第 32 卷 第 5 期 海 洋 学 报 Vol.32,No.5 2010 年 9 月 ACTA OCEANOLOGICASINICA September2010 日 本 鑚 精 子 结 构 及 环 境 因 子 对 精 子 存 活 率 的 影 响 许 星 鸿 1, 阎 斌 伦 1, 徐 加 涛 1, 徐 国 成 1, 浦 寅 芳 1, 吴 建 新 1 (1. 淮 海 工 学 院 江 苏 省 海 洋 生 物 技 术 重 点 建 设 实 验 室, 江 苏 连 云 港 222005) 摘 要 : 以 光 镜 和 电 镜 观 察 了 日 本 鑚 精 子 的 形 态 结 构, 对 雄 体 贮 精 囊 和 雌 体 纳 精 囊 中 的 精 子 结 构 进 行 了 比 较, 并 研 究 了 ph, 盐 度 对 日 本 鑚 精 子 存 活 率 的 影 响 规 律, 结 果 表 明 : 日 本 鑚 精 子 为 非 鞭 毛 型, 主 要 由 顶 体 核 杯 膜 复 合 体 和 辐 射 臂 等 组 成, 其 中 顶 体 呈 球 形 或 近 球 形, 可 分 成 头 帽 顶 体 管 和 顶 体 囊 三 部 分 核 杯 包 裹 整 个 顶 体 外 围, 染 色 质 呈 细 丝 状 或 颗 粒 状 辐 射 臂 向 精 子 四 周 发 出, 内 含 核 质, 没 有 运 动 能 力 雄 体 贮 精 囊 中 的 精 子 包 裹 在 椭 球 形 精 荚 中, 而 雌 体 纳 精 囊 中 的 精 子 呈 弥 散 状, 精 子 顶 体 管 中 有 囊 泡 状 结 构 中 心 体 位 置 前 移 胞 质 透 明 区 扩 大, 而 且 有 些 精 子 已 崩 解 精 巢 表 面 ph 为 6.5±0.2, 精 液 ph 为 7.0±0.2, 精 子 密 度 平 均 为 (3.47 10 9 ±0.42 10 9 ) 个 /cm 3 精 子 的 适 宜 ph 为 7~9, 最 适 ph 为 8; 适 宜 盐 度 为 20~30, 最 适 盐 度 为 25 关 键 词 : 日 本 鑚 ; 精 子 ; 形 态 结 构 ; 存 活 率 ;ph; 盐 度 中 图 分 类 号 :Q959.223 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :0253 4193(2010)05 0093 07 1 引 言 日 本 鑚 ( 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 ) 隶 属 于 甲 壳 纲 (Crustacean) 梭 子 蟹 科 (Portunidae), 俗 称 靠 山 红 [1] 赤 甲 红 等, 广 泛 分 布 于 我 国 各 海 区 其 肉 味 鲜 美 营 养 丰 富, 并 具 有 清 热 滋 补 消 肿 等 功 效, 为 [2-3] 经 济 价 值 较 高 的 大 型 海 产 蟹 类 由 于 近 年 来 的 滥 采 酷 捕 加 上 环 境 污 染, 致 使 日 本 鑚 天 然 资 源 量 日 趋 衰 竭, 亟 待 发 展 日 本 鑚 的 人 工 增 养 殖 目 前 关 于 日 本 鑚 繁 殖 生 物 学 的 资 料 较 少, 仅 见 王 春 [4-5] 琳 等 对 浙 江 象 山 港 日 本 鑚 的 繁 殖 习 性 胚 胎 发 育 进 行 了 初 步 研 究, 并 且 采 用 扫 描 电 镜 对 日 本 鑚 的 精 子 表 面 形 态 进 行 了 观 察 本 实 验 对 日 本 鑚 精 子 的 显 微 和 超 微 结 构 进 行 了 详 细 研 究, 并 分 析 了 环 境 因 子 对 日 本 鑚 精 子 存 活 率 的 影 响 规 律, 旨 在 为 日 本 鑚 的 人 工 繁 育 技 术 及 生 殖 生 理 的 深 入 研 究 提 供 理 论 基 础 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 雄 性 日 本 鑚 于 2007 年 5 月 下 旬 购 自 连 云 港 海 产 品 市 场, 共 30 个, 甲 长 为 4.5~6.9cm, 甲 宽 为 6.3~8.8cm 2.2 方 法 2.2.1 显 微 结 构 观 察 活 体 解 剖 取 出 精 巢, 用 Bouin 液 固 定, 石 蜡 包 埋, 切 片 厚 6~7 μm, 苏 木 精 伊 红 染 色,Nikon E1000 微 镜 观 察 摄 影 取 精 巢 于 研 钵 中, 加 入 少 量 无 钙 离 子 人 工 海 水 (Ca 2+ FASW) [6] 研 磨 5min, 用 200 目 筛 绢 网 过 滤 以 去 除 组 织 碎 片 制 成 精 子 悬 液 取 1 滴 精 子 悬 液 于 干 净 载 玻 片 上, 用 涂 片 法 制 片, 用 2% 曙 红 B 染 色 液 染 色 4min, 显 微 镜 下 观 察 并 摄 影 2.2.2 超 微 结 构 观 察 分 别 从 雄 体 贮 精 囊 和 雌 体 纳 精 囊 中 获 取 精 荚, 收 稿 日 期 :2010 01 12; 修 订 日 期 :2010 05 14 基 金 项 目 : 江 苏 省 海 洋 生 物 技 术 重 点 建 设 实 验 室 开 放 课 题 (Z2007HS006); 江 苏 省 科 技 厅 苏 北 科 技 发 展 计 划 项 目 (BN2010026) 作 者 简 介 : 许 星 鸿 (1970 ), 女, 江 苏 省 泰 兴 市 人, 副 教 授, 硕 士, 主 要 从 事 海 洋 动 物 发 育 生 物 学 研 究 E mail:xhxu119@163.com
94 海 洋 学 报 32 卷 用 2.5% 戊 二 醛 预 固 定 (4 ),1% 锇 酸 后 固 定, 梯 度 乙 醇 脱 水, 用 Epon812 环 氧 树 脂 包 埋 用 LKB No va 超 薄 切 片 机 切 片, 用 醋 酸 铀 和 柠 檬 酸 铅 双 染 色, 用 日 本 电 子 JEM-1200EX 型 透 射 电 镜 观 察 摄 影 取 精 荚 和 上 述 精 子 悬 液, 用 2.5% 戊 二 醛 和 1% 锇 酸 双 固 定, 用 梯 度 乙 醇 脱 水, 低 温 真 空 干 燥 后 喷 金, 用 日 本 电 子 JSM -6390LA 型 扫 描 电 镜 观 察 摄 影 2.2.3 精 液 ph 值 和 精 子 密 度 的 测 定 采 用 上 海 理 达 仪 器 厂 PHS-3CW 型 ph 计 测 定 精 巢 表 面 及 精 液 的 ph 值 取 稀 释 后 的 精 子 悬 液 用 血 球 计 数 板 测 定 精 子 的 密 度 测 定 个 体 数 为 6 个 2.2.4 环 境 因 子 对 精 子 存 活 率 的 影 响 采 用 2.2.1 节 的 方 法 制 备 精 子 悬 液,1000r/ min 离 心 5min, 取 得 白 色 精 子 沉 淀,4 保 存 备 用 (1) 以 上 述 无 钙 离 子 人 工 海 水 作 为 基 础 培 养 液, 用 0.1mol/dm 3 的 NaOH 和 HCl 溶 液 调 节 ph 至 5,6,7,8,9,10,11 共 7 个 ph 梯 度, 依 次 为 实 验 1~ 7 组 取 精 子 沉 淀, 测 初 始 存 活 率 后 置 于 各 实 验 组 中, 用 枪 头 吹 打 散 开,15 保 存 ( 日 本 鑚 繁 殖 盛 期 水 温 变 化 范 围 在 15.0~26.5, 另 文 发 表, 本 实 验 取 下 限 低 温 值 ), 并 分 别 于 1,4,24,48,72h 时 测 定 精 子 存 活 率 (2) 用 NaCl 和 蒸 馏 水 配 制 15,20,25,30,35, 40,45 共 7 个 盐 度 梯 度, 依 次 为 实 验 1~7 组, 各 组 ph 均 调 节 至 8.0 取 精 子 沉 淀 于 各 实 验 组 中, 用 枪 头 吹 打 散 开,15 保 存, 并 分 别 于 1,4,24,48,72h 时 测 定 精 子 存 活 率 (3) 测 定 精 子 存 活 率 采 用 曙 红 B 染 色 法, 每 次 随 机 计 数 200 个 精 子, 分 4 个 随 机 计 数 点, 每 个 点 约 计 50 个 精 子, 统 计 样 品 的 精 子 存 活 率 各 实 验 均 重 复 3 次, 实 验 数 据 用 平 均 数 加 或 减 标 准 差 表 示 采 用 SPSS16.0 软 件 进 行 数 据 处 理, 并 进 行 单 因 子 方 差 分 析 (one way ANOVA),LSD 多 重 比 较 和 Duncan 检 验, 显 著 性 水 平 设 计 为 犘 =0.05, 犘 > 0.05 表 示 差 异 不 显 著, 犘 0.05 表 示 差 异 显 著 3 结 果 与 分 析 3.1 日 本 鑚 精 子 的 显 微 结 构 精 巢 切 片 观 察, 生 精 小 管 中 充 满 成 熟 的 精 子 ( 见 图 1 1) 精 子 为 非 鞭 毛 型, 形 状 多 样, 呈 扇 形 圆 球 形 或 不 规 则 形, 直 径 约 2.5μm 精 子 边 缘 呈 嗜 碱 性, 染 成 蓝 紫 色, 在 精 子 一 端 凸 起 处 有 一 嗜 碱 性 颗 粒, 精 子 内 部 被 染 成 红 色 的 嗜 酸 性 区 域 多 呈 U 形 涂 片 观 察, 活 精 子 无 运 动 能 力, 不 着 色 透 明 或 者 部 分 轻 微 着 色 ( 见 图 1 2): 从 精 子 正 面 看 在 其 中 心 有 一 红 色 细 环 状, 为 精 子 的 头 帽, 头 帽 外 围 的 圆 形 阴 影 区 为 沟 环 ; 从 精 子 侧 面 看 仅 在 一 端 凸 起 的 头 帽 处 染 成 粉 红 色, 而 死 精 子 全 部 染 成 红 色, 头 帽 沟 环 以 及 向 四 周 伸 出 的 辐 射 臂 清 晰 可 见 ( 见 图 1 3) 发 生 顶 体 反 应 的 活 精 子 仅 在 顶 体 翻 出 囊 基 部 呈 红 色, 死 精 子 顶 体 翻 出 囊 呈 红 色 或 全 部 着 色 ( 见 图 1 4) 3.2 日 本 鑚 精 子 的 超 微 结 构 扫 描 电 镜 显 示 日 本 鑚 精 荚 呈 椭 球 形, 大 小 不 一, 直 径 约 20~50μm( 见 图 1 5) 精 荚 壁 较 薄, 经 制 片 处 理 后 出 现 褶 皱, 并 紧 贴 着 内 部 排 列 紧 密 的 精 子, 表 面 可 见 颗 粒 状 精 液 单 个 精 子 呈 球 状, 直 径 2.5~ 3.3μm( 见 图 1 6) 头 帽 略 微 突 出, 圆 形 沟 环 直 径 约 1μm 沟 环 后 精 子 表 面 伸 出 10~20 条 辐 射 臂, 长 约 3μm 透 射 电 镜 观 察, 日 本 鑚 精 荚 壁 由 外 周 精 荚 基 质 浓 缩 而 成, 与 内 部 精 荚 基 质 无 明 显 界 限 ( 见 图 1 7) 精 荚 内 精 子 排 列 不 规 则, 在 一 个 切 面 上 可 同 时 看 到 精 子 被 纵 切 横 切 及 斜 切 的 形 态 在 精 子 纵 切 面 可 见 核 膜 内 陷 成 圆 形 核 杯, 染 色 质 呈 细 丝 状 或 颗 粒 状, 散 布 于 核 区, 并 延 伸 至 辐 射 臂 中 ( 见 图 1 8) 核 杯 腔 最 宽 处 约 2μm, 内 含 球 形 或 近 球 形 顶 体 顶 体 由 头 帽 顶 体 管 和 顶 体 囊 三 部 分 组 成 头 帽 电 子 密 度 最 高, 呈 圆 锥 状 突 起 覆 盖 在 顶 体 管 和 顶 体 囊 的 前 端 顶 体 管 呈 子 弹 形, 前 端 略 尖, 其 前 段 含 有 多 个 纵 行 排 列 的 细 管 状 结 构, 构 成 穿 孔 器 顶 体 囊 根 据 电 子 密 度 的 不 同 可 分 为 内 层 中 间 层 和 外 层, 呈 同 心 圆 状 包 裹 着 顶 体 管 ( 见 图 1 9), 其 中 以 内 层 和 外 层 电 子 密 度 较 高, 中 间 层 电 子 密 度 略 低, 但 最 厚, 外 层 最 薄 少 量 细 胞 质 夹 在 核 杯 和 顶 体 之 间, 在 核 杯 前 端 可 看 到 线 粒 体 及 小 囊 泡 结 构, 为 膜 复 合 体 ( 见 图 1 8,10) 中 心 体 分 布 在 顶 体 管 的 下 方, 呈 圆 柱 状, 与 顶 体 管 垂 直, 两 个 中 心 粒 相 距 约 0.6μm( 见 图 1 9,11) 部 分 精 子 中 可 观 察 到 胞 质 透 明 区 ( 见 图 1 10) 纳 精 囊 中 的 精 子 呈 弥 散 状, 有 些 精 子 已 崩 解 ( 见 图 1 12) 与 雄 体 精 子 相 比, 取 自 纳 精 囊 的 精 子 在 结 构 上 出 现 一 定 的 变 化 : 顶 体 管 中 的 纵 行 细 管 状 结 构 变 成 囊 泡 状 ; 中 心 体 位 置 前 移 ; 胞 质 透 明 区 扩 大 ( 见 图 1 13)
5 期 许 星 鸿 等 : 日 本 鑚 精 子 结 构 及 环 境 因 子 对 精 子 存 活 率 的 影 响 95 图 1 日 本 鑚 精 子 的 光 镜 及 电 镜 观 察 1. 精 巢 横 切 (H.E. 染 色 ), 表 示 精 子 内 嗜 碱 性 颗 粒 ( ) 1000, 标 尺 10μm;2-4. 精 子 涂 片 ( 曙 红 B 染 色 ), 表 示 活 精 子 正 面 ( ) 活 精 子 侧 面 ( ) 死 精 子 ( ) 发 生 顶 体 反 应 的 活 精 子 ( ) 和 死 精 子 ( ) 2000, 标 尺 5μm;5. 精 荚 扫 描 电 镜 照 片, 表 示 颗 粒 状 精 液 ( ) 1700, 标 尺 5.88μm;6. 精 子 扫 描 电 镜 照 片 5100, 标 尺 1.96μm;7. 精 荚 透 射 电 镜 照 片 3000, 标 尺 3.33μm;8. 贮 精 囊 内 精 子 纵 切 18000, 标 尺 0.56μm;9. 贮 精 囊 内 精 子 横 切 18000, 标 尺 0.56μm;10. 贮 精 囊 内 精 子 纵 切, 表 示 膜 复 合 体 ( ) 18000, 标 尺 0.56μm;11. 贮 精 囊 内 精 子 纵 切, 表 示 中 心 体 ( ) 45000, 标 尺 0.22μm;12. 纳 精 囊 内 精 子 切 片, 表 示 崩 解 精 子 ( ) 6000, 标 尺 1.67μm;13. 纳 精 囊 内 精 子 纵 切, 表 示 顶 体 管 中 囊 泡 状 结 构 ( ) 30000, 标 尺 0.33μm AC. 头 帽, AT, 顶 体 管,AV. 顶 体 囊,BG. 嗜 碱 性 颗 粒,C. 染 色 质,Ct. 中 心 体,CPA. 胞 质 透 明 区,DR. 沟 环,DS. 崩 解 精 子,EV. 顶 体 翻 出 囊,GS. 颗 粒 状 精 液,IL. 内 层,MC. 膜 复 合 体,ML. 中 间 层,N. 细 胞 核,NM. 核 膜,OL. 外 层,RA. 辐 射 臂,S. 精 子,SW. 精 荚 壁,VS. 囊 泡 状 结 构 3.3 日 本 鑚 精 液 ph 值 和 精 子 密 度 日 本 鑚 精 巢 表 面 ph 为 6.5±0.2, 精 巢 内 精 液 ph 为 7.0±0.2 精 子 密 度 平 均 为 3.47 10 9 ± 0.42 10 9 个 /ml 3.4 环 境 因 子 对 日 本 鑚 精 子 存 活 率 的 影 响 3.4.1 ph 对 精 子 存 活 率 的 影 响 从 表 1 可 以 看 出, 日 本 鑚 精 子 对 碱 性 环 境 的 耐 受 力 要 高 于 酸 性 环 境 保 存 1h 后 ph8 组 精 子 存
96 海 洋 学 报 32 卷 活 率 下 降 不 明 显, 在 ph7,9,10 时 实 验 组 精 子 存 活 率 有 一 定 下 降, 但 组 间 差 异 不 显 著 在 ph5,6,11 时 实 验 组 精 子 存 活 率 下 降 迅 速, 保 存 至 24h 时 精 子 存 活 率 仅 为 15.76%,19.83% 和 24.74%, 保 存 至 72h 时 均 死 亡 ph8 组 保 存 24h 时 的 精 子 存 活 率 可 达 73.58%, 显 著 高 于 其 他 各 组 保 存 至 72h 时 ph7~10 组 都 仍 有 一 定 的 精 子 存 活, 以 ph8 和 9 两 组 较 多, 精 子 存 活 率 分 别 为 16.37% 和 12.98% 表 1 狆 犎 对 日 本 鑚 精 子 存 活 率 的 影 响 ( 均 值 加 或 减 标 准 差 ) 时 间 /h 5 6 7 8 9 10 11 0 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 1 42.42±2.53 fb 54.85±1.32 eb 72.57±2.33 cb 87.41±1.79 aa 80.93±1.04 bb 76.24±2.20 bcb 61.26±3.58 db 4 32.15±2.48 dc 37.58±1.08 dc 66.64±2.88 bb 78.82±3.49 ab 68.17±3.95 bc 66.88±2.74 bc 47.65±2.20 cc 24 15.76±1.82 fd 19.83±1.40 efd 43.27±1.75 dc 73.58±1.71 ab 61.12±3.04 bd 50.55±3.20 cd 24.74±1.99 ed 48 6.83±0.62 de 11.91±2.06 cde 24.92±3.66 bd 43.16±2.55 ac 27.87±1.58 be 23.45±1.02 be 16.68±1.11 ce 72 0 cf 0 cf 10.94±1.35 be 16.37±2.43 ad 12.98±2.75 abf 9.35±1.99 bf 0 cf 注 : 采 用 单 因 子 方 差 分 析, 表 中 上 标 小 写 不 同 字 母 表 示 同 一 时 间 不 同 ph 有 显 著 差 异 ( 犘 <0.05), 大 写 不 同 字 母 表 示 同 一 ph 不 同 时 间 有 显 著 差 异 ( 犘 <0.05) 3.4.2 盐 度 对 精 子 存 活 率 的 影 响 从 表 2 可 见, 在 精 子 保 存 1h 后 盐 度 为 20,25, 30 的 实 验 组 日 本 鑚 精 子 存 活 率 较 高, 其 中 以 盐 度 25 组 的 精 子 存 活 率 下 降 最 慢, 保 存 24h 后 精 子 存 活 率 可 达 85.46% 盐 度 15 和 35 两 组 精 子 存 活 率 下 降 略 快, 保 存 至 24h 时 的 精 子 存 活 率 分 别 为 51.83% 和 41.94% 盐 度 为 40 和 45 的 实 验 组 精 子 存 活 率 下 降 迅 速, 并 分 别 于 保 存 72 和 48h 后 全 部 死 亡 保 存 至 72h 时 以 盐 度 25 组 精 子 存 活 率 26.45% 为 最 高, 盐 度 20 和 30 组 次 之, 精 子 存 活 率 分 别 为 19.93% 和 16.27%, 而 盐 度 15 和 35 两 组 仅 有 少 量 精 子 存 活 表 2 盐 度 对 日 本 鑚 精 子 存 活 率 的 影 响 ( 均 值 加 或 减 标 准 差 ) 时 间 /h 15 20 25 30 35 40 45 0 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 92.51±0.73 A 1 77.58±1.92 cb 88.23±1.61 aba 91.55±0.88 aa 85.49±1.85 bb 68.37±1.54 db 42.55±2.89 eb 28.47±2.69 fb 4 68.42±1.73 cc 82.73±2.59 bb 88.92±1.37 aab 78.67±1.41 bc 57.18±3.44 dc 29.55±2.12 ec 15.13±1.06 fc 24 51.83±2.18 dd 76.17±3.40 bc 85.46±2.62 ab 68.75±2.96 cd 41.94±2.12 ed 17.92±1.35 fd 6.55±1.99 gd 48 28.34±1.36 de 49.61±1.88 bd 55.28±2.14 ac 42.35±0.94 ce 20.76±1.04 ee 4.47±0.67 fe 0 ge 72 8.73±1.07 cf 19.93±2.70 be 26.45±1.94 ad 16.27±0.87 bf 5.62±0.73 cf 0 df 0 de 注 : 采 用 单 因 子 方 差 分 析, 表 中 上 标 小 写 不 同 字 母 表 示 同 一 时 间 不 同 盐 度 有 显 著 差 异 ( 犘 <0.05), 大 写 不 同 字 母 表 示 同 一 盐 度 不 同 时 间 有 显 著 差 异 ( 犘 <0.05) 4 讨 论 4.1 日 本 鑚 精 荚 的 形 态 结 构 软 甲 类 与 桡 足 类 的 精 子 被 输 精 管 末 端 的 分 泌 物 [7] 包 被 而 形 成 精 荚 精 荚 形 态 各 异, 在 十 足 目 爬 行 亚 目 中 主 要 有 三 种 类 型 : 柄 状 ( 异 尾 类 ) 管 状 ( 长 尾 类 ) 球 形 或 椭 球 形 ( 短 尾 类 ) [8] 日 本 鑚 精 荚 呈 椭 球 形, 与 中 华 绒 螯 蟹 ( 犈 狉 犻 狅 犮 犺 犲 犻 狉 狊 犻 狀 犲 狀 狊 犻 ) [9] 相 似, 但 直 径 明 显 小 于 后 者 的 120~170μm 十 足 目 大 部 分 种 类 的 精 荚 具 有 1~3 层 精 荚 壁, 它 们 起 到 保 护 抵 御 [10 11] 酸 碱 及 抗 菌 等 多 重 作 用 日 本 鑚 精 荚 壁 和 内 部 精 荚 基 质 无 明 显 差 异, 结 构 简 单, 保 护 作 用 较 弱, 可 能 与 其 在 交 配 过 程 中 的 精 荚 和 外 界 环 境 接 触 时 间 较 短 有 关 4.2 日 本 鑚 精 子 的 类 型 与 结 构 特 征 [7] 日 本 鑚 精 子 为 非 鞭 毛 型, 同 其 他 甲 壳 动 物 王
5 期 许 星 鸿 等 : 日 本 鑚 精 子 结 构 及 环 境 因 子 对 精 子 存 活 率 的 影 响 97 春 琳 等 [5] 曾 报 道 日 本 鑚 精 子 大 小 为 (15~30) μ m (12~26) μ m, 而 本 实 验 采 用 光 镜 及 电 镜 等 多 种 方 法 观 察 到 的 日 本 鑚 精 子 直 径 均 在 2.5~3.3μm 之 间, 与 前 者 相 差 较 大, 但 与 堵 南 山 等 [12] 对 三 疣 梭 子 蟹 ( 犘 狅 狉 狋 狌 狀 狌 狊 狋 狉 犻 狋 狌 犫 犲 狉 犮 狌 犾 犪 狋 狌 狊 ) 精 子 的 观 察 结 果 3.0μm 相 近, 略 小 于 中 华 绒 螯 蟹 (4.5μm) 和 长 江 华 溪 蟹 ( 犛 犻 狀 狅 狆 狅 狋 犪 犿 狅 狀 狔 犪 狀 犵 狋 狊 犲 犽 犻 犲 狀 狊 犲 )(5.7μm) [12-13] 日 本 鑚 精 子 的 结 构 组 成 与 其 他 短 尾 类 相 似, 但 也 有 一 定 的 差 异 日 本 鑚 精 子 核 杯 较 深 顶 体 管 中 形 成 穿 孔 器 的 特 点 和 同 科 的 三 疣 梭 子 蟹 相 同, 但 前 者 顶 体 囊 外 层 没 有 片 层 结 构, 辐 射 臂 数 量 略 多 顶 体 囊 内 含 顶 体 素 或 卵 膜 溶 素, 为 数 种 蛋 白 酶 [12] 的 混 合 物, 可 在 精 卵 相 遇 时 释 放 出 溶 解 卵 膜, 打 开 精 子 入 卵 通 道 日 本 鑚 精 子 顶 体 酶 的 具 体 成 分 穿 孔 器 的 作 用 方 式 以 及 顶 体 反 应 条 件 有 待 于 进 一 步 研 究 在 日 本 鑚 精 子 中 可 观 察 到 胞 质 透 明 区, 在 以 往 的 爬 行 亚 目 精 子 研 究 中 未 见 报 道 在 秀 丽 白 虾 ( 犈 狓 狅 狆 犪 犾 犪 犲 犿 狅 狀 犿 狅 犱 犲 狊 狋 狌 狊 ) [14] 和 日 本 沼 虾 ( 犕 犪 犮 狉 狅 犫 狉 犪 犮 犺 犻 狌 犿 狀 犻 狆 狅 狀 犲 狀 狊 犲 ) [15] 等 游 泳 亚 目 精 子 核 质 中 发 现 大 量 空 泡, 空 泡 有 何 作 用 尚 不 明 确 短 尾 类 的 非 鞭 毛 型 精 子 无 运 动 能 力, 向 四 周 发 出 的 辐 射 臂 可 增 加 其 与 卵 子 相 遇 的 机 会 以 往 报 [12] 道 将 辐 射 臂 中 的 丝 状 物 质 称 为 微 丝, 笔 者 认 为 不 太 恰 当 微 丝 为 肌 动 蛋 白 单 体 组 装 成 的 细 胞 质 骨 [16] 架, 而 辐 射 臂 为 细 胞 核 向 外 延 伸 的 突 起 外 包 一 层 细 胞 膜 构 成, 内 部 的 丝 状 物 质 应 为 染 色 质 丝 而 非 微 丝 该 结 构 有 利 于 受 精 作 用 的 完 成 爬 行 亚 目 精 子 的 结 构 特 征 可 以 反 映 出 各 类 群 的 [12,17] [18] 生 殖 进 化 趋 势 长 尾 类 精 子 顶 体 结 构 简 单, 突 露 在 核 上, 顶 体 囊 仅 具 雏 形 顶 体 管 该 类 精 子 体 [19] 积 较 大, 如 犎 狅 犿 犪 狉 狌 狊 犪 犿 犲 狉 犻 犮 犪 狀 狌 狊 的 精 子 全 长 达 19.3μm, 其 中 顶 体 长 14.0μm 异 尾 类 的 精 子 具 备 [17] 了 短 而 简 单 的 初 级 顶 体 管, 长 度 也 明 显 缩 短 犇 犻 狅 犵 犲 狀 犲 狊 犮 狌 狊 狋 狅 狊 的 精 子 在 异 尾 类 中 是 最 长 的, 全 长 为 10.0μm, 其 中 顶 体 长 8.5μm 短 尾 类 精 子 顶 体 缩 小 呈 球 形 内 陷 于 核 杯 腔 中, 并 出 现 了 发 达 的 顶 体 [12,20] 管 和 穿 孔 器 迄 今 发 现 的 短 尾 类 精 子 直 径 均 小 于 5.7μm 本 实 验 中 观 察 到 的 日 本 鑚 精 子 的 结 构 特 征 与 之 相 符 由 此 可 见, 爬 行 亚 目 精 子 结 构 的 演 化 方 向 是 : 精 子 体 积 逐 渐 缩 小, 顶 体 结 构 由 简 单 到 复 杂, 顶 体 可 视 为 爬 行 亚 目 的 生 殖 进 化 特 征 4.3 雄 体 贮 精 囊 和 雌 体 纳 精 囊 中 的 精 子 比 较 日 本 鑚 雄 体 贮 精 囊 中 的 精 子 贮 存 在 精 荚 中, 而 雌 体 纳 精 囊 中 的 精 子 分 散 成 游 离 状 态, 可 能 是 利 于 和 卵 子 的 结 合 锯 缘 青 蟹 ( 犛 犮 狔 犾 犪 狊 犲 狉 犪 狋 犪 ) 纳 精 囊 [21] 中 的 精 子 也 呈 分 散 状 态 精 荚 在 纳 精 囊 中 的 裂 解 机 制 尚 不 清 楚, 有 必 要 对 日 本 鑚 纳 精 囊 的 结 构 及 其 内 环 境 进 行 深 入 的 研 究, 这 将 有 助 于 开 展 精 子 的 体 外 保 存 和 人 工 授 精 工 作 [22] 林 勤 武 等 曾 报 道 中 国 对 虾 雄 体 贮 精 囊 与 雌 体 纳 精 囊 中 的 精 子 比 较, 有 一 定 差 异 : 前 者 较 粗 短 核 膜 完 整 环 状 片 层 不 发 达 等 本 实 验 发 现, 与 雄 体 精 子 相 比, 取 自 日 本 鑚 纳 精 囊 的 精 子 在 结 构 上 也 出 现 一 定 的 变 化 : 顶 体 管 中 的 纵 行 细 管 状 结 构 变 成 囊 泡 状, 中 心 体 位 置 前 移, 胞 质 透 明 区 扩 大 笔 者 认 为, 这 些 变 化 是 精 子 为 发 生 顶 体 反 应 而 作 的 准 备 : 顶 体 管 中 出 现 的 囊 泡 利 于 胞 吐 作 用 的 进 行, 中 心 体 位 置 前 移 与 顶 体 管 将 要 前 伸 有 关, 而 胞 质 透 明 区 扩 大 是 由 于 精 子 变 态 期 胞 质 的 退 化 在 本 实 验 中 发 现, 取 自 日 本 鑚 雄 体 贮 精 囊 的 精 子 同 样 可 大 量 发 生 顶 体 反 应, 所 以 对 两 类 精 子 受 精 能 力 的 差 异 程 度 还 需 进 一 步 研 究 4.4 日 本 鑚 精 子 的 活 力 对 于 甲 壳 动 物 的 非 鞭 毛 型 精 子 活 力 判 断, 无 法 采 用 常 规 的 运 动 性 指 标, 常 以 精 子 存 活 率 来 说 明 其 [23] 活 力 状 况 管 卫 兵 等 发 现 台 盼 蓝 染 色 法 适 用 于 [24] 锯 缘 青 蟹 精 子 的 活 力 评 价, 朱 冬 发 等 则 认 为 在 三 疣 梭 子 蟹 精 子 活 力 判 断 中 采 用 曙 红 B 效 果 较 好 本 文 在 预 实 验 中 对 比 了 台 盼 蓝 和 曙 红 B 两 种 染 料 对 日 本 鑚 精 子 的 染 色 效 果, 认 为 台 盼 蓝 染 色 后 的 精 子 蓝 色 深 浅 程 度 较 难 判 断, 而 曙 红 B 染 色 清 晰, 更 适 用 于 评 价 日 本 鑚 精 子 的 活 力 在 昆 虫 精 子 活 力 评 价 研 究 中, 成 功 地 采 用 了 一 [25-26] 些 新 方 法, 如 应 用 络 合 异 硫 氰 酸 荧 光 素 的 豌 豆 凝 集 素 (FITC PSA) 进 行 精 子 顶 体 荧 光 标 记 对 精 子 顶 体 反 应 的 评 价 对 精 子 染 色 质 结 构 进 行 分 析 对 精 子 死 活 的 荧 光 直 接 进 行 评 价 对 精 子 顶 体 酶 的 活 力 进 行 测 定 等 这 些 方 法 是 否 适 用 于 日 本 鑚 等 甲 壳 动 物 精 子 的 活 力 评 价 需 要 进 一 步 研 究 日 本 鑚 栖 息 于 低 潮 线 附 近, 本 实 验 测 得 的 日 本 鑚 精 子 在 盐 度 稍 低 且 偏 碱 性 的 环 境 中 存 活 率 较 高, 与 其 成 体 的 生 活 环 境 相 符 合 日 本 鑚 精 巢 表 面 ph 为 6.5 精 液 ph 为 7.0, 均 低 于 其 最 适 ph, [27] 类 似 的 情 况 见 于 Gatij 等 对 虹 鳟 鱼 精 子 的 研 究
98 海 洋 学 报 32 卷 报 道 中 精 子 内 环 境 ph 值 要 比 外 环 境 下 降 1 个 ph 单 位 关 于 偏 碱 性 的 环 境 可 以 增 强 精 子 的 [28] 活 力 的 特 性 也 发 现 于 海 水 鱼 类 和 海 洋 环 节 动 [29] 物 中 国 海 洋 大 学 海 洋 生 命 学 院 姜 明 老 师 和 青 岛 医 学 院 电 镜 室 谭 金 山 老 师 对 本 工 作 给 予 大 力 支 持 和 帮 助, 谨 致 谢 忱 参 考 文 献 : [1] 梁 象 秋, 方 纪 祖, 杨 和 荃. 水 生 生 物 学 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社,1996:360. [2] 王 春 琳, 陈 建 青, 叶 晓 园, 等. 日 本 鑚 的 营 养 成 分 组 成 分 析 [J]. 营 养 学 报,2005,27(1):81 83. [3] 刘 洪 军. 海 水 经 济 蟹 类 养 殖 技 术 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社,2002:246. [4] 王 春 琳, 薛 良 义, 刘 凤 燕, 等. 日 本 鑚 繁 殖 生 物 学 的 初 步 研 究 :Ⅰ. 雌 性 繁 殖 习 性 [J]. 浙 江 水 产 学 报,1996,15(4):261 266. [5] 王 春 琳, 蒋 霞 敏, 陈 惠 群, 等. 日 本 鑚 繁 殖 生 物 学 的 初 步 研 究 :Ⅱ. 雄 性 繁 殖 习 性 及 胚 胎 发 育 [J]. 东 海 海 洋,2000,18(1):43 49. [6] LEUNG TJR,LAWRENCE AL.Observationonthedeclineinspermqualityof 犘 犲 狀 犪 犲 狌 狊 犲 狋 犻 犳 犲 狉 狌 狊 underlaboratoryconditions[j].aq uaculture,1987,65:363 370. [7] 李 霞. 水 产 动 物 组 织 胚 胎 学 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社,2006:276. [8] DUDENHAUSENEE,TALLBOTP.Anultrastructuralcomparisonofsoftandhardenedspermatophoresfromthecrayfish 犘 犪 犮 犻 犳 犪 狊 狋 犪 犮 狌 狊 犾 犲 狀 犻 狌 狊 犮 狌 犾 狌 狊 Dana[J].CanJZool,1983,61:182 194. [9] 王 群, 赵 云 龙, 赖 伟, 等. 中 华 绒 螯 蟹 精 荚 形 成 的 超 微 结 构 研 究 [J]. 华 东 师 范 大 学 学 报,2000,46(3):98 103. [10] BENINGERPG.Functionalanatomyofthemalereproductivesystemandthefemalespermathecainthesnowcrab 犆 犺 犻 狅 狀 狅 犲 犮 犲 狋 狊 狅 狆 犻 犾 狅 (O.fabricius)(Decapoda:Mjidae)andahypothesisforfertilization[J].JCrustBiol,1988,8(3):322 332. [11] HINSCH G W.Ultrastructureofthespermandspermaophoresofthegoldencrab 犌 犲 狉 狔 狅 狀 犳 犲 狀 犲 狉 犻 andacloselyrelatedspecies,thered crab 犌. 狇 狌 犻 狀 狇 狌 犲 犱 犲 狉 狊,fromtheeasternGultofMexico[J].JournalofCrustaceanBiology,1988,8:340 345. [12] 堵 南 山, 赖 伟, 陈 立 侨, 等. 蟹 类 精 子 超 微 结 构 的 比 较 研 究 [J]. 动 物 学 研 究,1999,20(5):372 378. [13] 王 兰. 长 江 华 溪 蟹 精 子 的 超 微 结 构 [J]. 动 物 学 报,2000,46(2):227 229. [14] 姜 叶 琴, 杨 万 喜. 秀 丽 白 虾 精 子 结 构 及 生 殖 进 化 特 征 [J]. 东 海 海 洋,2002,20(2):45 50. [15] 杨 万 喜, 周 宏. 日 本 沼 虾 生 精 细 胞 核 的 形 态 变 化 及 其 在 真 虾 部 Caridea 生 殖 进 化 中 的 地 位 [J]. 应 用 生 态 学 报,2000,11(5):763 766. [16] 翟 中 和, 王 喜 忠, 丁 明 孝. 细 胞 生 物 学 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,2007:267. [17] TUDGECC.Comarativeultrastructureofhermitcrabspermatozoa(Decapoda,Anomura,Paguroidea)[J].JCrustBiol,1992,12(3): 387 409. [18] BEACH D,TALBOTP.Ultrastructuralcomparisonofspermfromthecrayfishes 犆 犺 犲 狉 犪 狓 狋 犲 狀 狌 犻 犿 犪 狀 犽 狊 and 犆 犺 犲 狉 犪 狓 犪 犾 犫 犻 犱 狌 狊 [J].JCrustBi ol,1987,7(2):205 218. [19] TALBOTP,CHANMANONP.Ultrastructureofspermfromthelobster, 犎 狅 犿 犪 狉 狌 狊 犪 犿 犲 狉 犻 犮 犪 狀 狌 狊 [J].JUltrastructRes,1980,70:275 286. [20] 上 官 步 敏, 李 少 菁. 锯 缘 青 蟹 精 子 超 微 结 构 的 研 究 [J]. 动 物 学 报,1994,40(1):7 11. [21] 成 永 旭, 李 少 菁, 王 桂 忠. 锯 缘 青 蟹 排 卵 后 纳 精 囊 及 其 内 部 精 子 的 超 微 结 构 [J]. 上 海 水 产 大 学 学 报,2000,9(1):69 71. [22] 林 勤 武, 刘 瑞 玉, 相 建 海. 中 国 对 虾 精 子 的 形 态 结 构 生 理 生 化 功 能 的 研 究 :Ⅰ. 精 子 的 超 显 微 结 构 [J]. 海 洋 与 湖 沼,1991,22(5):397 401. [23] 管 卫 兵, 王 桂 忠, 李 少 菁, 等. 锯 缘 青 蟹 精 子 低 温 冷 藏 及 精 子 活 力 的 染 色 法 评 价 [J]. 台 湾 海 峡,2002,21(4):457-463. [24] 朱 冬 发, 周 帅. 三 疣 梭 子 蟹 精 子 活 力 的 评 价 方 法 [J]. 水 产 学 报,2008,32(5):765 771. [25] HUNTERF M,BIRKHEADTR.Spermviabilityandspermcompetitionininsects[J].CurrentBiology,2002,12:121 123. [26] BERNASCONIG,HELLRIEGELB,HEYLAND A,etal.Spermsurvivalinthefemalereproductivetractinthefly 犛 犮 犪 狋 犺 狅 狆 犺 犪 犵 犪 狊 狋 犲 狉 犮 狅 狉 犪 狉 犻 犪 (L)[J].JInsectPhysiol,2002,48:197 203. [27] GATTIJL,BILLARDR,ChristenR.Ionicregulationoftheplasmamembranepotentialofrainbowtroutspermatozoa:roleininitiationof sperm motility[j].celphysiol,1990,143:546 554. [28] ANDRZEIC.FactorsafectingmotilitycharacteristicsandfertilizingabilityofseaLampreyspermatozoa[J].TransanctionsofAmerican fisheriessociety,2002,131:193 202. [29] 牛 从 从, 张 志 峰, 邵 明 瑜. 单 环 刺 虫 精 子 生 物 学 特 性 和 环 境 因 子 的 关 系 [J]. 中 国 水 产 科 学,2005,12(5):556 561.
5 期 许 星 鸿 等 : 日 本 鑚 精 子 结 构 及 环 境 因 子 对 精 子 存 活 率 的 影 响 99 犛 狆 犲 狉 犿 犪 狋 狅 狕 狅 犪 犿 狅 狉 狆 犺 狅 犾 狅 犵 狔 犪 狀 犱 犻 狀 犳 犾 狌 犲 狀 犮 犲 狅 犳 犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾 犳 犪 犮 狋 狅 狉 狊 狅 狀 狏 犻 犪 犫 犻 犾 犻 狋 狔 狉 犪 狋 犲 狊 犻 狀 犮 狉 犪 犫 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 XU Xing hong 1,YANBin lun 1,XUJia tao 1,XU Guo cheng 1,PU Yin fang 1,WUJian xin 1 (1. 犓 犲 狔 犔 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔 狅 犳 犑 犻 犪 狀 犵 狊 狌 犘 狉 狅 狏 犻 狀 犮 犲 犳 狅 狉 犕 犪 狉 犻 狀 犲 犅 犻 狅 狋 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔, 犎 狌 犪 犻 犺 犪 犻 犐 狀 狊 狋 犻 狋 狌 狋 犲 狅 犳 犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔, 犔 犻 犪 狀 狔 狌 狀 犵 犪 狀 犵 222005, 犆 犺 犻 狀 犪 ) 犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋 :Themorphologyandstructureofspermfromthecrab 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 wereobservedinde tailwithalightandelectron microscope,andtheultrastructuralcomparisonofthespermatozoacolected from maleseminalreceptacleandfemalespermathecahasbeensummarized.meanwhilethephysiological densityandphofsperm weremeasured.theinfluenceofphandsalinityonthespermviabilityrateswere alsostudied.thematurespermof 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 hasnotanyflagela,andisconsistsofanacrosome, nuclearcup,membranecomplexand10~20radialarms.thesphericalacrosomeiscomprisedofapicalcap, acrosomalvesicleandacrosomaltubule.theacrosomeissurroundedwithnuclearcupwhichcontainsfila mentousorgrainularchromatin.theradialarmswhichextendfromspermsurfacewerefiledwithkaryo plasemandhavenocapableofmovement.thespermin maleseminalreceptacleforms manyspheroidal spermatophore,butthesperminfemalespermathecaisdispersed.severalultrastructuraldiferencesexist intwosourcessperm:thespermfromfemalespermathecahasvesicle likestructureinacrosomaltubule, thecentrosomemovesforwardandcytoplasmicpelucidareabecomeslargerthanthespermfrom malese minalreceptacle.thephvalueoftestissurfacein 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 is6.5±0.2,whilethephvalueof semenis7.0±0.2.thedensityofspermis3.47 10 9 ±0.42 10 9 /ml -1.Forspermviability,theopti mumphis7~9,andthebestis8,theoptimumsalinityis20~30,andthebestis25. 犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊 : 犆 犺 犪 狉 狔 犫 犱 犻 狊 犼 犪 狆 狅 狀 犻 犮 犪 ;spermatozoa;morphology;viabilityrates;ph;salinity