三 層析相關術語 1.基線(base line) 無試樣通過檢測器時 檢測到的信號即為基線 2.滯留時間 retention time tr 組成分從進樣(樣品注入)到管柱後出現濃度極大值 時所需的時間 3.層析(波)峰(peak) 組成分從柱後出現 被偵檢器偵測到所產生的訊號 值 因此一個波峰代表一個或一個以上 混合物 也就是未分離成功 的分析成分 1 峰高(peak height) 2 峰寬(peak width) 儀器分析 張永鍾 林志城 編著 2-2-2 分配係數 滯留時間 t R=tR-tM 調整滯留時間 無感時間或靜止時間(dead time): 移動相分子流經管柱所需的時間 層析管柱的分離效率部分取決於二成分物種在流 動相中流動的相對速率 而此固定相對速率由物 種在流動相與固定相間之分配係數K的大小所決 定 物種A在流動相與固定相間形成分配平衡 A流動相(M) A固定相(S) 分配係數(partition 分配係數(partition coefficient) K又稱為分配比 K (partition ratio) 可定義為A在固定相之莫耳濃 度Cs與A在流動相之莫耳濃度CM的比值 K=Cs/CM 理論上在一大物種濃度範圍內 於定溫時分配係 定溫時分配係 數K為定值 則C 為定值 s與cm成正比例的線性關係 Some terms 1.分配係數Distribution (partition) coefficient: K=Cs/CM Cs:sample 在stationary phase之濃度 CM:sample 在mobile phase之濃度 K, Cs :sample不易出來 樣品成分愈慢出來 2. capacity factor (k )容量因子 可用來表 示分析物種在管柱中的移動速率 K=Cs/CM=ns/Vs / nm/vm=nsvm / VsnM=k VM/ Vs k = ns/ nm 1
分析物種A及B在管柱中的分離效 果由選擇因子決定 3. Selectivity factor (α)(relative retention)--選擇因子(相對滯留率) α =KB/KA KB KA α 1 KB大 為 樣品愈慢出來 KA小 為 樣品愈快出來 α大表示選擇性高 4.Number of theoretical plates (N)理論板數 樣品在管柱中與stationary phase 與mobile phase呈平衡之次數 N小則波峰寬 N大則波峰窄 5.HETP (Height equivalent of theoretical plate) 理論平板相當高度(H) H=L/N L:管柱長度 即表示樣品走多長的管柱才有一次分配 故H愈小 表管柱之分離效率變大 拖尾因子 拖尾因子(tailing factor Tf)用來衡 量波峰的對稱性 亦稱為對稱因子 (symmetry factor) 或 不 對 稱 因 子 (asymmetry factor AF) 公式為 2-3-6管柱效率與平板高度 馬丁(Martin)和欣革(Synge)將層析管柱視為由無數個不 連續 但相鄰的理論平板的薄層所組成 在每一平板 上 假設分析物種在流動相和固定相間發生平衡 其中L為管柱填充之長度(單位為厘米 cm) 平板高度 一般稱為理論平板相當高度HETP (height equivalent of theoretical plate)簡稱平板高度 平板高度 假若L管柱填充之長度增加 則滯留時間tR也增加 一 一 般的層析管柱效率隨平板數 般的層析管柱效率隨平 板數 N的增加及平板高度 H的減 少而增加 由於管柱型式 流動相及固定相之 不同 少而增加 層析管柱的效率有很大的差異 以平板數表示的效率 值 可由數百至數十萬不等 平板高度範圍由數十分之 一至數千分之一厘米 四 解析度(resolution) 兩物質的解析度大小受層析過程中兩種因素的綜合影響 滯留時間之差及尖峰寬度 層析分離中的四種情況如圖所示 ①解析度大 完全分離 ②解析度可接受 基本上完全分離 ③解析度低 分離的不好 ④解析度差 分離效果更差 2
解析度可定義為二成分的滯留時間 的差值ΔZ與其平均峰寬度之比值 解析度的計算式 Rs 2(t R ( 2 ) t R (1) ) Wa ( 2 ) Wb (1) R=0.8 兩 峰 的 分 離程度可達 89% 解析度 相鄰的x和y二個波峰重疊率必須小於4% 定 量積分面積時準確度才夠 因此 以解析度 (resolution Rs)來判斷二個波峰之間分離的程 度 Rs 之理想值為1.5 公式為 R=1 分離程度 96% R=1.5 達 99.7% 相鄰兩 峰完全分離的標 準 從層析流出曲線上 可以得到許多重要資訊 l 根據層析峰的個數 可以判斷樣品中所含 組成分的最少個數 2 根據層析峰的保留值(或位置 可以進行 定性分析 定性分析 3 根據層析峰下的面積或峰高 可以進行定 定 量分析 量分析 4 層析峰的滯留時間 滯留時間及 及峰寬 是評價層析柱 層析柱 分離效能( 分離效能(Rs) Rs)的依據 5 層析峰兩峰間的距離 是評價固定相(和流 動相)選擇是否合適的依據 五 層析定性鑒定方法 1.利用純物質定性的方法 A.利用滯留時間定性 A. 利用滯留時間定性 通過對 比試樣中具有與純物質相同滯 留時間的層析峰 來確定試樣 由上式中可發現 增加理論板數 或降低理 論板高 管柱滯留因子和選擇因子的最佳 化等 都是提高層析解析度的方法 B.利用加入法定性 ( 標 準 加 入 法, standard addition method) 將 純 物 質加入到試樣中 觀察各組分層析峰 的相對變化 中是否含有該物質及在層析圖 中的位置 不適用於不同儀器 上獲得的資料之間的對比 3
HEWLETT PACKARD 1.0 DEG/MI N HEWLET TPACKAR D 5 972 A Ma ss S elective Detecto r 2. 與 其 他 分 析 儀 器 聯 用 的 定 性 方 法 層 析 - 質 譜 儀 聯 用 (GC-MS;LC-MS) 層 析 - 紅 外 光 譜 儀 聯 用 (GC-IR) 組 分 的 結 構 鑒 定 Sample D C A B Sample 5890 Gas Chromatograph (GC) B A C D Separation Mass Spectrometer (MS) A B C D Identification 定 量 分 析 法 常 用 的 層 析 定 量 方 法 有 : 定 絕 對 量 的 檢 量 線 法 (calibration curve), 包 括 : 外 標 準 法 (external standard calibration curve) 內 標 準 法 (internal standard calibration curve) 以 及 標 準 品 添 加 法 (standard addition) 三 種 另 一 類 是 決 定 相 對 量 的 常 態 化 處 理 (normalization), 即 面 積 百 分 比 法 再 者, 根 據 試 樣 層 析 具 體 情 況, 可 採 用 波 峰 面 積 或 波 峰 高 度 作 為 計 算 依 據, 但 面 積 百 分 比 法 或 內 標 準 法, 則 必 須 採 用 波 峰 面 積 來 定 量 ( 一 ) 峰 面 積 的 測 量 : 六 層 析 定 量 分 析 方 法 積 分 儀 或 電 腦 積 分 軟 體 法 剪 紙 稱 重 法 A=hW l. 峰 高 乘 半 峰 寬 法 h/2 A=1.065hW h/2 此 方 法 為 峰 面 積 的 近 似 測 量 法, 峰 高 h 與 半 峰 寬 W h/2, 為 矩 形 之 面 積, 如 圖 2-11 2. 峰 高 乘 平 均 峰 寬 法 對 於 不 對 稱 峰 以 峰 高 的 85 % 及 15% 處 分 別 測 得 該 處 之 峰 寬 W 0.85,W 0.15, 取 其 平 均 峰 寬 乘 以 峰 高 所 得 結 果 較 準 確 如 圖 2-12 所 示 A=1/2(W 0.85 +W 0.15 )h=w 0.5 h 試 樣 中 各 組 分 質 量 與 其 層 析 峰 面 積 成 正 比, 因 此 層 析 峰 面 積 愈 大 代 表 物 質 含 量 愈 高 在 一 定 條 件 下 被 分 析 成 分 的 量 m 與 偵 測 器 產 生 的 信 號 ( 峰 高 或 波 峰 面 積 ) 呈 正 比 校 正 因 子 層 析 法 定 量 分 析 是 基 於 被 測 成 分 的 量 與 所 得 峰 面 積 成 正 比 但 當 二 個 等 量 不 同 成 分 的 樣 品, 在 相 同 操 作 條 件 下, 使 用 同 一 種 偵 測 器 進 行 測 定 時. 所 得 的 面 積 卻 常 常 不 相 同, 此 時 直 接 採 用 峰 面 積 來 定 量 會 不 準 確 因 此 需 要 對 峰 面 積 進 行 校 正, 即 引 入 校 正 因 子 (correction factor) 來 計 算 m=fa m=fh f: 定 量 校 正 因 子 h: 峰 高 A: 峰 面 積 (2) 外 標 準 法 (external standard method) 外 標 法 也 稱 為 標 準 曲 線 法 其 特 點 及 要 求 : 操 作 條 件 變 化 對 結 果 準 確 性 影 響 較 大 對 進 樣 量 的 準 確 性 控 制 要 求 較 高 優 點 簡 便 快 速 4
3 內標準法(internal standard method) 外標準法特色是只要一條檢 量線即可同時分析大批試 樣 簡單省時 但基本要求 是圖譜解析度要足夠 而且 不能有干擾物 標準品添加法(Standard addition) 標準品添加法可彌補外標法的不足 對於分析波 峰解析度不足 或是有干擾物存在時特別適用 但缺點是操作較煩雜 試樣需用量較多 操作流 程如下 對同體積的試樣分別添加不同濃度的 包括零在內 分析物標準品 最後調整成體積均相同 上述試樣溶液分別定量注入層析 之後以標準品實際 添加量對其波鋒面積或是高度作圖 接著確定線性範 圍 並求此線性範圍的檢量線方程式 內標物要滿足以下要求 a 試樣中不含有該物質 b 與被測組成分性質比較接近 c 不與試樣發生化學反應 d 滯留時間應位於被測組成分附近 且無組成分波峰影響 試樣配製 準確稱取一定量的試樣W 加入一定量內標物mS 計算式 m=fa (成分的量m與波峰面積成正比, f:係數) mi f 'A f 'A i' i ; mi m s i' i ms f s AS f s AS f 'A ms i' i mi f s AS ms f i ' Ai ci % 100 100 100 W W W f s' AS 內標準法 internal 內標準法 internal standard method)簡稱內標法 係 method)簡稱內標法 係 稱取一定重量且物質與樣品相似的某純物質作為內標準 物 加入至已知重量的樣品中 混合均勻後成分注入管 柱中進行分析 根據樣品及內標準物的重量和峰面積 可求出待測定成分之含量 內標法特點 (a) 內標法的準確性較高 操作條件和進樣 量的稍許變動對定量結果的影響不大 (b) 每個試樣的分析 都要進行兩次稱量 要準確稱量樣品及內標準物 不適合大批 量試樣的快速分析 外插檢量線到濃度軸 讀取濃度值 或者以 波鋒面積或是高度為零從檢量線方程式計算分 析物濃度 最後由試樣前處理和稀釋情況計算 試樣中真正的分析物濃度 確定線性範圍後 本法能夠以只要添加一 種濃度的方式來定量 兩點決定一直 線 並依下列公式計算 5
6