中 華 民 國 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 科 教 處 補 助 大 眾 科 學 普 及 教 育 計 畫 義 守 大 學 醫 學 院 生 物 科 技 學 系 謝 文 權 教 授 製 作 教 師 手 冊 ~~ 生 物 可 分 解 掩 埋 分 解 實 驗 科 普 教 具 ~~ 1. 前 言 : 生 活 富 裕 化 造 成 很 多 化 學 商 品 的 大 量 使 用, 塑 膠 商 品 在 日 常 生 活 中 廣 泛 被 使 用, 也 是 污 染 我 們 環 境 最 嚴 重 的 一 項 商 品 如 何 解 決 垃 圾 問 題, 減 少 環 境 污 染 問 題, 需 要 全 民 一 起 努 力 去 解 決 近 年 科 學 家 為 了 解 決 環 境 污 染 問 題, 致 力 於 生 物 可 分 解 材 料 的 研 究, 希 望 能 為 地 球 近 一 份 心 力, 給 下 一 世 代 的 子 孫 們, 能 有 一 個 乾 淨 清 潔 的 地 球 為 了 提 高 社 會 大 眾 對 生 物 可 分 解 塑 膠 材 料 的 認 識, 義 守 大 學 生 物 科 技 學 系 生 醫 材 料 實 驗 室, 設 計 開 發 了 一 組 [ 生 物 可 分 解 掩 埋 分 解 實 驗 科 普 教 具 ], 讓 社 會 大 眾 了 解, 塑 膠 污 染 問 題 以 及 使 用 生 物 可 分 解 商 品 的 好 處, 加 深 對 環 境 保 護 的 認 識 2. 研 究 背 景 : 生 體 内 分 解 高 分 子 在 很 早 以 前 就 己 經 被 廣 泛 使 用 了 這 種 生 體 内 分 解 高 分 子, 主 要 是 因 為 它 的 生 體 適 合 性 和 生 體 吸 収 性 對 人 體 不 會 産 生 免 疫 發 炎 性 而 被 用 在 醫 療 用 材 料, 如 縫 線 被 覆 膜 骨 折 固 定 材 等 等 方 面 1980 年 代 麻 省 理 工 學 院 的 羅 伯 藍 格 (Robert Langer) 教 授 ; 哈 佛 醫 學 院 的 約 瑟 夫 瓦 肯 提 (Joseph Vacanti) 以 及 其 弟 查 理 斯 瓦 肯 提 (Charles Vacanti) 等 人, 鑑 於 移 植 用 組 織 器 官 取 得 不 易, 提 出 了 一 個 新 的 構 想 若 是 人 類 的 組 織 或 器 官, 能 夠 像 製 造 零 件 一 般 的 利 用 科 學 的 方 法 來 製 造, 或 許 可 以 降 低 組 織 器 官 的 來 源 不 足 的 問 題, 於 是 他 們 首 次 利 用 一 系 列 的 實 驗, 利 用 生 物 可 分 解 的 高 分 子 材 料 (Biodegradable polymer) 結 合 細 胞 的 植 入, 可 以 培 養 出 新 生 的 軟 骨 組 織 等, 開 啟 了 組 織 工 程 (Tissue engineering) 的 新 研 究 領 域 這 種 利 用 特 殊 的 生 物 高 分 子 材 料, 架 構 出 三 維 空 間 的 立 體 支 架 (Scaffold), 讓 植 入 的 細 胞 可 以 在 其 中 生 長 並 增 生 的 技 術, 是 嘗 試 去 結 合 人 體 組 織 移 植 與 人 工 材 料 修 復 的 優 點, 使 得 組 織 工 程 原 理 的 確 立, 而 且 也 讓 用 生 物 可 分 解 高 分 子 作 為 生 醫 材 料 的 應 用 更 顯 得 其 重 要 性 在 同 個 時 期 (1980 年 代 ), 地 球 上 的 各 種 環 境 汚 染, 是 世 界 各 國 面 臨 的 重 大 問 題 環 境 汚 染 的 防 止 環 境 保 全 資 源 保 護 的 觀 點 下, 能 在 自 然 環 境 下 被 微 生 物 分 解 的 高 分 子 的 研 究, 己 經 是 非 常 迫 切 的 需 要 現 在 地 球 上 的 環 境 汚 染 問 題, 大 致 有 :1. 地 球 温 暖 化 2. 酸 性 雨 3. 臭 氧 層 的 破 壊 4. 廢 棄 物 等 等 特 別 是 化 學 合 成 的 高 分 子 塑 膠, 不 僅 是 在 産 業 農 業 活 動 上, 一 般 的 消 費 者 的 日 常 生 活 中 也 非 常 普 及 化, 己 經 是 必 要 而 不 可 1
欠 缺 的 物 品 塑 膠 能 大 量 的 普 及, 像 紙 張 木 材 玻 璃 和 鋼 鐵 一 様 成 為 主 要 的 工 商 業 材 料, 主 要 是 因 為 它 有 優 越 的 化 學 性 質 耐 薬 品 性 耐 久 性 質 地 輕 加 工 容 易 等 等, 而 且 由 於 製 造 價 格 的 便 宜, 容 易 大 量 生 産 的 結 果, 使 得 塑 膠 在 大 量 使 用 廢 棄 後, 因 為 不 能 分 解 而 引 起 了 各 種 的 環 境 問 題 例 如 塑 膠 廢 棄 物 隨 著 河 川 流 向 大 海, 造 成 海 洋 生 物 因 誤 食 不 能 消 化 或 纏 住 身 體 無 法 解 開 而 死 亡 ; 或 者 由 於 塑 膠 的 不 能 分 解, 造 成 掩 埋 土 地 的 不 足, 使 得 垃 圾 大 量 的 不 法 投 棄 ( 圖 1-1) 若 是 將 塑 膠 以 燃 燒 來 處 理 又 會 造 成 戴 奥 辛 的 發 生, 燃 燒 時 産 生 的 二 氧 化 炭 也 造 成 地 球 温 暖 化 等 等 問 題 在 這 種 情 況 下, 近 年 自 然 環 境 下 能 被 微 生 物 分 解 的 塑 膠 的 開 發 : 微 生 物 合 成 的 高 分 子 天 然 高 分 子 或 者 是 生 物 分 解 可 能 的 化 學 合 成 高 分 子 等 等 的 研 究, 被 認 為 是 解 決 環 境 問 題 的 方 法 之 一, 而 成 了 注 目 的 焦 點 圖 1-1. 塑 膠 廢 棄 物 對 生 物 的 危 害 以 及 不 法 投 棄 垃 圾 天 然 物 誘 導 化 學 合 成 及 微 生 物 合 成 而 來 的 生 物 分 解 性 高 分 子, 可 以 製 作 成 各 種 塑 膠 産 品, 當 使 用 廢 棄 後 存 在 於 土 壤 中 或 者 是 海 洋 中 的 微 生 物, 可 以 將 這 種 塑 膠 産 品 分 解 成 低 分 子 的 物 質 最 後 變 成 二 氧 化 炭 和 水 微 生 物 的 分 解 腐 植 物 (Biomass) 可 以 作 為 肥 料 留 在 土 壤 中 供 植 物 的 生 長 使 用, 二 氧 化 炭 再 循 環 到 大 氣 中 進 行 光 合 作 用 製 成 各 種 的 糖 類 醇 類 有 機 酸, 又 可 以 再 被 微 生 物 吸 収 利 用, 形 成 一 個 可 以 循 環 再 利 用 的 系 統, 所 以 生 物 分 解 性 高 分 子 是 一 種 對 環 境 無 害, 適 合 環 境 使 用 的 緑 色 高 分 子 (Green Polymer)*[ 註 1] ( 圖 1-2) *[ 註 1] Green polymer 一 詞 在 環 境 汚 染 改 善 有 關 的 生 物 分 解 性 高 分 子 話 題 中 常 被 使 用 它 是 指 對 於 環 境 無 害, 不 會 汚 染 環 境 所 新 開 發 出 來 的 高 分 子 國 内 常 見 被 翻 譯 成 緑 色 高 分 子 (Green polymer) 或 是 緑 色 塑 膠 (Green plastic) 等 等 本 人 在 翻 譯 時 也 直 接 譯 成 緑 色 一 詞, 希 望 緑 色 這 名 詞 能 適 切 的 表 達 出 這 種 高 分 子 的 函 義, 使 人 一 看 這 名 詞 就 明 瞭 是 這 種 既 能 用 於 日 常 生 活 中, 使 用 廢 棄 後 在 環 境 又 能 分 解 對 環 境 無 害, 適 合 自 然 環 境 的 高 分 子 2
圖 1-2. 生 物 可 分 解 塑 膠 的 循 環 使 用 示 意 圖 3. 生 物 可 分 解 材 料 的 合 成 與 分 解 原 理 : 自 然 界 存 在 的 微 生 物, 可 以 合 成 一 種 的 聚 酯 高 分 子 物 質, 作 為 生 命 的 能 源 (ATP) 而 貯 蔵 在 身 體 内 當 没 有 營 養 源 時, 為 了 能 源 (ATP) 的 獲 得 或 着 是 蛋 白 質 的 合 成, 此 時 貯 蔵 在 身 體 内 的 聚 酯 高 分 子 物 質 會 被 分 解 而 被 代 謝 利 用 這 種 微 生 物 合 成 代 表 性 的 聚 酯 高 分 子 是 R 體 的 羥 基 丁 酸 物 質 [3-Hydroxybutyric acid] 所 構 成 的 聚 羥 基 烷 酯 高 分 子 Poly(3-hydroxybutyric acid) [P(3HB)]( 圖 2-1) 1925 年 法 國 巴 黎 的 Pasutul 研 究 所 的 微 生 物 學 者 Lemoigne, 首 次 從 微 生 物 Bacillus megaterium 的 體 内 將 高 分 子 淬 取 出 1958 年 Macrae 和 wilkinson 學 者 利 用 醗 酵 合 成 法 進 行 P(3HB) 高 分 子 的 合 成 終 於 在 1961 年 由 Schlegel 學 者 利 用 微 生 物 Ralstonia eutropha, 成 功 的 生 物 合 成 出 P(3HB) 高 分 子 由 於 生 物 分 解 性 高 分 子 的 醗 酵 合 成 法 的 成 功,1980 年 英 國 的 ICI 公 司 將 培 養 條 件 像 基 質 量 PH 溶 存 酸 素 濃 度 (DO) 炭 素 源 以 及 3
窒 素 源 的 比 率 等 等 的 控 制, 而 醗 酵 合 成 量 産 出 P(3HB) 高 分 子, 此 時 醗 酵 合 成 的 工 業 生 産 法 大 致 被 確 立 出 來 現 在 自 然 界 中 存 在 的 微 生 物 中, 體 内 可 以 蓄 積 P(3HB) 高 分 子 的 微 生 物 己 經 有 大 多 數 被 篩 選 出 來 這 種 由 微 生 物 所 製 作 出 來 的 高 分 子, 因 為 是 1. 生 物 可 分 解 性,2. 生 體 相 容 性,3. 熱 可 塑 性 等 等 的 優 點, 所 以 除 了 應 用 在 環 境 污 染 的 保 護 外, 在 組 織 工 程 ( 再 生 醫 療 ) 以 及 醫 藥 製 劑 上, 也 開 始 被 大 量 研 究 使 用 碳 素 源 ( 食 物 ) Ralstonia eutropha Alcaligenes latus Burkholderia cepacia D1 Delftia acidovorans 能 源 供 給 Poly(3-hydroxyalkanoates) P(3HA) 聚 羥 基 烷 酯 類 物 質 典 型 的 生 物 可 分 解 塑 膠 生 物 可 分 解 性 生 體 的 相 容 性 熱 可 塑 性 CH 3 O O CH CH 2 C x Poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB) 聚 羥 基 丁 酸 鹽 物 質 圖 2-1. 微 生 物 合 成 典 型 的 生 物 可 分 解 高 分 子 的 原 理 與 其 特 性 在 自 然 的 環 境 中 P(3HB) 分 解 微 生 物 會 在 體 外 分 泌 出 PHB 分 解 酵 素, 將 水 不 溶 解 的 P(3HB) 加 水 分 解 成 水 溶 性 的 (R)-3-Hydroxybutyric acid (3HB) 二 量 體 或 是 單 體, 而 且 將 這 些 分 解 生 成 物 會 被 吃 進 微 生 物 體 內 當 作 是 碳 素 源 或 是 能 量 取 得 的 原 料 而 被 代 謝 還 有 P(3HB) 分 解 微 生 物 的 數 量, 有 報 告 指 出 大 約 是 佔 土 壤 中 所 含 有 的 全 微 生 物 數 量 的 0.1-10% 左 右 而 已 到 目 前 為 止 從 各 式 各 樣 的 自 然 環 境 中 大 約 有 50 種 類 的 P(3HB) 分 解 微 生 物 被 分 離 出 來, 而 且 已 被 確 定 代 表 性 的 P(3HB) 分 解 微 生 物, 像 是 從 土 壤 中 分 離 的 Pseudomonas lemoigeei 或 是 從 活 性 污 泥 中 分 離 出 來 的 Alcaligenes faecalis T1 或 是 像 真 核 生 物 ( 黴 菌 類 ) 的 Penicillium funiculosum 等 等 還 有 從 海 水 中 分 離 出 Comamonas testosterone; 從 湖 水 中 分 離 出 Pseudomonas stutzeri Comamonas acidovorans 等 等, 而 在 實 驗 中 也 分 離 出 Ralstonia pickettii, 因 此 P(3HB) 可 以 被 在 各 種 的 自 然 環 境 中 所 棲 息 的 微 生 物 ( 黴 菌 放 線 菌 格 蘭 姆 陰 性 菌 格 蘭 姆 陽 性 菌 ) 所 分 解 關 於 P(3HB) 分 解 菌 的 分 解 酵 素 的 分 泌 機 制, 我 們 使 用 數 種 類 的 分 解 微 生 物 做 說 明 A. faecalis T1 使 用 以 fructose glucose (R)-3-hydroxybutyric acid 以 及 P(3HB) 為 單 一 的 4
碳 素 源 時,PHB 分 解 酵 素 會 在 菌 體 外 分 泌 ; 另 一 方 面 Comamonas sp. 只 有 使 用 以 P(3HB) 為 單 一 的 碳 素 源 時 才 會 分 泌 出 PHB 分 解 酵 素, 而 且 在 P(3HB) 以 外 加 入 其 他 的 碳 素 源 時, 很 容 易 利 用 的 碳 素 源 會 很 顯 著 的 抑 制 分 解 酵 素 的 合 成, 由 此 可 知, 這 個 菌 株 的 分 解 酵 素 的 合 成 會 根 據 P(3HB) 而 受 到 誘 導, 反 之 會 因 為 其 他 易 利 用 的 碳 素 源 代 謝 物 而 受 到 抑 制 還 有 C. acidovorans 的 PHB 分 解 酵 素 的 分 泌 機 構, 也 是 和 Comamonas sp. 時 會 受 到 同 樣 的 抑 制 使 用 P. stutzeri YM1006 的 分 解 酵 素 的 分 泌 機 制 作 調 查 的 結 果 P(3HB) 以 及 其 共 聚 合 物 的 P(3HB-co-3HV) 或 是 分 解 生 成 物 的 R 體 3-hydroxybutyric acid 以 及 4-hydroxybutyric acid 作 為 唯 一 的 碳 素 源 時, 讓 P. stutzeri YM1006 生 殖 之 時 就 會 分 泌 出 PHB 分 解 酵 素, 但 是 使 用 有 R 體 光 學 異 性 體 的 S 體 3-hydroxybutyric acid 為 唯 一 的 碳 素 源 時, 和 P. stutzeri YM1006 菌 的 R 體 作 同 樣 程 度 的 生 殖 培 養 時, 培 養 液 的 上 清 液 是 完 全 沒 有 觀 測 到 P(3HB) 分 解 活 性 從 這 些 結 果 得 到 的 結 論 是, 在 P. stutzeri YM1006 菌 株 P(3HB) 的 分 解 生 成 物 的 (R)-3-hydroxybutyric acid 是 分 解 酵 素 分 泌 的 誘 導 物 質 4. P(3HB) 分 解 酵 素 的 性 質 自 然 界 的 微 生 物 為 了 分 解 高 結 晶 性 的 P(3HB) 薄 膜 或 是 粒 子, 微 生 物 會 在 菌 體 外 分 泌 出 一 種 的 分 解 酵 素 分 解 P(3HB) 薄 膜 或 是 粒 子, 而 分 解 生 成 物 則 會 被 微 生 物 利 用 作 為 生 命 活 動 的 能 源 生 物 分 解 性 高 分 子 的 分 解, 一 般 是 微 生 物 先 在 菌 體 外 分 泌 出 分 解 酵 素 而 附 著 在 材 料 的 表 面 開 始 分 解 過 程 酵 素 會 將 酯 (Ester) 結 合 或 是 胜 肽 (Peptide) 結 合 等 等 的 化 學 結 合 由 加 水 分 解 反 應 而 切 斷 其 結 果 産 生 出 一 量 體 或 是 二 量 體 的 低 分 子 生 成 物, 這 種 分 解 被 稱 為 一 次 分 解 過 程 分 解 後 的 低 分 子 生 成 物 會 被 微 生 物 吸 収 進 入 體 内, 經 過 各 種 的 代 謝 路 徑, 合 成 為 生 體 高 分 子 或 是 能 源 生 産 利 用, 而 變 成 二 酸 化 炭 素 和 水, 這 種 分 解 被 稱 為 完 全 分 解 過 程 菌 體 外 分 解 酵 素 和 菌 體 内 分 解 酵 素 ( 結 晶 性 的 P(3HB) 不 能 分 解 ) 的 最 大 的 差 別, 就 是 結 晶 化 後 硬 的 P(3HB) 薄 膜 或 是 粒 子 等 等 的 製 品 可 以 被 分 解 [* 註 2] 現 在 菌 體 内 能 分 泌 分 解 酵 素 的 細 菌 從 土 壤 活 性 汚 泥 海 水 湖 等 等 的 環 境 中 己 經 有 15 種 類 以 上 被 分 離 鑑 定 出 來 從 土 壤 活 性 汚 泥 海 水 湖 等 等 的 環 境 中 所 篩 選 出 菌 體 内 能 分 泌 分 解 酵 素 的 細 菌 其 分 解 酵 素 的 分 子 量 大 約 38000~60000 的 範 圍, 是 從 單 量 體 的 多 胜 肽 (polypeptide) 所 構 成, 等 電 點 大 約 是 存 在 於 中 性 到 鹸 性, 最 適 合 的 ph 値 除 了 R. Pickettii YM-b 以 及 P. funiculosum ATCC9644 分 解 酵 素 是 存 在 於 酸 性 領 域 中 之 外, 其 他 的 分 解 酵 素 都 是 存 在 於 中 性 到 鹸 性 [* 註 2] 通 常 微 生 物 會 産 生 二 種 類 的 酵 素 一 是 菌 體 内 分 解 酵 素, 二 是 菌 體 外 分 解 酵 素 菌 體 内 分 解 酵 素 可 以 分 解 菌 體 内 的 P(3HB) 物 質, 留 在 菌 體 内 的 P(3HB) 通 常 是 非 結 晶 狀 態 如 海 綿 一 様, 分 子 和 分 子 之 間 有 非 常 多 的 水 分 存 在 當 從 菌 體 内 將 P(3HB) 物 質 抽 出 時, 由 於 各 種 的 物 理 處 理 或 是 加 熱 處 理,P(3HB) 會 變 成 高 結 晶 性 的 物 質 結 晶 後 的 P(3HB) 是 無 法 被 菌 體 内 的 分 解 酵 素 所 分 解, 但 是 菌 體 外 的 分 解 酵 素 却 可 以 將 結 晶 性 的 P(3HB) 分 解 5. 教 具 : 5
如 包 裝 內 所 附 [ 生 物 可 分 解 蔬 菜 ] 二 枚 6. 對 象 : 國 民 小 學 3-6 年 級 以 及 國 民 中 學 學 生 7. 實 驗 所 需 要 時 間 : 實 驗 說 明 :1-2 小 時 實 驗 觀 察 :30-50 天 結 果 整 理 :1-2 小 時 8. 實 驗 方 法 : 老 師 們 請 先 閱 讀 上 面 有 關 生 物 可 分 解 塑 膠 之 詳 細 資 料, 在 實 驗 開 始 之 前 先 與 同 學 說 明 這 類 產 品 的 資 訊, 讓 同 學 了 解 生 物 可 分 解 的 原 理 以 及 微 生 物 的 運 作, 並 明 瞭 環 境 清 潔 的 重 要 性 之 後 實 驗 說 明 如 下 : 老 師 們 可 以 自 由 發 揮 如 下 所 述 三 點, 最 後 再 整 合 同 學 的 實 驗 經 過 以 及 報 告 讓 同 學 了 解 實 驗 室 隨 著 時 間 地 點 以 及 環 境 有 所 差 異 1. 同 學 們 請 將 實 驗 觀 察 用 的 生 物 可 分 解 蔬 菜 上, 寫 上 實 驗 開 始 的 日 期, 將 二 枚 的 生 物 可 分 解 蔬 菜, 在 學 生 們 各 自 所 想 到 的 場 所 作 掩 埋 ( 例 如 : 花 園 中 花 盆 內 腐 葉 土 中 堆 肥 中 水 槽 內 生 活 廢 水 中 等 等 ), 做 一 掩 埋 實 驗 觀 察 並 做 紀 錄 2. 經 過 一 定 時 間 之 後, 開 始 觀 察 各 掩 埋 場 所 中, 生 物 可 分 解 蔬 菜 的 分 解 速 度 是 如 何 變 化 ( 例 如 : 色 澤 的 變 化 或 是 蔬 菜 的 分 解 劣 化 等 等 ), 做 一 調 查 還 有 在 各 自 選 擇 的 掩 埋 場 所 中, 其 分 解 過 程 的 差 異 以 及 其 他 在 實 驗 中 影 響 微 生 物 分 解 塑 膠 所 注 意 到 的 部 份, 詳 細 考 慮 之 後 可 以 用 繪 圖 或 是 文 章 方 式 做 一 整 理 說 明 ( 請 將 實 驗 過 程 記 錄 在 心 得 報 告 中 ) 3. 同 學 們 做 完 報 告 後, 可 以 將 選 擇 相 似 的 掩 埋 場 所 的 同 學, 分 組 在 一 起 討 論 其 實 驗 分 解 過 程 的 結 果, 是 否 有 所 差 異? 其 造 成 實 驗 差 異 的 問 題 點, 做 一 整 理 報 告 9. 學 習 的 思 考 方 向 : 1. 現 在 所 使 用 的 塑 膠 產 品 大 部 分 都 是 以 垃 圾 處 理 而 被 丟 棄 由 於 如 此 的 丟 棄 處 理 方 式, 而 產 生 了 像 因 燃 燒 產 生 戴 奧 辛 的 問 題 ; 或 是 因 所 產 生 的 二 氧 化 碳 造 成 地 球 溫 暖 化 問 題 ; 或 是 因 無 法 分 解 而 造 成 垃 圾 掩 埋 場 場 地 不 足 等 問 題 在 這 些 各 種 問 題 之 中, 同 學 們 多 加 思 考 環 保 問 題 點 2. 生 物 可 分 解 蔬 菜 的 原 料 是 什 麼? 為 什 麼 可 以 分 解? 這 類 商 品 其 功 用 或 是 作 為 環 境 污 染 對 策 的 可 能 性 等 等 請 加 以 思 考 在 思 考 的 同 時, 對 於 環 境 中 微 生 物 的 活 動 與 作 用 ; 對 分 解 塑 膠 的 原 理 也 可 以 找 資 料 一 併 作 說 明 6