = t R t M, 其 中 t R 为 保 留 时 间, t M 为 滞 留 时 间 ( 不 保 留 的 小 分 子 化 合 物 完 全 通 过 各 孔 隙 从 色 谱 柱 中 被 洗 脱 出 来 所 用 的 时 间 ) Adjusted retention volume (V R')( 调 整 保 留 体 积 V R'): 扣 除 滞 留 体 积 后 的 保 留 体 积 ;V R' = V R V M, 其 中 V R 为 目 标 峰 的 保 留 体 积,V M 为 滞 留 体 积 ( 相 对 于 色 谱 柱 中 流 动 相 总 体 积 的 体 积 ) 参 见 死 体 积 和 滞 留 体 积 Adsorbent( 吸 附 剂 ): 吸 附 色 谱 所 用 的 填 料 硅 胶 和 氧 化 铝 是 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 中 最 常 用 的 吸 附 剂 Adsorption( 吸 附 ): 溶 质 与 吸 附 剂 表 面 发 生 相 互 作 用 的 保 留 过 程 其 作 用 力 可 以 是 强 作 用 力 ( 氢 键 ) 或 弱 作 用 力 ( 范 德 华 力 ) 对 于 硅 胶, 硅 醇 基 是 吸 附 的 驱 动 力, 任 何 溶 质 官 能 团 都 可 以 与 该 基 团 发 生 相 互 作 用, 而 保 留 在 硅 胶 上 吸 附 主 要 发 生 在 表 面, 而 不 是 渗 透 或 嵌 入 到 固 定 相 涂 层 内 部, 或 键 合 到 表 面 Adsorption chromatography( 吸 附 色 谱 ): 一 种 吸 附 发 生 在 活 性 固 体 表 面 而 影 响 分 离 的 基 本 LC 模 式 硅 胶 和 氧 化 铝 是 最 常 用 的 正 相 吸 附 剂, 分 子 通 过 其 极 性 官 能 团 与 填 料 表 面 官 能 团 的 相 互 作 用 而 被 保 留, 例 如, 硅 醇 基 碳 在 反 相 模 式 中 也 被 用 作 吸 附 剂 Adsorption isotherm( 吸 附 等 温 线 ): 吸 附 色 谱 中, 单 位 体 积 流 动 相 中 的 样 品 浓 度 与 单 位 重 量 固 定 相 中 的 浓 度 之 比 吸 附 等 温 线 的 形 状 可 以 决 定 溶 质 的 色 谱 行 为 ; 例 如, 拖 尾 峰 前 伸 峰 和 色 谱 柱 过 载 Aerogel( 气 凝 胶 ): 在 制 备 过 程 中, 从 凝 胶 系 统 中 去 除 分 散 溶 剂 后 不 会 使 硅 胶 结 构 塌 陷 的 一 种 填 料 体 积 排 阻 色 谱 (SEC) 中 使 用 的 硅 胶 和 玻 璃 珠 即 为 气 凝 胶 的 实 例, 即 使 在 HPLC 的 高 压 下 仍 能 保 持 其 结 构 可 参 见 干 凝 胶 Affinity chromatography( 亲 和 色 谱 ): 将 特 异 性 配 体 比 如 酶 抗 体 或 激 素 与 固 体 基 体 或 载 体 偶 联, 从 而 能 够 提 供 特 异 生 物 吸 附 的 技 术 这 种 固 定 配 体 只 和 能 与 之 选 择 性 结 合 的 分 子 发 生 作 用 未 结 合 的 分 子 将 被 不 保 留 洗 脱 出 去 然 后 保 留 的 化 合 物 将 以 纯 化 状 态 被 洗 脱 亲 和 色 谱 一 般 为 一 种 开 关 式 分 离 技 术 Agarose( 琼 脂 糖 ): 一 种 在 生 物 色 谱 中 作 为 分 离 介 质 的 高 分 子 量 多 糖 在 凝 胶 过 滤 色 谱 中 常 以 珠 状 形 式 存 在, 使 用 水 相 流 动 相 Alkoxysilane( 硅 氧 烷 ): 化 学 键 合 相 制 备 中 使 用 的 一 种 反 应 物 可 与 硅 胶 进 行 下 列 反 应 :R 3SiOR + SiOH & Si- OSiR 3 + ROH, 其 中 R 为 烷 基 Alumina( 氧 化 铝 ): 吸 附 色 谱 中 使 用 的 一 种 正 相 吸 附 剂 氧 化 铝 为 多 孔 吸 附 剂, 具 有 弱 碱 性 表 面 ; 也 可 以 进 行 中 性 和 酸 性 改 性 碱 性 氧 化 铝 比 硅 胶 更 有 优 势, 后 者 具 有 酸 性 表 面 142

图 79. 拖 尾 峰 实 例 ( 经 参 考 文 献 3 允 许 进 行 修 改 ) Amino phase( 氨 基 固 定 相 ): 正 相 键 合 相 色 谱 中 使 用 的 丙 胺 基 固 定 相 可 与 某 些 溶 质 分 子 ( 如, 醛 类 ) 或 可 与 胺 发 生 反 应 的 流 动 相 添 加 剂 产 生 相 互 作 用 氨 基 固 定 相 有 几 种 用 途 : 作 为 弱 阴 离 子 交 换 剂, 也 可 以 用 水 - 乙 腈 为 流 动 相 分 离 碳 水 化 合 物 等 这 是 一 种 相 对 不 稳 定 的 固 定 相 Amphoteric ion exchange resin( 两 性 离 子 交 换 树 脂 ): 既 带 阳 离 子 基 团 又 带 阴 离 子 基 团 的 离 子 交 换 树 脂 这 类 树 脂 主 要 用 于 离 子 阻 滞, 所 有 离 子 型 物 质 都 可 以 从 溶 液 中 去 除, 因 为 该 树 脂 上 同 时 存 在 阴 离 子 和 阳 离 子 的 功 能 基 Analyte( 分 析 物 ): 经 由 HPLC 色 谱 柱 进 样 并 被 洗 脱 的 目 标 待 测 化 合 物 分 析 柱 Column( 分 析 柱 ): 用 于 定 性 和 定 量 分 析 的 HPLC 色 谱 柱 ; 一 般 分 析 柱 为 4.6 mm 内 径 50-250 cm( 柱 长 ), 但 也 有 更 窄 内 径 ( 低 至 0.05 mm 内 径 ) 的 分 析 柱 ; 可 用 不 锈 钢 玻 璃 玻 璃 内 衬 不 锈 钢 PEEK 和 其 它 金 属 和 非 金 属 材 料 制 成 Anion exchange( 阴 离 子 交 换 ): 分 离 阴 离 子 的 离 子 交 换 过 程 合 成 树 脂 键 合 相 硅 胶 和 其 它 金 属 氧 化 物 都 可 以 用 于 这 种 模 式 的 分 析 典 型 的 阴 离 子 交 换 功 能 基 是 四 烷 基 季 铵 盐, 为 强 阴 离 子 交 换 剂 而 键 合 固 定 相 上 的 氨 基 是 弱 阴 离 子 交 换 的 一 个 例 子 Asymmetry( 不 对 称 性 ): 描 述 色 谱 峰 形 的 因 子 色 谱 理 论 认 为 高 斯 分 布 的 峰 为 对 称 峰 定 量 测 定 峰 不 对 称 因 子, 在 峰 高 10% 处, 色 谱 峰 顶 点 到 色 谱 峰 后 沿 的 距 离 与 峰 顶 点 到 色 谱 峰 前 沿 的 距 离 之 比 不 对 称 性 还 有 其 它 常 用 测 量 方 法, 特 别 是 美 国 药 典 (USP) 方 法 见 图 80, 还 可 参 见 Foley-Dorsey 方 程 Asymmetry factor( 不 对 称 因 子 ): 表 示 峰 形 的 因 子 不 对 称 因 子 的 计 算 方 法 是, 从 色 谱 峰 顶 点 作 垂 线, 与 峰 高 10% 处 的 水 平 线 相 交 ; 交 点 处 沿 水 平 线 到 峰 尾 的 距 离 ( 距 离 B), 除 以 交 点 沿 水 平 线 到 峰 前 沿 的 距 离 ( 距 离 A), 得 到 的 比 值 称 为 峰 不 对 称 因 子 ( 见 图 79) 该 比 值 为 1 代 表 对 称 峰, 小 于 1 为 伸 舌 峰, 大 于 1 为 拖 尾 峰 该 值 越 大, 峰 的 对 称 性 越 差, 大 于 2 以 上 为 不 合 格 Atmosphere (atm)( 大 气 压 (atm)): 通 过 HPLC 柱 的 压 力 降 数 值 ;1 atm = 14.7 lb/ 英 寸 2 (psi) 可 参 见 bar 和 pascals Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)( 大 气 压 化 学 电 离 (APCI)): Atmospheric pressure photo ionization (APPI)( 大 气 压 光 电 离 (APPI)): Atomic mass( 原 子 质 量 ): 原 子 的 质 量, 以 amu( 原 子 质 量 单 位 ) 测 量, 该 单 位 定 义 为 基 态 碳 -12 原 子 的 质 量 的 十 二 分 之 一 B β: 参 见 相 比 B o: 参 见 渗 透 性 B solvent(b 溶 剂 ): 通 常 指 二 元 洗 脱 或 梯 度 分 离 中 较 强 的 溶 剂 ; 一 般 为 反 相 LC 中 的 有 机 改 性 剂 或 富 含 改 性 剂 的 二 元 混 合 物 ( 与 水 混 合 ) B term(b 项 ): van Deemter 方 程 中 的 第 二 项 也 可 参 见 纵 向 扩 散 和 分 子 扩 散 项 Backflushing( 反 冲 ): 一 种 柱 切 换 技 术, 在 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间 有 一 个 四 通 阀, 流 动 相 可 以 向 两 个 方 向 流 动 使 用 反 冲 洗 脱 柱 头 上 的 强 驻 留 化 合 物 可 以 对 这 些 化 合 物 进 行 分 析, 也 可 以 只 是 将 其 从 色 谱 柱 中 除 去 Backpressure( 反 压 ): 同 柱 头 压 柱 压 Backpressure regulator( 反 压 调 节 器 ): 置 于 检 测 器 之 后 的 在 线 设 备, 其 作 用 是 使 流 通 池 保 持 正 压, 最 大 限 度 地 减 少 检 测 器 中 溶 剂 气 泡 溢 出 的 问 题 Band( 谱 带 ): 指 流 经 并 最 终 洗 脱 出 色 谱 柱 的 色 谱 峰 143

Bidentate silane( 双 配 位 基 硅 烷 ): 一 种 特 殊 键 合 相, 硅 烷 通 过 两 个 硅 氧 烷 基 键 合 在 填 料 表 面 上, 硅 烷 上 的 两 个 硅 原 子 以 短 烃 桥 连 接 Binary mobile phase( 二 元 流 动 相 ): 含 两 种 溶 剂 或 缓 冲 液 的 流 动 相 图 80. 不 同 高 度 的 高 斯 峰 宽 是 该 峰 标 准 偏 差 σ 的 函 数 ( 经 参 考 文 献 2 允 许 进 行 修 改 ) Band broadening( 谱 带 变 宽 ): 色 谱 谱 带 流 经 色 谱 柱 的 过 程 中, 峰 宽 增 加 并 伴 随 稀 释 的 现 象 理 论 上, 色 谱 峰 以 窄 条 形 式 进 样, 如 果 没 有 谱 带 变 宽 的 过 程, 每 个 分 离 的 组 分 也 将 以 纯 化 合 物 的 窄 条 形 式 被 洗 脱 谱 带 变 宽 的 测 量 是 带 宽 (t w), 或, 更 准 确 地 说, 是 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 (N) 有 时 称 为 谱 带 扩 散 或 谱 带 延 伸 参 见 图 80 Bandwidth (t w )( 谱 带 宽 度 t w ): 从 色 谱 柱 中 洗 脱 出 的 色 谱 谱 带 宽 度 一 般 测 量 方 法 是, 在 高 斯 峰 曲 线 两 侧 的 拐 点 处 作 切 线, 测 量 基 线 上 两 交 点 间 的 距 离 窄 带 宽 通 常 代 表 有 效 分 离, 也 称 峰 宽 见 图 80 Bar:HPLC 中 的 压 力 单 位, 相 当 于 1 atm,~ 15 lb/in. 2, 或 0.1 MPa Baseline( 基 线 ): 基 线 是 记 录 设 备 划 出 的 一 条 线, 表 示 仅 有 流 动 相 通 过 时 检 测 器 产 生 的 信 号 也 是 计 算 色 谱 峰 的 峰 面 积 或 峰 高 的 初 始 边 界 线 Baseline noise( 基 线 噪 音 ): 电 流 噪 音 温 度 波 动 流 通 池 中 气 体 溢 出 或 流 动 相 溶 剂 混 合 不 好 等 原 因 造 成 的 色 谱 基 线 的 不 规 则 变 化 ( 短 期 ) BET method(bet 方 法 ): 由 Bruner Emmett 和 Teller (BET) 三 人 开 发 的 方 法, 通 过 液 氮 温 度 下 孔 隙 内 氮 吸 附 - 凝 结 测 量 表 面 积 用 BET 方 法 还 可 以 计 算 孔 隙 体 积 和 孔 径 分 布 Biocompatible( 生 物 兼 容 性 ): 指 不 会 发 生 不 可 逆 吸 附 或 强 吸 附 使 生 物 分 子 ( 如, 蛋 白 质 ) 失 活 的 色 谱 柱 或 仪 器 部 件 通 常 指 无 金 属 或 陶 瓷 的 表 面 和 部 件 Bonded-phase chromatography( 键 合 相 色 谱 ): 液 相 色 谱 中 最 常 用 的 模 式, 用 化 学 键 合 在 支 持 剂 上 的 固 定 相 进 行 分 离 键 合 相 色 谱 最 常 用 的 支 持 剂 是 硅 胶 微 粒, 最 常 见 的 键 合 相 类 型 是 有 机 硅 烷, 如, 反 相 色 谱 中 使 用 的 十 八 烷 基 硅 烷 约 70% 的 HPLC 应 用 都 是 用 化 学 键 合 相 完 成 的 Bonded-phase concentration( 键 合 相 浓 度 ): 参 见 覆 盖 率 Boxcar chromatography(boxcar 色 谱 ): 参 见 柱 切 换 Breakthrough volume( 穿 透 体 积 ): 某 种 溶 质 持 续 通 过 色 谱 柱 到 开 始 被 洗 脱 前 的 体 积 与 色 谱 柱 体 积 和 该 溶 质 的 保 留 因 子 有 关 在 测 定 特 定 溶 质 的 色 谱 柱 总 样 品 容 量 时 非 常 有 用 Buffer( 缓 冲 液 ): 保 持 ph 不 变 的 溶 液, 阻 止 因 稀 释 或 加 入 少 量 酸 碱 而 带 来 的 ph 改 变 Buffer capacity( 缓 冲 容 量 ): 缓 冲 液 缓 冲 能 力 的 定 量 测 定 值 ( 定 义 为 改 变 1 升 缓 冲 液 ph 1 个 单 位 所 需 的 强 酸 或 碱 的 量 ), 或 指 承 受 进 样 缓 冲 的 样 品 溶 液 而 不 改 变 流 动 相 ph 的 缓 冲 能 力 ; 缓 冲 容 量 由 ph 缓 冲 液 pk a 缓 冲 液 浓 度 决 定 Buffer strength( 缓 冲 强 度 ): 参 见 离 子 强 度 C C term(c 项 ): van Deemter 方 程 的 传 质 阻 抗 项 参 见 传 质 和 van Deemter 方 程 C8: 参 见 辛 基 硅 烷 C18: 参 见 十 八 烷 基 硅 烷 144

C4, C8, C18, etc(c4, C8, C18 等 ): 指 反 相 键 合 相 的 烷 烃 链 长 度 C S : 参 见 Langmuir 等 温 线 Capacity( 容 量 ): 参 见 样 品 容 量 Capacity factor (k')( 容 量 因 子 k'): 色 谱 参 数 的 旧 术 语 是 说 明 保 留 的 参 数 现 在 由 国 际 提 纯 和 应 用 化 学 联 盟 (IUPAC) 定 义 为 保 留 因 子 (k) 参 见 保 留 因 子 的 计 算 方 法 Capillary column( 毛 细 管 柱 ): 指 内 径 小 于 0.5 mm 的 色 谱 柱 Capillary electrochromatography (CEC)( 毛 细 管 电 色 谱 CEC): 在 毛 细 管 柱 内 填 充 色 谱 吸 附 剂, 由 电 渗 流 而 不 是 压 力 驱 动 流 动 相 流 过 色 谱 柱 的 一 种 混 合 技 术 ; 该 技 术 兼 具 有 HPLC 填 料 表 面 的 选 择 性 和 毛 细 管 电 泳 (CE) 的 高 柱 效 Capillary LC( 毛 细 管 液 相 色 谱 ): 一 般 指 在 石 英 管 或 其 它 类 型 毛 细 管 中 进 行 的 HPLC, 内 径 一 般 小 于 0.5 mm, 也 称 微 量 LC Capillary micellar electrochromatography( 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 ): 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 (MEKC) 的 CEC 版 Capillary tubing( 毛 细 管 管 线 ): 连 接 色 谱 仪 各 部 件 并 引 导 流 动 相 流 入 适 当 部 件 的 管 线 HPLC 中 使 用 的 大 多 数 毛 细 管 管 线 内 径 小 于 0.020 英 寸 最 窄 的 有 用 内 径 约 为 0.004 英 寸 Capping( 端 基 保 护 ): 同 封 端 Carbon load( 碳 载 量 ): 对 于 硅 胶 键 合 相 来 说, 该 术 语 一 般 用 来 描 述 表 面 覆 盖 率 或 填 料 表 面 硅 醇 基 已 发 生 反 应 并 被 键 合 相 取 代 的 程 度 ; 碳 载 量 越 高, 残 留 硅 醇 基 数 越 少 碳 载 量 通 常 用 % 碳 表 示 ( 比 如,12% 碳 ) 在 反 相 LC 中, 碳 载 量 越 高, 分 析 物 保 留 越 大 Carrier( 载 体 ): 常 在 亲 和 色 谱 中 使 用 的 术 语 ; 指 结 合 活 性 配 基 ( 通 常 通 过 共 价 键 ) 的 支 持 剂 ; 也 指 其 它 色 谱 模 式 ( 比 如, 液 液 色 谱 ) 中 的 支 持 剂 Carrier gas( 载 气 ): 气 象 色 谱 (GC) 中 的 流 动 相 Cartridge column( 卡 套 柱 ): 一 种 置 于 卡 套 中 没 有 柱 端 接 头 的 色 谱 柱 该 柱 由 一 根 柱 管 和 填 料 组 成, 柱 管 两 端 有 筛 板 卡 套 柱 易 于 更 换, 比 带 柱 端 接 头 的 常 规 色 谱 柱 更 经 济 更 方 便 Cation exchange chromatography( 阳 离 子 交 换 色 谱 ): 离 子 交 换 色 谱 的 一 种, 使 用 带 有 分 离 阳 离 子 官 能 团 的 树 脂 或 填 料 强 阳 离 子 官 能 团 可 以 是 磺 酸, 弱 阳 离 子 交 换 官 能 团 可 以 是 羧 酸 CE: 毛 细 管 电 泳 CEC: 参 见 毛 细 管 电 色 谱 CGE: 参 见 毛 细 管 凝 胶 电 泳 CZE: 参 见 毛 细 管 区 带 电 泳 Chain length( 碳 链 长 度 ): 反 相 填 料 烷 烃 部 分 中 的 碳 链 长 度 用 碳 原 子 数 表 示 (C8 C18 等 ) 不 包 括 短 链 一 般 为 也 能 连 接 硅 烷 的 甲 基 异 丙 基 和 仲 丁 基 Channeling( 沟 流 ): 发 生 于 填 料 产 生 的 空 隙 中, 使 流 动 相 及 溶 质 的 流 速 比 平 均 流 速 移 动 更 快, 从 而 导 致 谱 带 变 宽 空 隙 产 生 的 原 因 是 填 充 不 当, 或 填 充 柱 床 损 坏 Check valve( 单 向 阀 ): 插 入 到 流 动 液 体 中 的 装 置, 可 以 使 液 流 只 向 一 个 方 向 流 动, 常 用 于 HPLC 泵 的 入 口 和 出 口 部 分 Chemisorption( 化 学 吸 附 ): 与 填 料 发 生 化 学 反 应 引 起 的 吸 附 这 种 相 互 作 用 大 多 数 都 是 不 可 逆 的, 通 常 发 生 在 带 反 应 性 官 能 团 的 填 料 上 ( 如, 硅 醇 基 或 键 合 氨 基 固 定 相 ) 化 学 吸 附 常 见 于 有 强 Lewis 酸 位 点 的 金 属 氧 化 物 固 定 相 Chiral recognition( 手 性 识 别 ): 手 性 固 定 相 与 两 个 对 映 体 发 生 不 同 相 互 作 用, 使 其 发 生 HPLC 分 离 的 能 力 Chiral stationary phases( 手 性 固 定 相 ): 为 分 离 对 映 体 混 合 物 而 设 计 的 固 定 相 固 体 支 持 剂 可 以 键 合 或 涂 覆 这 种 固 定 相, 在 固 体 支 持 剂 表 面 产 生 原 位, 或 存 在 于 表 面 孔 隙 内, 均 能 与 一 种 对 映 体 结 构 发 生 特 异 性 相 互 作 用 Chlorosilane( 氯 硅 烷 ): 用 于 制 备 硅 氧 烷 键 合 相 的 化 学 试 剂, 反 应 能 力 依 次 为 单 氯 硅 烷 < 二 氯 硅 烷 < 三 氯 硅 烷 烷 烃 部 分 ( 十 八 烷 基 辛 烷 基 等 ) 决 定 了 所 得 键 合 相 的 疏 水 性, 也 可 以 用 烷 氧 基 硅 烷, 但 反 应 活 性 较 低 Chromatogram( 色 谱 图 ): 在 色 谱 分 离 过 程 中, 时 间 对 检 测 器 输 出 信 号 或 洗 脱 体 积 对 样 品 浓 度 作 图 的 曲 线 145

Chromatograph( 色 谱 仪 ): 名 词 : 用 于 进 行 色 谱 分 离 的 仪 器 动 词 (IUPAC): 通 过 色 谱 柱 床 进 行 洗 脱 分 离 的 行 为 Chromatographic conditions( 色 谱 条 件 ): 描 述 如 何 进 行 分 析 的 色 谱 方 法 参 数 必 须 提 供 足 够 的 信 息, 从 而 使 分 析 可 以 重 复, 达 到 验 证 的 目 的 Classification( 分 级 ): 筛 分 不 同 粒 径 填 料 的 过 程 ; 一 般 而 言, 在 HPLC 中 窄 粒 径 分 布 由 于 没 有 细 微 颗 粒, 能 提 供 更 好 的 柱 效 和 更 高 的 渗 透 性 可 采 用 沉 降 水 析 和 离 心 等 技 术 完 成 不 同 粒 径 填 料 的 分 级 Column backpressure( 色 谱 柱 反 压 ): 见 柱 头 压 Column chromatography( 柱 色 谱 ): 采 用 色 谱 柱 或 柱 管 填 充 固 定 相 的 色 谱 形 式 开 管 柱 色 谱 HPLC 和 开 管 毛 细 管 柱 色 谱, 都 是 柱 色 谱 的 形 式 多 数 情 况 下 是 指 用 于 制 备 级 别 的 开 管 柱 色 谱 Column dead time( 色 谱 柱 死 时 间 ): 死 时 间 与 死 体 积 相 关 ; 用 死 体 积 除 以 流 速 测 定 ; 在 反 相 液 相 色 谱 中, 常 用 尿 嘧 啶 测 量 死 体 积 和 死 时 间 Column length (L)( 柱 长,L): HPLC 或 CE 中 用 于 进 行 液 相 分 离 的 色 谱 柱 或 毛 细 管 的 长 度 Column packing( 柱 填 料 ): 固 体 材 料, 通 常 为 多 孔 固 体 可 具 备 或 不 具 备 化 学 活 性 表 面 的, 填 充 于 色 谱 柱 内, 用 于 有 差 异 地 保 留 分 析 物, 特 指 固 定 相 常 用 填 料 为 未 键 合 和 键 合 硅 胶 树 脂 无 机 - 有 机 混 合 物 和 石 墨 化 炭 黑 Column performance (N)( 色 谱 柱 性 能,N): 特 指 色 谱 柱 柱 效 ; 给 定 化 合 物 的 理 论 塔 板 数 Column plate number (N)( 色 谱 柱 塔 板 数,N): 代 表 柱 效, 塔 板 数 越 高, 该 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 就 越 高 一 般 来 讲, 用 5-/m d p 多 孔 填 料 填 充 良 好 的 150 x 4.6 mm 色 谱 柱 的 塔 板 数 应 在 10000-12000 之 间 Column switching( 柱 切 换 ): 将 多 根 色 谱 柱 通 过 切 换 阀 连 接 在 一 起, 用 于 更 好 的 色 谱 分 离 或 样 品 净 化 第 一 根 色 谱 柱 中 流 出 的 组 分 可 以 切 换 到 两 个 或 更 多 二 级 色 谱 柱 上, 再 依 次 被 送 入 其 它 色 谱 柱 或 检 测 器 有 时 称 为 多 维 色 谱 Competing base( 竞 争 性 碱 ): 在 反 相 色 谱 流 动 相 中 添 加 少 量 碱 性 化 合 物, 如 三 乙 胺 或 二 甲 基 辛 胺 (10-50 mm), 抑 制 碱 性 分 析 物 与 残 留 硅 醇 基 的 相 互 作 用, 遵 循 质 量 作 用 定 律, 因 为 竞 争 性 碱 的 浓 度 远 远 大 于 分 析 物 浓 度 也 可 参 见 添 加 剂 Comprehensive two-dimensional chromatography ( 全 二 维 色 谱 ): 用 于 各 种 组 分 分 离 的 二 维 色 谱 也 可 参 见 二 维 色 谱 Controlled surface porosity support( 控 制 表 面 孔 隙 率 支 持 剂 ): 同 多 孔 层 珠 和 薄 壳 型 填 料 Counterion( 平 衡 离 子 ): 在 离 子 交 换 过 程 中 用 于 从 离 子 位 点 上 取 代 目 标 离 子 的 溶 液 中 离 子 在 离 子 对 形 成 过 程 中, 加 入 流 动 相 中 的 用 于 形 成 溶 液 中 中 性 离 子 对 的 反 电 荷 离 子 Coupled columns( 结 合 柱 ): 柱 切 换 的 一 种 形 式, 一 根 初 级 柱 通 过 选 择 阀 连 接 两 根 二 级 柱 从 第 一 根 色 谱 柱 中 流 出 的 组 分, 选 择 性 地 导 入 第 二 和 第 三 根 色 谱 柱 进 一 步 分 离 该 术 语 还 用 于 表 示 将 两 根 或 更 多 色 谱 柱 串 联 在 一 起, 增 加 塔 板 数 Coverage( 覆 盖 率 ): 指 在 键 合 相 色 谱 中, 硅 胶 支 持 剂 上 键 合 相 的 量 覆 盖 率 通 常 用 每 平 方 米 微 摩 尔 或 碳 百 分 含 量 (w/w) 表 示 Critical micelle concentration( 临 界 胶 束 浓 度 ): 离 子 型 表 面 活 性 剂 聚 集 形 成 胶 束 的 浓 度 ; 胶 束 加 入 流 动 相 中 通 过 分 配 机 制 改 善 非 离 子 型 物 质 在 HPLC 和 CE (MEKC) 中 的 分 离 Cross-linking( 交 联 ): 在 树 脂 形 成 三 维 基 质 的 共 聚 过 程 中, 加 入 一 种 双 功 能 基 单 体 在 相 邻 聚 合 物 链 之 间 形 成 交 联 键 交 联 的 程 度 由 反 应 中 单 体 的 加 入 量 决 定 例 如, 二 乙 烯 基 苯 是 生 产 聚 苯 乙 烯 离 子 交 换 树 脂 常 用 的 交 联 剂 树 脂 的 溶 胀 和 扩 散 性 质 由 其 交 联 度 决 定 Cyano phase( 氰 基 固 定 相 ): 一 种 末 端 带 -CN 基 团 的 化 学 键 合 相, 可 以 作 为 一 种 中 等 极 性 的 吸 附 剂 用 于 正 相 分 离, 也 可 以 作 为 一 种 短 链 键 合 相 用 于 反 相 分 离 Column volume (V c)( 柱 体 积,V c ): 未 填 充 柱 的 体 积 ; V c = A cl, 其 中 A c 和 L 分 别 为 柱 管 截 面 积 和 柱 管 长 度 146

Cyclodextrins( 环 糊 精 ): 由 几 个 D-(+)- 吡 喃 葡 萄 糖 单 元 组 成 的 环 状 低 聚 物, 用 于 手 性 HPLC 和 CE 分 离 常 用 的 有 a,b 和 g- 环 糊 精 ; 具 有 短 锥 形 结 构 相 对 疏 水 的 空 腔, 在 其 两 端 有 一 级 和 二 级 羟 基 ; 基 于 对 对 映 体 不 同 的 包 含 作 用 对 其 进 行 分 离 ; 带 衍 生 羟 基 的 改 性 环 糊 精 也 可 用 于 改 变 选 择 性 D Data acquisition rate( 数 据 采 集 速 率 ): 指 检 测 器 输 出 的 样 品 采 集 速 率 如 需 表 征 一 个 色 谱 峰 必 须 至 少 采 集 20-30 个 数 据 点 数 据 采 集 速 率 通 常 用 赫 兹 表 示, 定 义 为 当 色 谱 峰 通 过 检 测 器 时, 每 秒 钟 收 集 多 少 个 数 据 点 对 于 快 速 色 谱 分 析 而 言, 数 据 采 集 速 率 必 须 足 够 快, 以 表 征 一 个 窄 峰 现 代 检 测 器 的 数 据 采 集 速 率 可 高 达 80 Hz; 也 称 为 数 据 速 率 和 采 样 速 率 Dead volume (V M)( 死 体 积 V M ): 色 谱 柱 死 体 积 指 小 分 子 ( 可 渗 透 入 填 料 的 所 有 孔 隙 ) 可 通 过 的 所 有 空 间 包 括 空 隙 体 积 和 空 孔 隙 体 积 用 V M 表 示 系 统 死 体 积 包 括 连 接 进 样 器 和 检 测 器 到 色 谱 柱 的 管 线 体 积 系 统 死 体 积 一 般 通 过 进 样 基 本 不 保 留 的 小 分 子 来 测 定 尿 嘧 啶 丙 酮 和 硫 脲 是 反 相 色 谱 中 最 常 用 的 测 试 物 质 也 可 参 见 调 整 保 留 体 积 滞 留 体 积 和 空 隙 体 积 DEAE: 参 见 二 乙 氨 基 乙 基 Degassing( 脱 气 ): 在 使 用 前 或 使 用 中, 去 除 流 动 相 中 溶 解 气 体 的 过 程 溶 解 的 气 体 可 能 在 检 测 器 流 通 池 内 从 溶 液 中 逸 出, 引 起 基 线 尖 峰 和 噪 音 溶 解 的 空 气 可 以 影 响 的 检 测 器 包 括 电 化 学 ( 参 与 反 应 ) 或 荧 光 ( 造 成 淬 灭 ) 检 测 器 溶 解 的 气 体 还 可 能 使 泵 损 失 性 能 脱 气 的 方 式 包 括 加 热 溶 剂 氦 气 鼓 泡 或 使 用 真 空 ( 用 真 空 瓶 ) 或 用 一 种 由 可 透 过 气 体 的 物 质 ( 聚 四 氟 乙 烯 PTFE) 制 成 的 管 线 在 线 抽 真 空 Denaturing HPLC( 变 性 HPLC): 用 反 相 HPLC 研 究 DNA 碱 基 对 以 分 析 基 因 突 变 Desalting( 脱 盐 ): 将 低 分 子 量 盐 和 其 它 化 合 物 从 非 离 子 化 和 高 分 子 量 化 合 物 中 去 除 的 技 术 一 个 实 例 是 反 相 填 料 通 过 疏 水 作 用 保 留 样 品 化 合 物, 使 盐 不 保 留 洗 脱 另 一 个 例 子 是 使 用 SEC 柱 排 除 大 分 子, 保 留 较 小 分 子 量 的 盐 Dextran( 葡 聚 糖 ): 主 要 用 于 低 压 生 物 色 谱 的 葡 聚 糖 基 质 填 料 ; 例 如,Sephadex (GE Healthcare, Piscataway, NewJersey) Diethylaminoethyl (DEAE)( 二 乙 氨 基 乙 基,DEAE): 一 种 常 用 的 弱 阴 离 子 交 换 功 能 基 ( 通 常 连 接 在 纤 维 素 或 Sepharose [GE Healthcare] 上 ), 用 于 分 离 生 物 大 分 子 Diffusion coefficient (D M or D S)( 扩 散 系 数,D M 或 D S ): 分 子 在 气 体 溶 液 (D M) 或 固 定 相 (D S) 中 的 基 本 参 数 用 每 秒 平 方 厘 米 表 示 D M 取 决 于 溶 质 的 分 子 量 温 度 溶 剂 粘 度 和 溶 质 的 摩 尔 体 积 100-Da 的 分 子 在 室 温 下 反 相 色 谱 中 扩 散 系 数 一 般 为 10-5 cm 2 /s Diol phase( 二 醇 固 定 相 ): 一 种 正 相 和 反 相 使 用 的 亲 水 固 定 相 为 二 醇 结 构 ( 在 脂 肪 烃 链 相 邻 碳 原 子 上 有 两 个 羟 基 ) 在 正 相 色 谱 中, 其 极 性 比 硅 胶 弱 在 反 相 色 谱 中 用 于 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 Displacement chromatography( 置 换 色 谱 ): 一 种 色 谱 技 术, 样 品 置 于 色 谱 柱 头, 然 后 用 一 种 比 原 混 合 物 中 化 合 物 与 固 定 相 吸 附 更 强 的 化 合 物 进 行 置 换 然 后 样 品 分 子 被 彼 此 置 换, 被 强 吸 附 化 合 物 推 动 其 结 果 是 洗 脱 的 样 品 溶 质 区 带 可 能 很 尖 锐 ; 置 换 技 术 主 要 用 于 制 备 级 HPLC 应 用 Distribution constant (coefficient) (K c)( 分 布 常 数 ( 系 数 )(K c): 在 分 配 色 谱 中, 用 固 定 相 单 位 体 积 表 述 固 定 相 中 的 样 品 浓 度, 使 用 分 配 系 数 K c, 即 V R = V M + K cv S 在 固 体 固 定 相 中, 则 用 干 燥 固 定 相 的 单 位 质 量 ( 重 量 ) 表 述 固 定 相 中 的 样 品 浓 度, 即 分 配 系 数 KV g 在 吸 附 色 谱 中, 吸 附 剂 的 比 表 面 积 需 是 良 好 表 征 的 已 知 值, 固 体 相 中 浓 度 用 单 位 表 面 积 表 述 Divert valve( 分 流 阀 ): 用 于 将 色 谱 柱 液 流 导 入 废 液 瓶 ( 而 非 质 谱 仪 ) 的 阀 D M : 见 扩 散 系 数 d p : 见 粒 径 D S : 见 扩 散 系 数 Dwell time( 驻 留 时 间 ): 与 驻 留 体 积 相 当 的 时 间 ; 由 流 速 和 驻 留 体 积 决 定 147

Dwell volume( 驻 留 体 积 ): 溶 剂 混 合 点 ( 通 常 在 液 相 色 谱 仪 的 混 合 腔 内 或 比 例 阀 中 ) 与 LC 柱 头 之 间 的 体 积 在 梯 度 洗 脱 或 等 度 洗 脱 的 溶 剂 组 成 改 变 时, 驻 留 体 积 对 于 使 色 谱 柱 在 尽 可 能 短 的 时 间 内 完 成 流 动 相 组 成 的 变 化 非 常 重 要 低 压 混 合 物 系 统 的 驻 留 体 积 一 般 比 高 压 混 合 系 统 大 Dynamic coating( 动 态 涂 层 ): 在 流 动 相 中 添 加 一 种 物 质, 可 以 吸 附 在 填 料 上 ( 或 吸 附 进 填 料 中 ), 或 管 壁 表 面, 在 HPLC 中 填 料 上 或 CE 中 毛 细 管 壁 上 形 成 原 位 涂 层 动 态 涂 层 的 目 的 是 生 成 新 的 固 定 相 或 去 除 填 料 或 毛 细 管 壁 的 活 性, 避 免 发 生 不 需 要 的 相 互 作 用 一 个 简 单 的 例 子 是 将 流 动 相 或 分 析 缓 冲 液 的 ph 调 到 3 以 下, 使 硅 醇 基 质 子 化 并 抑 制 其 影 响 另 一 个 例 子 是 用 亲 水 聚 合 物 材 料 对 固 定 相 进 行 涂 层, 防 止 蛋 白 质 的 吸 收 Dynamic range( 动 态 范 围 ): 测 定 量 的 最 大 值 与 最 小 值 之 比 E E: 参 见 分 离 阻 抗 e: 参 见 颗 粒 间 孔 隙 率 Eddy dispersion (diffusion) term (l)( 涡 流 扩 散 项,l): van Deemter 方 程 中 的 A 项 由 于 填 料 粒 径 和 形 状 及 管 壁 作 用 造 成 了 轴 向 流 向 不 稳 定, 决 定 因 此 影 响 了 塔 板 高 度 ; A = 2 ld p, 其 中,l 为 色 谱 柱 经 验 常 数 填 充 良 好 的 色 谱 柱 其 典 型 的 l 值 为 0.8-1.0 某 些 色 谱 理 论 认 为, 与 流 速 相 关 的 塔 板 高 度 相 当 于 这 一 过 程 的 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 也 称 为 涡 流 扩 散, 流 向 不 稳 定 导 致 峰 变 宽, 及 多 通 道 项 也 可 参 见 van Deemter 方 程 e e : 见 间 隙 孔 隙 率 Effective plate height (H eff)( 有 效 塔 板 高 度,H eff ): 柱 长 除 以 有 效 塔 板 数 Effective theoretical plates (N eff)( 有 效 理 论 塔 板 数 N eff ): 同 时 也 被 IUPAC 称 为 有 效 塔 板 数 色 谱 柱 中 的 真 实 塔 板 数, 因 为 它 用 死 体 积 校 正 了 理 论 塔 板 数 N eff = 16[(t R'/ w b) 2 ], 其 t R' 为 调 整 R b 保 留 时 间,w b 为 该 色 谱 峰 的 带 宽 ( 见 144 页 图 80) 对 于 形 状 和 相 比 差 别 很 大 的 色 谱 柱 而 言, 这 一 指 标 比 单 纯 的 塔 板 数 更 有 可 比 性 Efficiency (N or H )( 柱 效,N 或 H): 一 般 为 用 方 程 N = 16(V R/w b) 2 = 16 (t R/w b) 2 计 算 产 生 的 理 论 塔 板 数 (N), 其 中 w b 为 色 谱 峰 的 基 线 宽 度 ( 见 144 页 图 80) 如 果 在 半 峰 高 处 测 量 峰 宽, 则 使 用 下 式 计 算 :N = 5.545 (V R/w h) 2 塔 板 高 度 (H) 或 HETP 由 H = L/N 测 定 不 对 称 峰 的 柱 效 最 好 用 峰 的 距 心 和 峰 形 方 差 进 行 计 算 也 可 参 见 Foley- Dorsey 方 程 Effluent( 流 出 物 ): 从 色 谱 柱 流 出 的 流 动 相 ; 同 洗 脱 物 e i : 见 颗 粒 内 孔 隙 率 EIC: 提 取 离 子 色 谱 图 Electrospray Ionization (ESI)( 电 喷 雾 电 离 (ESI)): 电 喷 雾 电 离 (ESI) 是 一 种 用 于 生 成 气 相 离 子 的 软 电 离 技 术 Eluate( 洗 脱 物 ): 从 色 谱 柱 流 出 的 流 动 相 与 溶 质 ; 也 称 流 出 物 Eluent( 洗 脱 液 ): 用 于 进 行 分 离 的 流 动 相 Eluite( 被 洗 脱 物 ): 被 洗 脱 的 物 质, 分 析 物, 或 样 品 Eluotropic series( 洗 脱 序 ): 在 液 固 色 谱 或 吸 附 色 谱 中, 按 照 溶 剂 强 度 增 强 的 顺 序 排 列 的 一 系 列 常 用 溶 剂 ( 洗 脱 液 ) 在 正 相 色 谱 中, 非 极 性 溶 剂, 如 戊 烷 应 在 序 列 的 最 低 端, 中 等 极 性 溶 剂, 如 二 氯 甲 烷, 应 在 序 列 的 中 间, 强 极 性 溶 剂, 如 甲 醇, 应 接 近 序 列 的 最 高 端 在 反 相 色 谱 中, 强 度 顺 序 相 反, 水 最 弱, 而 乙 腈 最 强 因 此, 开 发 方 法 或 运 行 梯 度 时, 洗 脱 序 对 溶 剂 的 选 择 非 常 有 用 也 可 参 见 Snyder e o Elute( 洗 脱 ): 通 过 洗 脱 进 行 色 谱 分 离 洗 脱 一 词 在 旧 术 语 表 中 多 指 过 展 开 Elution( 洗 脱 过 程 ): 流 动 相 流 经 色 谱 柱, 将 溶 质 洗 出 色 谱 柱 的 过 程 Elution chromatography( 洗 脱 色 谱 ): 最 常 用 的 色 谱 方 法, 将 样 品 以 一 条 窄 区 带 置 于 柱 头, 各 分 析 物 被 分 离 并 从 柱 末 端 洗 脱 可 与 置 换 色 谱 和 迎 头 分 析 进 行 对 比 Elution volume (V R)( 洗 脱 体 积 V R ): 指 将 溶 质 从 色 谱 柱 中 洗 脱 需 要 的 流 动 相 体 积 为 一 个 对 称 峰 从 进 样 时 算 起 到 最 大 浓 度 ( 顶 点 ) 时 的 体 积 ;V R = Ft R, 其 中 F 为 流 速,t R 是 目 标 峰 的 保 留 时 间 148

Elutriation( 水 析 ): 按 斯 托 克 沉 淀 速 度 不 同 使 粒 径 大 小 不 同 的 填 料 颗 粒 分 开 的 技 术 常 用 于 分 离 需 要 窄 粒 径 范 围 的 离 子 交 换 树 脂, 如 氨 基 酸 树 脂 该 技 术 是 让 水 从 下 向 上 进 入 大 圆 管 中, 把 未 筛 分 的 颗 粒 加 入 水 流 中, 颗 粒 按 密 度 和 粒 径 不 同 沉 淀 在 自 己 的 层 面 上 然 后 取 出 特 定 层 面 高 纯 度 球 形 硅 胶 有 时 也 用 水 析 筛 分 Enantiomeric compound( 对 映 体 化 合 物 ): 具 有 手 性 活 性 的 化 合 物 ; 这 些 化 合 物 需 要 能 拆 分 R- 和 S- 对 映 体 的 分 离 机 制, 特 殊 色 谱 柱 才 能 进 行 这 种 分 离 Endcapping( 封 端 ): 用 于 去 除 在 硅 胶 与 大 分 子 硅 烷 化 试 剂 ( 如, 十 八 烷 基 三 氯 硅 烷 ) 反 应 后 残 留 的 硅 醇 基 的 技 术 在 小 分 子 硅 烷 化 试 剂 ( 如, 三 甲 基 氯 硅 烷, 或 二 氯 二 甲 基 硅 烷 ) 键 合 硅 胶 填 料 表 面 残 留 的 硅 醇 基 之 后, 可 以 认 为 该 色 谱 柱 已 封 端 最 常 用 于 反 相 填 料, 以 最 大 限 度 地 减 少 对 碱 性 可 离 子 化 离 子 型 化 合 物 的 不 必 要 吸 附 封 端 反 应 也 用 于 去 除 聚 合 物 固 定 相 的 末 端 硅 醇 基 Endfitting( 柱 端 接 头 ): 色 谱 柱 柱 端 的 接 头, 可 连 接 进 样 器 或 检 测 器 大 多 数 HPLC 柱 端 接 头 都 有 截 留 填 料 的 筛 板, 死 体 积 小, 能 最 大 限 度 地 减 小 谱 带 变 宽 通 常 用 不 锈 钢 制 成, 但 也 可 使 用 聚 醚 醚 酮 (PEEK) 和 其 它 聚 合 物 材 料 e T : 见 总 孔 隙 率 Exact mass( 精 确 质 量 数 ): 使 用 单 同 位 素 质 量 数, 通 过 分 子 式 计 算 而 得 的 质 量 数 通 过 比 较 精 确 质 量 与 精 确 质 量 数 来 确 定 元 素 组 成 Exchange capacity( 交 换 容 量 ): 见 离 子 交 换 容 量 Excluded volume( 排 阻 体 积 ): 见 间 隙 体 积 Exclusion chromatography( 排 阻 色 谱 ): 见 离 子 排 阻 色 谱 和 空 间 排 阻 色 谱 Exclusion limit( 排 阻 限 ): 超 出 分 子 量 ( 或 体 积 ) 上 限 的 分 子 将 以 相 同 保 留 体 积 被 洗 脱, 这 一 体 积 称 为 排 阻 体 积 许 多 SEC 填 料 的 排 阻 限 已 知 例 如, 多 孔 硅 胶 105 柱 将 排 阻 分 子 量 大 于 100000 的 分 子 ( 基 于 聚 苯 乙 烯 校 正 标 样 ) Exclusion volume (V 0,V ei)( 排 阻 体 积,V 0,V ei ): 一 个 分 子 在 SEC 填 料 上 的 最 小 保 留 体 积, 在 此 填 料 中 所 有 比 最 大 孔 隙 大 的 分 子 都 被 完 全 排 阻 这 些 分 子 不 能 进 入 到 孔 隙 内, 直 接 通 过 色 谱 柱 的 间 隙 ( 颗 粒 间 ) 被 洗 脱 出 来 Exponentially modified Gaussian peak( 指 数 修 正 的 高 斯 峰 ): 高 斯 峰 由 于 过 慢 通 过 检 测 器 或 体 积 过 大 将 导 致 非 对 称 峰 经 常 作 为 柱 每 秒 所 产 生 拖 尾 峰 的 模 型 Foley- Dorsey 方 程 的 基 础 也 可 参 见 Foley-Dorsey 方 程 Extracolumn effects( 柱 外 效 应 ): 除 色 谱 柱 本 身 以 外 所 有 色 谱 系 统 部 件 的 总 谱 带 展 宽 效 应 为 保 持 柱 效 必 须 将 柱 外 效 应 降 至 最 低 谱 带 展 宽 的 原 因 包 括 进 样 器 设 计 进 样 体 积 连 接 管 线 柱 端 接 头 筛 板 检 测 器 池 体 积 以 及 检 测 器 内 部 管 线 所 有 这 些 因 素 的 不 同 都 会 导 致 谱 带 展 宽 的 不 同 Extracolumn volume( 柱 外 体 积 ): 有 效 进 样 点 到 有 效 检 测 点 之 间 排 除 色 谱 柱 中 包 含 固 定 相 部 分 的 体 积 包 括 进 样 器 连 接 管 线 和 筛 板, 以 及 检 测 器 的 体 积 它 决 定 了 柱 外 效 应 F F: 参 见 流 速 F: 参 见 流 量 阻 抗 参 数 Fast LC( 快 速 LC): 使 用 填 充 了 小 粒 径 填 料 (3 或 5 µm d p ) 的 常 规 内 径 (2-6 mm) HPLC 短 柱 进 行 分 析 分 离 常 在 几 分 钟 内, 甚 至 几 秒 内 完 成 Fast protein LC (FPLC)( 快 速 蛋 白 质 LC): 特 指 蛋 白 质 分 离 的 专 用 HPLC 术 语 FPLC 中 通 常 使 用 玻 璃 柱 中 等 耐 压 和 球 形 填 料 微 粒 Flow rate (F)( 流 速,F): 流 动 相 流 经 LC 柱 的 流 量 速 率 常 规 4.6 mm 内 径 HPLC 柱 的 一 般 流 速 为 1-2 ml/min Flow resistance parameter (F)( 流 阻 参 数 F):F = d 2 p /B o, 其 中 B o 为 渗 透 率 也 可 参 见 渗 透 率 Fluoro phase( 含 氟 固 定 相 ): 脂 肪 族 和 芳 香 族 反 相 填 料 的 一 种, 其 中 键 合 相 的 重 要 成 分 是 氟 取 代 的 有 时 也 称 为 含 氟 固 定 相 或 全 氟 固 定 相 一 般 这 种 固 定 相 具 有 与 烃 类 固 定 相 不 同 的 选 择 性 Foley-Dorsey equation(foley-dorsey 方 程 ): 对 由 于 柱 外 体 积 造 成 的 峰 展 宽 所 致 拖 尾 峰 的 塔 板 数 和 保 留 时 间 的 修 正 见 参 考 3 FPLC: 见 快 速 蛋 白 质 LC 149

Fractionation range( 分 离 范 围 ): 指 SEC 中 凝 胶 或 填 料 的 操 作 范 围 在 该 范 围 内, 填 料 可 以 按 分 子 大 小 对 其 进 行 分 离 此 范 围 的 上 限, 是 不 能 扩 散 到 孔 隙 内 而 发 生 排 阻 的 过 大 分 子 此 范 围 下 限, 是 可 以 扩 散 进 入 到 所 有 孔 隙 内, 在 填 料 中 完 全 扩 散 的 小 分 子, 需 要 渗 透 体 积 才 能 被 洗 脱 ( 未 分 离 ) Frit( 筛 板 ): 在 色 谱 柱 两 端 截 留 柱 填 料 的 多 孔 配 件 每 根 柱 管 的 末 端 都 要 配 置, 更 常 见 的 是 置 于 柱 端 接 头 中 筛 板 可 以 是 不 锈 钢 或 其 它 惰 性 金 属 或 塑 料 的, 如, 多 孔 PTFE 或 聚 丙 烯 筛 板 的 孔 隙 必 须 小 于 HPLC 柱 中 的 最 小 填 料 颗 粒 ; 否 则 颗 粒 将 通 过 筛 板, 造 成 填 料 流 失 Frontal analysis( 迎 头 分 析 ): 一 种 将 样 品 连 续 加 到 色 谱 柱 上, 吸 附 最 弱 的 化 合 物 流 动 速 度 最 快, 从 而 得 到 其 最 纯 状 态 的 色 谱 技 术 在 第 一 种 洗 脱 的 化 合 物 之 后 被 洗 脱 的 是 次 弱 吸 附 的 化 合 物, 第 一 种 和 第 二 种 化 合 物 之 后 是 第 三 弱 吸 附 的 化 合 物, 依 次 类 推, 直 到 最 初 的 样 品 从 色 谱 柱 出 口 洗 脱 迎 头 分 析 很 少 使 用, 主 要 是 一 种 制 备 技 术 Frontal chromatography( 迎 头 色 谱 ): 同 迎 头 分 析 Fronting( 前 伸 峰 ): 在 色 谱 图 中 峰 前 半 部 分 ( 顶 点 之 前 ) 锥 度 超 过 后 半 部 分 的 峰 形 ; 即, 前 半 部 分 的 坡 度 小 于 后 半 部 分 该 峰 前 沿 呈 不 对 称 分 布 前 伸 峰 的 不 对 称 因 子 值 小 于 1 拖 尾 峰 则 与 之 相 反 前 伸 峰 可 能 是 由 于 等 温 线 中 的 正 曲 度 及 使 用 了 填 充 柱 较 差 造 成 的 上 样 量 过 大 引 起 的 G g: 障 碍 或 曲 度 因 子, 分 子 扩 散 项 也 可 参 见 曲 度 Gaussian curve( 高 斯 曲 线 ): 一 种 基 于 数 学 方 程 的 标 准 误 差 曲 线, 为 对 称 的 铃 铛 形 谱 带 或 峰 大 多 数 色 谱 理 论 都 认 为 色 谱 峰 是 高 斯 峰 用 峰 的 最 高 位 置 测 定 保 留 时 间, 前 述 柱 效 方 程 也 假 设 色 谱 峰 为 高 斯 峰 形 见 144 页 图 80 Gaussian peak( 高 斯 峰 ): 峰 形 遵 循 下 列 方 程 的 色 谱 峰 : C = C max exp[-(t - t R) 2 /2σ 2 ] Gel( 凝 胶 ): 凝 胶 色 谱 或 凝 胶 渗 透 色 谱 (GPC) 中 使 用 的 固 体 填 料 凝 胶 包 含 两 部 分 : 被 分 散 介 质 ( 固 体 部 分 ) 和 分 散 介 质 ( 溶 剂 ) 也 定 义 为 胶 状 分 散 的 固 体 和 液 体, 其 中 固 体 为 连 续 相 Gel filtration chromatography (GFC)( 凝 胶 过 滤 色 谱, GFC): 又 称 为 水 相 体 积 排 阻 色 谱 用 水 相 流 动 相 进 行 一 般 指 在 软 胶 ( 葡 聚 糖 ) 上 进 行 的 依 据 分 子 体 积 进 行 的 分 离, 但 也 可 以 使 用 高 度 交 联 的 聚 合 物 硅 胶 和 其 它 多 孔 介 质 大 多 数 凝 胶 过 滤 分 离 都 应 用 于 生 物 聚 合 物 和 水 溶 性 聚 合 物 如 聚 丙 烯 酸 的 分 离 Gel permeation chromatography (GPC)( 凝 胶 渗 透 色 谱, GPC): SEC 是 用 有 机 相 作 为 流 动 相, 用 于 聚 合 物 的 分 离 和 表 征 使 用 水 相 流 动 相 的 SEC 称 为 水 相 GPC GFC 或 水 相 SEC GFC: 参 见 凝 胶 过 滤 色 谱 Gigapores: 见 灌 注 色 谱 GPC: 见 凝 胶 渗 透 色 谱 Gradient( 梯 度 ): 溶 剂 强 度 随 时 间 变 化 ( 一 般 是 溶 剂 强 度 增 强 ), 逐 渐 洗 脱 保 留 较 强 的 分 析 物 的 过 程 通 常, 梯 度 可 以 是 二 元 三 元 和 四 元 混 合 溶 剂, 其 中 各 种 溶 剂 混 合 以 达 到 适 当 强 度 Gradient delay volume( 梯 度 延 迟 体 积 ): 见 驻 留 体 积 Gradient elution( 梯 度 洗 脱 ): 通 过 在 色 谱 分 离 过 程 中 逐 渐 增 加 流 动 相 强 度 而 缩 短 分 离 时 间 的 技 术 也 称 为 溶 剂 编 程 梯 度 可 以 是 连 续 的, 也 可 以 阶 梯 式 的 HPLC 常 用 二 元 三 元 和 四 元 溶 剂 梯 度 Graphitized carbon( 石 墨 化 炭 黑 ): 石 墨 化 炭 黑 是 由 非 石 墨 碳 经 石 墨 化 加 热 处 理 后 制 备 的 多 维 或 至 少 三 维 六 角 晶 型 序 列 石 墨 化 碳 ; 这 种 填 料 对 水 相 样 品 和 水 溶 性 的 有 机 提 取 物 中 的 极 性 化 合 物 具 有 强 亲 和 作 用 常 用 于 食 品 样 品 中 的 农 药 分 析 Graphitized carbon packing( 石 墨 化 炭 黑 填 料 ): 一 种 由 纯 石 墨 化 炭 黑 组 成 的 反 相 填 料 具 有 目 标 吸 附 特 性, 如, 对 邻 间 和 对 位 芳 香 化 合 物 和 顺 反 异 构 体 等 几 何 异 构 体 的 分 离 Guard column( 保 护 柱 ): 安 装 于 进 样 器 和 分 析 柱 之 间 的 小 柱 可 保 护 分 析 物 不 被 样 品 颗 粒 和 强 保 留 物 质 污 染 保 护 柱 一 般 填 充 和 分 析 柱 相 同 的 填 料, 通 常 具 有 相 同 的 内 径 但 它 更 短 更 便 宜, 一 般 在 发 生 污 染 后 丢 弃 即 可 一 体 化 的 保 护 - 分 析 柱 系 统 与 保 护 柱 和 分 析 柱 分 开 的 系 统 相 比, 连 接 管 线 所 带 来 的 柱 外 效 应 更 小 150

H h: 折 合 板 高 定 义 为 HETP/d p, 其 中 HETP 相 当 于 理 论 塔 板 数 的 塔 板 高 度,d p 是 填 料 颗 粒 直 径 也 可 参 见 折 合 板 高 H: 同 HETP 也 可 参 见 柱 效 h: 参 见 粘 度 Head pressure (Dp)( 柱 前 压,Dp): 色 谱 柱 入 口 和 出 口 的 压 力 之 差, 用 每 平 方 英 寸 磅 表 示 填 充 一 般 孔 隙 率 (0.5) 的 球 形 填 料 色 谱 柱, 其 柱 前 压 可 由 下 列 方 程 估 算 :Dp = 3000Lh/t Md 2 p, 其 中 L 是 色 谱 柱 的 柱 长 ( 以 厘 米 为 单 位 ), h 为 流 动 相 的 粘 度 ( 以 厘 泊 为 单 位 ),t M 是 色 谱 柱 的 滞 留 时 间 ( 以 分 钟 为 单 位 ),d p 为 填 料 直 径 ( 以 微 米 为 单 位 ) 压 力 可 以 用 每 平 方 英 寸 磅 巴 大 气 压 或 帕 斯 卡 表 示 Heart cutting( 中 心 切 割 ): 指 在 制 备 LC 中, 对 色 谱 峰 中 心 纯 度 最 高 的 部 分 进 行 馏 分 收 集 该 术 语 也 用 于 柱 切 换 H eff : 见 有 效 塔 板 高 度 Helium sparging( 氦 气 鼓 泡 ): 见 脱 气 氦 在 大 多 数 常 用 液 体 中 的 溶 解 度 都 非 常 低 HETP: 理 论 塔 板 数 对 应 的 高 度 来 自 于 蒸 馏 理 论 ; 柱 效 的 一 种 表 达 方 式 ;HETP = L/N, 其 中,L 为 柱 长,N 是 理 论 塔 板 数 对 于 5 µm 粒 径 填 充 良 好 的 HPLC 柱,HETP 应 为 2-3 d p,hetp( 或 H) 值 一 般 在 0.01-0.03 mm 范 围 内 也 可 参 见 柱 效 和 h High performance CE( 高 效 毛 细 管 电 泳 ): 一 种 在 小 直 径 毛 细 管 内 缓 冲 的 电 导 液 中 高 电 压 下 ( 可 高 达 30000 V) 使 用 的, 基 于 不 同 电 泳 淌 度 对 离 子 型 分 子 进 行 分 离 的 技 术 非 离 子 型 ( 中 性 ) 分 子 可 以 用 MEKC 分 离 High performance liquid chromatography (HPLC)( 高 效 液 相 色 谱 HPLC): 液 相 色 谱 技 术 的 现 代 全 仪 器 化 形 式, 采 用 小 粒 径 填 料 和 高 压 有 时 称 为 高 压 LC High pressure mixing( 高 压 混 合 ): 一 种 HPLC 系 统 的 配 置, 溶 剂 用 多 个 泵 ( 一 般 为 2 个 ) 高 压 混 合 ; 这 种 系 统 与 在 单 泵 前 用 比 例 阀 进 行 混 合 的 低 压 混 合 系 统 相 比, 梯 度 延 迟 体 积 更 低 Holdup volume (V M)( 滞 留 体 积,V M ): 柱 内 流 动 相 总 体 积, 无 论 其 在 哪 里 ;V M = V e + V i, 其 中 V e 为 间 隙 体 积, V i 为 颗 粒 内 体 积 也 称 为 色 谱 柱 空 隙 体 积 IUPAC 提 出 应 将 死 体 积 这 一 术 语 从 这 个 概 念 中 删 除 死 体 积 的 使 用 限 于 流 动 相 系 统 没 有 流 经 的 区 域 进 样 可 通 过 所 有 孔 径 的 不 保 留 物 质 对 滞 留 体 积 进 行 测 量 也 可 参 见 间 隙 孔 隙 率 和 颗 粒 内 孔 隙 率 HPLC: 见 高 效 液 相 色 谱 Hybrid silica( 杂 化 硅 胶 ): 包 含 有 机 和 无 机 两 部 分 的 硅 胶, 兼 具 聚 合 物 填 料 和 硅 胶 填 料 的 性 质 用 含 有 机 官 能 团 的 硅 烷 合 成 与 未 加 修 饰 或 未 涂 层 硅 胶 相 比, 具 有 不 同 的 选 择 性 和 更 高 的 ph 稳 定 性 Hydrodynamic volume( 流 体 力 学 体 积 ): 由 分 子 在 自 由 溶 液 中 的 有 效 半 径 决 定 的 分 子 体 积, 其 流 体 动 力 学 半 径 由 分 子 在 溶 液 中 以 其 中 心 轴 旋 转 的 半 径 决 定 SEC 中 使 用 该 术 语 定 义 分 子 形 状, 解 释 为 什 么 同 样 分 子 量 的 分 子 常 具 有 不 同 的 洗 脱 体 积 用 斯 托 克 半 径 测 定 Hydrophilic( 亲 水 的 ): 希 腊 语 亲 水 一 般 指 完 全 与 水 兼 容 的 固 定 相 和 水 溶 性 分 子 用 于 分 离 蛋 白 质 的 许 多 色 谱 柱 如 离 子 交 换 SEC 和 亲 和 柱 等 都 具 有 亲 水 性, 不 会 发 生 水 相 环 境 的 蛋 白 质 不 可 逆 吸 附 或 变 性 Hydrophilic interaction chromatography( 亲 水 相 互 作 用 色 谱 ): 反 相 HPLC (RPC) 的 一 种 替 代 技 术, 用 于 分 离 在 RPC 中 可 能 只 有 微 弱 保 留 的 强 极 性 分 析 物,HILIC 需 要 高 比 例 非 极 性 流 动 相 和 极 性 固 定 相, 与 正 相 色 谱 (NPC) 的 需 求 相 似 但 不 同 的 是,NPC 使 用 非 极 性 溶 剂 ( 如, 正 己 烷 和 二 氯 甲 烷 ), 其 流 动 相 不 含 水, 而 HILIC 的 流 动 相 中 需 要 含 一 定 量 水, 以 维 持 固 定 相 表 面 对 分 析 物 可 能 有 选 择 性 分 配 的 富 水 层 另 外, 使 用 与 水 相 溶 的 有 机 溶 剂 而 不 是 NPC 中 与 水 不 相 溶 的 溶 剂 在 HILIC 中, 使 用 的 吸 附 剂 包 括 未 修 饰 硅 胶 键 合 二 醇 和 聚 羟 乙 基 天 冬 酰 胺 极 性 分 析 物 具 有 良 好 保 留, 按 亲 水 性 逐 渐 增 大 的 顺 序 洗 脱, 与 RPLC 正 好 相 反 Hydrophobic( 疏 水 的 ): 希 腊 语 恐 水 指 与 水 不 兼 容 的 固 定 相 或 一 般 不 与 水 亲 和 的 分 子 疏 水 分 子 基 本 上 没 有 极 性 官 能 团 大 多 数 具 有 高 含 烃 量 ( 脂 肪 族 和 芳 香 族 ) 官 能 团 151

Hydrophobic interaction chromatography( 疏 水 相 互 作 用 色 谱 ): 使 用 弱 极 性 ( 非 烃 类 ) 填 料 通 过 其 疏 水 部 分 的 相 互 作 用 和 填 料 表 面 的 疏 水 位 点 对 分 子 进 行 分 离 的 技 术 流 动 相 使 用 高 浓 度 盐 溶 液, 通 过 改 变 盐 浓 度 进 行 分 离 该 技 术 类 似 于 从 溶 液 中 盐 析 分 子 梯 度 洗 脱 为 逐 渐 降 低 盐 浓 度 常 用 该 技 术 分 离 在 常 规 反 相 色 谱 的 有 机 溶 剂 中 极 易 变 性 的 蛋 白 质 疏 水 相 互 作 用 色 谱 中 一 般 很 少 使 用 或 不 使 用 有 机 溶 剂 Hydroxyapatite( 羟 磷 灰 石 ): 一 种 化 学 上 类 似 于 骨 骼 和 牙 齿 的 多 孔 羟 基 磷 酸 钙 类 固 体 是 分 离 核 酸 成 分 单 克 隆 抗 体 和 蛋 白 质 等 的 生 物 色 谱 的 填 料 Hyphenated techniques( 联 用 技 术 ): 指 以 其 首 字 母 缩 写 而 闻 名 的 一 系 列 技 术, 包 括 LC- 质 谱 (MS) LC- 傅 里 叶 变 换 IR 光 谱 (FTIR) 和 LC-MS-MS 也 可 参 见 多 维 色 谱 I IC: 参 见 离 子 色 谱 Immobilized metal-affinity chromatography( 固 定 金 属 亲 和 色 谱 ): 参 见 金 属 亲 和 色 谱 Immunoaffinity chromatography( 免 疫 亲 和 色 谱 ): 一 种 将 抗 体 键 合 或 固 定 在 HPLC 支 持 材 料 表 面 的 特 殊 分 离 形 式 根 据 分 子 识 别 机 制, 被 抗 体 作 为 特 异 性 靶 标 的 分 析 物, 通 过 抗 原 - 抗 体 相 互 作 用 被 选 择 性 地 保 留, 而 从 复 杂 混 合 物 中 分 离 出 来 洗 脱 干 扰 物 之 后, 改 变 流 动 相 条 件, 将 强 结 合 的 分 析 物 释 放 出 来 Imprinted phases( 印 迹 固 定 相 ): 依 据 模 板 或 印 迹 分 子 产 生 的 聚 合 物 和 硅 胶 固 定 相 这 种 固 定 相 能 够 提 高 对 模 板 分 子 的 选 择 性 Included volume( 渗 入 体 积 ): 也 称 为 全 渗 入 体 积 小 分 子 完 全 进 入 到 色 谱 柱 的 全 部 孔 隙 空 间 的 洗 脱 体 积 也 可 参 见 体 积 排 阻 色 谱 Indirect detection( 间 接 检 测 ): 用 于 检 测 没 有 紫 外 吸 收 或 无 荧 光 的 分 析 物 将 具 有 UV 吸 收 的 化 合 物 或 荧 光 化 合 物 加 入 流 动 相 中, 保 持 高 背 景 信 号 ; 当 无 吸 收 或 无 荧 光 的 分 析 物 洗 脱 时, 背 景 被 稀 释, 这 样 就 检 测 到 了 分 析 物 的 负 峰 当 分 析 物 表 现 为 增 加 指 示 物 浓 度 时, 将 产 生 一 个 正 峰 检 测 到 负 信 号 时, 检 测 器 信 号 反 向 传 送 到 输 出 设 备 Infinite diameter column effect( 无 限 直 径 柱 效 应 ): 一 定 柱 长 下, 进 样 到 填 充 柱 床 中 心 的 样 品, 按 半 径 方 向 扩 散 展 开, 但 不 能 触 及 柱 管 壁, 管 壁 效 应 可 能 导 致 谱 带 变 宽 John Knox 观 察 到 一 个 现 象, 从 色 谱 柱 中 心 收 集 的 样 品 峰 比 靠 近 管 壁 处 收 到 的 样 品 峰, 柱 效 更 高 无 限 直 径 效 应 取 决 于 柱 长 内 径 粒 径 和 流 动 相 性 质 在 HPLC 中 很 少 应 用 Injection solvent( 进 样 溶 剂 ): 将 样 品 进 样 到 色 谱 柱 所 用 的 溶 剂 ; 溶 剂 应 与 流 动 相 强 度 相 当 或 略 低, 可 防 止 使 用 较 强 溶 剂 时 发 生 的 延 色 谱 柱 过 早 的 运 动 Inlet( 入 口 ): 溶 剂 和 样 品 进 入 色 谱 柱 的 起 始 部 位 入 口 筛 板 通 常 可 以 截 留 填 料, 某 种 情 况 下, 对 填 充 柱 床 起 到 保 护 作 用 Inlet/outlet check valves( 入 口 / 出 口 单 向 阀 ):LC 泵 上 的 单 向 阀 使 流 动 相 沿 一 个 方 向 而 不 是 相 反 方 向 流 动 入 口 单 向 阀 使 流 动 相 从 溶 剂 瓶 流 入 泵, 出 口 单 向 阀 使 流 动 相 从 泵 流 入 色 谱 柱 Inlet filter( 入 口 过 滤 器 ): 连 接 到 泵 的 入 口 管 路 上 的 过 滤 装 置, 在 溶 剂 达 到 泵 之 前 去 除 流 动 相 中 的 颗 粒 物 ; 溶 剂 瓶 过 滤 头 是 置 于 溶 剂 瓶 中 的 一 种 入 口 过 滤 器 Inline filter( 在 线 过 滤 器 ): 一 种 防 止 颗 粒 物 损 坏 色 谱 柱 的 装 置 现 代 低 体 积 在 线 过 滤 器 可 以 置 于 进 样 器 和 色 谱 柱 之 间, 对 谱 带 变 宽 没 有 大 的 影 响 在 这 个 位 置 上 的 过 滤 器 可 以 防 止 样 品 颗 粒 进 入 柱 床 或 柱 入 口 筛 板 Interparticle porosity (e e)( 颗 粒 间 孔 隙 率,e e ): 每 单 位 柱 体 积 的 填 充 柱 颗 粒 间 体 积 ;e e = V e/v c, 其 中 V e 为 间 隙 体 积,V c 为 总 体 积 也 可 参 见 间 隙 孔 隙 率 Interparticle volume (V o)( 颗 粒 间 体 积,V o ): 在 填 料 颗 粒 之 外 的 流 动 相 体 积 Interstitial porosity (e e)( 间 隙 孔 隙 率,e e ): 柱 填 料 颗 粒 间 ( 间 隙 ) 的 体 积 比 率 ;e e = V e/v c Interstitial velocity (u e)( 间 隙 流 速,u e ): 洗 脱 液 流 经 色 谱 柱 从 填 料 颗 粒 周 围 流 过 的 实 际 速 度 ;u e = F/A c e e 间 隙 流 速 是 计 算 折 合 流 速 的 基 础 152

Interstitial volume (V e)( 间 隙 体 积 ): 填 料 颗 粒 之 间 的 体 积 不 包 括 颗 粒 孔 隙 内 的 体 积 也 称 为 排 阻 体 积 ( 见 SEC) 和 颗 粒 间 体 积 通 过 进 样 不 进 入 任 何 孔 隙 不 与 填 料 表 面 发 生 相 互 所 用 的 分 子 测 得 在 SEC 中, 该 体 积 用 V o 表 示 Intraparticle porosity (e i)( 颗 粒 内 孔 隙 率,e i ): 填 料 颗 粒 孔 内 的 体 积 比 率 :e i = V pore/v particle Intraparticle volume (V i)( 颗 粒 内 体 积,V i ): 填 料 颗 粒 孔 内 体 积 也 称 内 体 积 和 渗 入 体 积 可 以 用 BET 法 或 汞 压 入 孔 隙 率 法 测 定 Ion chromatography (IC)( 离 子 色 谱,IC): 一 种 离 子 交 换 技 术, 用 低 离 子 交 换 容 量 的 离 子 交 换 剂 和 稀 缓 冲 液, 测 定 低 浓 度 有 机 和 无 机 阴 阳 离 子 常 用 电 导 检 测 器 IC 有 两 种 操 作 形 式 : 抑 制 型 IC, 用 第 二 根 色 谱 柱 或 膜 分 离 器 去 除 分 析 物 中 的 缓 冲 液 反 离 子, 同 时 用 氢 离 子 或 氢 氧 根 离 子 置 换, 将 缓 冲 液 转 换 成 不 带 电 荷 的 物 质, 起 到 抑 制 背 景 提 高 灵 敏 度 的 作 用 在 非 抑 制 型 IC 中, 选 择 低 浓 度 弱 电 导 的 缓 冲 液, 所 有 洗 脱 物 都 流 经 检 测 器, 离 子 在 背 景 信 号 之 上 被 检 测 Ion exchange capacity( 离 子 交 换 容 量 ): 填 料 上 能 够 参 与 离 子 交 换 过 程 的 离 子 型 位 点 数 离 子 交 换 容 量 用 每 克 毫 当 量 (mequiv) 表 示 典 型 的 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 强 阴 离 子 交 换 树 脂 的 容 量 为 3-5 mequiv/g IC 所 用 的 交 换 剂 容 量 非 常 低 弱 阴 离 子 和 弱 阳 离 子 交 换 剂 的 容 量 随 ph 改 变 而 发 生 显 著 变 化 Ion exchange chromatography( 离 子 交 换 色 谱 ): 在 填 料 的 阳 离 子 或 阴 离 子 位 点 上 分 离 离 子 型 物 质 的 一 种 色 谱 模 式 样 品 离 子, 通 常 带 反 离 子, 与 填 料 上 已 存 在 的 离 子 基 团 发 生 交 换 保 留 大 小 基 于 不 同 离 子 对 该 位 点 的 亲 和 性, 以 及 其 它 溶 液 参 数, 如,pH 离 子 强 度 和 反 离 子 类 型 等 离 子 色 谱 基 本 上 是 一 种 离 子 交 换 技 术 Ion exclusion( 离 子 排 斥 ): 用 离 子 交 换 树 脂 使 离 子 化 溶 质 与 非 离 子 化 或 部 分 离 子 化 溶 质 分 离 的 过 程 唐 南 电 位 使 分 离 得 以 进 行, 即, 离 子 型 溶 质 在 溶 液 中 的 浓 度 比 在 固 定 相 中 的 更 高, 而 非 离 子 型 溶 质 则 均 匀 分 布 在 流 动 相 和 树 脂 之 间 因 此 离 子 型 溶 质 比 非 离 子 型 溶 质 的 通 过 色 谱 柱 的 速 度 更 快 当 用 反 相 色 谱 在 使 硅 醇 基 离 子 化 的 ph 条 件 下 分 离 阴 离 子 时, 也 存 在 离 子 排 斥 现 象 Ionic strength( 离 子 强 度 ): 离 子 强 度 是 电 解 质 溶 液 的 特 性 通 常 表 示 为 电 解 质 离 子 之 间 的 平 均 静 电 相 互 作 用 其 与 电 解 质 浓 度 有 关, 但 离 子 强 度 与 电 解 质 浓 度 的 主 要 区 别 在 于, 如 果 某 些 离 子 带 更 高 的 电 荷, 前 者 将 更 高 流 动 相 的 离 子 强 度 越 高, 其 对 于 离 子 分 析 物 或 吸 附 位 点 的 竞 争 力 就 越 强 Ion-moderated partitioning chromatography( 离 子 调 节 分 配 色 谱 ): 一 种 用 强 阳 离 子 交 换 填 料 ( 特 殊 的 阳 离 子 形 态, 如, 钙 氢 银 ) 分 离 碳 水 化 合 物 的 技 术, 其 分 离 机 制 是 络 合 而 不 是 离 子 交 换 Ion-pair chromatography( 离 子 对 色 谱 ): 一 种 色 谱 形 式, 溶 液 中 的 离 子 可 以 成 对 或 被 中 性 化, 以 离 子 对 的 形 式 在 反 相 柱 上 得 到 分 离 离 子 对 试 剂 一 般 为 含 烷 烃 链 的 离 子 型 化 合 物, 具 有 一 定 疏 水 型, 因 而 形 成 的 离 子 对 可 以 在 反 相 柱 上 保 留 保 留 与 烷 烃 链 的 长 度 和 离 子 对 添 加 剂 的 浓 度 成 正 比 正 相 色 谱 中 也 有 离 子 对, 离 子 对 的 一 部 分 是 动 态 添 加 的 吸 附 剂, 不 过 这 项 技 术 的 应 用 不 如 反 相 色 谱 中 普 遍 也 称 为 离 子 相 互 作 用 色 谱 或 动 态 离 子 交 换 色 谱, 要 强 调 的 是, 用 户 有 时 也 不 清 楚 添 加 剂 是 如 何 控 制 保 留 的 确 切 机 制 细 节 Ion retardation( 离 子 阻 滞 ): 指 使 用 两 性 离 子 交 换 树 脂, 阻 滞 离 子 型 分 子, 并 让 非 离 子 型 分 子 或 非 电 解 质 先 洗 脱 Ion suppression( 离 子 抑 制 ): 水 相 流 动 相 可 以 在 特 定 ph 下 发 生 缓 冲 作 用, 抑 制 溶 质 的 离 子 化 例 如, 弱 羧 酸 的 离 子 抑 制 是 将 ph 调 节 到 其 pk a 值 以 下 在 反 相 色 谱 中 用 于 改 善 弱 酸 和 弱 碱 的 峰 形 Irregular packing( 不 规 则 填 料 ): 指 填 料 的 形 状 不 规 则 填 料 有 各 种 粒 径 将 碾 碎 的 固 体 填 料 用 分 离 机 械 按 粒 径 筛 分 成 窄 范 围 填 料 颗 粒 在 分 析 型 HPLC 中 球 形 填 料 比 不 规 则 填 料 更 常 用, 但 在 制 备 型 LC 中 价 格 便 宜 的 不 规 则 填 料 仍 有 广 泛 用 途 Irreversible adsorption( 不 可 逆 吸 附 ): 将 把 与 吸 附 剂 有 极 强 亲 和 力 的 化 合 物 进 样 到 色 谱 柱 上 时, 将 产 生 强 烈 吸 附, 不 能 从 柱 上 洗 脱 样 品 与 吸 附 剂 表 面 之 间 发 生 化 学 反 应, 就 是 不 可 逆 吸 附 的 一 个 例 子 也 可 参 见 化 学 吸 附 Isocratic( 等 梯 度 ): 在 LC 中 洗 脱 剂 组 成 不 随 时 间 而 变 153

Isotherm( 等 温 线 ): 见 吸 附 等 温 线 Isothermal chromatography( 等 温 色 谱 ): 采 用 恒 温 条 件 绝 大 多 数 LC 都 是 在 等 温 条 件 下 进 行 的 K k: 见 保 留 因 子 k': 旧 术 语 已 被 IUPAC 批 准 的 术 语 保 留 因 子 (k) 取 代 K: 见 分 配 系 数 k A/B : 见 选 择 性 系 数 Kc: 见 分 布 常 数 ( 系 数 ) Kieselguhr( 硅 藻 土 ): 柱 色 谱 中 使 用 的 硅 藻 类 土, 也 可 作 为 样 品 净 化 介 质 只 有 弱 吸 附 性, 可 以 用 作 液 - 液 色 谱 的 支 持 剂 HPLC 中 很 少 使 用 Kinetic Plot( 动 力 学 曲 线 ): 动 力 学 曲 线 是 表 征 柱 效 实 际 极 限 的 方 法, 根 据 压 力 降 限 制 的 塔 板 数 (N ) 对 理 论 塔 板 (H) 和 分 离 阻 抗 (E ) 作 图 动 力 学 曲 线 保 留 了 van Deemter 曲 线 显 示 的 信 息, 但 还 包 含 了 柱 床 渗 透 性 的 信 息 参 见 Poppe 曲 线 Knox equation(knox 方 程 ):John Knox 对 van Deemter 方 程 的 改 良, 其 中 A 项 为 涡 流 扩 散 乘 以 u1/3, 其 中 u 为 间 隙 洗 脱 液 流 速 一 般 用 无 因 次 或 折 合 塔 板 高 度 (h ) 及 折 合 流 速 (v ) 等 表 示,h = Av 1/3 + B/v + Cv 也 可 参 见 van Deemter 方 程 L L: 见 柱 长 Laminar flow( 层 流 ): 液 体 在 粘 滞 力 比 惯 性 更 强 的 条 件 下 移 动 时, 产 生 的 不 随 时 间 变 化 的 平 坦 液 流 层 流 用 低 雷 诺 数 ( 见 雷 诺 数 ) 表 征 在 一 个 圆 筒 状 管 路 中, 中 心 的 液 流 比 管 壁 的 液 流 流 动 更 快, 呈 现 以 中 心 流 速 为 顶 点 的 抛 物 线 形 分 布 在 柱 床 中 的 这 种 间 隙 轴 向 流 速 不 均 衡 性, 也 是 导 致 填 充 柱 内 峰 变 宽 的 原 因 Langmuir isotherm(langmuir 等 温 式 ): 等 温 式 的 一 种 特 殊 形 式 :C S = N0C M/(K d + C M), 其 中 C S 和 C M 是 溶 质 在 固 定 相 和 流 动 相 的 平 衡 浓 度,N 0 是 可 用 的 表 面 吸 附 位 点 数,K d 是 吸 附 结 合 常 数 LC: 见 液 相 色 谱 Ligand( 配 位 体 ): 在 配 位 交 换 色 谱 中, 指 固 定 相 进 行 配 位 交 换 的 分 析 物 在 亲 和 色 谱 中, 指 与 支 持 剂 偶 联 构 成 亲 和 柱 的 生 物 特 异 性 物 质 酶 抗 原, 或 激 素 等 在 键 合 相 色 谱 中, 指 与 表 面 共 价 结 合 的 部 分 Ligand exchange chromatography( 配 位 交 换 色 谱 ): 螯 合 配 位 体 添 加 到 流 动 相 中, 被 填 料 吸 附 的 一 种 技 术 这 些 被 吸 附 的 分 子 充 当 了 特 定 溶 质 的 螯 合 剂 例 如, 可 以 将 铜 盐 加 入 流 动 相 中, 与 氨 基 酸 螯 合 并 使 其 分 离 螯 合 树 脂 具 有 类 似 的 功 能 : 螯 合 基 团 与 聚 苯 乙 烯 骨 架 化 学 键 合 Limit of detection (LOD)( 检 测 限 (LOD)): 在 本 底 噪 音 水 平 以 上 能 够 检 测 到 的 化 合 物 的 最 少 量 Linear elution adsorption chromatography( 线 性 洗 脱 吸 附 色 谱 ): 指 在 吸 附 等 温 线 的 线 性 部 分 所 进 行 的 吸 附 色 谱 由 Lloyd Snyder 创 造 的 术 语 Linear velocity (u)( 线 性 流 速,u): 流 动 相 流 经 色 谱 柱 时 的 流 速 用 厘 米 / 秒 表 示 与 色 谱 柱 横 截 面 积 的 流 速 有 关 用 柱 长 除 以 不 保 留 化 合 物 的 保 留 时 间 测 得 也 可 参 见 空 隙 时 间 Linearity( 线 性 ): 线 性 动 态 范 围 : 离 子 信 号 与 分 析 物 浓 度 呈 线 性 关 系 的 浓 度 范 围 Liquid chromatography (LC)( 液 相 色 谱,LC): 一 种 流 动 相 为 液 体 的 分 离 技 术 多 数 在 色 谱 柱 内 进 行 Liquid-liquid chromatography( 液 - 液 色 谱 ): 一 种 最 早 的 HPLC 分 离 模 式, 在 二 十 世 纪 七 十 年 代 初 期 化 学 键 合 相 出 现 后 即 已 不 再 使 用 同 分 配 色 谱 Liquid-solid chromatography( 液 - 固 色 谱 ): 同 吸 附 色 谱 Loadability( 负 载 能 力 ): 可 以 加 载 到 色 谱 柱 上 的 分 析 物 最 大 量, 如 果 超 过 这 个 量 就 不 能 够 达 到 分 离 所 需 纯 度 和 回 收 率 的 要 求 ; 在 制 备 色 谱 中 非 常 重 要 154

Loading (phase loading versus sample loading)( 荷 载 量, 固 定 相 荷 载 量 与 样 品 荷 载 量 ): 涂 层 或 键 合 在 固 体 支 持 剂 上 的 固 定 相 量 在 液 - 液 色 谱 中, 液 体 固 定 相 的 量 以 毫 克 / 克 填 料 计 在 键 合 相 色 谱 中, 荷 载 量 可 以 用 毫 摩 尔 / 平 方 米, 或 碳 百 分 含 量 (w/w) 表 示 也 称 为 覆 盖 率 或 表 面 覆 盖 率 还 有 另 一 种 不 相 关 的 概 念, 即, 进 样 到 分 析 柱 或 制 备 柱 上 的 样 品 质 量 制 备 柱 经 常 在 过 载 条 件 下 操 作, 以 得 到 更 高 通 量 log k w :log k 对 反 相 LC 中 有 机 改 性 剂 体 积 作 图 的 外 推 截 距 也 可 参 见 S Longitudinal diffusion( 纵 向 扩 散 ): 同 分 子 扩 散 项 van Deemter 方 程 中 的 B 项 也 可 参 见 van Deemter 方 程 Low pressure mixing( 低 压 混 合 ): 参 见 高 压 混 合 M µ: 见 电 泳 淌 度 Macroporous resin (macroreticular)( 大 孔 树 脂 ( 大 网 络 树 脂 )): 具 有 分 子 级 微 孔 或 几 百 埃 大 孔 的 交 联 离 子 交 换 树 脂 这 种 大 孔 树 脂 内 表 面 积 较 大 可 让 大 分 子 进 入 Mass accuracy( 质 量 准 确 度 ): 衡 量 分 析 物 的 测 定 质 量 与 其 精 确 质 量 数 的 接 近 程 度 的 指 标, 通 常 用 ppm 表 示 Mass defect( 质 量 亏 损 ): 标 称 质 量 与 精 确 质 量 数 之 差 Mass error( 质 量 误 差 ): 计 算 式 :( 精 确 质 量 数 ) ( 精 确 质 量 ) Mass resolution( 质 量 分 辨 率 ): 确 保 样 品 范 围 内 的 质 量 准 确 度 以 ( 离 子 质 量 )/( 质 谱 峰 宽 ) 衡 量,R = (m/z)/w 1/2 还 可 表 示 为 质 量 分 辨 率 = ( 离 子 质 量 )/( 质 谱 峰 分 离 度 ),R = (m/z)/dm 解 决 特 定 分 析 问 题 所 需 的 分 辨 率 取 决 于 样 品 和 基 质 Mass spectrum( 质 谱 ): 质 谱 仪 采 集 的 数 据, 代 表 离 子 的 分 布 情 况, 以 离 子 信 号 对 质 荷 比 (m/z) 作 图 而 得 Mass transfer (interphase)( 传 质 ( 相 间 )): 溶 质 在 流 动 相 和 固 定 相 之 间 运 动 的 过 程 van Deemter 方 程 的 C 项, 称 为 相 间 传 质 项 传 质 过 程 越 快, 柱 效 越 高 在 HPLC 中, 传 质 速 率 慢 是 影 响 柱 效 的 最 重 要 因 素 可 以 通 过 使 用 小 粒 径 填 料 薄 固 定 相 层 低 粘 度 流 动 相 和 高 温, 提 高 传 质 速 率 Mean pore diameter( 平 均 孔 径 ): 多 孔 填 料 的 平 均 孔 径 最 常 用 BET 法 测 定, 假 设 为 均 匀 的 圆 柱 状 孔, 可 用 4 倍 孔 隙 面 积 除 以 表 面 积 (4V/A) 计 算 得 到 孔 径 的 重 要 之 处 在 于, 溶 质 分 子 必 须 能 在 孔 内 外 自 由 扩 散, 才 能 与 固 定 相 表 面 发 生 相 互 作 用 另 外, 孔 之 间 必 须 贯 通 良 好, 具 有 最 少 的 闭 塞 点, 从 而 允 许 分 子 可 以 通 过 通 道 进 入 到 孔 内 的 任 何 部 分 在 SEC 中, 填 料 有 不 同 的 孔 径, 因 此 可 以 分 离 不 同 体 积 的 分 子 典 型 的 物 质, 如 硅 胶, 最 常 见 的 孔 径 是 60- 和 100Å 孔 径 大 于 300Å 可 用 于 生 物 分 子 的 分 离 孔 隙 一 般 分 为 微 孔 (< 20Å) 中 等 孔 (20-500Å) 和 大 孔 (> 500 Å) 三 个 级 别 MECC: 参 见 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱 Megapores: 参 见 灌 注 色 谱 MEKC: 参 见 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱 Metal-affinity chromatography( 金 属 亲 和 色 谱 ): 一 种 特 殊 的 配 位 交 换 色 谱, 用 特 定 金 属 离 子 ( 一 般 为 铜 (II) 锌 (II) 和 铁 (II)) 的 特 殊 亲 和 性 分 离 生 物 聚 合 物 Metalophile ( 嗜 金 属 ): 一 种 对 硅 胶 表 面 活 性 酸 性 硅 醇 基 有 高 亲 和 性 的 化 合 物 通 常 为 强 碱 性 胺 或 多 功 能 基 羧 酸 酯 或 酚 Method development( 方 法 开 发 ): 对 包 括 样 品 预 处 理 在 内 的 分 离 过 程 进 行 优 化, 以 得 到 可 重 现 的 耐 用 的 分 离 方 法 一 般 来 说, 重 点 是 筛 选 固 定 相 洗 脱 液 和 色 谱 柱 温 的 组 合, 提 供 足 够 的 ( 如 果 不 是 最 优 化 的 ) 分 离 Method validation( 方 法 认 证 ): 对 方 法 进 行 测 试, 检 查 其 保 留 时 间 分 离 度 以 及 对 目 标 组 分 的 定 量 是 否 能 符 合 需 求 的 准 确 度 和 精 密 度 的 过 程 Micellar chromatography( 胶 束 色 谱 ): 向 流 动 相 中 加 入 胶 束 进 行 分 离 胶 束 可 以 作 为 置 换 剂 或 分 配 剂, 为 改 变 选 择 性 提 供 另 一 个 参 数 胶 束 色 谱 和 MEKC 中 使 用 的 表 面 活 性 剂 浓 度 大 于 其 临 界 胶 束 浓 度 Micro-LC( 微 量 LC): 泛 指 分 离 所 用 色 谱 柱 内 径 比 常 规 柱 窄 的 技 术 在 色 谱 柱 内 径 小 于 0.5 mm 的 HPLC 中 常 用 微 量 LC 这 一 术 语 ; 在 样 品 量 有 限 的 高 灵 敏 度 分 析 中, 以 及 当 使 用 某 种 LC-MS 电 离 技 术, 需 要 进 入 离 子 源 的 溶 剂 体 积 必 须 尽 可 能 小 的 时 候, 也 使 用 微 量 LC 155

Microbore( 微 径 ): 指 在 HPLC 中 使 用 的, 比 常 用 内 径 更 小 的 色 谱 柱 一 般 认 为 2 mm 及 以 下 的 色 谱 柱 为 微 径 柱 0.5 mm 及 更 小 的 内 径 称 为 微 量 LC 柱 Microchip devices( 微 芯 片 装 置 ): 基 于 硅 玻 璃 和 其 它 类 型 的 微 加 工 芯 片, 通 过 这 一 装 置 可 以 将 实 验 微 缩 到 单 通 道 或 多 通 道 微 液 流 环 路 中 进 行 这 种 装 置 可 用 于 CE 和 CEC 成 本 较 低 并 且 是 一 次 性 的 目 前 进 行 分 离 的 微 型 装 置 还 处 于 初 级 阶 段, 今 后 其 应 用 还 将 进 一 步 扩 展 Microparticulate( 微 粒 ):HPLC 中 使 用 的 小 颗 粒 填 料 一 般 来 说, 粒 度 小 于 10 mm 的 全 多 孔 填 料 即 为 微 粒 Microporous resin( 微 孔 树 脂 ): 同 微 网 状 树 脂 Microreticular resin( 微 网 状 树 脂 ): 具 有 与 分 子 大 小 相 符 合 的, 交 联 合 成 的 开 口 孔 隙, 离 子 交 换 树 脂 在 窄 孔 内 的 扩 散 可 能 受 影 响, 存 在 离 子 交 换 率 低 和 柱 效 差 的 问 题, 尤 其 对 于 大 分 子 而 言 Migration rate( 迁 移 速 率 ): 见 电 泳 淌 度 Migration time (tm)( 迁 移 时 间,t m ): 在 毛 细 管 电 泳 中, 带 电 荷 分 子 从 进 样 点 移 动 到 检 测 点 所 用 的 时 间 与 滞 留 时 间 不 同 (t M ) Minimum plate height( 最 小 塔 板 高 度 ):van Deemter 曲 线 以 H 对 v 作 图 得 到 的 最 低 值 该 值 代 表 从 特 定 色 谱 柱 和 流 动 相 系 统 得 到 的 最 大 理 论 塔 板 数 一 般 出 现 在 极 低 流 速 下 也 称 为 最 佳 塔 板 高 度 通 常 为 良 好 填 充 色 谱 柱 粒 径 的 2-3 倍 Mixed-bed column( 混 合 床 色 谱 柱 ): 同 一 根 柱 子 上 填 充 了 两 种 或 更 多 固 定 相, 常 用 于 IEC( 阴 离 子 和 阳 离 子 混 合 树 脂 ) 和 SEC( 不 同 孔 径 填 料 的 混 合 物 ) 中 在 IEC 中 其 优 势 是 既 去 除 了 阳 离 子 化 合 物, 也 去 除 了 阴 离 子 化 合 物 在 SEC 使 用 是 因 为 可 以 在 同 一 根 色 谱 柱 上 得 到 更 宽 的 分 子 量 范 围 Mixed-mode separation( 混 合 模 式 分 离 ): 在 一 根 色 谱 柱 上 得 到 的, 由 双 重 保 留 机 制 进 行 的 具 有 不 同 保 留 和 选 择 性 的 分 离 例 如, 在 中 到 高 ph 下, 带 硅 醇 基 的 反 相 柱, 可 以 利 用 离 子 化 硅 醇 基 的 疏 水 相 互 作 用 和 离 子 相 互 作 用 进 行 分 离 有 时, 混 合 模 式 分 离 对 提 高 选 择 性 ( 谱 带 间 隔 ) 很 有 帮 助, 但 可 能 会 造 成 不 对 称 峰, 如 果 需 要 在 后 续 批 次 的 填 料 中 精 确 控 制 这 些 相 互 作 用 的 平 衡 将 会 比 较 困 难 Mobile phase( 流 动 相 ): 推 动 溶 质 流 经 色 谱 柱 的 溶 剂 在 LC 中, 流 动 相 与 溶 质 和 固 定 相 同 时 发 生 相 互 作 用, 因 而 对 分 离 有 重 大 影 响 Mobile phase strength( 流 动 相 强 度 ): 参 见 溶 剂 强 度 Mobile phase velocity (u M)( 流 动 相 流 速,u M ): 流 动 相 流 经 填 料 柱 床 的 速 度 ;u M = L/t M, 其 中 L 为 柱 长,t M 是 滞 留 时 间, 也 可 参 见 调 整 保 留 体 积 滞 留 体 积 和 死 体 积 Mobility( 淌 度 ): 参 见 电 泳 淌 度 Modifier( 改 性 剂 ): 改 变 流 动 相 性 质 的 添 加 剂 例 如, 甲 醇 是 反 相 中 的 强 溶 剂, 有 时 称 为 改 性 剂 ( 水 是 弱 溶 剂 ); 有 时 其 它 添 加 剂 竞 争 性 碱, 如, 三 乙 胺, 或 离 子 对 试 剂 也 称 为 改 性 剂, 但 称 其 为 添 加 剂 才 更 贴 切 也 可 参 见 添 加 剂 Molecular diffusion term (B term)( 分 子 扩 散 项,B 项 ): 指 van Deemter 方 程 中 的 B 项 ( 第 二 项 ) 也 称 纵 向 扩 散 项 或 轴 向 扩 散 项 它 只 在 流 速 非 常 低 ( 在 最 小 塔 板 高 度 以 下 ) 时 起 主 要 作 用, 此 时 各 溶 质 可 能 在 色 谱 柱 上 存 在 纵 向 ( 纵 深 ) 扩 散 对 B 项 的 影 响 来 自 流 动 相 中 的 扩 散, 为 2gD M, 其 中 g 为 障 碍 因 子 ( 一 般 为 0.6-0.8),D M 是 扩 散 系 数 也 可 参 见 van Deemter 方 程 Molecular weight distribution( 分 子 量 分 布 ): 聚 合 物 样 品 分 子 的 分 子 量 分 布 分 布 可 以 定 义 为 重 量 平 均 值 和 数 量 平 均 值 分 子 印 迹 相 : 参 见 印 迹 固 定 相 Monodisperse particles( 单 分 散 填 料 颗 粒 ): 粒 径 分 布 窄 的 填 料 颗 粒 也 可 参 见 多 分 散 颗 粒 Monomeric phase( 单 体 固 定 相 ): 指 单 个 分 子 键 合 到 支 持 剂 上 的 键 合 相 对 于 硅 胶 来 说, 单 体 固 定 相 是 由 一 氯 烷 烃 芳 烃 或 烷 氧 基 硅 烷 制 备 而 成 的 聚 合 物 固 定 相 通 常 用 二 或 三 氯 硅 烷 或 烷 氧 基 硅 烷 反 应 物, 在 水 存 在 下 制 备 而 成 的 Moving zone( 移 动 区 带 ): 与 流 动 相 不 同, 移 动 区 带 指 色 谱 柱 中 间 隙 部 分 的 流 动 相 部 分 也 可 参 见 固 定 相 156

Multidimensional chromatography( 多 维 色 谱 ): 使 用 两 根 或 更 多 色 谱 柱 或 使 用 不 同 的 色 谱 技 术, 以 获 得 更 好 的 分 离 用 于 样 品 净 化 提 高 分 离 度 提 高 通 量 和 增 加 峰 容 量 也 可 以 在 馏 分 收 集, 重 新 进 样 到 第 二 根 色 谱 柱 上 离 线 使 用, 或 者 通 过 切 换 阀 在 线 使 用 也 称 为 双 柱 色 谱 柱 切 换 多 柱 色 谱 和 boxcar 色 谱 N n: 见 峰 容 量 N: 理 论 塔 板 数 ;N = 16(t R/w b) 2, 其 中 t R 为 保 留 时 间, w b 是 峰 底 宽 是 说 明 色 谱 柱 柱 效 的 参 数 有 时 按 下 式 计 算,N = 5.54(t R/w h) 2, 其 中 w h ( 或 w 1 2) 为 半 峰 高 处 的 峰 宽 也 可 参 见 柱 效 和 理 论 塔 板 n: 见 折 合 流 速 NanoLC( 纳 升 LC): 采 用 内 径 小 于 100 µm 的 色 谱 柱 进 行 的 液 相 色 谱 分 离 ; 一 般 需 要 特 殊 仪 器 ; 常 用 于 样 品 有 限, 需 要 高 灵 敏 度 的 蛋 白 质 组 学 研 究 Narrow-bore column( 窄 径 柱 ):HPLC 中 使 用 的 内 径 小 于 2 mm 的 色 谱 柱 也 称 微 径 N eff : 参 见 有 效 理 论 塔 板 Noise( 噪 声 ): 参 见 基 线 噪 声 Non-aqueous reversed phase chromatography( 非 水 相 反 相 色 谱 ): 指 在 反 相 填 料 上 进 行 的 不 用 水 作 为 洗 脱 液 成 分 的 反 相 色 谱 在 化 合 物 非 极 性 很 强, 用 100% 的 甲 醇 或 乙 腈 不 能 或 很 难 将 其 洗 脱 下 来 时 使 用 该 方 法 在 这 种 情 况 下, 溶 剂 A 应 为 乙 腈, 溶 剂 B 为 更 强 的 溶 剂, 如, 四 氢 呋 喃 反 相 规 律 适 用 于 非 水 相 反 相 色 谱, 即, 分 析 物 非 极 性 越 强, 其 保 留 就 越 强 Non-Polar( 非 极 性 ): 非 极 性 分 子 是 电 子 分 布 更 为 对 称, 相 反 方 向 没 有 大 量 电 荷 的 分 子 所 有 电 荷 都 互 相 抵 消 非 极 性 化 合 物 溶 剂 或 固 定 相 易 溶 于 有 机 溶 剂, 如 正 己 烷, 而 不 易 溶 于 水 Nonporous packing( 非 多 孔 填 料 ): 填 料 颗 粒 类 似 于 多 孔 层 实 心, 但 粒 径 处 于 亚 5 µm 范 围 ; 粒 径 经 常 在 亚 2 µm d p 范 围 用 于 短 柱 的 高 速 分 离 常 用 的 色 谱 柱 缩 写 :NPS, 指 非 多 孔 硅 胶 ;NPR, 指 非 多 孔 树 脂 ;NPZ, 指 非 多 孔 氧 化 锆 Nonporous particle( 非 多 孔 颗 粒 ): 指 作 为 多 孔 涂 层 或 键 合 相 支 持 剂 的 固 体 颗 粒 ; 薄 壳 型 填 料 颗 粒 是 大 粒 径 非 多 孔 填 料 颗 粒 (~40 µm) 粒 径 小 于 3 µm 的 非 多 孔 硅 胶 和 树 脂 一 般 是 指 带 薄 多 孔 涂 层 的 硅 胶 键 合 硅 胶 或 聚 合 物 固 定 相 微 球 Normal phase chromatography( 正 相 色 谱 ): 一 种 固 定 相 极 性 大 于 流 动 相 的 色 谱 模 式 典 型 的 正 相 系 统 是 在 硅 胶 或 氧 化 铝 上 进 行 的 吸 附 色 谱, 用 弱 极 性 的 洗 脱 液, 如 己 烷 - 二 乙 基 乙 醚 作 为 流 动 相 也 指 极 性 键 合 相, 如 氰 基 和 氧 化 铝 O Octadecylsilane( 十 八 烷 基 硅 烷 ):HPLC 中 使 用 最 多 的 反 相 固 定 相 十 八 烷 基 硅 烷 固 定 相 键 合 到 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 上 可 以 用 单 体 键 合, 也 可 以 聚 合 键 合 柱 名 称 缩 写 为 C18 和 ODS Octylsilane( 辛 基 硅 烷 ): 反 相 色 谱 中 的 常 用 固 定 相 与 更 加 常 用 的 C18 相 比, 保 留 稍 弱 可 以 用 单 体 键 合, 也 可 以 聚 合 键 合 柱 名 称 缩 写 为 C8 ODS: 见 十 八 烷 基 硅 烷 On-column detection( 柱 上 检 测 ): 色 谱 柱 本 身 作 为 HPLC 或 CE-CEC 的 流 通 池 通 常, 该 术 语 在 石 英 毛 细 管 应 用 中 使 用 剥 离 聚 酰 亚 胺 外 层, 光 束 直 接 透 过 毛 细 管, 测 量 设 备, 如 光 电 倍 增 管 置 于 该 毛 细 管 的 另 一 侧 Online preconcentration( 在 线 预 浓 缩 ): 将 预 柱 置 于 分 离 柱 之 前, 在 分 离 前 浓 缩 分 析 物 可 用 不 同 机 制 疏 水 相 互 作 用 吸 附 或 酶 反 应 保 留 分 析 物 然 后 浓 缩 的 分 析 物 通 过 置 换 ( 如, 溶 剂 洗 脱 或 ph 变 化 ) 转 移 到 分 离 柱 上 Open tubular columns( 开 管 柱 ): 这 是 一 种 目 前 正 在 研 究 的 用 于 HPLC 超 临 界 流 体 色 谱 (SFC) 和 CE 的 窄 内 径 色 谱 柱 ( 小 于 100 µm) 固 定 相 可 以 键 合 到 小 柱 的 内 壁 上 最 常 用 的 柱 材 料 是 石 英 管 在 常 规 HPLC 或 SFC 中 很 少 使 用, 但 在 CE 中 常 用 Optically active resin( 光 学 活 性 树 脂 ): 离 子 交 换 树 脂 中 结 合 光 学 活 性 基 团, 用 于 分 离 光 学 异 构 体 很 少 有 用 于 HPLC 应 用 的 该 种 商 业 树 脂 出 售 157

Organic modifier( 有 机 改 性 剂 ): 在 反 相 HPLC 中, 加 入 到 水 相 流 动 相 中 以 获 得 分 离 的 与 水 混 溶 有 机 溶 剂 常 用 的 有 机 改 性 剂 有 乙 腈 甲 醇 异 丙 醇 和 四 氢 呋 喃 Orthogonality( 正 交 性 ): 在 二 维 分 离 中, 可 以 对 二 维 中 的 洗 脱 时 间 分 别 进 行 统 计 学 处 理 理 想 情 况 下, 二 维 应 具 有 完 全 不 同 的 保 留 机 理 ( 如, 反 相 和 正 相, 离 子 交 换 和 反 相 ) Outlet Check Valve( 出 口 单 向 阀 ): 见 单 向 阀 Overload( 过 载 ): 在 制 备 色 谱 中, 过 载 定 义 为 进 样 到 色 谱 上 的 最 大 样 品 量, 如 果 再 继 续 增 加 上 样 量, 将 开 始 影 响 其 柱 效 和 分 离 度 也 可 参 见 样 品 容 量 P Dp: 见 柱 前 压 Pa: 见 帕 斯 卡 Packing( 填 料 ):HPLC 柱 中 使 用 的 吸 附 剂 凝 胶 或 固 体 支 持 剂 最 新 的 分 析 型 HPLC 填 料 平 均 直 径 小 于 10 µm, 一 般 常 用 5 µm Paired-ion chromatography( 配 对 离 子 色 谱 ): 同 离 子 对 色 谱 Particle size (d p)( 粒 径,d p ): LC 柱 中 填 料 的 平 均 粒 径 填 料 都 不 是 单 分 散 的, 因 此 一 根 5 µm d p 柱 应 填 充 具 有 一 定 粒 径 分 布 的 填 料 颗 粒 也 可 参 见 单 分 散 颗 粒 粒 径 分 布 和 多 分 散 颗 粒 Particle size distribution( 粒 径 分 布 ): 用 于 说 明 填 充 LC 柱 颗 粒 的 分 布 的 参 数 在 HPLC 中, 窄 粒 径 分 布 较 为 理 想 如 果 平 均 d p 为 10 µm, 粒 径 度 分 布 为 d p ± 10%, 说 明 90% 的 颗 粒 都 分 布 在 9 到 11 µm 的 范 围 内 Particulates( 微 粒 ): 通 常 指 流 动 相 中 的 小 颗 粒, 可 能 因 为 堵 塞 筛 板 引 起 反 压 问 题 ; 也 可 以 指 HPLC 柱 中 填 充 的 小 粒 径 填 料 Partition chromatography( 分 配 色 谱 ): 一 种 液 相 附 着 在 固 体 支 持 剂 上 ( 固 定 相 ), 而 另 一 种 液 相 自 由 流 过 该 色 谱 柱 ( 流 动 相 ) 的 分 离 过 程 溶 质 基 于 在 两 相 中 的 分 配 系 数 在 两 相 间 自 由 分 配 液 - 液 色 谱 就 是 一 个 例 子 ; 现 代 键 合 相 色 谱 也 可 以 看 作 是 分 配 色 谱 的 一 种 形 式, 其 中 液 相 真 正 键 合 在 固 体 支 持 剂 上 而 分 配 色 谱 意 味 着 溶 质 至 少 部 分 地 嵌 入 固 定 相 内, 或 浸 渍 涂 层 或 键 合 到 该 物 质 上 与 之 相 反 的 是 吸 附 过 程, 在 此 过 程 中 溶 质 不 渗 入 保 留 表 面 或 两 相 界 面 Partition coefficient (K)( 分 配 系 数,K): 溶 质 在 固 定 相 的 平 衡 浓 度 与 流 动 相 中 的 平 衡 浓 度 之 比 也 称 为 分 布 系 数,K D, 和 分 布 常 数 (K c) Pascal (Pa)( 帕 斯 卡,Pa): 压 力 单 位,1 MPa 约 等 于 10 bar (atm) 或 150 psi PCDL: 个 人 化 合 物 数 据 库 与 谱 库 Peak( 峰 ): 分 析 化 合 物 从 色 谱 柱 洗 脱 后 经 过 检 测 器 绘 制 的 曲 线 ; 通 常 用 记 录 仪 或 打 印 机 按 检 测 器 的 电 子 响 应 绘 出 可 见 输 出 信 号 Peak area( 峰 面 积 ): 色 谱 峰 下 的 测 量 面 积 ; 一 般 用 积 分 仪 或 数 据 系 统 测 量 ; 峰 面 积 与 色 谱 峰 中 洗 脱 物 质 的 量 有 关 Peak capacity (n)( 峰 容 量,n): 一 张 色 谱 图 从 滞 留 时 间 到 保 留 上 限 之 间 可 以 容 纳 分 离 良 好 的 色 谱 峰 的 数 量 (n ) 当 R = 1 时,n 大 约 为 1 + 0.25[(N)1/2 ln(1 + k n)], 其 中 R 是 分 离 度,N 是 理 论 塔 板 数,k n 为 峰 n 的 保 留 因 子 Peak dispersion( 峰 分 散 度 ): 见 谱 带 展 宽 Peak doublet( 双 峰 ): 通 常 是 由 色 谱 柱 空 腔 造 成 的 分 裂 峰 也 可 为 距 离 很 近 的 相 邻 洗 脱 化 合 物 Peak height( 峰 高 ): 色 谱 峰 从 基 线 到 峰 顶 点 的 测 量 高 度 ; 峰 高 与 色 谱 峰 内 洗 脱 物 的 量 有 关 Peak shape( 峰 形 ): 对 色 谱 峰 形 状 的 描 述 理 论 上 认 为 是 高 斯 峰 形 ( 完 全 对 称 ) 峰 不 对 称 因 子 用 比 率 说 明 峰 形 见 143 和 144 页 图 79 和 80 也 可 参 见 不 对 称 性 Peak tracking( 峰 追 踪 ): 一 种 比 对 方 法 开 发 过 程 中 用 不 同 实 验 获 得 的 含 相 同 化 合 物 色 谱 峰 的 方 法 基 于 每 个 纯 分 析 物 的 检 测 参 数 二 极 管 阵 列 检 测 器 和 质 谱 具 有 特 异 性, 因 而 是 峰 追 踪 所 用 的 最 好 检 测 器 158

Peak variance (s 2 )( 峰 畸 变 性,s 2 ): 保 留 时 间 的 第 二 中 心 力 矩 对 于 高 斯 峰, 畸 变 性 是 控 制 峰 宽 的 基 本 参 数 见 144 页 图 80 也 可 参 见 高 斯 峰 Peak volume( 峰 体 积 ): 当 色 谱 峰 通 过 检 测 器 时 的 总 体 积 ;V R = F x W b 见 144 页 图 80 Peak width (W b)( 峰 宽,W b ): 同 带 宽 见 144 页 图 80 Pellicular packing( 薄 壳 型 填 料 ): 见 多 孔 层 微 球 Percent B solvent (% B solvent)( 溶 剂 B 的 百 分 比,%B 溶 剂 ): 指 二 元 溶 剂 混 合 物 中 的 较 强 溶 剂 % A 为 较 弱 溶 剂 Perfusion chromatography( 灌 流 色 谱 ): 指 用 很 大 孔 径 (4000-8000Å) 颗 粒, 称 为 通 孔 ( 巨 孔 ), 进 行 的 色 谱 分 离 洗 脱 液 在 大 孔 之 间 流 动, 经 过 颗 粒 的 300-1000Å 相 贯 通 孔 ( 称 为 扩 散 孔 ) 最 适 合 大 分 子 的 制 备 分 离 Permeability (B o)( 渗 透 性,B o ): 也 称 柱 渗 透 性 和 特 异 性 渗 透 性 是 表 示 填 充 柱 对 流 动 相 液 流 阻 抗 的 参 数 对 填 充 柱 来 说,B o d 2 p e 3 /[180(1-e) 2 ] 5 d 2 p /1000 渗 透 性 高 的 色 谱 柱 产 生 低 压 降 Permeation( 渗 透 ): 指 SEC 的 分 离 过 程 溶 质 随 流 动 相 进 入 填 料 孔 径 的 过 程 Phase ratio (b)( 相 比,b): 色 谱 柱 中 固 定 相 与 流 动 相 的 相 对 量 在 分 配 色 谱 中,b = V S/V M, 其 中 V S 和 V M 分 别 为 色 谱 柱 中 固 定 相 和 流 动 相 的 体 积 保 留 因 子 是 相 比 和 分 配 系 数 的 产 物 Phenyl phase( 苯 基 键 合 相 ): 通 过 二 甲 苯 基 氯 或 烷 氧 基 硅 烷 与 硅 胶 反 应 制 备 的 常 用 非 极 性 键 合 相 对 含 芳 香 基 团 的 化 合 物 具 有 亲 和 性, 提 供 与 烷 基 键 合 相 不 同 的 选 择 性 Pirkle column(pirkle 柱 ): 基 于 3,5- 二 硝 基 苯 甲 酰 苯 基 甘 氨 酸 硅 胶 的 手 性 刷 型 固 定 相, 用 于 分 离 各 种 对 映 异 构 体 用 其 开 发 者, 伊 利 诺 斯 大 学 的 William Pirkle 的 名 字 命 名 Planar chromatography( 平 板 色 谱 ): 一 种 固 定 相 以 平 面 存 在 或 涂 布 在 平 面 上 的 分 离 技 术 (IUPAC) 典 型 形 式 有 纸 层 析 色 谱 和 薄 层 层 析 色 谱 Plate height (H)( 塔 板 高 度,H): 见 HETP Plate or plate number( 塔 板 或 塔 板 数 ): 指 填 充 柱 中 的 理 论 塔 板 数 (IUPAC) 也 可 参 见 理 论 塔 板 数 Polar( 极 性 ): 化 学 极 性 是 指 一 个 分 子 的 正 电 荷 端 与 另 一 个 分 子 或 同 一 分 子 的 负 电 荷 端 之 间 的 偶 极 - 偶 极 相 互 作 用 分 子 的 极 性 取 决 于 化 合 物 中 原 子 间 负 电 性 的 差 异, 以 及 该 化 合 物 结 构 的 不 对 称 性 例 如, 水 是 极 性 的, 因 为 其 电 子 分 布 不 均 匀 但 一 般 认 为 甲 烷 是 非 极 性 的, 因 为 其 碳 原 子 均 衡 分 担 了 氢 原 子 Polyacrylamide gel( 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ): 水 相 SEC 中 使 用 的 中 性 亲 水 聚 合 物 型 填 料 通 过 丙 烯 酰 胺 与 N,N'- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 共 聚 制 得 Polydisperse particles( 多 分 散 颗 粒 ): 具 有 各 种 内 径 的 填 料 颗 粒 (> 10%) Polyethyleneimine( 聚 乙 烯 亚 胺 ): 一 种 用 于 涂 覆 或 键 合 到 硅 胶 或 聚 合 物 填 料 上 的 阴 离 子 型 固 定 相 常 用 于 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 Polymeric packings( 聚 合 物 型 填 料 ): 以 聚 合 物 为 基 质 的 填 料, 通 常 为 球 形 微 粒 LC 中 常 用 的 聚 合 物 为 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 (PS-DVB) 聚 二 乙 烯 基 苯 聚 丙 烯 酰 胺 聚 丙 烯 酸 甲 酯 聚 环 氧 乙 烯 葡 聚 糖 和 多 糖 Polymeric phase( 聚 合 物 固 定 相 ): 指 将 聚 合 物 材 料 键 合 到 硅 胶 颗 粒 上 的 化 学 键 合 相 Polystyrene-divinylbenzene resin (PS-DVB)( 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 树 脂,PS-DVB): 离 子 交 换 色 谱 中 最 常 用 的 基 础 聚 合 物 离 子 型 基 团 可 参 与 各 种 化 学 反 应 中 性 PS-DVB 微 粒 用 于 反 相 色 谱 通 过 改 变 与 DVB 的 交 联 程 度 可 改 变 孔 隙 率 和 机 械 稳 定 性 Poppe Plot(Poppe 曲 线 ): 以 荷 兰 阿 姆 斯 特 丹 大 学 Hans Poppe [J. Chromatogr. A 778, 3 (1997)] 教 授 的 名 字 命 名 的 一 种 动 力 学 曲 线, 其 中, 以 理 论 塔 板 数 (N) 为 变 量 描 述 塔 板 时 间 [log(t0/n)], 以 评 估 柱 效 作 为 以 粒 度 柱 压 降 等 为 参 数 的 函 数 时 的 极 限 Pore diameter( 孔 径 ): 同 平 均 孔 径 Pore size( 孔 隙 大 小 ): 多 孔 填 料 上 一 个 孔 隙 的 平 均 尺 寸 其 数 值 用 埃 或 纳 米 表 示 孔 隙 大 小 决 定 了 分 子 是 否 能 够 在 填 料 内 外 扩 散 也 可 参 见 平 均 孔 径 Plate number( 塔 板 数 ): 见 色 谱 柱 塔 板 数 159

Pore volume( 孔 隙 体 积 ): 多 孔 填 料 中 孔 隙 体 积 的 总 和, 一 般 用 毫 升 / 克 表 示 更 恰 当 的 叫 法 应 该 是 特 异 性 孔 隙 体 积 用 氮 吸 附 BET 法 或 汞 压 入 孔 隙 法 ( 在 高 压 下 将 汞 泵 入 孔 隙 内 ) 测 定 Porosity( 孔 隙 率 ): 多 孔 物 质 颗 粒 孔 隙 的 体 积 占 该 颗 粒 总 体 积 的 比 率 孔 隙 体 积 ( 以 毫 升 / 克 表 示 ) 是 说 明 孔 隙 率 的 一 个 方 面 Porous-layer bead( 多 孔 层 微 球 ): 用 固 定 相 薄 层 涂 渍 的 小 玻 璃 微 球 薄 层 可 以 是 吸 附 剂 树 脂 或 化 学 键 合 在 吸 附 剂 上 的 固 定 相 该 填 料 是 首 先 应 用 在 HPLC 中 的 一 种 其 粒 度 为 20-40 µm, 比 现 在 用 的 填 料 微 粒 大, 但 容 易 填 充, 并 能 提 供 满 意 的 柱 效 也 称 为 控 制 表 面 孔 隙 率 的 支 持 剂 和 薄 壳 材 料 Porous particle( 多 孔 颗 粒 ): 指 具 有 一 定 直 径 和 体 积, 互 连 孔 隙 的 柱 填 料 颗 粒 在 HPLC 应 用 中, 分 析 人 员 一 般 使 用 直 径 小 于 10 mm 的 多 孔 颗 粒 较 大 颗 粒 成 本 较 低, 并 具 有 较 高 的 柱 渗 透 性, 因 而 用 于 制 备 级 色 谱 分 离 Porous polymer( 多 孔 聚 合 物 ): 一 种 以 有 机 聚 合 物 或 共 聚 物 为 基 质 的 填 料, 一 般 为 球 形 最 常 见 的 例 子 包 括 PS-DVB 聚 丙 烯 酸 酯 葡 聚 糖 聚 丙 烯 酰 胺 和 聚 丁 二 烯 Precolumn( 预 柱 ): 置 于 泵 和 进 样 器 之 间 的 小 柱 其 作 用 是 去 除 流 动 相 中 可 能 存 在 的 颗 粒, 用 固 定 相 或 溶 解 性 物 质 使 流 动 相 预 饱 和, 以 防 止 分 析 柱 中 的 固 定 相 损 失 或 溶 解, 导 致 目 标 物 的 化 学 吸 附, 从 而 干 扰 分 离 其 体 积 基 本 不 影 响 等 度 洗 脱, 但 对 梯 度 洗 脱 的 梯 度 有 延 迟 作 用 Precolumn Filter( 预 柱 过 滤 器 ): 在 进 样 器 和 色 谱 柱 ( 或 保 护 柱 ) 之 间 使 用 的 过 滤 器, 以 防 止 不 想 要 的 样 品 组 分 进 入 色 谱 柱 ; 有 时 也 称 为 在 线 过 滤 器, 偶 尔 称 为 进 样 口 过 滤 器 Preconcentration( 预 浓 缩 ): 参 见 痕 量 富 集 Preparative chromatography( 制 备 色 谱 ): 指 使 用 LC 进 行 分 离, 得 到 足 以 进 行 其 它 实 验 或 满 足 其 他 功 能 需 求 的 量 的 过 程 在 制 药 或 生 物 技 术 纯 化 中, 使 用 内 径 几 英 尺 的 大 柱 进 行 几 克 级 物 质 的 分 离 要 分 离 几 毫 克 宝 贵 的 天 然 产 物 时, 可 以 使 用 4.6 mm 内 径 的 分 析 柱 根 据 色 谱 工 作 者 的 目 的 不 同, 两 种 规 格 的 色 谱 柱 都 可 以 作 为 制 备 色 谱 的 选 择 Pressure (pressure drop) (Dp)( 压 力 ( 压 降 ),Dp): 见 柱 前 压 Pressure injection( 压 力 进 样 ):CE 中 的 压 力 驱 动 进 样 使 用 压 力 或 真 空 将 纳 升 级 体 积 的 样 品 注 入 毛 细 管 柱 最 适 用 于 内 径 小 于 10 µm 的 窄 径 毛 细 管 流 体 静 力 学 进 样 的 一 种 形 式 Process-scale chromatography( 生 产 规 模 色 谱 ): 指 在 实 验 室 外 使 用 的 工 业 规 模 的 LC 与 实 验 室 规 模 的 HPLC 相 比, 一 般 需 要 特 别 设 计 的 色 谱 柱 ( 内 径 通 常 > 5 cm), 可 回 收 的 溶 剂 低 成 本 填 料 ( 较 大 的 不 规 则 形 状 填 料 颗 粒 ) 和 过 载 操 作 条 件 Programmed-temperature chromatography( 程 序 温 控 色 谱 ): 在 色 谱 运 行 中 改 变 温 度 在 LC 中 很 少 使 用 PS-DVB: 参 见 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 树 脂 Pulsating flow( 脉 动 流 ): 往 复 泵 产 生 的 液 流 通 常 情 况 下, 用 脉 冲 阻 尼 器 电 子 压 力 反 馈 环 路 或 主 动 阻 尼 器 泵 头 抑 制 脉 冲 电 化 学 示 差 折 光 等 检 测 器 受 流 量 脉 动 的 影 响 很 大 Q Quaternary methyl amine( 四 甲 基 铵 ): 树 脂 填 料 中 常 用 的 强 阴 离 子 交 换 官 能 团 通 常 使 用 氯 化 物 形 式 Quaternary mobile phase( 四 元 流 动 相 ): 包 含 四 种 溶 剂 或 缓 冲 液 的 流 动 相 Quaternary-solvent mobile phase( 四 元 溶 剂 流 动 相 ): 流 动 相 包 括 四 种 分 开 的 溶 剂, 可 以 对 流 动 相 组 成 进 行 微 调 ; 这 种 流 动 相 最 常 用 低 压 四 元 泵 输 送 Q-TOF: 由 四 极 杆 和 飞 行 时 间 质 量 分 析 器 组 成 的 混 合 型 质 谱 仪 QTOF 质 谱 仪 是 一 种 高 质 量 准 确 度 高 分 辨 率 的 仪 器 R r: 参 见 相 对 保 留 Radial compression( 径 向 压 缩 ): 对 弹 性 壁 色 谱 柱 实 施 径 向 压 缩, 以 降 低 柱 壁 效 应 160

Radial diffusion-dispersion( 径 向 扩 散 - 分 散 ):LC 柱 径 向 的 扩 散 - 分 散 如 果 样 品 恰 好 进 样 到 色 谱 柱 的 中 心, 它 将 不 仅 沿 纵 向 移 动 通 过 色 谱 柱, 也 将 沿 径 向 展 开, 使 溶 质 达 到 柱 壁 区 域, 洗 脱 液 的 流 速 与 柱 中 心 处 不 同 Re: 参 见 雷 诺 数 Recovery( 回 收 率 ): 从 色 谱 柱 洗 脱 出 的 溶 质 或 样 品 量 与 进 样 量 的 比 值 高 回 收 率 对 良 好 定 量 制 备 分 离 ( 尤 其 是 生 物 大 分 子 ), 以 及 良 好 峰 形 和 分 离 度 都 非 常 重 要 回 收 率 不 高 的 原 因 可 能 是 溶 质 与 填 料 柱 筛 板 和 柱 管 上 的 活 性 位 点 发 生 了 相 互 作 用 化 合 物 在 分 离 过 程 中 发 生 分 解 也 可 能 影 响 回 收 率 Recycling chromatography( 循 环 色 谱 ): 色 谱 柱 洗 脱 液 再 循 环 到 柱 头 以 延 长 柱 长 可 以 让 洗 脱 液 通 过 泵 头 在 同 一 根 色 谱 柱 上 进 行 循 环 也 可 以 使 用 两 根 色 谱 柱, 用 切 换 阀 连 接, 一 根 柱 子 的 洗 脱 液 直 接 进 入 另 一 根 柱 子 的 柱 头 HPLC 中 很 少 使 用, 只 在 排 阻 色 谱 中 应 用 Reduced plate height (h)( 折 合 塔 板 高 度,h): 用 于 比 较 不 同 色 谱 柱 的 柱 效 ;h = H/d p, 其 中 H 为 理 论 塔 板 数 的 塔 板 高 度,d p 是 粒 径 最 佳 流 速 下 h 为 2 或 更 小, 表 明 HPLC 柱 填 充 良 好 Reduced velocity (v)( 折 合 流 速,v): 与 折 合 塔 板 高 度 一 起 用 于 比 较 不 同 的 填 充 色 谱 柱 与 溶 质 在 流 动 相 中 的 扩 散 系 数 (D M) 和 柱 填 料 的 粒 径 (d p) 有 关,v = ud p/d M, 其 中 u 为 平 均 间 隙 流 动 相 线 速 度 也 可 参 见 Knox 方 程 Refractive index peak( 折 射 峰 ): 常 在 死 体 积 附 近 出 现 的 假 峰, 由 吸 收 对 折 射 率 的 敏 感 性 和 其 它 检 测 器 引 起 也 可 参 见 空 白 峰 Regeneration( 再 生 ): 在 梯 度 洗 脱 后, 使 色 谱 柱 中 的 填 料 恢 复 到 初 始 状 态 流 动 相 以 阶 梯 或 连 续 梯 度 流 经 色 谱 柱 恢 复 固 定 相 或 充 分 溶 剂 化 使 其 回 到 初 始 状 态 在 离 子 交 换 中, 再 生 包 含 用 占 据 交 换 位 点 的 原 始 离 子 置 换 在 交 换 过 程 中 被 取 代 的 离 子 再 生 也 可 以 指 使 色 谱 柱 恢 复 到 初 始 状 态 ; 例 如 用 强 溶 剂 去 除 杂 质 Relative retention (r)( 相 对 保 留,r): 相 对 于 标 样 的 保 留 ;r = t R '/t R(st)' = k/k st, 其 中 t R' 是 目 标 组 分 的 调 整 保 留 时 间,t R(st)' 是 标 样 的 调 整 保 留 时 间,k 和 k st 是 相 应 的 保 留 因 子 对 于 两 个 相 邻 的 色 谱 峰, 相 对 保 留 也 称 分 离 因 子 ( 以 前 叫 做 选 择 性 或 选 择 性 因 子 ); 计 算 公 式 为 a = t R2'/t R1' = k 2/k 1, 其 中 t R2' 和 t R1' 分 别 为 峰 2 和 峰 1 的 调 整 保 留 时 间, k 2 和 k 1 是 相 应 的 保 留 因 子 Residual silanols( 残 留 硅 醇 基 ): 在 填 料 表 面 进 行 化 学 键 合 后 填 料 表 面 残 留 的 硅 醇 基 (-Si-OH) 这 些 硅 醇 基 一 般 存 在 于 小 孔 隙 内, 不 能 参 与 与 大 分 子 有 机 硅 烷 ( 如, 十 八 烷 基 二 甲 基 氯 硅 烷 ) 的 反 应, 但 小 分 子 极 性 化 合 物 可 以 进 入 去 除 它 们 的 方 法 通 常 为 用 小 分 子 有 机 硅 烷 ( 如 三 甲 基 氯 硅 烷 ) 进 行 封 端 也 可 参 见 封 端 Resin( 树 脂 ): 离 子 交 换 分 离 使 用 的 固 体 聚 合 物 填 料 最 常 用 的 树 脂 是 粒 径 小 于 10 µm 的 PS-DVB 共 聚 物 离 子 型 官 能 团 结 合 在 树 脂 上 Resolution (R s)( 分 离 度,R s ): 色 谱 柱 分 离 色 谱 峰 的 能 力 R s = (t R2 - t R1 )/[(w b1 + w b2 )/2], 其 中 t R2 和 t R1 是 两 个 色 谱 峰 的 保 留 时 间,w b 是 两 峰 峰 底 宽 分 离 度 通 常 表 示 两 峰 分 离 程 度 分 离 度 为 1 时, 认 为 是 最 小 的 可 测 量 分 离, 可 以 进 行 良 好 定 量 分 离 度 为 0.6 时, 可 以 分 辨 两 个 等 高 的 色 谱 峰 分 离 度 为 1.5 时, 认 为 两 个 等 高 峰 已 达 到 足 够 的 基 线 分 离 分 离 度 为 1.7 或 以 上, 一 般 为 耐 用 方 法 的 理 想 值 参 见 144 页 图 80 Resolution equation( 分 离 度 方 程 ): 也 称 一 般 分 离 度 方 程 和 Purnell 方 程 ;R = 4N 1/2 [(α-1)/α][k/(1+k)], 其 中 N 是 柱 效,a 是 分 离 因 子,k 是 保 留 因 子 Retention factor (k)( 保 留 因 子,k): 样 品 组 分 滞 留 在 固 定 相 中 的 时 间 与 其 在 流 动 相 中 的 时 间 之 比 用 调 整 保 留 时 间 除 以 滞 留 时 间 计 算 ;k = (t R- t M)/t M, 其 中 t R 是 样 品 峰 的 保 留 时 间,t M 是 不 保 留 峰 的 保 留 时 间 ( 以 前 使 用 的 是 k', 称 为 容 量 因 子 或 容 量 比 ) Retention time (t R)( 保 留 时 间,t R ): 也 称 总 保 留 时 间 从 进 样 开 始 到 出 现 某 组 分 色 谱 峰 的 最 高 点 所 经 历 的 时 间 总 保 留 体 积 (V R) 用 保 留 时 间 乘 以 流 速 测 得 调 整 保 留 时 间 (t R' ) 则 需 减 去 色 谱 柱 空 隙 体 积 ;t R' = t R t M 一 般 测 定 从 进 样 点 到 峰 顶 点 的 距 离, 但 应 测 定 对 称 峰 的 重 心 161

Retention volume (V R)( 保 留 体 积,V R ): 从 色 谱 柱 中 洗 脱 一 种 物 质 需 要 的 流 动 相 体 积 ;V R = Ft R 或 V R = V M + K DV S, 其 中 V M 是 空 隙 体 积,K D 是 分 布 系 数,V S 是 固 定 相 体 积 也 可 参 见 保 留 时 间 Reversed phase chromatography( 反 相 色 谱 ): 最 常 用 的 HPLC 模 式 使 用 低 极 性 填 料, 如 十 八 烷 基 或 辛 基 硅 烷 固 定 相 键 合 到 硅 胶 或 中 性 聚 合 物 微 球 上 流 动 相 一 般 为 水 或 与 水 混 溶 的 有 机 溶 剂, 如 甲 醇 或 乙 腈 按 照 溶 质 的 疏 水 性 或 亲 油 性 进 行 洗 脱 疏 水 性 越 强, 保 留 就 越 强 分 析 物 的 水 溶 性 越 大, 保 留 就 越 弱 该 技 术 有 许 多 可 变 因 素, 各 种 流 动 相 添 加 剂 可 造 成 不 同 的 选 择 性 例 如, 分 析 阴 离 子 时 加 入 缓 冲 液 和 四 烷 基 铵 盐, 形 成 离 子 对 进 行 分 离, 与 离 子 交 换 色 谱 类 似 90% 以 上 的 HPLC 分 析 人 员 使 用 反 相 色 谱 Reynolds number (Re)( 雷 诺 数,Re): 流 体 粘 滞 力 与 惯 性 力 的 比 值 在 平 滑 的 无 填 充 管 内 测 量 流 量 ;Re = ud/(h/r), 其 中 u 是 平 均 流 速 ( 用 厘 米 / 秒 表 示 ),d 是 管 径,h 是 粘 度 ( 用 厘 米 秒 / 克 表 示 ),r 是 密 度 ( 用 克 / 立 方 厘 米 表 示 ) 低 Re 时, 粘 滞 摩 擦 主 要 控 制 着 流 体 的 运 动, 使 其 缓 慢 而 平 稳 在 空 管 中,Re 超 过 4200 时, 流 体 完 全 呈 湍 流 状 态 在 填 充 柱 床 上,u 用 平 均 间 隙 流 速 取 代,d 为 平 均 粒 度 在 填 充 柱 床 内 Re 值 大 于 10 时 流 体 为 湍 流, 但 不 是 全 湍 流 状 态, 直 到 Re 超 过 100-200 R s : 参 见 分 离 度 S S: 反 相 色 谱 中 的 溶 剂 强 度 参 数 以 log 10 k 对 有 机 改 性 剂 体 积 作 图, 曲 线 的 斜 率 与 溶 质 相 关 S 随 改 性 剂 类 型 固 定 相 和 温 度 而 变 化 SAX: 见 强 阴 离 子 交 换 剂 SCX: 见 强 阳 离 子 交 换 剂 s 2 : 见 峰 畸 变 性 Salting-out effect( 盐 析 作 用 ): 在 流 动 相 中 使 用 高 浓 度 盐 缓 冲 液 时, 导 致 低 极 性 分 析 物 在 水 中 溶 解 性 降 低, 从 而 在 溶 液 中 沉 淀 或 析 出 最 常 用 于 蛋 白 质 的 疏 水 相 互 作 用 色 谱, 蛋 白 质 首 先 在 高 盐 浓 度 下 沉 淀, 然 后 用 反 相 梯 度 洗 脱 通 过 逐 渐 稀 释 使 其 洗 脱 Sample capacity( 样 品 容 量 ): 指 进 样 不 过 载 的 最 大 样 品 量 一 般 用 每 克 填 料 的 样 品 克 数 表 示 过 载 的 定 义 是, 使 柱 效 比 正 常 值 降 低 10% 的 进 样 样 品 质 量 ; 有 时 称 为 样 品 负 荷 量 Sampling Rate( 采 样 速 率 ): 参 见 数 据 采 集 速 率 Saturator column( 饱 和 柱 ): 参 见 预 柱 Scalability( 放 大 ): 在 从 分 析 色 谱 过 渡 到 制 备 色 谱 的 过 程 中, 使 用 相 同 粒 度 和 键 合 相, 在 不 同 内 径 色 谱 柱 上 得 到 可 重 现 的 结 果 ; 通 常 是 使 用 较 大 内 径 的 色 谱 柱 以 增 加 容 量 ; 线 性 放 大 过 程 最 大 限 度 地 缩 短 了 优 化 制 备 分 离 的 时 间 SEC: 见 尺 寸 排 阻 色 谱 和 立 体 排 阻 色 谱 Sedimentation( 沉 降 ): 用 于 筛 分 离 子 交 换 色 谱 所 用 树 脂 的 技 术 在 一 个 固 定 于 固 定 平 面 的 容 器 中 加 入 溶 剂, 通 常 为 水, 后 将 宽 分 布 的 微 球 加 入 溶 剂 中 基 于 颗 粒 大 小 和 密 度, 微 球 将 以 不 同 速 度 下 沉, 形 成 颗 粒 大 小 梯 度, 即 可 取 出 感 兴 趣 的 馏 分 通 过 沉 降 可 以 得 到 非 常 窄 的 颗 粒 粒 径 范 围 Selectivity or selectivity factor (a )( 选 择 性 或 选 择 性 因 子,a): 已 被 分 离 因 子 取 代 的 旧 术 语 有 时 称 为 相 对 保 留 Selectivity coefficient (k A/B)( 选 择 性 系 数,k A/B ): 在 离 子 交 换 色 谱 中, 按 离 子 交 换 剂 的 质 量 作 用 定 律 得 到 其 平 衡 系 数, 并 用 电 渗 流 选 择 同 一 溶 液 中 存 在 的 两 个 离 子 表 征 离 子 交 换 剂 的 性 能 例 如, 用 Na + 交 换 H + k Na/H = ([Na] S [H] M)/([Na] M[H] S) Semi-preparative chromatography( 半 制 备 色 谱 ): 在 分 析 柱 (4-5 mm 内 径 ) 或 略 大 的 色 谱 柱 (6-10 mm 内 径 ) 上 进 行 的 制 备 型 LC 进 样 量 一 般 为 毫 克 到 低 克 级 Sensitivity( 灵 敏 度 ): 对 特 定 量 的 分 析 物 的 信 号 响 应, 被 归 一 化 为 产 生 该 响 应 的 分 析 物 的 量, 通 常 由 校 准 曲 线 的 斜 率 来 确 定 Separation factor (a)( 分 离 因 子,a): 测 量 两 个 组 分 相 对 保 留 的 热 动 力 学 因 子 过 去 称 为 选 择 性 或 选 择 性 因 子 相 对 保 留 ;a = t R2'/t R1' = k 2/k 1, 其 中 t R2' 和 t R1' 分 别 为 峰 2 和 峰 的 调 整 保 留 时 间,k 2 和 k 1 是 相 应 的 保 留 因 子 162

Separation impedance (E)( 分 离 阻 抗,E): 由 John Knox 建 立 的 一 种 性 能 指 数, 用 以 比 较 两 个 色 谱 系 统 的 柱 效, 对 分 析 时 间 和 压 力 降 进 行 归 一 化 处 理 ;E = t R D p/ N 2 v(1 + k), 其 中 t R 为 保 留 时 间,D p 是 压 力 降,N 为 柱 效, v 是 折 合 流 速,k 是 保 留 因 子 E 值 越 低, 系 统 越 好 SFC: 参 见 超 临 界 流 体 色 谱 Silanol( 硅 凝 胶 ): 硅 胶 表 面 上 的 Si-OH 基 团 硅 醇 基 在 强 度 方 面 的 变 化, 与 其 位 置 彼 此 间 的 联 系 以 及 硅 胶 的 金 属 含 量 有 关 最 强 的 硅 醇 基 为 酸 性, 在 色 谱 过 程 中 常 与 碱 性 化 合 物 发 生 不 良 相 互 作 用 Silanophile( 亲 硅 醇 基 化 合 物 ): 对 硅 胶 表 面 的 活 性 或 酸 性 硅 醇 基 具 有 强 亲 和 性 的 化 合 物 通 常 为 强 碱 性 胺 Silica gel( 硅 胶 ): 应 用 最 广 泛 的 HPLC 填 料 具 有 多 孔 无 定 形 结 构, 由 硅 氧 烷 和 硅 醇 基 组 成 可 用 于 所 有 LC 模 式, 在 吸 附 色 谱 作 为 填 料 在 液 - 液 色 谱 或 化 学 键 合 相 中 作 为 支 持 剂, 同 时 以 其 不 同 的 孔 径 也 可 作 为 SEC 的 填 料 HPLC 中 使 用 的 是 平 均 粒 径 3 5 和 10 µm 的 微 粒 硅 胶 与 不 规 则 硅 胶 相 比, 现 代 分 析 HPLC 柱 更 倾 向 于 使 用 球 形 硅 胶, 因 为 这 种 填 料 具 有 良 好 的 重 现 性 和 较 低 的 压 力 降 常 称 为 硅 胶 Siloxane( 硅 氧 烷 ):Si-O-Si 键 硅 胶 硅 烷 化 合 物 或 键 合 相 中 的 一 种 基 本 化 学 键 除 在 高 ph 下 的 条 件 下 均 较 稳 定 对 HPLC 分 离 几 乎 没 有 影 响 Silylation( 硅 烷 化 ): 有 机 氯 或 有 机 硅 氧 烷 与 含 反 应 基 团 的 化 合 物 发 生 反 应 的 过 程 在 LC 中, 指 在 色 谱 分 离 之 前 对 溶 质 进 行 的 衍 生 化 过 程, 使 其 可 检 测 或 防 止 与 固 定 相 发 生 有 害 相 互 所 用 也 可 以 指 在 固 体 支 持 剂 上 添 加 化 学 键 合 相 或 使 填 料 去 活 以 降 低 表 面 活 性 的 过 程 Simulated moving bed( 模 拟 移 动 床 ): 一 种 色 谱 系 统, 用 一 系 列 色 谱 柱 和 阀 设 置, 模 拟 流 动 相 和 固 定 相 的 逆 流 移 动, 能 够 连 续 取 出 产 品, 并 重 复 利 用 样 品 制 备 级 色 谱 中 应 用 的 一 种 复 杂 形 式 的 循 环 色 谱 Size exclusion chromatography (SEC)( 体 积 排 阻 色 谱, SEC): 同 立 体 排 阻 色 谱 Slurry packing( 匀 浆 填 充 ): 将 微 粒 填 充 入 HPLC 色 谱 柱 的 最 常 用 技 术 填 料 悬 浮 在 约 10% (w/v ) 的 匀 浆 中, 用 特 殊 的 高 压 泵 快 速 泵 入 空 柱 管 中 Snyder e o: 吸 附 色 谱 中 的 溶 剂 强 度 参 数 溶 剂 占 据 的 每 单 位 表 面 积 的 溶 剂 吸 附 能 量 Soap chromatography( 皂 色 谱 ): 离 子 对 色 谱 的 早 期 名 称 将 长 链 皂 或 表 面 活 性 剂 作 为 流 动 相 添 加 剂 Sol gel( 溶 胶 - 凝 胶 法 ): 硅 胶 由 硅 溶 胶 聚 集 形 成 得 到 的 B 型 硅 胶 与 较 早 的 A 型 硅 胶 相 比, 具 有 较 低 的 表 面 酸 性 较 低 痕 量 金 属 较 低 比 表 面 积 和 孔 隙 率, 以 及 更 高 的 ph 稳 定 性 Solid phase extraction (SPE)( 固 相 萃 取,SPE): 将 20-40 µm dp 固 相 填 料 装 填 在 小 塑 料 卡 套 柱 膜 盘 或 96 孔 板 的 孔 中, 以 此 进 行 样 品 制 备 的 技 术 使 用 的 固 定 相 与 HPLC 填 料 一 致 虽 然 与 色 谱 相 关, 但 SPE 的 原 理 却 不 相 同, 有 时 也 称 为 数 位 式 色 谱 最 常 用 的 过 程 需 要 4 步 : 活 化 吸 附 剂 加 入 样 品 洗 去 杂 质, 然 后 用 体 积 尽 可 能 小 的 强 溶 剂 洗 脱 样 品 Solid support( 固 体 吸 附 剂 ): 同 支 持 剂 Solute( 溶 质 ): 也 可 参 见 分 析 物 Solvent( 溶 剂 ): 用 于 溶 解 样 品 并 注 入 HPLC 柱 或 CE 毛 细 管 的 液 体 有 时 指 使 用 的 流 动 相 也 可 参 见 洗 脱 液 Solvent demixing( 溶 剂 分 层 ): 使 用 两 种 强 度 区 别 非 常 大 的 溶 剂 时 容 易 出 现 的 现 象 A 为 弱 溶 剂,B 是 强 溶 剂 两 者 作 为 洗 脱 液 用 于 未 修 饰 硅 胶 或 氧 化 铝 强 溶 剂 (B) 优 先 被 固 定 相 活 性 表 面 吸 附, 直 到 饱 和 ; 这 种 情 况 出 现 后, 弱 溶 剂 (A) 在 流 经 色 谱 柱 的 过 程 中 被 富 集 或 分 层 最 后, 整 根 柱 子 被 溶 剂 B 饱 和, 流 动 相 在 起 始 强 度 时 与 溶 剂 A 混 合 流 出, 样 品 组 成 则 随 着 溶 剂 强 度 的 突 然 改 变 被 洗 脱 Solvent selectivity( 溶 剂 选 择 性 ): 溶 剂 影 响 选 择 性 的 能 力 例 如, 溶 剂 B 从 5% 变 到 10%, 或 将 反 相 色 谱 中 的 有 机 改 性 剂 从 甲 醇 换 成 乙 腈, 将 影 响 谱 带 间 距 Solvent-selectivity triangle( 溶 剂 选 择 性 三 角 形 ): 在 不 同 溶 剂 中 进 行 选 择 以 改 变 谱 带 间 距 的 有 用 指 南 溶 剂 选 择 性 取 决 于 溶 剂 分 子 的 偶 极 距 酸 性 和 碱 性 Solvent strength( 溶 剂 强 度 ): 指 溶 剂 从 色 谱 柱 中 洗 脱 特 定 溶 质 或 化 合 物 的 能 力 Snyder 描 述 氧 化 铝 和 按 洗 脱 顺 序 对 溶 剂 定 量 分 级 的 线 性 洗 脱 吸 附 色 谱 ( 液 - 固 色 谱 ) 性 质 在 硅 胶 和 活 性 碳 吸 附 剂 上 应 用 不 广 泛 也 可 参 见 Snyder e o 163

Sorb( 吸 附 ): 当 保 留 机 制 吸 附 吸 收 或 分 配 不 明 时, 被 固 定 相 保 留 的 过 程 Sorbent( 吸 附 剂 ): 指 LC 使 用 的 填 料 常 用 吸 附 剂 为 聚 合 物 硅 胶 氧 化 铝 二 氧 化 钛 二 氧 化 锆 和 化 学 修 饰 材 料 SPE: 参 见 固 相 萃 取 Specific surface area( 特 定 表 面 积 ): 用 公 认 技 术 ( 如, 氮 吸 附 BET 法 ) 测 得 的 LC 填 料 表 面 积 Spherical packing( 球 形 填 料 ): 指 球 形 的 固 体 填 料 在 分 析 型 HPLC 中, 球 形 填 料 一 般 比 不 规 则 填 料 更 受 欢 迎, 但 不 规 则 填 料 因 其 价 格 低 廉 常 用 制 备 色 谱 中 Standards( 标 样 ): 含 有 已 知 量 目 标 化 合 物 的 样 品 通 过 相 同 条 件 下 对 比 标 准 品 和 样 品 的 保 留 时 间, 鉴 别 样 品 峰 在 定 量 分 析 中, 以 外 标 化 合 物 的 检 测 器 输 出 ( 峰 面 积 或 峰 高 ) 对 浓 度 作 图 绘 制 校 正 曲 线 ; 将 未 知 物 的 检 测 器 输 出 带 入 校 正 曲 线 进 行 计 算 浓 度 内 标 法 是 将 已 知 浓 度 但 保 留 时 间 不 同 的 化 合 物 加 入 到 样 品 中, 通 过 对 比 内 标 物 与 未 知 物 的 相 对 响 应 值 对 未 知 物 进 行 定 量 Stagnant mobile phase( 滞 留 流 动 相 ): 填 料 颗 粒 孔 隙 中 所 含 的 流 动 相 部 分 Stationary phase( 固 定 相 ): 参 与 色 谱 过 程 的 色 谱 保 留 性 固 定 相 LC 中 的 固 定 相 可 以 是 固 体 在 固 体 支 持 剂 上 键 合 的 固 定 的 或 涂 层 相, 或 涂 壁 相 固 定 相 常 代 表 LC 模 式 的 特 征 例 如, 硅 胶 用 于 吸 附 色 谱, 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 相 用 于 反 相 色 谱 Stationary zone( 固 定 区 带 ): 与 固 定 相 不 同 固 定 区 带 包 括 滞 留 流 动 相 和 具 有 色 谱 活 性 的 固 定 相 Stepwise elution( 分 段 洗 脱 ): 在 色 谱 过 程 中 使 用 不 同 组 成 的 洗 脱 液 通 过 泵 或 选 择 器 阀 以 分 段 形 式 改 变 洗 脱 液 而 梯 度 洗 脱 是 连 续 改 变 流 动 相 的 组 成 Steric exclusion chromatography( 立 体 排 阻 色 谱 ): LC 的 一 种 主 要 模 式, 其 中 样 品 基 于 其 在 溶 液 中 的 大 小 得 到 分 离 也 称 体 积 排 阻 色 谱 凝 胶 渗 透 色 谱 凝 胶 过 滤 色 谱 和 凝 胶 色 谱 立 体 排 阻 色 谱 在 聚 合 物 分 离 和 表 征 中 最 为 常 用 Sterically protected bonded phase( 立 体 保 护 键 合 相 ): 对 大 官 能 团 进 行 立 体 保 护 的 键 合 相, 如, 异 丙 基 和 异 丁 基 环 绕 共 价 键 合 表 面 硅 氧 烷 防 止 硅 氧 键 发 生 催 化 水 解, 以 及 在 ph 3 以 下 条 件 下 的 键 合 相 流 失 Straight phase chromatography: 同 正 相 色 谱 Strong anion exchanger( 强 阴 离 子 交 换 剂 ): 带 强 碱 性 离 子 基 团 ( 如, 四 烷 基 胺 基 团 ) 的 阴 离 子 交 换 填 料 Strong cation exchanger( 强 阳 离 子 交 换 剂 ): 带 强 酸 性 离 子 基 团 ( 如, 磺 酸 基 ) 的 阳 离 子 交 换 填 料 Strong solvent( 强 溶 剂 ): 一 般 指 对 化 合 物 溶 解 性 良 好 的 溶 剂 ; 在 色 谱 中, 指 提 供 较 高 溶 剂 强 度 能 使 分 析 物 快 速 从 色 谱 柱 中 洗 脱 的 流 动 相 成 分 ; 在 反 相 色 谱 水 和 乙 腈 的 二 元 溶 剂 系 统 中, 乙 腈 是 强 溶 剂 Sub-2 µm( 亚 2 µm): 指 平 均 直 径 2 µm 以 下 的 多 孔 填 料 ; 目 前 的 产 品 直 径 在 1.5 到 2.0 µm 之 间 Sulfonyl cation exchanger( 磺 酰 基 阳 离 子 交 换 剂 ): 树 脂 类 填 料 上 的 强 阳 离 子 交 换 官 能 团, 一 般 为 丙 基 -SO 3H 可 能 以 阳 离 子 形 式 存 在, 如, 钠 铵 银 和 钙 Supercritical fluid chromatography (SFC)( 超 临 界 流 体 色 谱,SFC): 一 种 将 超 临 界 流 体 作 为 流 动 相 的 技 术 该 技 术 已 用 于 不 能 使 用 LC( 因 检 测 问 题 ), 或 GC( 因 挥 发 性 不 足 ) 分 析 的 物 质 的 分 离 应 用 实 例 包 括 甘 油 三 酯 碳 水 化 合 物 和 脂 肪 酸 目 前 SFC 已 可 以 同 时 应 用 HPLC 泵 和 GC 检 测 器 了 Superficial velocity (us)( 表 面 速 度,us): 当 相 同 色 谱 柱 在 未 填 充 但 流 速 相 同 的 条 件 下 操 作, 假 设 的 流 动 相 流 速 ;us = F/A c, 其 中 F 是 流 速,A c 是 柱 管 的 横 截 面 积 Superficially porous packing( 表 面 多 孔 填 料 ): 同 多 孔 层 微 球 Support( 支 持 剂 ): 指 固 体 颗 粒 在 HPLC 中, 支 持 剂 可 以 是 裸 露 的 覆 盖 涂 层 或 带 化 学 键 合 相 通 常, 固 体 支 持 剂 不 参 与 色 谱 分 离 过 程 Suppressor column( 抑 制 柱 ): 指 置 于 离 子 交 换 柱 后 的 色 谱 柱 其 目 的 是 去 除 或 抑 制 缓 冲 离 子 的 离 子 化, 从 而 使 样 品 离 子 在 电 导 检 测 器 的 弱 电 导 背 景 下 可 以 被 测 到 有 时 用 膜 抑 制 器 代 替 色 谱 柱 164

Surface area( 比 表 面 积 ): 指 吸 附 剂 固 体 表 面 的 总 面 积, 用 公 认 的 测 量 技 术 ( 如, 使 用 氮 气 吸 附 的 BET 法 ) 测 定 一 般 多 孔 吸 附 剂 ( 如, 硅 胶 ) 的 比 表 面 积 范 围 为 100 到 600 m 2 /g Surface coverage( 表 面 覆 盖 率 ): 一 般 指 键 合 在 LC 支 持 剂 上 的 单 位 面 积 固 定 相 的 质 量 常 用 毫 摩 尔 / 平 方 米 表 面 积 表 示 有 时 也 用 碳 百 分 比 表 示 Swelling-shrinking( 胀 缩 ): 树 脂 和 凝 胶 由 于 溶 剂 环 境 的 改 变 而 增 加 或 减 小 其 体 积 的 过 程 胀 缩 取 决 于 交 联 度 程 度, 低 交 联 度 的 树 脂 比 高 交 联 度 树 脂 更 容 易 胀 缩 如 果 在 填 充 柱 中 发 生 溶 胀, 将 使 柱 发 生 堵 塞, 反 压 升 高, 并 影 响 柱 效 T Tailing( 拖 尾 ): 正 常 高 斯 峰 不 对 称 因 子 大 于 1 的 现 象 该 色 谱 峰 后 缘 延 长 拖 尾 是 由 填 料 位 点 造 成 的, 溶 质 比 正 常 保 留 更 强, 并 且 具 有 解 吸 附 更 慢 拖 尾 现 象 的 一 个 典 型 离 子 是 在 中 等 ph 值 下, 低 覆 盖 率 反 相 填 料 残 留 硅 醇 基 对 氨 类 的 强 吸 附 造 成 拖 尾 的 其 它 原 因 还 包 括, 进 样 量 过 大 色 谱 柱 填 充 不 当 柱 外 体 积 过 大 不 良 接 头 检 测 器 体 积 过 大, 以 及 检 测 器 响 应 慢 等 见 143 页 图 79 Tailing factor( 拖 尾 因 子 ): 美 国 药 典 对 峰 不 对 称 性 的 描 述, 指 峰 高 5% 处 的 峰 宽 除 以 距 峰 顶 点 峰 宽 处 较 短 半 峰 宽 两 倍 的 值 大 于 1 的 为 拖 尾 峰 也 可 参 见 不 对 称 因 子 Temperature programming( 温 度 编 程 ); 在 分 离 过 程 中 柱 温 随 时 间 改 变 在 HPLC 中 很 少 使 用, 主 要 用 于 分 段 洗 脱 方 式 Ternary mobile phase( 三 元 流 动 相 ): 三 种 溶 剂 或 缓 冲 液 组 成 的 流 动 相 Theoretical plate (N)( 理 论 塔 板 数,N): 由 Martin 和 Synge 提 出 的 一 个 概 念 将 色 谱 分 离 与 蒸 馏 理 论 联 系 在 一 起 与 这 一 概 念 有 关 的 柱 长 称 为 高 度, 相 当 于 理 论 塔 板 也 可 参 见 HETP 塔 板 数 用 下 式 计 算 N = 16(V R/w b ) 2 = 16 (t R/w b ) 2, 其 中 V R 是 保 留 体 积,w b 是 色 谱 峰 峰 底 宽,t R 是 保 留 时 间, 也 可 参 见 N Thermally tuned tandem column chromatography( 热 调 谐 串 联 柱 色 谱 ): 一 种 LC 形 式, 两 根 选 择 性 完 全 不 同 的 色 谱 柱 串 联 在 一 起, 在 两 个 温 度 下 操 作, 优 化 分 离 度 或 分 析 速 度 两 根 色 谱 柱 使 用 一 种 洗 脱 液, 所 有 样 品 都 要 通 过 两 根 色 谱 柱, 然 后 用 同 一 检 测 器 检 测 这 不 是 二 维 技 术, 因 为 每 个 样 品 组 分 只 有 一 个 色 谱 峰 Titania( 二 氧 化 钛 ): 一 种 吸 附 色 谱 中 不 太 常 用 的 吸 附 剂 TIC: 总 离 子 流 色 谱 图 t m : 见 迁 移 时 间 t M : 滞 留 时 间 TOF: 一 种 质 量 分 析 器, 在 初 始 动 能 已 知 的 情 况 下, 根 据 离 子 通 过 设 定 距 离 所 需 的 时 间 来 测 量 离 子 的 质 荷 比 Tortuosity or tortuosity factor( 曲 折 度 或 曲 折 因 子 ): 填 充 柱 的 一 种 性 质, 当 溶 质 沿 色 谱 柱 轴 向 扩 散 时, 控 制 其 纵 向 扩 散 抑 制 程 度 van Deemter 方 程 中 B 项 与 曲 折 度 成 正 比 也 可 参 见 B 项 g 和 分 子 扩 散 项 Total mobile-phase volume (V t)( 流 动 相 总 体 积,V t ): SEC 柱 中 的 流 动 相 总 体 积 也 称 为 总 渗 入 体 积 同 V M Total permeation volume (V p)( 总 渗 透 体 积,V p ): SEC 填 料 的 保 留 体 积, 所 有 小 于 最 小 孔 径 的 分 子 将 被 洗 脱 换 言 之, 所 有 分 子 全 部 渗 透 到 全 部 孔 隙 中, 以 单 一 峰 被 洗 脱 同 V M Total porosity (e T)( 总 孔 隙 率,e T ): 色 谱 柱 中 流 动 相 总 体 积 与 色 谱 柱 总 体 积 的 比 值 ;e = V M/V c = e e + e i (1 - e e); 其 中 V M 是 流 动 相 体 积,V c 是 色 谱 柱 体 积 ;e e 是 颗 粒 间 隙 孔 隙 率,e i 是 颗 粒 内 孔 隙 率 Totally porous packing( 全 多 孔 填 料 ): 固 定 相 是 多 孔 基 质, 溶 质 渗 透 入 多 孔 基 质 与 固 定 相 发 生 相 互 作 用 t R : 见 保 留 时 间 t R': 见 调 整 保 留 时 间 和 保 留 时 间 165

Trace enrichment( 痕 量 富 集 ): 用 弱 流 动 相 或 溶 液 洗 脱 时, 将 痕 量 化 合 物 保 留 在 HPLC 或 预 柱 填 料 上, 然 后 再 加 入 较 强 流 动 相, 使 其 以 浓 缩 形 式 被 洗 脱 下 来, 这 种 技 术 称 为 痕 量 富 集 该 技 术 最 成 功 的 应 用 是 对 疏 水 化 合 物 的 痕 量 浓 缩, 如, 用 反 相 填 料 富 集 水 中 的 多 环 芳 烃 用 强 溶 剂 ( 如, 乙 腈 ) 洗 脱 富 集 的 化 合 物 Triethylamine( 三 乙 胺 ): 用 反 相 色 谱 分 离 碱 性 分 析 物 时, 一 种 极 为 常 用 的 屏 蔽 硅 醇 基 的 添 加 剂 Trifluoroacetic acid( 三 氟 乙 酸 ): 使 用 反 相 色 谱 分 离 多 肽 和 蛋 白 质 时 极 为 常 见 的 添 加 剂 Tryptic digestion( 胰 蛋 白 酶 裂 解 ): 一 种 有 选 择 并 可 重 复 地 切 断 蛋 白 质 肽 键 的 技 术, 得 到 可 以 用 反 相 LC 梯 度 洗 脱 分 析 的, 原 始 蛋 白 质 的 较 小 特 征 单 位 Turbulence( 湍 流 ): 流 体 流 速 在 某 点 上 下 随 机 波 动 的 状 态 也 可 参 见 雷 诺 数 和 湍 流 Turbulent flow( 湍 流 ): 一 种 流 体 运 动 形 式, 随 时 间 变 化, 液 流 不 再 平 稳, 而 是 变 得 无 序 而 波 动 其 特 征 是 压 力 降 明 显 高 于 层 流 区 获 得 同 样 体 积 流 速 产 生 的 压 力 降 Turbulent flow chromatography( 紊 流 色 谱 ): 在 使 用 高 雷 诺 数 的 条 件 下, 用 大 粒 径 填 料 以 极 高 线 性 流 速 进 行 的 色 谱 分 离 在 此 条 件 下, 在 H 对 v 的 曲 线 上,H 随 v 增 加 而 减 少 见 144 页 图 80 t w : 见 带 宽 Two-dimensional chromatography( 二 维 色 谱 ): 部 分 或 全 部 分 离 样 品 组 分 继 续 进 入 另 一 个 分 离 步 骤 的 过 程 可 以 将 从 第 一 根 色 谱 柱 洗 脱 的 特 定 组 分 导 入 第 二 根 色 谱 柱 或 具 有 不 同 分 离 特 征 的 系 统 中 包 括 二 维 TLC 等 技 术, 使 用 两 种 展 开 系 统, 将 薄 层 板 旋 转 90, 再 使 用 第 二 种 展 开 剂 也 包 括 LC 再 接 GC, 一 种 LC 模 式, 再 接 另 一 种 不 同 的 模 式, 如, 反 相 色 谱 后 面 接 SEC 也 可 参 见 多 维 色 谱 Type A silica(a 型 硅 胶 ): 由 胶 化 可 溶 性 硅 酸 盐 形 成 的 硅 胶 与 B 型 硅 胶 相 比, 通 常 具 有 较 高 的 酸 性 较 高 的 比 表 面 积 和 孔 隙 率 较 多 痕 量 金 属, 较 低 的 高 ph 稳 定 性 Type B silica(b 型 硅 胶 ): 见 溶 胶 - 凝 胶 t 0 : 见 空 隙 时 间 U u: 参 见 线 性 流 速 和 线 速 度 u e : 参 见 间 隙 流 速 u M : 参 见 流 动 相 流 速 u s : 参 见 表 面 流 速 u z : 参 见 区 域 流 速 UHPLC: 指 超 高 压 液 相 色 谱 泛 指 任 何 压 力 高 于 常 规 泵 (400 bar) 的 分 离, 原 指 在 20000 psi 以 上 进 行 的 分 离 V Vacancy chromatography( 空 穴 色 谱 ): 流 动 相 添 加 剂 造 成 检 测 器 正 输 出 信 号 的 技 术 一 种 溶 质 从 色 谱 柱 中 洗 脱 时, 将 使 该 信 号 稀 释 并 产 生 负 峰 或 空 穴 这 项 技 术 起 初 用 于 单 柱 离 子 色 谱, 其 中 柠 檬 酸 盐 和 磷 酸 盐 缓 冲 液 等 流 动 相 在 UV 区 有 吸 收 当 没 有 吸 收 的 阴 离 子 被 洗 脱 时, 将 稀 释 UV 吸 收 背 景, 产 生 一 个 负 峰 ; 检 测 器 的 输 出 一 般 设 为 反 向, 从 而 使 色 谱 图 看 起 来 为 正 向 这 一 技 术 也 已 应 用 于 CE 检 测 中 van Deemter equation(van Deemter 方 程 ): 用 于 解 释 色 谱 中 峰 展 宽 的 方 程 该 方 程 提 出 了 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 的 概 念 并 由 三 项 进 行 描 述 A 项 描 述 的 是 由 轴 向 流 速 不 均 匀 导 致 的 涡 流 分 散 或 扩 散 B 项 反 映 的 是 流 经 色 谱 柱 的 溶 质 分 子 扩 散 或 纵 向 扩 散 对 峰 展 宽 的 影 响 C 项 是 固 定 相 内 传 质 对 峰 展 宽 的 影 响, 将 溶 质 在 固 定 相 和 流 动 相 之 间 的 有 限 速 度 考 虑 在 内 其 最 简 单 的 表 达 是,h = A + B/v + Cv 也 可 参 见 折 合 塔 板 高 度 和 折 合 流 速 V c : 参 见 柱 体 积 V d : 参 见 死 体 积 V e : 参 见 间 隙 体 积 Velocity (u)( 线 速 度 ): 同 线 速 度 v eo : 参 见 电 渗 流 V i : 参 见 颗 粒 内 体 积 166

Viscosity (h)( 粘 度,h): 也 称 为 流 动 相 粘 度 流 动 相 粘 度 随 色 谱 柱 温 度 而 改 变 低 粘 度 流 动 相 通 常 比 粘 度 较 差 的 流 动 相 提 供 更 高 的 柱 效, 因 为 扩 散 因 子 与 溶 剂 粘 度 呈 负 相 关 例 如, 反 相 色 谱 中, 使 用 乙 腈 作 为 改 性 剂 比 用 异 丙 醇 柱 效 高, 因 为 后 者 粘 性 更 大 柱 反 压 直 接 与 溶 剂 粘 度 成 正 比 V M : 参 见 滞 留 体 积 也 可 参 见 流 动 相 体 积 Void( 空 隙 ): 通 常 是 在 柱 头 形 成 的 空 隙 或 间 隙, 由 柱 填 料 沉 降 或 溶 解 产 生 色 谱 柱 中 的 空 隙 导 致 了 柱 效 降 低 和 分 离 度 损 失 即 便 是 小 空 隙, 对 小 粒 径 色 谱 柱 也 将 是 灾 难 性 的 有 时 空 隙 可 以 用 玻 璃 微 球 或 色 谱 柱 中 使 用 的 相 同 多 孔 填 料 填 充 Void time (t 0)( 空 隙 时 间,t 0 ): 不 保 留 峰 的 洗 脱 时 间 ; 也 称 死 时 间 和 滞 留 时 间 (t M) 空 隙 体 积 由 空 隙 时 间 乘 以 流 速 测 得 Void volume (V M)( 空 隙 体 积,V M ): 色 谱 柱 中 流 动 相 的 总 体 积 ; 色 谱 柱 的 其 余 部 分 为 填 料 该 体 积 可 以 用 进 样 不 保 留 物 质 测 定 也 称 死 体 积 常 用 符 号 V 0 表 示 空 隙 体 积 这 只 能 用 于 填 充 非 多 孔 填 料 的 色 谱 柱 用 V 0 可 以 表 示 SEC 中 的 排 阻 体 积 (V e) V p : 参 见 总 渗 透 体 积 V R : 参 见 保 留 体 积 和 洗 脱 体 积 V R': 参 见 调 整 保 留 时 间 V t : 参 见 总 流 动 相 体 积 V o : 参 见 排 阻 体 积 W Wall effect( 管 壁 效 应 ): 刚 性 HPLC 柱 管 壁 附 近 填 料 密 度 松 散 造 成 引 起 的 后 果 由 于 局 部 渗 透 性 增 加, 流 动 相 靠 管 壁 附 近 的 流 速 有 稍 微 加 快 的 趋 势 了 管 壁 附 近 的 溶 质 分 子 比 溶 质 峰 的 平 均 移 动 速 度 快, 因 而 造 成 峰 变 宽, 以 及 柱 效 损 失 WCX: 见 弱 阳 离 子 交 换 剂 Weak anion exchanger( 弱 阴 离 子 交 换 剂 ): 带 弱 碱 性 离 子 基 团 的 阴 离 子 交 换 填 料, 如 氨 基 DEAE Weak cation exchanger( 弱 阳 离 子 交 换 剂 ): 带 弱 酸 性 离 子 基 团 ( 如, 羧 酸 基 ) 的 阳 离 子 交 换 填 料 Weak solvent( 弱 溶 剂 ): 通 常 指 对 化 合 物 溶 解 性 差 的 溶 剂 ; 在 色 谱 中, 指 提 供 低 溶 剂 强 度 使 分 析 物 从 色 谱 柱 中 洗 脱 较 慢 的 流 动 相 组 分, 在 反 相 LC 的 水 - 乙 腈 二 元 溶 剂 系 统 中, 水 被 认 为 是 弱 溶 剂 Wilke-Chang equation(wilke-chang 方 程 ): 用 于 估 算 扩 散 系 数 的 半 经 验 方 程, 溶 质 分 子 大 小 和 溶 液 粘 度 对 液 体 的 影 响 X Xerogels( 干 凝 胶 ):SEC 中 使 用 的 在 不 同 溶 剂 中 胀 缩 的 凝 胶 也 指 用 可 溶 性 硅 酸 盐 酸 化 制 备 的 硅 胶 基 填 料, 为 无 定 形 高 比 表 面 积 高 孔 隙 率 的 刚 性 颗 粒 Z Zero dead volume( 零 死 体 积 ): 接 头 或 组 件 没 有 洗 脱 液 未 及 的 体 积 Zirconia( 二 氧 化 锆 ): 多 孔 氧 化 锆 作 为 色 谱 吸 附 剂 使 用, 通 常 用 聚 合 有 机 固 定 相 覆 盖 或 键 合 Zone: 参 见 谱 带 Zone velocity (u z)( 区 带 速 度,u z ): 溶 质 区 带 移 动 的 速 度 ;u z = u M/(1 + k) = L/t R, 其 中 u M 为 流 动 相 速 度,k 为 保 留 因 子,L 为 柱 长,t R 为 保 留 时 间 Zwitterions( 两 性 离 子 ): 在 溶 液 中 既 带 正 电 荷 又 带 负 电 荷 的 化 合 物 WAX: 见 弱 阴 离 子 交 换 剂 w b : 见 峰 宽 167

词 汇 表 参 考 文 献 1:R.E. Majors and P.W. Carr, LCGC 19 (2) 124-162 (2001). 2: 'Nomenclature for Chromatography', Pure and Appl. Chem. 65 (4), 819-872 (1993). 3: J.P. Foley and J.G. Dorsey, Anal. Chem. 55, 730-737 (1983) 4: L.R. Snyder, P.W., Carr, and S.C. Rutan, J. Chromatogr. A 656, 537 (1993). 词 汇 表 作 者 Peter W. Carr: Peter W. Carr 是 明 尼 苏 达 大 学 (207 Pleasant Street SE, Minneapolis, MN 55455-0431) 化 学 系 的 化 学 教 授,LCGC 的 常 务 编 委 Ronald E. Majors: Ronald E. Majors 是 Column Watch 和 Sample Prep Perspectives 的 主 编 Ronald E. Majors 是 安 捷 伦 科 技 公 司 (Wilmington, Delaware) 生 命 科 学 与 化 学 分 析 部, 色 谱 柱 与 消 耗 品 部 门 的 资 深 化 学 家, 也 是 LCGC 的 常 务 编 委 致 谢 特 别 感 谢 参 与 本 书 编 撰 的 安 捷 伦 色 谱 工 作 人 员 : 样 品 前 处 理 产 品 经 理 Paul Boguszewski Aaron Boice,LC/Q-TOF 产 品 经 理 LC 柱 技 术 支 持 专 家 William Champion 应 用 化 学 家 John W. Henderson LC 柱 市 场 战 略 经 理 Maureen Joseph 博 士 小 分 子 LC 柱 产 品 经 理 Jason Link 博 士 大 分 子 LC 柱 产 品 经 理 Linda Lloyd 博 士 LC 资 深 应 用 科 学 家 William Long 博 士 Anne Mack, 小 分 子 液 相 色 谱 柱 应 用 科 学 家 资 深 科 学 家 Ron Majors 博 士 Maggie Ostrowski,GC/MS 和 LC/MS 单 四 极 杆 产 品 经 理 LC 柱 技 术 支 持 专 家 Rita Steed Lester Taylor, 小 分 子 制 药 市 场 经 理 Martin Vollmer 博 士, 分 析 型 和 制 备 型 HPLC 营 销 经 理 LC 和 LC/MS 应 用 专 家 Michael Woodman 168

索 引 性 能 影 响 因 素 索 引 保 留 螯 合 化 合 物...52 保 留 因 子...7 等 度 优 化... 79, 85-86 方 法 开 发... 65-67, 86 分 离 度...8 固 定 相 改 性... 53, 68-71 故 障 排 除... 68, 76-79, 117-119, 121, 123-124 聚 合 物 色 谱 柱...84 LC/MS...73 流 动 相 选 择...68 色 谱 柱 老 化...57 色 谱 柱 选 择...64 数 据 采 集 速 率...46 梯 度...54 梯 度 公 式... 10-11 梯 度 优 化...82 UHPLC...29 USP 指 定 产 品...130 优 化 色 谱 柱 重 新 平 衡... 55-56 正 相... 93-94 滞 后 体 积...49 泵 13 等 度...15 二 元...14 溶 剂 混 合...14 四 元...15 压 力 范 围...13 延 迟 体 积...16 方 法 转 移 55, 87, 115 分 离 度 8-9 保 护 柱...115 保 留 因 子...7 等 度 优 化... 80-81, 85 方 法 开 发...60 固 定 相 改 性... 69-71 固 定 相 选 择...66 故 障 排 除...68, 74-78, 87, 120 LC/MS...31 色 谱 柱 规 格...35 色 谱 柱 老 化...57 梯 度 优 化... 83-84 填 料 粒 径...34 UHPLC... 13, 30, 113 USP 指 定 产 品...126 药 物 应 用...67 正 相...93, 94 滞 后 体 积... 16, 51, 52, 119 柱 外 体 积...16, 40 故 障 排 除 120 保 留... 123-124 峰 形...97 固 定 相 改 性 剂... 74, 76-77 基 线...74-75, 124-125 流 动 相... 68-69 压 力...121 缓 冲 液 ( 另 请 参 见 流 动 相 ) 56, 58-59, 68, 70, 71, 73, 74, 86, 102-103, 113, 135 检 测 单 四 极 杆 质 谱...99 二 极 管 阵 列...23, 25 飞 行 时 间 质 谱...99 离 子 化...101 灵 敏 度...24,97 溶 剂 / 缓 冲 液 选 择... 71, 102, 110 软 件... 106-107 三 重 四 极 杆 质 谱...99, 100 数 据 采 集 速 率...25, 105 169

稀 释 剂 强 度...123 线 性 范 围...24, 98 效 率...5-8, 10-11, 30 在 线 过 滤 器...89, 157 质 谱...22, 97 柱 外 体 积... 16, 40, 48, 88 紫 外 (UV)...22-23, 24, 25, 71, 73, 97, 124 接 头 与 连 接 A-Line Quick Connect 快 速 连 接 色 谱 柱 接 头...16 不 锈 钢... 高 压... 故 障 排 除... 116, 122, 124 接 头 类 型...44 聚 合 物...43 可 重 复 使 用...43 Parker...42 PEEK( 聚 酮 )...43 如 何 实 现 正 确 的 接 头 连 接...42 Swagelok...88 死 体 积...28 正 确 使 用... 42-45 进 样 45 故 障 排 除... 68, 76, 120-125 交 叉 污 染...20 缩 放 谱 图 ( 梯 度 )...89 自 动 进 样 器... 17-21 流 动 相 变 化... 68-69, 73 故 障 排 除... 68-69 混 合...13-15, 68, 69, 73, 119, 125 LC/MS... 71, 102-103 强 度...10, 78, 79 UHPLC...13, 113 选 择 改 性 剂 / 缓 冲 液... 53, 71, 135 选 择 溶 剂... 68, 102-103 正 相...93 毛 细 管 16, 22, 88, 105, 178, 181-182 ph 53, 69-74, 76, 77, 84, 119 容 量 因 子 7, 8, 57 溶 剂 安 全 盖 185 溶 剂 效 应 46, 123 色 谱 柱 螯 合... 39, 52-53 表 面 多 孔...26, 30, 60 储 存... 115-117 规 格... 27, 28, 35, 64, 78, 83, 123 老 化... 39, 57, 124 平 衡 / 重 新 平 衡...55-56, 117, 118, 123 维 护...115 选 择... 28, 62-63, 121 延 长 寿 命... 36-37, 116 柱 温 箱...21 数 据 采 集 速 率 25, 39, 46-47, 87, 105, 123 梯 度 Agilent 1290 LC...89 安 捷 伦 方 法 转 换 软 件...46 操 作... 54-56 多 肽 / 蛋 白 质 应 用...75 反 相...84 方 法 开 发...61 固 定 相 选 择... 65-66 故 障 排 除... 74, 120-125 磺 胺 类 药 物 应 用...83 聚 合 物 色 谱 柱...84 离 子 交 换...95 溶 剂 饱 和...115 色 谱 柱 清 洗...57 缩 放 谱 图...89 梯 度 公 式... 10-11 优 化... 78, 82-83 无 人 值 守 系 统...81 正 相...93 滞 后 体 积... 48, 49, 51, 52, 119 170

脱 气 13-15, 69 USP 指 定 产 品 126-131 选 择 性 保 留 因 子...7 等 度 优 化... 79-81, 85 方 法 重 现 性... 118-119 方 法 转 移...87 分 离 度...8 分 离 因 子... 7-8 固 定 相 改 性... 69-70, 135 故 障 排 除... 76, 117, 120-123 聚 合 物 色 谱 柱...84 LC/MS...72 流 动 相 选 择...68 色 谱 柱 老 化...57 色 谱 柱 特 性...33 色 谱 柱 选 择... 64-66 梯 度 优 化...82 效 率...6 选 择 性 公 式... 7-8 选 择 性 因 子... 7-8 压 力 公 式 9, 30, 121 延 迟 ( 滞 后 ) 体 积 14-16, 18, 21, 49-50, 52, 89, 189 样 品 前 处 理 103, 109 van Deemter 曲 线 10, 88 产 品 索 引 C18 固 定 相 Polaris Amide-C18...131 Polaris C18-A...127 Polaris C18-Ether...127 Poroshell 120 EC-C18...127 Poroshell 120 SB-C18...127 Pursuit C18...127 Pursuit XRs C18...127 SepTech ST150 C18...127 SepTech ST60 C18...127 ZORBAX 300SB-C18...127 ZORBAX Eclipse Extend-C18 ZORBAX Eclipse Plus C18... 76, 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse XDB-C18...92, 127 ZORBAX Extend-C18... 77, 86, 122, 127 ZORBAX RRHD SB-C18...105 ZORBAX Rx-C18...127 ZORBAX SB-C18...46, 127 C3 固 定 相 ZORBAX 300SB-C3...75 ZORBAX SB-C3...131 C8 固 定 相 Polaris C8-A...128 Polaris C8-Ether...128 Poroshell 120 EC-C8...128 Pursuit C8...128 Pursuit XRs C8...128 ZORBAX C8...128 ZORBAX Eclipse Plus C8...128 ZORBAX Eclipse XDB-C8...128 ZORBAX Rx-C8...128 ZORBAX SB-C8...128 ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8...48 HILIC 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse XDB-C18...92, 127 ZORBAX Rx-SIL...92, 127 HPLC 卡 套 柱 36 ChromSep...36 Dynamax 制 备 柱...37 Load & Lock 制 备 柱...37 PLRP-S...37 PL-SAX...37 171

PL-SCX 3...7 ZORBAX RR...36 ZORBAX RRHT...36 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱...37 ZORBAX 保 护 卡 套 柱...36 LC/MS Agilent 溶 剂 节 省 柱...31 PLRP-S... 33, 37, 67, 129 ZORBAX Eclipse XDB-C18...92, 127 ZORBAX 快 速 分 离 高 通 量 卡 套 柱 ZORBAX Rx-SIL 9...2, 127 UHPLC Poroshell 120...30, 31 ZORBAX RRHD...30 ZORBAX RRHT...30 氨 基 固 定 相 Polaris Amide-C18...131 Polaris NH2...128 ZORBAX NH2...128 保 护 柱 ZORBAX 半 制 备 保 护 柱 ZORBAX 保 护 卡 套 柱...36 苯 基 固 定 相 Pursuit Diphenyl...128 Pursuit PFP...130 Pursuit XRs Diphenyl...128 ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl...128 ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX Phenyl ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 灯 183 反 相 色 谱 柱 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱...127 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱...131 Bio SEC-3...130 Bio SEC-5...130 IonSpher C...131 LiChrospher Diol...129 PL aquagel-oh...130 PLgel MIXED-D...96 PLgel...129 PLRP-S... 33, 37, 67, 129 Polaris C18-A...127 Polaris C18-Ether...127 Polaris C8-A...128 Polaris C8-Ether...128 Polaris Si-A...127 Poroshell 120 Bonus-RP...131 Poroshell 120 EC-C18...127 Poroshell 120 EC-C8...128 Poroshell 120 PFP...130 Poroshell 120 SB-C18...127 Poroshell 120...30, 31, 40, 66, 77, 84-88, 110 Poroshell 300...31 Poroshell HPH-C18...127 Poroshell HPH-C8...128 ProSEC...130 Pursuit C18...127 Pursuit C8...128 Pursuit Diphenyl...128 Pursuit PFP...130 Pursuit XRs C18...127 Pursuit XRs C8...128 Pursuit XRs Diphenyl...128 Pursuit XRs Si...127 SepTech ST150 C18...127 SepTech ST60 C18...127 Ultron ES-OVM...131 ZORBAX 300SB-C18...66, 127 ZORBAX 300SB-C3...75 ZORBAX C8...128 ZORBAX Eclipse Extend-C18 172

ZORBAX Eclipse Plus C18... 76, 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse Plus C8...128 ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl...128 ZORBAX Eclipse Plus... 76, 85-86 ZORBAX Eclipse XDB Phenyl...128 ZORBAX Eclipse XDB...92 ZORBAX Eclipse XDB-C18...127 ZORBAX Eclipse XDB-C8...128 ZORBAX Extend-C18... 77, 86, 122, 127 ZORBAX GF-250...130 ZORBAX GF-450...130 ZORBAX ODS 经 典...127 ZORBAX ODS...127 ZORBAX Phenyl ZORBAX RRHD ZORBAX RRHD SB-C18...105 ZORBAX RRHT...67 ZORBAX Rx-C18...127 ZORBAX Rx-C8...128 ZORBAX SB-C18... 45, 46, 127 ZORBAX SB-C3...131 ZORBAX SB-C8...55, 128 ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 ZORBAX SIL...127 ZORBAX StableBond...76 ZORBAX TMS...129 ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8...48 硅 胶 柱 IonSpher C...131 Polaris C18-A...127 Polaris C18-Ether...127 Polaris C8-A...128 Polaris C8-Ether...128 Polaris Si-A...127 Poroshell 120 EC-C18...127 Poroshell 120 EC-C8...128 Poroshell 120 SB-C18...128 Poroshell 120...30, 31, 40, 66, 77, 84-88, 110 Poroshell 300...31 Pursuit C18...127 Pursuit C8...128 Pursuit Diphenyl...128 Pursuit PFP...130 Pursuit XRs C18...127 Pursuit XRs C8...128 Pursuit XRs Diphenyl...128 Pursuit XRs Si...127 Ultron ES-OVM...131 ZORBAX 300SB-C18...66, 127 ZORBAX 300SB-C3...75 ZORBAX Bonus-RP ZORBAX C8...128 ZORBAX Eclipse Extend-C18 ZORBAX Eclipse Plus C18... 76, 86, 104, 110, 127 ZORBAX Eclipse Plus C8...128 ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl...128 ZORBAX Eclipse Plus... 76, 85-86 ZORBAX Eclipse XDB...92 ZORBAX Eclipse XDB-C18...92, 127 ZORBAX Eclipse XDB-C8...128 ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl ZORBAX Extend-C18... 77, 86, 122, 127 ZORBAX GF-250...130 ZORBAX GF-450...130 ZORBAX ODS 经 典...127 ZORBAX ODS...127 ZORBAX RRHD SB-C18...105 ZORBAX RRHT...67 ZORBAX Rx-C18...127 ZORBAX Rx-C8...128 ZORBAX SB-C18... 45, 46, 127 ZORBAX SB-C3...131 ZORBAX SB-C8...55, 128 ZORBAX SB-Phenyl...53, 128 ZORBAX SIL...127 ZORBAX StableBond...76 173

ZORBAX TMS...129 ZORBAX 快 速 分 离 Eclipse XDB-C8...48 过 滤 器 1200 RRLC...114 1260 Infinity LC...188 1290 Infinity LC...114 HPLC 卡 套 柱...36 检 测 器 1290 Infinity II 二 极 管 阵 列...25 6000 系 列 LC/MS...99 聚 合 物 色 谱 柱 Bio SEC-3...130 Bio SEC-5...130 Hi-Plex Ca (Duo)...129 Hi-Plex Ca...129 Hi-Plex H...129 Hi-Plex Na (Octo)...131 Hi-Plex Na...131 Hi-Plex Pb...130 PL aquagel-oh...130 PLgel MIXED-D...96 PLgel...129 PLRP-S... 33, 37, 67, 129 PL-SAX...37 PL-SCX...37 ProSEC...130 SepTech ST150 C18...127 SepTech ST60 C18...127 卡 套 系 统 色 谱 柱 离 子 交 换 色 谱 柱 Bio SAX...131 Hi-Plex Ca (Duo)...129 Hi-Plex Ca...129 Hi-Plex H...129 Hi-Plex Na (Octo)...131 Hi-Plex Na...131 Hi-Plex Pb...130 PL-SAX...37 PL-SCX...37 ZORBAX 300SCX...130 ZORBAX SAX...129 ZORBAX SCX...128 氰 基 固 定 相 ZORBAX CN...128 ZORBAX Eclipse XDB-CN...128 ZORBAX SB-CN...128 筛 板 Poroshell 120...30 手 性 柱 ChiraDex 手 性 柱...130 体 积 排 阻 色 谱 柱 Bio SEC-3...130 Bio SEC-5...130 PL aquagel-oh...130 PLgel MIXED-D...96 PLgel...129 ProSEC...130 液 相 色 谱 仪 1100 LC...93 1200 RRLC...50, 114 1200SL...52 1260 Infinity LC...188 1290 Infinity II LC...13 1290 Infinity LC...106, 114 正 相 色 谱 柱 Polaris Amide-C18...131 Polaris NH2...128 ZORBAX CN...128 ZORBAX Eclipse XDB-CN...128 ZORBAX NH2...128 ZORBAX Rx-SIL...92, 127 ZORBAX SB-CN...128 174

产 品 与 订 购 信 息 在 下 面 几 页 中, 我 们 选 择 了 一 些 产 品 用 以 进 行 突 出 并 提 供 给 您 快 速 参 考 部 件 号 安 捷 伦 液 相 色 谱 柱 Poroshell 120 色 谱 柱 帮 助 您 在 任 何 高 效 液 相 色 谱 / 超 高 压 液 相 色 谱 上 获 得 更 高 效 率 和 分 析 速 度 参 见 30-32 页 获 得 更 多 信 息 Poroshell 120 - 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) Eclipse Plus EC-C18 (USP L1) Eclipse Plus EC-C8 (USP L7) Eclipse Plus EC-CN StableBond SB-C18 (USP L1) StableBond SB-C8 (USP L7) 分 析 柱 4.6 x 150 693975-902 693975-906 693975-905 683975-902 683975-906 分 析 柱 4.6 x 100 695975-902 695975-906 695975-905 685975-902 685975-906 分 析 柱 4.6 x 75 697975-902 697975-906 687975-902 分 析 柱 4.6 x 50 699975-902 699975-906 699975-905 689975-902 689975-906 分 析 柱 4.6 x 30 691975-902 691975-906 681975-902 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 693975-302 693975-306 693975-305 683975-302 683975-306 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 100 695975-302 695975-306 695975-305 685975-302 685975-306 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 75 697975-302 697975-306 687975-302 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 50 699975-302 699975-306 699975-305 689975-302 689975-306 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 30 691975-302 691975-306 681975-302 窄 径 柱 2.1 x 150 693775-902 693775-906 693775-905 683775-902 683775-906 窄 径 柱 2.1 x 100 695775-902 695775-906 695775-905 685775-902 685775-906 窄 径 柱 2.1 x 75 697775-902 697775-906 687775-902 窄 径 柱 2.1 x 50 699775-902 699775-906 699775-905 689775-902 689775-906 窄 径 柱 2.1 x 30 691775-902 691775-906 681775-902 Fast Guard 4.6 x 5 820750-911 820750-912 Fast Guard 3.0 x 5 823750-911 823750-912 Fast Guard 2.1 x 5 821725-911 821725-912 转 下 页 175

Poroshell 120 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) StableBond SB-Aq Phenyl-Hexyl (USP L11) Bonus-RP (USP L60) HILIC 分 析 柱 4.6 x 150 683975-914 693975-912 693968-901 693975-901 分 析 柱 4.6 x 100 685975-914 695975-912 695968-901 695975-901 分 析 柱 4.6 x 50 689975-914 699975-912 699968-901 699975-901 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 683975-314 693975-312 693968-301 693975-301 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 100 685975-314 695975-312 695968-301 695975-301 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 50 689975-314 699975-312 699968-301 699975-301 窄 径 柱 2.1 x 150 683775-914 693775-912 693768-901 693775-901 窄 径 柱 2.1 x 100 685775-914 695775-912 695768-901 695775-901 窄 径 柱 2.1 x 50 689775-914 699775-912 699768-901 699775-901 新 型 Poroshell 120 粒 径 2.7 µm 尺 寸 新 型 新 型 新 型 (mm) HPH-C18 HPH-C8 PFP 分 析 柱 4.6 x 150 683975-702 693975-706 693975-408 分 析 柱 4.6 x 100 685975-702 695975-706 695975-408 分 析 柱 4.6 x 50 689975-702 699975-706 699975-408 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 683975-702 693975-706 693975-408 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 100 685975-702 695975-706 695975-408 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 50 689975-702 699975-706 699975-408 窄 径 柱 2.1 x 150 683775-702 693775-706 693775-408 窄 径 柱 2.1 x 100 685775-702 695775-706 695775-408 窄 径 柱 2.1 x 50 689775-702 699775-706 699775-408 Poroshell 120 粒 径 4 µm 尺 寸 (mm) EC-C18 EC-C8 PFP Phenyl-Hexyl HILIC 分 析 柱 4.6 x 250 690970-902 690970-906 690970-408 690970-912 690970-901 分 析 柱 4.6 x 150 693970-902 693970-906 693970-408 693970-912 693970-901 分 析 柱 4.6 x 100 695970-902 695970-906 695970-408 695970-912 695970-901 分 析 柱 4.6 x 50 699970-902 699970-906 699970-408 699970-912 699970-901 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 250 690970-302 690970-306 690970-308 690970-312 690970-301 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 693970-302 693970-306 693970-308 693970-312 693970-301 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 100 695970-302 695970-306 695970-308 695970-312 695970-301 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 50 699970-302 699970-306 699970-308 699970-312 699970-301 转 下 页 176

Poroshell 120 粒 径 4 µm 尺 寸 EC-C18 EC-C8 PFP Phenyl-Hexyl HILIC (mm) 窄 径 柱 2.1 x 250 650750-902 650750-906 650750-408 650750-912 650750-901 窄 径 柱 2.1 x 150 693770-902 693770-906 693770-408 693770-912 693770-901 窄 径 柱 2.1 x 100 695770-902 695770-906 695770-408 695770-912 695770-901 窄 径 柱 2.1 x 50 699770-902 699770-906 699770-408 699770-912 699770-901 Poroshell 120 保 护 柱 粒 径 4 µm 描 述 尺 寸 (mm) 部 件 号 Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C18 4.6 820750-916 Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C18 3 823750-916 Poroshell 120 UHPLC 保 护 柱,EC-C18 2.1 821725-916 我 们 将 继 续 开 发 更 多 Poroshell 120 固 定 相 如 需 完 整 列 表, 请 访 问 www.agilent.com/chem/poroshell120 如 需 安 捷 伦 色 谱 柱 的 完 整 产 品 清 单, 请 访 问 www.agilent.com/chem/getguides 索 取 最 新 的 安 捷 伦 色 谱 与 光 谱 产 品 目 录 AdvanceBio 肽 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 2.7 µm 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 分 析 柱 4.6 x 150 653950-902 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 653950-302 窄 径 柱 2.1 x 250 651750-902 窄 径 柱 2.1 x 150 653750-902 窄 径 柱 2.1 x 100 655750-902 快 速 保 护 柱 * 4.6 850750-911 快 速 保 护 柱 * 3.0 853750-911 快 速 保 护 柱 * 2.1 851725-911 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 2.7 µm 表 面 多 孔, 耐 压 达 600 bar 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 分 析 柱 4.6 x 250 680975-913 分 析 柱 4.6 x 150 683975-913 分 析 柱 4.6 x 100 685975-913 窄 径 柱 2.1 x 250 651750-913 窄 径 柱 2.1 x 150 683775-913 窄 径 柱 2.1 x 100 685775-913 快 速 保 护 柱 2.7, 2.1 821725-906 AdvanceBio 糖 谱 分 析 色 谱 柱 粒 径 1.8 µm 耐 压 达 1200 bar 尺 寸 (mm) AdvanceBio 色 谱 柱 窄 径 柱 2.1 x 150 859700-913 窄 径 柱 2.1 x 100 858700-913 快 速 保 护 柱 2.1, 1.8 821725-905 有 关 Agilent Advanced Bio 的 更 多 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/advancebio 177

安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX 超 高 压 快 速 高 分 辨 (RRHD) 柱, 在 高 达 1200 Bar 下 稳 定 Eclipse Plus C18 (USP L1) Eclipse Plus C8 (USP L7) Eclipse XDB-C18 (USP L1) Extend-C18 (USP L1) RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 959759-902 959759-906 981759-902 759700-902 RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm 959758-902 959758-906 981758-902 758700-902 RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 959757-902 959757-906 981757-902 757700-902 RRHD, 3.0 x 150 mm, 1.8 µm 959759-302 959759-306 981759-302 RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm 959758-302 959758-306 981758-302 758700-302 RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm 959757-302 959757-306 981757-302 757700-302 StableBond SB- C18 (USP L1) StableBond SB-C8 (USP L7) StableBond SB-Phenyl (USP L11) StableBond SB-CN (USP L10) RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 859700-902 859700-906 859700-912 859700-905 RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm 858700-902 858700-906 858700-912 858700-905 RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 857700-902 857700-906 857700-912 857700-905 RRHD 3.0 x 150 mm, 1.8 µm 859700-302 859700-306 RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm 858700-302 858700-306 858700-312 858700-305 RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm 857700-302 857700-306 857700-312 857700-305 Eclipse PAH (USP L1) StableBond SB-Aq HILIC Plus Eclipse Plus Phenyl-Hexyl RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 959759-918 859700-914 959759-901 959759-912 RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm 959758-918 858700-914 959758-901 959758-912 RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 959757-918 857700-914 959757-901 959757-912 RRHD 3.0 x 100 mm, 1.8 µm 959758-318 858700-314 959758-301 959758-312 RRHD 3.0 x 50 mm, 1.8 µm 959757-318 857700-314 959757-301 959757-312 Bonus-RP RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 857768-901 858768-901 859768-901 我 们 还 将 继 续 开 发 更 多 RRHD 固 定 相 如 需 可 提 供 部 件 号 的 全 部 列 表, 请 访 问 www.agilent.com/chem/rrhd 用 于 蛋 白 质 和 多 肽 分 析 的 300Å 色 谱 柱 StableBond StableBond StableBond 300-300-HILIC 300SB-C18 300SB-C8 300SB-C3 (USP L56) Diphenyl (USP L11) RRHD 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 857750-909 857750-944 857750-901 RRHD 2.1 x 100 mm, 1.8 µm 858750-902 858750-906 858750-909 858750-944 858750-901 RRHD 2.1 x 150 mm, 1.8 µm 857750-902 857750-906 178

安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Plus 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus C18 (USP L1) Eclipse Plus C8 (USP L7) Eclipse Plus Phenyl-Hexyl Eclipse Plus PAH (USP L1) (USP L11) 分 析 柱 4.6 x 250 5 959990-902 959990-906 959990-912 959990-918 分 析 柱 4.6 x 150 5 959993-902 959993-906 959993-912 959993-918 分 析 柱 4.6 x 100 5 959996-902 959996-906 959996-912 959996-918 分 析 柱 4.6 x 50 5 959946-902 959946-906 快 速 分 离 柱 4.6 x 150 3.5 959963-902 959963-906 959963-912 959963-918 快 速 分 离 柱 4.6 x 100 3.5 959961-902 959961-906 959961-912 959961-918 快 速 分 离 柱 4.6 x 75 3.5 959933-902 959933-906 959933-902 快 速 分 离 柱 4.6 x 50 3.5 959943-902 959943-906 959943-912 959943-918 快 速 分 离 柱 4.6 x 30 3.5 959936-902 959936-906 959936-912 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x 100 1.8 959964-902 959964-906 959964-912 959964-918 600 bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x 75 1.8 959951-902 600 bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x 50 1.8 959941-902 959941-906 959941-912 959941-918 600 bar 快 速 分 离 高 通 量 柱, 4.6 x 30 1.8 959931-902 959931-906 959931-912 959931-918 600 bar 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 250 5 959990-318 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 5 959993-302 959993-306 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 150 3.5 959963-302 959963-306 959963-312 溶 剂 节 省 柱 3.0 x 100 3.5 959961-302 959961-306 959961-312 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x 150 1.8 959759-302 959759-306 1200 bar 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x 100 1.8 959758-302 959758-306 1200 bar 溶 剂 节 省 RRHD 柱, 3.0 x 50 1.8 959757-302 959757-306 1200 bar 溶 剂 节 省 高 通 量 柱, 3.0 x 100 1.8 959964-302 959964-306 959964-312 600 bar 溶 剂 节 省 高 通 量 柱, 3.0 x 50 1.8 959941-302 959941-306 959941-312 600 bar 窄 径 柱 2.1 x 250 5 959790-918 窄 径 柱 2.1 x 150 5 959701-902 959701-906 959701-912 959701-918 窄 径 柱 2.1 x 50 5 959746-902 959746-906 转 下 页 179

安 捷 伦 液 相 色 谱 色 谱 柱 ZORBAX Eclipse Plus 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus C18 (USP L1) C8 (USP L7) Phenyl-Hexyl PAH (USP L1) (USP L11) 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 150 3.5 959763-902 959763-906 959763-912 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 100 3.5 959793-902 959793-906 959793-912 959793-918 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 50 3.5 959743-902 959743-906 959743-912 窄 径 快 速 分 离 柱 2.1 x 30 3.5 959733-902 959733-906 959733-912 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHD 柱, 1200 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 窄 径 RRHT 柱, 600 Bar 2.1 x 150 1.8 959759-902 959759-906 2.1 x 100 1.8 959758-902 959758-906 2.1 x 50 1.8 959757-902 959757-906 2.1 x 100 1.8 959764-902 959764-906 959764-912 959764-918 2.1 x 50 1.8 959741-902 959741-906 959741-912 959741-918 2.1 x 30 1.8 959731-902 959731-906 959731-912 ZORBAX Eclipse Plus: 保 护 柱 卡 套 尺 寸 (mm) 粒 径 (µm) Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus Eclipse Plus C18 (USP L1) C8 (USP L7) Phenyl-Hexyl PAH (USP L1) (USP L11) 保 护 柱 卡 套,4/ 包 4.6 x 12.5 5 820950-936 820950-937 820950-938 820950-939 保 护 柱 卡 套,4/ 包 2.1 x 12.5 5 821125-936 821125-937 821125-938 821125-939 保 护 柱 硬 件 工 具 包 820999-901 820999-901 820999-901 820999-901 以 上 只 是 固 定 相 和 色 谱 柱 的 部 分 列 表 安 捷 伦 具 有 一 系 列 BioHPLC 色 谱 柱, 可 快 速 准 确 的 分 离 蛋 白 质 和 多 肽 如 需 可 提 供 部 件 号 的 完 整 列 表, 请 访 问 www.agilent.com/chem/getguides 索 取 最 新 的 安 捷 伦 色 谱 与 光 谱 产 品 目 录 或 BioHPLC 色 谱 柱 选 择 指 南 180

安 捷 伦 毛 细 管 和 接 头 为 您 的 应 用 选 择 合 适 的 毛 细 管 使 用 合 适 的 毛 细 管 对 于 得 到 最 佳 分 析 性 能 至 关 重 要 下 表 是 推 荐 用 于 传 统 高 效 液 相 色 谱 和 超 高 压 液 相 色 谱 系 统 的 接 头 标 准 系 统 毛 细 管 柱 :1290 系 列 - 1200 Bar 起 始 端 (A) 结 束 端 (B) 材 料 内 径 (mm) 长 度 (mm) 接 头 类 型 起 始 端 接 头 类 型 结 束 端 备 注 部 件 号 泵 自 动 进 样 器 SS 0.17 300 S S A 和 B 上 已 预 装 配 5067-4657 泵 恒 温 自 动 进 样 器 SS 0.17 450 S S A 和 B 上 已 预 装 配 5067-4658 自 动 进 样 器 TCC SS 0.12 340 S S A 上 已 预 装 配 5067-4659 色 谱 柱 DAD SS 0.12 220 S S A 上 已 预 装 配 5067-4660 1290 系 统 CTC 自 动 进 样 器 CTC 自 动 进 样 器 SS 0.17 600 S SH A 上 已 预 装 配 5067-4670 色 谱 柱 SS 0.12 600 S S 5067-4669 检 测 器 废 液 容 器 PTFE 0.8 5000* 不 包 括 手 紧 接 头 (0100-1516, 2/ 包 ) 5067-2462 材 料 缩 写 SS S SH SL SLV SX M 描 述 不 锈 钢 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头 Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 长 接 头,1200 bar Swagelok 内 径 1.6 mm 接 口, 超 长 接 头 Metric M4 内 径 0.8 mm 接 口 181

1290 阀 头 连 接 :600 和 1200 Bar 起 始 端 (A) 结 束 端 (B) 材 料 内 径 (mm) 自 动 进 样 器 带 Swagelok 接 口 的 阀 自 动 进 样 器 自 动 进 样 器 自 动 进 样 器 带 10/32 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 短 色 谱 柱 短 色 谱 柱 长 色 谱 柱 短 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 长 度 (mm) 接 头 类 型 起 始 端 接 头 类 型 结 束 端 备 注 阀 信 息 部 件 号 SS 0.12 340 S SX A 上 已 预 装 配 5067-4684 SS 0.12 340 S SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS 0.12 340 SLV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS 0.12 500 SLV M G4234A/B 6 种 色 谱 柱 选 择 阀, 600/1200 bar 热 交 换 器 SS 0.12 90 SX S A 和 B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar 热 交 换 器 SS 0.12 90 M SL B 上 已 预 装 配 G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 Swagelok 接 口 的 阀 短 色 谱 柱 带 10/32 Swagelok 接 口 的 阀 长 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 SS 0.12 130 SV M G4234A/B 6 种 色 谱 柱 选 择 阀, 600/1200 bar SS 0.12 150 SV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS 0.12 280 SV M G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar SS 0.12 150 SL SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS 0.12 150 SL SX G4232B 2 位 / 10 通 阀 阀 头, 1200 bar SS 0.12 280 SL SX B 上 已 预 装 配 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar 5067-4647 5067-4744 5067-4745 5067-4649 5067-5106 5067-4735 5067-5104 5067-5107 5067-4650 5067-4686 5067-4651 转 下 页 182

1290 阀 头 连 接 :600 和 1200 bar 从 (A) 从 (B) 材 料 ID (mm) 带 Swagelok 接 口 的 阀 长 色 谱 柱 带 Swagelok 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 热 交 换 器 色 谱 柱 色 谱 柱 色 谱 柱 G4232A 2 位 / 10 通 阀 阀 头, 1200 bar 长 度 (mm) 接 头 类 型, 从 接 头 类 型, 到 检 测 器 SS 0.12 200 SX S A 和 B 上 已 预 装 配 带 Swagelok 接 口 的 阀 备 注 阀 信 息 部 件 号 G4231A/B 2 位 / 6 通 阀 阀 头, 600/1200 bar SS 0.12 280 SL SX G4232B 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 检 测 器 SS 0.12 200 SX S A 上 已 预 装 备 G4232B 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 检 测 器 SS 0.12 250 M SLV G4232A 2 位 /10 通 微 量 阀 阀 头,600 bar 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 带 M4 接 口 的 阀 SS 0.17 90 SL M A 上 已 预 装 备 G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS 0.17 90 SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS 0.17 150 SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS 0.17 280 SV M G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar SS 0.17 250 SL M A 上 已 预 装 备 G4232A 2 位 /10 通 阀 阀 头,1200 bar 5067-4653 5067-4687 5067-4689 5067-4746 5067-5109 5067-5110 5067-5111 5067-5112 5067-5113 接 头 说 明 缩 写 包 装 部 件 号 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头 S 10 个 / 包 5062-2418 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头, 长 螺 栓 SL 10 个 / 包 5065-4454 Swagelok 1.6 mm 不 锈 钢 接 头, 超 长 螺 栓 SX 10 个 / 包 5062-9967 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头 SV 1 个 / 包 5067-4733 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头, 长 螺 栓 SLV 1 个 / 包 5067-4738 Swagelok 1.6 mm 1200 bar 可 拆 卸 接 头, 超 长 螺 栓 SXV 1 个 / 包 5067-4739 183

A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 组 件 * 适 用 范 围 毛 细 管 接 头 长 度 (mm) 部 件 号 色 谱 柱 到 检 测 器 0.12 x 280 5067-5960 色 谱 柱 到 检 测 器 0.12 x 220 5067-5959 热 交 换 器 到 色 谱 柱 0.12 x 150 5067-5958 热 交 换 器 到 色 谱 柱 0.12 x 105 5067-5957 热 交 换 器 到 色 谱 柱 0.075 x 105 5067-5961 * 所 有 组 件 均 包 括 一 个 连 接 到 合 适 毛 细 管 上 的 Quick Connect 接 头 以 及 一 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 ( 在 另 一 端 ) Quick Connect 接 头 只 可 用 于 该 表 给 出 的 毛 细 管 A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 独 立 部 件 描 述 部 件 号 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 280 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 5500-1170 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 220 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 5500-1171 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 150 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 5500-1172 毛 细 管 不 锈 钢 0.12 x 105 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 5500-1173 毛 细 管 不 锈 钢 0.075 x 105 mm, 包 括 1 个 未 装 配 的 Swagelok 接 头 5500-1174 前 密 封 垫 圈 5043-0924 独 立 Quick Connect 接 头 ( 与 合 适 的 毛 细 管 配 合 使 用, 用 于 系 统 设 置 ) 5067-5965 更 多 有 关 Agilent A-Line Quick Connect Fittings 快 速 连 接 接 头 的 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/a-line 184

A-Line Quick Turn 接 头 和 密 封 垫 圈 描 述 部 件 号 Quick Turn UHPLC 接 头 5067-5966 前 密 封 垫 圈 5043-0924 A-Line Quick Turn 毛 细 管 描 述 部 件 号 不 锈 钢,0.17 500 mm, 带 长 套 管 5500-1197 不 锈 钢,0.17 280 mm, 带 长 套 管 5500-1196 不 锈 钢,0.17 x 200 mm, 带 长 套 管 5500-1195 不 锈 钢,0.17 150 mm, 带 长 套 管 5500-1194 不 锈 钢,0.17 105 mm, 带 长 套 管 5500-1193 不 锈 钢,0.12 500 mm, 带 长 套 管 5500-1192 不 锈 钢,0.12 280 mm, 带 长 套 管 5500-1191 不 锈 钢,0.12 200 mm, 带 长 套 管 5500-1190 不 锈 钢,0.12 150 mm, 带 长 套 管 5500-1189 不 锈 钢,0.12 105 mm, 带 长 套 管 5500-1188 不 锈 钢,0.075 105 mm, 带 长 套 管 5500-1198 Quick Turn 接 头 需 使 用 本 表 给 出 的 毛 细 管 更 多 有 关 Agilent A-Line Quick Turn 接 头 的 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/a-line 185

安 捷 伦 液 相 色 谱 检 测 器 光 源 带 给 您 耐 久 的 性 能 使 用 非 标 准 液 相 色 谱 灯 可 导 致 光 强 度 不 一 致 基 线 噪 音 高 系 统 停 机 以 及 成 本 增 加 为 了 确 保 液 相 色 谱 系 统 的 准 确 性 重 现 性 和 可 靠 性, 请 使 用 严 格 按 照 ISO 9001 标 准 制 造 的 安 捷 伦 认 证 氘 灯 安 捷 伦 氘 灯 的 与 众 不 同 之 处 在 于 : 性 能 最 优 精 准 的 操 作 电 压 一 致 的 光 强 度 以 及 准 直 定 位 使 用 寿 命 比 其 他 产 品 长 50% 可 达 2000 小 时 信 噪 比 更 高 发 光 孔 径 更 窄, 从 而 提 高 了 光 强 度, 降 低 了 噪 音 灵 敏 度 更 高 扩 展 了 1200 Infinity 系 列 和 6100 Series 四 极 杆 质 谱 仪 的 检 测 能 力, 可 运 行 任 何 现 有 HPLC 或 RRLC 方 法 二 极 管 阵 列 检 测 器 / 多 波 长 检 测 器 检 测 器 灯 描 述 部 件 号 G1315A/B G1365A/B 长 寿 命 氘 灯 5182-1530 G4212A/B 长 寿 命 HiS 氘 灯 (8 针 ), 带 有 RFID 识 别 标 签 5190-0917 G1315C/D G1365C/D G1315A/B/C/D G1365A/B/C/D 长 寿 命 氘 灯, 带 有 RFID 识 别 标 签 2140-0820 钨 灯 G1103-60001 可 变 波 长 检 测 器 检 测 器 灯 描 述 部 件 号 G1314D/E/F 长 寿 命 氘 灯, 带 有 RFID 识 别 标 签 G1314-60101 G1314A/B/C 1120 Infinity 液 相 色 谱 1220 Infinity 液 相 色 谱 长 寿 命 氘 灯 G1314-60100 186

Agilent Captiva 优 级 注 射 式 过 滤 器 样 品 在 进 入 高 效 液 相 色 谱 超 高 效 液 相 色 谱 气 相 色 谱 气 质 联 用 系 统 或 液 质 联 用 系 统 分 析 前 进 行 过 滤, 对 获 取 最 佳 系 统 性 能 起 着 决 定 性 的 作 用 Agilent Captiva 增 强 型 注 射 式 过 滤 器 拥 有 业 内 最 高 流 速 和 载 样 量, 使 得 进 程 比 过 去 更 快 请 根 据 个 人 需 求 挑 选 不 同 的 膜 类 型 和 孔 径 有 关 Captiva 过 滤 产 品 的 详 细 信 息 及 其 它 产 品 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/filtration 优 级 注 射 式 过 滤 器 (100/ 包 ) 直 径 / 孔 径 滤 膜 类 型 4 mm 15 mm 25 mm 0.2 µm 0.45 µm 0.2 µm 0.45 µm 0.2 µm 0.45 µm PTFE 5190-5082 5190-5083 5190-5084 5190-5085 5190-5086 5190-5087 尼 龙 5190-5090 5190-5091 5190-5092 5190-5093 PES 5190-5094 5190-5095 5190-5096 5190-5097 5190-5098 5190-5099 再 生 纤 维 素 5190-5106 5190-5107 5190-5108 5190-5109 5190-5110 5190-5111 醋 酸 纤 维 素 5190-5116* 5190-5117* 玻 璃 微 纤 维 5190-5120 5190-5122* 深 层 过 滤 器 : 玻 璃 /PTFE 5190-5126 5190-5127 5190-5128 5190-5129 深 层 过 滤 器 : 玻 璃 / 尼 龙 5190-5132 5190-5133 5190-5134 5190-5135 备 注 :* 较 大 直 径 为 28 mm( 并 非 25 mm) 以 蓝 色 显 示 的 部 件 号 产 品 经 过 LC/MS 系 统 验 证 ; 其 它 产 品 均 经 过 LC/UV 系 统 验 证 187

安 捷 伦 溶 剂 安 全 盖 提 高 实 验 室 安 全 性 Agilent A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 能 够 阻 止 99.9% 的 溶 剂 释 放 到 空 气 中, 从 而 保 护 您 与 同 事 的 健 康 溶 剂 的 密 度 随 着 时 间 的 延 长 可 能 会 发 生 变 化, 从 而 影 响 您 色 谱 分 析 的 结 果 使 用 气 密 性 的 A-Line 溶 剂 瓶 安 全 盖 保 存 溶 剂 可 以 避 免 这 个 问 题, 确 保 溶 剂 稳 定 性 以 及 色 谱 分 析 结 果 的 准 确 性 A-Line 溶 剂 瓶 安 全 盖 带 有 一 个 时 间 标 签, 用 于 提 醒 您 何 时 需 要 更 换 放 空 阀 A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 GL45 描 述 插 口 放 空 阀 过 滤 器 废 液 1 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 (5043-1190) 1 x 3.2 mm 1 5043-1217 2 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 (5043-1190) 2 x 3.2 mm 1 5043-1218 3 个 插 口 1 个 带 时 间 标 签 的 放 空 阀 (5043-1190) 3 x 3.2 mm 1 5043-1219 4 个 插 口 1 个 泄 漏 管 2 x 3.2 mm 1 x 2.3 mm 1 x 1.6 mm 1 1 5043-1220 更 多 有 关 A-Line Stay Safe 溶 剂 瓶 安 全 盖 的 信 息, 请 访 问 www.agilent.com/chem/a-line 188

用 于 NS29/32 磨 口 瓶 安 全 盖 II, 带 2 个 插 口 - 用 于 NS29/32 5043-0221 1 个 基 础 瓶 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色, 用 于 NS29/32, 带 PTFE 锥,2 个 插 口 内 含 2 个 一 体 接 头,PFA 3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 1 个 1 µm 放 空 阀,PTFE 滤 膜 内 含 用 于 GL 45 螺 纹 口 溶 剂 瓶 安 全 盖 II, 带 2 个 插 口 的 - 用 于 GL 45 5043-0222 1 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,2 个 接 口 内 含 2 个 接 头,PFA 3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 I, 带 1 个 插 口 的 - 用 于 GL 45 5043-0223 1 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,1 个 插 口 内 含 1 个 一 体 接 头,PFA,3.2 mm, 黑 色 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 II, 带 2 个 关 闭 阀 用 于 GL 45 5043-0224 1 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,2 个 插 口 2 个 关 闭 阀 内 含 2 个 接 头,PFA,3.2 mm(1 蓝 色,1 红 色 ) 内 含 2 个 接 头,PTFE,3.2 mm( 白 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 全 盖 I, 带 1 个 关 闭 阀 - 用 于 GL45 5043-0225 1 个 基 础 盖, 聚 丙 烯, 蓝 色,GL45, 带 PTFE 锥,1 个 插 口 1 个 关 闭 阀 内 含 1 个 一 体 接 头,PFA,3.2 mm, 黑 色 内 含 1 个 接 头,PTFE,3.2 mm( 白 色 ) 内 含 1 个 放 空 阀,1 µm,ptfe 滤 膜 内 含 安 捷 伦 安 全 盖 是 能 够 自 由 旋 转 的 PTFE 和 PFA 螺 口 盖, 适 用 于 实 验 室 中 高 效 液 相 色 谱 系 统 的 所 有 溶 剂 瓶 和 废 液 瓶 最 高 可 减 少 70% 的 溶 剂 排 放, 并 能 有 效 防 止 可 能 改 变 色 谱 结 果 的 溶 剂 泄 漏 和 蒸 发 瓶 盖 采 用 自 由 旋 转 设 计, 更 加 便 于 溶 剂 的 更 换 操 作, 有 助 于 避 免 容 器 更 换 过 程 中 发 生 管 路 缠 绕 189

安 捷 伦 在 线 过 滤 器 保 护 您 的 液 相 色 谱 系 统 色 谱 柱 进 样 口 滤 芯 污 染 可 能 增 大 柱 反 压 并 降 低 柱 效 由 于 进 样 口 滤 芯 直 径 小, 微 径 色 谱 柱 堵 塞 成 为 一 个 值 得 关 注 的 问 题 为 了 防 止 堵 塞, 请 始 终 在 液 相 色 谱 系 统 中 使 用 适 当 的 过 滤 器 安 捷 伦 有 几 种 类 型 的 高 压 在 线 过 滤 器 工 具 包 可 用 于 任 何 高 效 液 相 色 谱 系 统 低 扩 散 在 线 过 滤 器 : 直 接 置 于 色 谱 柱 之 前, 可 去 除 样 品 和 进 样 系 统 中 的 微 粒 由 于 过 滤 器 具 有 直 径 仅 2.1 mm 的 滤 芯 及 锥 形 插 件, 从 而 使 谱 带 展 宽 最 小 此 过 滤 器 适 用 于 任 何 微 径 高 速 或 标 准 的 分 析 柱 通 用 型 在 线 过 滤 器 : 安 装 于 液 相 色 谱 泵 和 进 样 器 之 间, 去 除 溶 剂 中 的 颗 粒, 使 用 高 容 量 过 滤 器 滤 芯 置 于 插 件 的 锥 形 边 缘 之 间, 使 溶 剂 能 够 均 匀 地 分 布 于 滤 芯 的 表 面 上 高 效 液 相 色 谱 在 线 过 滤 器 说 明 滤 芯 孔 径 滤 芯 入 口 内 径 注 释 部 件 号 可 更 换 的 滤 芯 (µm) (mm) RRLC 在 线 过 滤 器, 连 接 毛 细 管 0.2 4.6 最 高 耐 压 600 bar 5067-1553 5067-1562, 10 个 / 包 RRLC 在 线 过 滤 器, 连 接 毛 细 管 0.2 2.1 最 高 耐 压 600 bar 5067-1551 5067-1555, 10 个 / 包 低 扩 散 在 线 过 滤 器, 包 括 两 个 滤 芯 2 0.5 2.1 <1 ml/min. 01090-68702 280959-904, 10 个 / 包 (2 µm). 280959-907, 10 个 / 包 (0.5 µm). 通 用 在 线 过 滤 器, 两 个 滤 芯, 带 衬 垫, 2 4.8 1 5 ml/min. 01090-69703 01090-27609, 2 个 / 包 130 0.25 mm 连 接 毛 细 管 半 制 备 过 滤 器 0.5 12.7 1 5 ml/min. 5064-8273 5022-2185 高 压 半 制 备 过 滤 器 10 19 5 10 ml/min 5022-2165 5022-2166, 10 个 / 包 制 备 过 滤 器 10 10 100 ml/min 5065-4500 5065-9901, 可 更 换 玻 璃 滤 芯 G1311A 泵 的 在 线 过 滤 器 建 议 在 盐 溶 度 较 高 时 使 用 G1311-60006 1290 Infinity 在 线 过 滤 器 (0.3 µm) 0.3 2.0 1200 bar 5067-4638 5023-0271, 5 个 / 包 190

Agilent 1200 Infinity 系 列 液 相 色 谱 产 品 组 合 Agilent 1200 Infinity 系 列 产 品 继 承 了 安 捷 伦 40 年 来 开 发 和 生 产 最 高 质 量 液 相 色 谱 仪 的 优 良 传 统, 迄 今 为 止 已 销 售 100 多 万 台 仪 器 在 1200 Infinity 系 列 与 之 前 的 1100 或 1200 系 列 之 间, 安 捷 伦 提 供 了 无 限 制 的 组 件 和 系 统 兼 容 性 安 捷 伦 保 值 承 诺 可 以 让 任 何 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪 灵 活 地 逐 步 升 级 无 论 是 现 在 还 是 未 来! 无 限 超 值 Agilent 1220 Infinity LC 是 用 于 常 规 HPLC 和 先 进 的 UHPLC 分 析 的 高 质 量 集 成 系 统, 为 您 的 投 资 带 来 最 大 的 回 报 600 bar 的 性 能 范 围 最 高 达 5 ml/min 的 流 速 和 80 Hz 的 检 测 器 速 率 让 您 的 实 验 室 充 分 利 用 最 新 的 液 相 色 谱 柱 技 术 带 来 的 优 势 与 1200 Infinity 系 列 中 的 所 有 其 他 安 捷 伦 检 测 器 和 6100 系 列 四 极 杆 质 谱 仪 完 全 兼 容 使 用 与 1260 Infinity 和 1290 Infinity II 液 相 色 谱 系 统 相 同 的 技 术 和 部 件 无 限 信 心 1260 Infinity 液 相 色 谱 仪 建 立 了 更 高 的 性 能 标 准, 可 提 高 结 果 的 可 信 度 它 兼 顾 UHPLC 水 平 的 分 析 效 率 数 据 质 量 和 稳 定 性 价 格 却 仅 仅 相 当 于 普 通 的 HPLC 系 统 具 有 600 bar 的 性 能 范 围 最 高 达 10 ml/min 的 流 速 80 Hz 的 检 测 器 速 率 和 提 高 了 10 倍 的 UV 检 测 灵 敏 度 足 以 应 对 现 在 和 未 来 的 挑 战 与 您 的 所 有 HPLC 方 法 完 全 兼 容, 确 保 无 风 险 地 完 成 对 现 有 仪 器 的 替 换 以 相 同 的 预 算 获 得 更 大 价 值 价 格 与 以 前 的 1200 系 列 HPLC 相 当, 却 能 提 供 UHPLC 性 能 无 限 高 效 新 的 1290 Infinity II LC 代 表 着 UHPLC 的 未 来 发 展 趋 势 拥 有 安 捷 伦 提 供 的 无 与 伦 比 的 可 靠 性 和 稳 定 性, 以 及 突 破 性 的 色 谱 性 能 和 最 高 的 效 率 最 大 化 分 析 效 率 : 无 可 比 拟 的 分 离 和 检 测 性 能, 可 提 供 最 高 质 量 的 分 析 数 据, 让 您 对 结 果 充 满 信 心 最 大 化 仪 器 效 率 : 最 高 的 样 品 容 量 最 快 的 进 样 周 期 以 及 前 所 未 有 的 可 用 性 使 仪 器 在 任 何 应 用 中 均 可 实 现 最 高 的 通 量 最 大 化 实 验 室 效 率 : 可 与 实 验 室 现 有 架 构 无 缝 整 合, 从 原 有 设 备 实 现 平 稳 无 干 扰 地 的 方 法 转 移, 从 而 获 得 最 高 的 分 析 效 率 和 最 低 的 使 用 维 护 成 本 随 时 了 解 来 自 安 捷 伦 仪 器 的 无 限 卓 越 的 技 术, 请 访 问 www.agilent.com/chem/1200 191

采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 Agilent 1290 Infinity II 液 相 色 谱 采 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 解 决 不 同 液 相 色 谱 之 间 进 行 方 法 转 换 时 的 各 种 问 题 不 同 液 相 色 谱 仪 之 间 的 设 计 差 别 例 如 功 能 范 围 延 迟 体 积 混 合 性 能 温 度 控 制 柱 外 体 积 和 检 测 器 流 通 池 设 计 等 都 会 影 响 从 一 个 系 统 向 另 一 系 统 的 方 法 转 换 因 此, 在 不 同 液 相 色 谱 仪 上 使 用 相 同 的 液 相 色 谱 方 法 可 能 会 出 现 不 同 的 保 留 时 间 和 色 谱 分 离 度 延 迟 体 积 和 梯 度 混 合 的 影 响 液 相 色 谱 系 统 的 延 迟 ( 驻 留 ) 体 积 决 定 了 混 合 溶 剂 多 快 能 够 到 达 色 谱 柱 而 且, 混 合 性 能 影 响 着 梯 度 曲 线 延 迟 / 驻 留 体 积 和 混 合 性 能 均 由 仪 器 的 设 计 决 定, 方 法 转 换 将 使 得 保 留 时 间 和 分 离 度 出 现 差 异 [mau] 800 700 600 500 400 100 200 100 0 R S = 1.15 R S = 1.90 1 1.5 2 2.5 3 min 1100 3.5 条 件 色 谱 柱 : Poroshell 120, 3 x 50 mm (2.7 um) 流 速 : 0.85 ml /min 流 动 相 : 水, 乙 腈 梯 度 : 0 min (10% 乙 腈 ), 3 min (90% 乙 腈 ) 流 动 相 : 四 氢 呋 喃 (THF) 由 不 同 延 迟 体 积 和 梯 度 混 合 性 能 造 成 的 色 谱 柱 溶 剂 组 成 不 同 将 产 生 不 同 的 保 留 时 间 和 分 离 度 192

仪 器 间 方 法 转 换 的 解 决 方 案 : 配 备 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 的 1290 Infinity II 液 相 色 谱 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 使 得 1290 Infinity II 液 相 色 谱 成 为 世 界 上 第 一 台 真 正 意 义 上 的 通 用 液 相 色 谱 系 统, 无 需 修 改 原 方 法 或 改 动 仪 器 硬 件, 即 可 运 行 任 何 传 统 的 HPLC 方 法 或 最 新 的 UHPLC 方 法, 得 到 与 原 方 法 相 同 的 色 谱 结 果 仅 需 点 击 鼠 标 即 可 [mau] 800 700 600 500 400 100 200 100 0 (ISET) 1290 Infinity 1100 R S = 1.87 R S = 1.90 1 1.5 2 2.5 3 min 3.5 结 果 : 保 留 时 间 和 分 离 度 均 相 同, 无 需 修 改 仪 器 或 原 方 法 有 效 提 高 方 法 开 发 和 质 量 管 理 / 质 量 控 制 (QA/QC) 的 效 率, 并 降 低 成 本 使 用 1290 Infinity II 液 相 色 谱 和 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 可 以 利 用 超 高 效 液 相 色 谱 性 能 加 快 方 法 开 发 的 速 度, 然 后 通 过 模 拟 目 标 系 统 对 方 法 进 行 微 调 使 方 法 更 可 靠 地 按 预 期 方 式 运 行 简 单 即 可 模 拟 开 发 原 方 法 的 液 相 色 谱 系 统 使 用 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET) 继 续 运 行 传 统 方 法 的 同 时 还 能 够 充 分 利 用 1290 Infinity II 液 相 色 谱 的 超 高 压 液 相 色 谱 速 度 分 离 度 和 灵 敏 度 优 势 有 了 智 能 化 系 统 模 拟 技 术 (ISET), 就 无 需 再 保 留 您 的 旧 液 相 色 谱 系 统 了 要 了 解 有 关 此 技 术 的 更 多 信 息, 及 时 跟 踪 安 捷 伦 仪 器 无 限 卓 越 的 最 新 技 术, 请 访 问 www.agilent.com/chem/1290 193

备 注 194

备 注 195

备 注 196

备 注 197

Agilent CrossLab 集安捷伦科的创新实验室服务 软件和消耗品 供应于一体 为您提供了与全球科学技术专家团队直接交流的 途径 他们可针对不同层级的实验室环境提供重要且可执行见 解 从而最大限度提高性能 降低实验室运作的复杂性 助力客户实现更高效的经济 运营 与科学成果 唯有 Agilent CrossLab 独特地结合了创新产品与全面解决方案 可确保实验室效率得到快速 持久的改善 我们愿与全球客户携手前行 不断探索实验室领域的新机遇 如需了解更多信息 请访问 www.agilent.de/crosslab www.agilent.com/chem/lccolumns 查找当地的安捷伦客户中心 www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线 800-820-3278 400-820-3278 手机用户 联系我们 LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 www.agilent.com/chem/erfq-cn 安捷伦科技大学 http://www.lsca-china.com.cn/agilent 浏览和订阅 Access Agilent 电子期刊 www.agilent.com/chem/accessagilent-cn 本文中的信息 说明和指标 如有变更 恕不另行通知 安捷伦对本文可能存在的错误或由于提供 展示或使用本文所造成的间接损 失不承担任何责任 安捷伦科技 中国 有限公司 2016 2016 年 2 月 1 日 中国出版 出版号 5990-7595CHCN 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南 了解更多信息 液相色谱手册 液相色谱柱与方法开发指南