免疫学实验常见Q&A

免 疫 学 实 验 常 见 Q&A Western Blot 常 见 问 题 及 处 理 ( 一 ) 1 western blot 的 优 点 答 : 灵 敏, 可 达 ng 级, 用 Ecl 显 色 法 理 论 上 可 达 pg 级 方 便, 特 异 性 高 2 为 什 么 我 的 细 胞 提 取 液 中 没 有 目 标 蛋 白? 答 : 原 因 有 很 多 : a) 你 的 细 胞 中 不 表 达 这 种 蛋 白 质, 换 一 种 细 胞 ;b) 你 的 细 胞 中 的 蛋 白 质 被 降 解 掉 了, 你 必 需 加 入 PMSF, 抑 制 蛋 白 酶 活 性 ;c) 你 的 抗 体 不 能 识 别 目 标 蛋 白, 多 看 看 说 明, 看 是 否 有 问 题 3 我 的 细 胞 提 取 液 有 的 有 沉 淀, 有 的 很 清 亮, 为 什 么 呢? 答 : a) 有 沉 淀 可 能 因 为 你 的 蛋 白 没 有 变 性 完 全, 可 以 适 当 提 高 SDS 浓 度, 同 时 将 样 品 煮 沸 时 间 延 长, b) 也 不 排 除 你 的 抗 原 浓 度 过 高, 这 时 再 加 入 适 量 上 样 缓 冲 液 即 可 4 我 做 的 蛋 白 质 分 子 量 很 小 (10KD), 请 问 怎 么 做 WB? 答 : 可 以 选 择 0.2μml 的 膜, 同 时 缩 短 转 移 时 间 也 可 以 将 两 张 膜 叠 在 一 起, 再 转 移 其 他 按 步 骤 即 可 5 我 的 目 的 带 很 弱, 怎 么 加 强? 答 : 可 以 加 大 抗 原 上 样 量 这 是 最 主 要 的 同 时 也 可 以 将 一 抗 稀 释 比 例 降 低 6 胶 片 背 景 很 脏, 有 什 么 解 决 方 法? 答 : 减 少 抗 原 上 样 量, 降 低 一 抗 浓 度, 改 变 一 抗 孵 育 时 间, 提 高 牛 奶 浓 度 7 目 标 带 是 空 白, 周 围 有 背 景, 是 为 什 么? 答 : 你 的 一 抗 浓 度 较 高, 二 抗 上 HRP 催 化 活 力 太 强, 同 时 你 的 显 色 底 物 处 于 一 个 临 界 点, 反 应 时 间 不 长, 将 周 围 底 物 催 化 完, 形 成 了 空 白 即 反 亮 现 象 将 一 抗 和 二 抗 浓 度 降 低, 或 更 换 新 底 物 8 我 的 胶 片 是 一 片 空 白, 是 怎 么 回 事? 答 : 如 果 能 够 排 除 下 面 的 几 个 问 题 那 么 问 题 多 半 出 现 在 一 抗 和 抗 原 制 备 上 a) 二 抗 的 HRP 活 性 太 强, 将 底 物 消 耗 光 ;b) ECM 底 物 中 H2O2, 不 稳 定, 失 活 ;c) ECL 底 物 没 覆 盖 到 相 应 位 置 ;d) 二 抗 失 活 9 我 在 显 影 液 中 显 影 1 分 钟 和 5 分 钟 后, 底 片 漆 黑 一 片, 是 什 么 原 因 呢? 答 :a) 可 能 是 红 灯 造 成 的, 胶 片 本 来 就 被 曝 光 了, 可 以 在 完 全 黑 暗 的 情 况 下 操 作. 看 是 否 有 改 善.;b) 显 影 时 间 过 长 10 DAB 好 还 是 ECM 好? 答 :DAB 有 毒, 但 是 比 较 灵 敏, 是 HRP 最 敏 感 的 底 物 ;ECM 结 果 容 易 控 制, 但 被 催 化 时 灵 敏 度 差 一 点, 但 如 果 达 到 阀 值, 就 特 别 灵 敏, 可 以 检 测 pg 级 抗 原 要 看 你 实 验 的 情 况 11 抗 原 检 测 出 的 分 子 量 比 资 料 上 的 大, 是 怎 么 回 事? 答 :a) 抗 原 形 成 了 二 聚 体 增 多 巯 基 乙 醇 量, 煮 沸 变 性 时 间 延 长, 可 以 打 开 二 聚 体 b) 蛋 白 本 身 的 修 饰 如 : 糖 基 化, 磷 酸 化 等

12 蛋 白 转 移 不 到 膜 上, 但 胶 上 有, 同 时 Marker 转 上 去 了, 为 什 么? 答 : 可 能 是 :a) 样 品 浓 度 过 低 ;b) 转 移 时 间 不 够, 13 磷 酸 化 抗 体 的 检 测 样 本 制 备 时 是 否 一 定 要 加 NaF 等? 答 :NaF 是 一 种 广 谱 磷 酸 化 酶 的 抑 制 剂, 一 般 最 好 加 但 是 不 加 也 可 以, 大 部 分 时 候 是 不 用 加 的 14 要 验 证 某 个 细 胞 上 有 无 该 蛋 白 的 存 在, 需 要 做 免 疫 组 化 和 western blot 试 验 吗? 做 这 两 个 试 验 时 的 一 抗 和 二 抗 可 以 共 用 吗? 答 : 1 免 疫 组 化 可 以 用 来 进 行 定 位, 但 是 不 能 精 确 定 量, 而 且 有 时 会 有 假 阳 性, 不 易 与 背 景 区 分 ;Western blot 可 以 特 异 性 检 测 某 个 蛋 白 质 分 子, 进 行 定 量, 但 是 不 能 定 位 2 两 种 实 验 的 一 抗 有 时 候 不 能 通 用, 公 司 的 产 品 说 明 一 般 都 会 说 明 可 以 进 行 什 么 实 验, 在 免 疫 组 化 时, 是 否 适 合 石 蜡 切 片 或 者 冰 冻 切 片 15 做 Western Blot 时, 提 取 蛋 白 后 冻 存 ( 未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 ), 用 的 博 士 德 的 一 抗, 开 始 还 有 点 痕 迹, 现 在 越 来 越 差, 上 样 量 已 加 到 120μg, 换 了 个 santa cloz 的 一 抗 仍 不 行 是 什 么 原 因? 蛋 白 酶 抑 制 剂 单 加 PMSF 行 吗? 答 : 怀 疑 是 样 品 问 题, 可 能 是 :1, 样 品 不 能 反 复 冻 融 ;2, 样 品 未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 同 时, 建 议 检 查 Western Blot 过 程, 提 高 一 抗 浓 度 对 于 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 来 说, 一 般 加 PMSF 就 可 以 了, 最 好 能 多 加 几 中 种 蛋 白 酶 抑 制 剂 16 细 胞 水 平 要 做 western blot, 多 少 细 胞 提 的 蛋 白 够 做 western blot? 答 : 一 般 5 10^6 就 足 够 了 17 同 一 样 品 能 同 时 提 RNA 又 提 蛋 白 么? 这 样 对 western blot 有 无 影 响? 答 : 能, 没 有 问 题 18 同 一 蛋 白 样 品 能 同 时 进 行 两 种 因 子 的 Western Blot 检 测 吗? 答 : 当 然 可 以, 有 的 甚 至 可 以 同 时 测 几 十 种 样 品 19 如 果 目 标 蛋 白 是 膜 蛋 白 或 是 胞 浆 蛋 白, 操 作 需 要 注 意 什 么? 答 : 如 果 是 膜 蛋 白 和 胞 浆 蛋 白, 所 用 的 去 垢 剂 要 温 和 得 多, 这 时 最 好 加 上 NaF 去 抑 制 磷 酸 化 酶 的 活 性 20 我 的 样 品 的 蛋 白 含 量 很 低, 每 微 升 不 到 1 微 克, 但 是 在 转 膜 时 经 常 会 发 现 只 有 一 部 分 蛋 白 转 到 了 膜 上, 就 是 在 转 膜 后 染 胶 发 现 有 的 孔 所 有 的 蛋 白 条 带 都 在, 只 是 颜 色 变 淡 了, 有 什 么 办 法 可 以 解 决? 答 : 你 可 以 加 大 上 样 量, 没 有 问 题, 还 有 转 移 时 你 可 以 用 减 少 电 流 延 长 时 间, 加 20% 甲 醇 21 想 分 离 的 蛋 白 是 分 子 量 200kd 的,SDS-PAGE 电 泳 的 分 离 胶 浓 度 多 大 合 适? 积 层 胶 的 浓 度 又 该 用 多 少? 这 么 大 分 子 量 的 蛋 白 容 易 作 Western Blot 吗? 答 :200kd 的 蛋 白 不 好 做, 分 离 胶 用 7%, 积 层 胶 3.5% 22 如 果 上 样 量 超 载, 要 用 什 么 方 法 来 增 加 上 样 量?

答 : 可 以 浓 缩 样 品, 也 可 以 根 据 你 的 目 标 分 子 量 透 析 掉 一 部 分 小 分 子 蛋 白 一 般 地, 超 载 30% 是 不 会 有 问 题 的 如 果 已 经 超 了 不 少 了, 而 且 小 分 子 量 的 也 要, 可 以 考 虑 加 大 胶 的 厚 度, 可 以 试 试 1.5mm 的 23 蛋 白 变 性 后 可 以 存 放 多 久? 答 :-80, 一 两 年 没 有 问 题 最 关 键 两 条 : 不 要 被 蛋 白 酶 水 解 掉 ; 不 要 被 细 菌 消 化 掉 ( 也 是 被 酶 水 解 了 ) 24 我 所 测 定 的 蛋 白 分 子 量 是 105KD, 按 理 说 分 离 胶 应 当 采 用 7.5%, 但 资 料 却 要 求 分 离 胶 和 浓 缩 胶 均 采 用 11% 的 配 方, 不 知 为 何? 答 : 上 述 提 到 的 两 种 凝 胶 均 可 以 使 用, 因 为 105KD 的 蛋 白 在 上 述 两 种 胶 的 线 性 分 辨 范 围 内, 但 需 注 意 条 带 位 置 25 二 抗 是 生 物 素 化 的 抗 体, 三 抗 是 亲 和 素 生 物 素 体 系, 不 知 采 用 这 样 的 方 案 后, 封 闭 液 是 否 要 作 调 整, 能 否 再 用 5% 的 脱 脂 奶 粉 呢? 好 像 有 资 料 说 脱 脂 奶 粉 会 影 响 亲 和 素 生 物 素 的 生 成, 是 吗? 解 答 : 不 能 使 用 脱 脂 奶 粉, 因 为 脱 脂 奶 粉 中 含 生 物 素, 用 BSA 代 替 应 该 好 一 点. 26 问 一 般 一 次 上 样 的 蛋 白 总 量 是 多 少, 跟 目 的 蛋 白 的 表 达 量 有 关 系 吗? 答 :Western Blot 一 般 上 样 30-100 微 克 不 等, 结 果 跟 目 的 蛋 白 的 丰 度 上 样 量 一 二 抗 的 量 和 孵 育 时 间 都 有 关 系, 也 与 显 色 时 间 长 短 有 关 开 始 摸 条 件 时, 为 了 拿 到 阳 性 结 果, 各 个 步 骤 都 可 以 量 多 一 点 时 间 长 一 点, 当 然 背 景 也 就 出 来 了 要 拿 到 好 的 结 果, 如 果 抗 体 好 的 话 比 较 容 易, 抗 体 不 好 的 话 就 需 要 反 复 地 试 了, 当 然 有 的 不 适 合 Western Blot 的 怎 样 做 也 不 行 27 做 组 织 样 品 的 western 的 时 候, 怎 样 处 理 样 品? 答 : 必 须 进 行 研 磨 匀 浆 超 声 处 理, 蛋 白 质 溶 解 度 会 更 好, 离 心 要 充 分, 膜 蛋 白 需 用 更 剧 烈 的 方 法 抽 提, 低 丰 度 膜 蛋 白 可 能 还 要 分 步 抽 提 ( 超 速 离 心 ) 还 有 一 点 就 是 组 织 中 的 蛋 白 酶 活 性 更 强, 需 要 注 意 抑 制 蛋 白 酶 的 活 性 ( 加 入 PMSF) 28 问 大 分 子 量 蛋 白 200KD, 在 做 western 要 注 意 什 么 呢? 答 : 做 200kd 蛋 白 的 Western Blot 时 要 注 意, 分 离 胶 最 好 选 择 >7% 的 ; 剥 胶 时 要 小 心 ; 转 移 时 间 需 要 相 应 延 长 ; 要 做 分 子 量 参 照 ( 否 则 出 现 杂 带 不 知 道 如 何 分 析 ) 29 有 什 么 方 法 可 以 提 高 上 样 量? 答 :a) 可 以 浓 缩 样 品 ; 增 大 上 样 体 积 来 增 大 上 样 量 ;b) 用 5 倍 的 上 样 缓 冲 液 来 稀 释 变 性 30 蛋 白 的 上 样 量 有 没 有 什 么 具 体 的 要 求? 答 : 上 样 量 要 根 据 实 验 的 要 求 来 定, 如 果 要 求 是 定 量 和 半 定 量 的 Western Blot 则 上 样 量 要 均 等, 如 果 只 是 要 定 性, 则 没 有 太 大 的 关 系, 尽 量 多 上 就 行 了, 但 是 不 要 超 载. 31 一 抗, 二 抗 的 比 例 是 否 重 要? 答 : 比 较 重 要, 调 整 好 一 抗, 二 抗 的 比 例, 可 以 去 掉 部 分 非 特 异 的 本 底 32 要 做 磷 酸 化 某 因 子 Western Blot, 其 二 抗 有 何 要 求? 答 : 对 二 抗 无 要 求, 要 看 你 实 验 条 件 来 选 择, 一 般 推 荐 用 HRP 标 记 的 二 抗

33 免 疫 组 化 和 Western Blot 可 以 用 同 一 种 抗 体 吗? 答 : 免 疫 组 化 时 抗 体 识 别 的 是 未 经 变 性 处 理 的 抗 原 决 定 簇 ( 又 称 表 位 ), 有 些 表 位 是 线 性 的, 而 有 的 属 于 构 象 型 ; 线 性 表 位 不 受 蛋 白 变 性 的 影 响, 天 然 蛋 白 和 煮 后 的 蛋 白 都 含 有 ; 构 象 型 表 位 由 于 受 蛋 白 空 间 结 构 限 制, 煮 后 变 性 会 消 失 如 果 你 所 用 的 抗 体 识 别 的 是 蛋 白 上 连 续 的 几 个 氨 基 酸, 也 就 是 线 性 表 位, 那 么 这 种 抗 体 可 同 时 用 于 免 疫 组 化 和 Western, 而 如 果 抗 体 识 别 构 象 形 表 位, 则 只 能 用 于 免 疫 组 化 34 Western Blot 中 抗 体 的 可 以 重 复 应 用 吗? 答 : 抗 体 工 作 溶 液 一 般 不 主 张 储 存 反 复 使 用, 但 是 如 抗 体 比 较 珍 贵, 可 反 复 使 用 2-3 次 稀 释 后 应 在 2-3 天 内 使 用,4 度 保 存, 避 免 反 复 冻 融 35 在 做 Western Blot 时,PVDF 膜 用 甲 醇 浸 泡 的 目 的? 答 :PVDF 膜 用 甲 醇 泡 的 目 的 是 为 了 活 化 PVDF 膜 上 面 的 正 电 基 团, 使 它 更 容 易 跟 带 负 电 的 蛋 白 质 结 合, 做 小 分 子 的 蛋 白 转 移 时 多 加 甲 醇 也 是 这 个 目 的 36 检 测 同 一 抗 体 的 磷 酸 化 和 非 磷 酸 化 的 抗 原 可 以 在 同 一 张 膜 上 吗? 答 : 可 以 37 转 膜 后 经 丽 春 红 染 色 的 条 带, 为 什 么 大 蛋 白 分 子 的 一 端 的 转 膜 好 象 不 是 很 好, 为 什 么? 答 : 这 是 正 常 的, 大 分 子 的 蛋 白 转 移 的 慢, 你 延 长 转 移 时 间 和 电 流, 大 分 子 一 端 就 会 好 的 多, 但 是 小 分 子 的 就 有 可 能 会 变 淡 38 做 Western Blot 时, 同 样 的 抗 体 免 疫 组 化 能 做 出, 而 Western Blot 却 不 能? 答 : 这 多 半 是 抗 体 的 问 题, 要 看 抗 体 的 说 明, 是 否 能 做 Western Blot 和 免 疫 组 化 39 如 果 是 6 8 转 印 膜, 要 加 多 少 一 抗? 答 : 一 抗 的 稀 释 度 是 有 说 明 的, 根 据 你 的 一 抗 看 看 就 知 道 了, 但 是 那 么 大 的 膜 孵 育 体 积 一 般 最 少 为 3-5ml 40 上 下 槽 缓 冲 液 有 何 要 求, 怎 样 才 能 达 到 最 佳 效 果 答 : 无 特 殊 要 求 但 我 们 一 般 是 上 槽 放 新 鲜 的 缓 冲 液, 下 槽 可 以 是 重 复 使 用 过 一 两 次 的 缓 冲 液 41 跑 电 泳 的 时 候 配 的 胶 总 是 缩 是 什 么 原 因 呢? 是 有 的 成 分 不 对 吗? 答 : 没 什 么 问 题, 就 是 你 胶 里 的 水 分 被 蒸 发 了 过 夜 时 拿 保 鲜 膜 包 起 来, 在 里 面 加 点 水 保 持 湿 度 就 可 以 了 ; 也 可 能 母 液 (30% 聚 丙 酰 胺 ) 有 问 题, 你 可 以 重 新 配 制 一 份 观 察 ; 能 够 替 换 的 试 剂, 尽 量 换 一 下, 选 用 好 的 试 剂 42 蛋 白 质 的 分 子 量 跨 度 很 大, 如 要 分 离 小 21KD, 中 至 66KD, 大 至 170KD, 可 以 一 次 做 好 吗? 答 : 这 么 广 的 分 布 不 好 转 移, 一 般 建 议 :21kd 和 66kd 可 以 一 起 转,12%SDS- PAGE, 湿 转 120mA, 45-60min 就 可 以 了, 可 以 根 据 你 实 验 室 的 经 验 调 节 ;170kd 用 7%SDS-PAGE,200mA 90-120min 43 不 能 很 好 地 将 大 分 子 量 蛋 白 转 移 到 膜 上, 转 移 效 率 低 怎 么 样 解 决?

答 : 可 以 考 虑 : 转 移 缓 冲 液 中 加 入 20% 甲 醇 ( 是 指 终 浓 度 ), 因 为 甲 醇 可 降 低 蛋 白 质 洗 脱 效 率, 但 可 增 加 蛋 白 质 和 NC 膜 的 结 合 能 力, 甲 醇 可 以 防 止 凝 胶 变 形, 甲 醇 对 高 分 子 量 蛋 白 质 可 延 长 转 移 时 间 ; 转 移 缓 冲 液 加 入 终 浓 度 0.1%SDS, 也 是 为 了 增 加 转 移 效 率 ; 用 优 质 的 转 移 膜, 或 使 用 小 孔 径 的 NC 膜 (0.2 微 米 ). 44 我 用 的 是 可 视 marker, 但 是 电 泳 总 跑 不 全 8 条 带, 请 问 什 么 原 因? 怎 样 改 善? 胶 用 过 8%,10%,12%, 都 是 这 样 marker 是 新 买 的 答 : 一 般 来 说, 是 小 分 子 量 Marker 跑 走 了, 增 加 胶 浓 度 或 减 少 电 泳 时 间 试 试 看 当 然 梯 度 胶 也 是 不 错 的 选 择 45 是 否 Western Blot 实 验 半 定 量 一 定 要 加 ACTIN 内 参? 答 : 对 于 发 表 文 章 的 实 验 最 好 加 内 参, 实 验 严 谨 46 核 内 抗 原 Western Blot 内 参 选 择 什 么 合 适? 答 : 可 以 选 用 组 蛋 白, 组 蛋 白 在 细 胞 核 中 的 表 达 是 很 稳 定 的, 有 很 多 都 可 以 当 成 内 参, 在 网 上 查 查 就 可 以 选 出 你 要 的 内 参 47 做 半 定 量 Western Blot, 内 参 β-actin,gapdh 哪 个 好? 答 : 选 用 beta-actin 就 可 以 48 想 问 一 下 细 胞 裂 解 液 选 择 蛋 白 酶 抑 制 剂 时 有 什 么 原 则 吗? 受 不 受 组 织 来 源 的 影 响? 胞 膜 和 胞 浆 有 区 别 吗? 答 : 一 般 来 说 提 取 时 加 入 广 谱 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 就 可 以 了, 操 作 时 保 持 低 温 除 非 有 文 献 特 别 指 明 用 特 殊 的 方 法, 一 般 来 说 都 没 有 区 别 49 转 膜 后 的 脱 脂 奶 粉 封 闭 液 是 5% 的 TBST 脱 脂 奶 粉, 其 中 TBST 最 后 那 个 T 是 Tween 吗, 浓 度 多 大? 答 : 是 Tween, 配 方 如 下 :Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl:8g, Tris base:2.42g 加 水 800ml 溶 解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用 HCl 调 节 ph 至 7.4, 加 水 定 容 至 1L. 50 封 闭, 一 抗, 二 抗 时 的 温 度 有 没 有 什 么 规 定 呢, 比 如 在 室 温 里 做, 或 者 要 在 4 度 下? 答 : 均 可 在 室 温 进 行, 如 果 时 间 不 够, 一 抗 孵 育 可 以 先 在 室 温 进 行 一 个 小 时, 然 后 4 度 过 夜 51 请 问 一 下 PVDF 膜 和 硝 酸 膜 结 合 蛋 白 的 原 理 是 什 么? 答 : 一 般 而 言, 硝 酸 纤 维 素 膜 是 通 过 疏 水 作 用 来 和 蛋 白 质 相 联, 这 样 的 话, 反 复 洗 几 次 后, 蛋 白 容 易 掉 下 来, 结 果 较 差 PVDF 膜 主 要 通 过 它 膜 上 的 正 电 荷 和 蛋 白 接 合, 同 时 也 有 疏 水 作 用, 但 相 对 较 弱 这 样 的 话,PVDF 膜 和 蛋 白 接 合 较 牢, 不 易 脱 落, 结 果 较 好 52 怎 样 才 能 把 胶 跑 的 非 常 漂 亮, 泳 道 都 能 很 直, 上 样 的 量 和 灌 胶 是 否 很 重 要, 电 压 有 什 么 要 求? 答 : 影 响 跑 胶 跑 的 质 量, 有 以 下 几 个 因 素 :1 电 压, 小 的 电 压 会 使 胶 的 分 子 筛 效 应 得 到 充 分 发 挥 电 压 越 小, 条 带 越 漂 亮, 浓 缩 胶 55v, 分 离 胶 75v 就 能 跑 得 很 好 2 胶 的

均 匀 度, 胶 越 均 匀, 条 带 越 窄, 分 离 越 均 匀 倒 胶 之 前, 一 定 要 充 分 混 匀, 玻 璃 板 一 定 要 干 净, 双 蒸 水 隔 离 时, 一 定 要 比 较 轻 地 加 上 去, 避 免 稀 释 上 层 的 分 离 胶. 53 为 什 么 提 高 大 分 子 量 蛋 白 的 转 移 的 时 候, 小 分 子 量 蛋 白 会 丢 失 一 些 哪? 什 么 原 因? 答 : 小 分 子 的 蛋 白 在 转 移 过 程 中, 会 透 过 膜 去, 所 以 大 分 子 的 上 去 以 后, 有 一 部 分 小 分 子 的 就 透 过 去 了 Western Blot 常 见 问 题 及 处 理 ( 二 ) 1. 电 泳 中 常 出 现 的 一 些 现 象 : ) 条 带 呈 笑 脸 状 原 因 : 凝 胶 不 均 匀 冷 却, 中 间 冷 却 不 好 ; 电 泳 系 统 温 度 偏 高 ( 条 带 呈 皱 眉 状 原 因 : 可 能 是 由 于 装 置 不 合 适, 特 别 可 能 是 凝 胶 和 玻 璃 挡 板 底 部 有 气 泡, 或 者 两 边 聚 合 不 完 全 拖 尾 原 因 : 样 品 溶 解 不 好 纹 理 ( 纵 向 条 纹 ) 原 因 : 样 品 中 含 有 不 溶 性 颗 粒 条 带 偏 斜 原 因 : 电 极 不 平 衡 或 者 加 样 位 置 偏 斜 条 带 两 边 扩 散 原 因 : 加 样 量 过 多 2.Western blot 结 果 中 背 景 较 高 可 能 的 原 因 及 建 议 : 膜 封 闭 不 够 延 长 封 闭 的 时 间 ; 选 择 更 加 适 合 的 封 闭 液 一 抗 稀 释 度 不 适 宜 对 抗 体 进 行 滴 度 测 试, 选 择 最 适 宜 的 抗 体 稀 释 度 一 抗 孵 育 的 温 度 偏 高 建 议 4 结 合 过 夜 选 择 的 膜 容 易 产 生 高 背 景 一 般 硝 酸 纤 维 素 膜 的 背 景 会 比 PVDF 膜 低 膜 在 实 验 过 程 中 干 过 实 验 过 程 中 要 注 意 保 持 膜 的 湿 润 检 测 时 曝 光 时 间 过 长 减 少 曝 光 时 间 3.Western blot 结 果 中 杂 带 较 多 可 能 的 原 因 及 建 议 :

目 的 蛋 白 有 多 个 修 饰 位 点 ( 磷 酸 化 位 点 糖 基 化 位 点 乙 酰 化 位 点 等 ), 本 身 可 以 呈 现 多 条 带 查 阅 文 献 或 进 行 生 物 信 息 学 分 析, 获 得 蛋 白 序 列 的 修 饰 位 点 信 息, 通 过 去 修 饰 确 定 蛋 白 实 际 大 小 目 的 蛋 白 有 其 它 剪 切 本 查 阅 文 献 或 生 物 信 息 学 分 析 可 能 性 样 本 处 理 过 程 中 目 的 蛋 白 发 生 降 解 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 ; 样 本 处 理 时 在 冰 上 操 作 上 样 量 过 高, 太 敏 感 适 当 减 少 上 样 量 一 抗 特 异 性 不 高 重 新 选 择 或 制 备 高 特 异 性 的 抗 体 一 抗 不 纯 纯 化 抗 体 一 抗 或 者 二 抗 浓 度 偏 高 降 低 抗 体 浓 度 4. Western blot 结 果 中 无 信 号 或 显 示 信 号 弱 可 能 的 原 因 及 建 议 : 检 测 样 本 不 表 达 目 的 蛋 白 选 择 表 达 量 高 的 细 胞 作 为 阳 性 对 照, 用 于 确 定 检 测 样 本 是 否 为 阴 性 检 测 样 本 低 表 达 目 的 蛋 白 提 高 上 样 量, 裂 解 液 中 注 意 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 转 移 不 完 全 或 过 转 移 可 以 用 丽 春 红 染 膜 并 结 合 染 胶 ( 考 马 斯 亮 蓝 ) 后 确 定 条 带 是 否 转 至 膜 上 或 转 移 过 头 ; 适 当 调 整 转 膜 的 时 间 和 电 流 抗 体 不 能 识 别 测 试 种 属 的 相 关 蛋 白 购 买 抗 体 前 应 当 认 真 阅 读 抗 体 说 明 书, 确 定 其 是 否 能 够 交 叉 识 别 测 试 种 属 的 对 应 蛋 白 一 抗 孵 育 时 间 不 足 建 议 4 结 合 过 夜 二 抗 与 一 抗 不 匹 配 选 择 针 对 一 抗 来 源 的 种 属 的 抗 体 洗 膜 过 度 洗 膜 时 间 不 宜 过 长, 加 入 的 去 垢 剂 不 宜 过 强 或 过 多, 建 议 使 用 0.1% 的 弱 去 垢 剂 Tween-20 5. 其 它 现 象 :

膜 上 多 处 出 现 黑 点 或 黑 斑 原 因 : 抗 体 与 封 闭 试 剂 发 生 非 特 异 性 的 结 合 反 白 ( 条 带 显 白 色 ) 原 因 : 目 的 蛋 白 含 量 太 高 或 者 一 抗 浓 度 偏 高 蛋 白 分 子 量 偏 低 或 偏 高 原 因 : 胶 浓 度 不 适 合, 高 分 子 量 要 用 低 浓 度 胶 ; 小 分 子 蛋 白 要 用 高 浓 度 胶 6. 安 全 问 题 操 作 有 毒 试 剂 时, 带 手 套 和 口 罩, 且 操 作 挥 发 性 试 剂 应 在 通 风 橱 中 进 行 IHC 问 题 总 结 Q1: 边 缘 效 应? 1) 组 织 边 缘 与 玻 片 粘 贴 不 牢, 边 缘 组 织 松 脱 漂 浮 在 液 体 中, 每 次 清 洗 不 易 将 组 织 下 面 试 剂 洗 尽 所 致. 解 决 办 法 : 制 备 优 质 的 胶 片 (APES 或 多 聚 赖 氨 酸 ), 切 出 尽 量 薄 的 组 织 切 片, 不 厚 于 4 微 米, 组 织 的 前 期 处 理 应 规 范, 尽 量 避 免 选 用 坏 死 较 多 的 组 织 2) 切 片 上 滴 加 的 试 剂 未 充 分 覆 盖 组 织, 边 缘 的 试 剂 容 易 首 先 变 干, 浓 度 较 中 心 组 织 高 而 致 染 色 深 解 决 办 法 : 试 剂 要 充 分 覆 盖 组 织, 应 超 出 组 织 边 缘 2mm 用 组 化 笔 画 圈 时, 为 了 避 免 油 剂 的 影 响, 画 圈 应 距 组 织 边 缘 3-4mm Q2: 产 生 组 织 切 片 非 特 异 性 染 色 的 原 因 有 哪 些? 如 何 解 决? 1) 抗 体 孵 育 时 间 过 长 抗 体 浓 度 高 易 增 加 背 景 着 色 这 可 通 过 缩 短 一 抗 / 二 抗 孵 育 时 间 稀 释 抗 体 来 控 制 这 是 最 重 要 的 一 条 2) 一 抗 用 多 克 隆 抗 体 易 出 现 非 特 异 性 着 色, 建 议 试 用 单 克 隆 抗 体 看 看 3) 内 源 性 过 氧 化 物 酶 和 生 物 素 在 肝 脏 肾 脏 等 组 织 含 量 很 高 ( 含 血 细 胞 多 的 组 织 ), 需 要 通 过 延 长 灭 活 时 间 和 增 加 灭 活 剂 浓 度 来 降 低 背 景 染 色 ; 4) 非 特 异 性 组 分 与 抗 体 结 合, 这 需 要 通 过 延 长 二 抗 来 源 的 动 物 免 疫 血 清 封 闭 时 间 和 适 当 增 加 浓 度 来 加 强 封 闭 效 果 ; 5) DAB 孵 育 时 间 过 长 或 浓 度 过 高 ; 6) PBS 冲 洗 不 充 分, 残 留 抗 体 结 果 增 强 着 色, 在 一 抗 二 抗 或 SP 孵 育 之 后 的 浸 洗 尤 为 重 要 ; 7) 标 本 染 色 过 程 中 经 常 出 现 干 片, 这 容 易 增 强 非 特 异 性 着 色 Q3: 免 疫 组 化 染 色 呈 阴 性 结 果 的 原 因 有 哪 些? 1) 抗 体 浓 度 和 质 量 问 题 以 及 抗 体 来 源 选 择 错 误 不 是 抗 体 浓 度 越 高 就 越 易 出 现 阳 性 结 果, 抗 原 抗 体 反 应 有 前 带 和 后 带 效 应, 必 须 摸 索 最 佳 浓 度 2) 抗 原 修 复 不 全, 对 于 甲 醛 固 定 的 组 织 必 须 用 充 分 抗 原 修 复 来 打 开 抗 原 表 位, 以 利 于 与 抗 体 结 合 ; 建 议 微 波 修 复 用 高 火 4 次 *6min 试 试 有 人 做 过 实 验, 这 是 最 佳 的 时 间 和 次 数 若 不 行, 还 可 高 压 修 复 3) 组 织 切 片 本 身 这 种 抗 原 含 量 低 ; 4) 血 清 封 闭 时 间 过 长 5) DAB 孵 育 时 间 过 短

6) 细 胞 通 透 不 全, 抗 体 未 能 充 分 进 入 胞 内 参 与 反 应 7) 开 始 做 免 疫 组 化, 一 定 要 首 先 做 个 阳 性 对 照 片, 排 除 抗 体 等 外 的 方 法 问 题 Q4: 背 景 强 的 原 因? 1) 考 虑 一 抗 浓 度 高 ; 2) 然 后 调 整 DAB 孵 育 时 间 ; 3) 也 要 考 虑 血 清 封 闭 时 间 是 否 过 短 4) 适 当 增 加 抗 体 孵 育 后 的 浸 洗 次 数 和 延 长 浸 洗 时 间 等 Q5: 石 蜡 切 片 在 染 色 过 程 中 出 现 脱 片 现 象? 1) 烤 片 时 间 不 够, 或 温 度 不 够, 可 以 延 长 烤 片 时 间 和 提 高 烤 片 温 度 2) 用 含 有 多 聚 赖 氨 酸 的 玻 片, 可 以 购 买 到 或 这 自 己 做 3) 有 些 组 织 本 身 就 容 易 掉 片, 如 骨 组 织 等, 操 作 时 冲 PBS 不 要 直 接 冲 到 组 织 上, 冲 到 组 织 上 方, 让 它 流 下 冲 洗 组 织, 4) 用 高 温 修 复 时, 温 度 骤 冷 也 可 能 引 起 Q6: 一 抗 从 4 度 拿 出 后, 为 什 么 要 进 行 37 度 复 温? 1) 一 方 面, 防 止 切 片 从 4 度 直 接 放 入 PBS 易 脱 片 ; 2) 另 一 方 面, 使 抗 原 抗 体 结 合 更 稳 定 一 般 不 需 要, 但 对 表 达 较 弱 的 抗 原 可 能 有 用, 4 度 和 37 度 时 分 子 运 动 方 式 不 同, 前 者 分 子 碰 撞 机 率 和 运 动 速 度 小 于 后 者, 后 者 结 合 更 快, 但 敏 感 性 也 提 高 了 并 易 造 成 非 特 异 染 色 Q7: 切 片 染 色 后 背 景 太 深, 如 何 区 分 特 异 性 与 非 特 异 性 着 色? 全 片 着 色 是 指 整 个 切 片 全 都 染 上 了 颜 色, 着 色 的 强 度 可 深 可 浅, 总 之, 分 不 清 那 些 组 织 是 阳 性 那 些 组 织 是 阴 性 出 现 这 种 现 象 的 原 因 有 : 1) 抗 体 浓 度 过 高 : 一 抗 浓 度 过 高 是 常 见 的 原 因 之 一 解 决 办 法 是, 每 次 使 用 新 抗 体 前 应 当 对 其 工 作 浓 度 进 行 测 试, 使 每 一 抗 体 个 体 化, 找 到 适 合 自 己 实 验 室 的 理 想 工 作 浓 度, 既 使 是 即 用 型 的 抗 体 也 应 如 此, 不 能 只 简 单 的 按 说 明 书 进 行 染 色 2) 抗 体 孵 育 时 间 过 长 或 温 度 较 高 : 解 决 办 法 是, 严 格 执 行 操 作 规 程, 最 好 随 身 佩 带 报 时 表 或 报 时 钟, 及 时 提 醒, 避 免 因 遗 忘 而 造 成 时 间 延 长 现 在 流 行 的 二 步 法 (Polymer) 敏 感 性 很 高, 要 求 一 抗 孵 育 的 时 间 不 是 传 统 的 1 小 时, 而 是 30 分 钟, 因 此, 要 根 据 染 色 结 果 进 行 调 整 3) DAB 变 质 和 显 色 时 间 太 长 :DAB 最 好 现 用 现 配, 如 有 沉 渣 应 进 行 过 滤 后 再 用 配 制 好 的 DAB 不 应 存 放 时 间 太 长, 因 为 在 没 有 酶 的 情 况 下, 过 氧 化 氢 也 会 游 离 出 氧 原 子 与 DAB 产 生 反 应 而 降 低 DAB 的 效 力, 未 用 完 的 DAB 存 放 在 冰 箱 里 几 天 后 再 用 这 种 似 乎 节 约 的 办 法 是 不 可 取 的 DAB 的 显 色 最 好 在 显 微 镜 下 监 控, 达 到 理 想 的 染 色 程 度 时 立 即 终 止 反 应 不 过 当 染 色 片 太 多 时 或 用 染 色 机 时, 这 样 做 似 乎 不 现 实, 但 至 少 应 对 一 些 新 的 或 少 用 的 抗 体 显 色 时 进 行 监 控, 避 免 显 色 时 间 过 长 4) 组 织 变 干 : 修 复 液 溢 出 后 未 及 时 补 充 液 体 染 色 切 片 太 多 动 作 太 慢 忘 记 滴 液 滴 液 流 失 等 都 是 造 成 组 织 变 干 的 原 因 解 决 的 办 法 是 操 作 要 认 真 仔 细, 采 用 DAKO 笔 或 PAP Pen 在 组 织 周 围 画 圈, 可 以 有 效 的 避 免 液 体 流 失, 也 能 提 高 操 作 速 度

5) 切 片 在 缓 冲 液 或 修 复 液 中 浸 泡 时 间 太 长 ( 大 于 24 小 时 ): 原 因 上 不 清 楚, 但 现 象 存 在 有 的 实 验 室 喜 欢 前 一 天 将 切 片 脱 蜡 至 修 复, 第 二 天 加 抗 体 进 行 免 疫 组 化 染 色, 如 果 将 装 有 切 片 和 修 复 液 的 容 器 放 在 4ºC 冰 箱 过 夜, 对 结 果 无 明 显 影 响, 如 果 放 在 室 温, 特 别 是 炎 热 的 夏 天, 会 出 现 背 景 着 色, 因 此, 不 可 存 放 时 间 太 长 6) 一 抗 变 质 质 量 差 的 多 克 隆 抗 体 : 注 意 抗 体 的 有 效 期, 过 期 的 抗 体 要 麽 不 显 色 要 麽 背 景 着 色 用 新 买 的 抗 体 时 最 好 设 立 阳 性 对 照 和 用 使 用 过 的 抗 体 作 比 较 Q8: 脱 片 产 生 的 原 因 有 哪 些? 1) 多 聚 赖 氨 酸 玻 片 质 量 的 问 题 2) 组 织 切 的 不 好, 切 片 机 的 问 题 例 如 比 较 老 的 旧 的 机 器 切 的 厚 或 者 不 均 匀, 或 者 切 片 者 手 法 不 好 等 3) 没 烤 好, 时 间 短, 温 度 不 够 之 类 4) 操 作 的 时 候 甩 的 太 猛 了, 有 脱 片 嫌 疑 的 片 子 最 好 不 甩 或 轻 轻 甩, 用 卫 生 纸 从 边 缘 上 慢 慢 吸 水 5) 修 复 的 问 题 : 抗 原 修 复 的 时 候 高 压 时 间 过 长 了, 或 者 放 进 100 度 的 修 复 液 时 手 法 不 好, 咚 的 一 声 就 丢 进 去 了, 这 样 超 容 易 脱 片 此 外, 用 EDTA 修 复 比 柠 檬 酸 容 易 脱 片, 但 是 你 要 用 到 EDTA 的 时 候 也 没 办 法, 只 有 从 另 外 的 问 题 上 着 手 6) 一 旦 见 到 有 组 织 漂 起 来 操 作 就 更 加 要 谨 慎, 用 PBS 的 时 候 尽 量 用 泡 的, 不 要 冲 基 本 上 把 这 些 方 面 都 注 意 到 了, 能 改 善 的 尽 量 改 善, 脱 片 可 以 减 少 很 多 7) 组 织 的 问 题, 我 用 的 组 织 癌 症 的 很 多, 越 是 癌 症 组 织 有 坏 死 之 类 越 容 易 脱 Q9:DAB 显 色 后 发 现 切 片 着 色 不 均 匀 : 如 一 片 着 色, 一 片 不 着 色 或 染 色 浅? 1) 切 出 的 片 子 厚 度 本 身 可 能 就 不 一 样, 切 出 一 片 厚, 一 片 薄, 这 样 可 能 造 成 着 色 深 浅 不 一 2) 有 可 能 是 你 显 色 液 底 物 加 到 片 子 上 后 没 有 摇 匀, 造 成 局 部 底 物 浓 度 不 一 致, 所 以 加 完 显 色 液 后 最 好 将 片 子 来 回 左 右 晃 动 几 下, 使 片 子 上 所 有 区 域 的 底 物 浓 度 一 致 3) 如 果 你 的 片 子 是 中 间 的 染 色 深, 靠 近 边 上 的 浅, 那 有 可 能 是 你 蜡 圈 画 的 太 小, 显 色 液 覆 盖 的 面 积 不 过 大 而 产 生 了 边 缘 效 应 最 外 侧 的 组 织 片 最 好 离 显 色 液 外 缘 0.5 cm Q10: 染 色 过 强 1) 抗 体 的 浓 度 过 高 或 抗 体 孵 育 时 间 过 长 降 低 抗 体 滴 度 ( 一 般 指 浓 缩 性 抗 体 ) 2) 孵 育 温 度 过 高, 3) DAB 显 色 时 间 过 长 或 DAB 浓 度 过 高, 显 色 时 间 不 能 超 过 5-10 分 钟, 以 显 微 镜 下 观 察 为 准 Q11: 非 特 异 性 背 景 染 色 1) 操 作 过 程 中 冲 洗 不 充 分 2) 组 织 中 含 过 氧 化 物 酶 未 阻 断, 可 再 配 置 新 鲜 3%H2O2 封 闭, 孵 育 时 间 延 长 3) 组 织 中 含 内 源 性 生 物 素, 可 用 正 常 非 免 疫 动 物 血 清 再 封 闭 4) 血 清 蛋 白 封 闭 不 充 分, 可 延 长 血 清 蛋 白 封 闭 时 间 Q12: 染 色 弱

1) 抗 体 浓 度 过 低, 孵 育 时 间 过 短, 可 提 高 抗 体 浓 度, 孵 育 时 间 不 能 少 于 60 分 钟 2) 试 剂 超 过 有 效 使 用 期 及 时 更 换 试 剂 3) 操 作 中, 滴 加 试 剂 时 缓 冲 液 未 沥 干, 致 使 试 剂 稀 释, 可 每 步 滴 加 试 剂 前 沥 干 切 片 中 多 余 的 缓 冲 液 ( 但 防 止 切 片 干 燥 ) 4) 室 温 太 低, 低 于 15 若 室 温 低 于 15 度, 要 改 放 在 37 孵 育 箱 孵 育 30-60 分 钟 ( 或 4 冰 箱 过 夜 ) 5) 蛋 白 封 闭 过 度, 封 闭 时 间 不 要 超 过 10 分 钟 Q13: 染 色 阴 性 1) 操 作 步 骤 错 误 重 新 试 验, 设 立 阳 性 对 照 2) 组 织 中 无 抗 原 设 立 阳 性 对 照 片, 以 验 证 实 验 结 果 3) 一 抗 与 二 抗 种 属 连 接 错 误 仔 细 确 定 一 抗 与 二 抗 种 属 无 误