蛋 白 質 體 學 及 應 用 中 山 大 學 生 醫 所 黃 弘 文
內 容 介 紹 何 謂 蛋 白 質 體 學 蛋 白 質 體 學 研 究 方 法 蛋 白 質 體 學 應 用 實 驗 技 術
何 謂 蛋 白 質 體 學 蛋 白 質 體 學 與 傳 統 生 化 學 傳 統 研 究 蛋 白 質 的 科 學 生 物 化 學 酵 素 學 等
蛋 白 質 的 構 造 細 胞 的 功 能 主 要 由 蛋 白 質 執 行 代 謝 生 化 反 應 繁 殖 蛋 白 質 為 一 長 鏈 的 胺 基 酸 聚 合 物, 鏈 長 由 數 十 至 數 千 生 物 體 約 有 20 種 胺 基 酸
胺 基 酸 構 造 Functional group: 1.-NH 3 2.-COOH 3.-R ( 羧 基 ) 4. 鏡 像 結 構
20 種 胺 基 酸 : 依 R group 分 類 : 1. 非 極 性 2. 極 性 3. 正 電 4. 負 電
蛋 白 質 鏈 方 向 性 (N C )
蛋 白 質 四 元 結 構
傳 統 研 究 蛋 白 質 的 方 法 蛋 白 質 濃 度 測 定 蛋 白 質 ( 酵 素 ) 反 應 測 定 蛋 白 質 分 離 純 化 蛋 白 質 定 序
各 種 蛋 白 質 定 量 法 : H 206 nm (carbonyl) 280 nm (aromatic) UV Absorbance Special Binding Groups (heme) OH Tyr Lys Cu 2+ Biuret Method... phsophomolybdicphosphotungstate Coomassie Blue G (carbonyl) Lowry Method NH 2 + + N=N NH NH 3 HN C OH SO - 3 NH SO - C 3 2 SO - C 3 N=N NH C Fe O C OH SO - 3 C C C H H C SO - R H O CR 3 N N O C C C N C C R O N C R C C C H + R R C - O (metal) C N H O H Active O H N H Site N N C C R C C H 2 N H O C O N C C R O H O R SO 3 - Arg NH 2 尿 素 urea
Bradford Method: Coomassie Brilliant Blue G-250 CBG 是 一 種 指 示 劑 470 nm 595 nm 加 入 蛋 白 質 酸 性 環 境 下 呈 茶 色 與 蛋 白 質 結 合 變 藍 色
酵 素 反 應 及 偵 測 方 法 : 移 除 生 成 物 並 轉 成 可 測 量 者 使 用 大 量 反 應 物 10 x K m 可 能 有 回 饋 抑 制 - 酵 素 + NAD 直 接 測 量 NADH - 耦 合 反 應 反 應 物 生 成 物 能 否 直 接 測 量? 把 生 成 物 再 轉 換 成 可 被 測 量 的 生 成 物
蛋 白 質 的 分 離 電 泳 (electrophoresis) 色 層 分 析 法 (column chromatography)
電 泳 形 式 的 演 進 : - 濾 紙 電 泳 Cellulose Protein Denatured 薄 層 電 泳 (TLE) Cellulose acetate Partial Denatured + 膠 體 電 泳 Starch Gel
兩 種 主 要 蛋 白 質 染 色 法 : 金 屬 銀 沉 澱 + NH 2 Glu NH C C C (Cys) H Ammoniacal silver Coomassie + Blue R Ag H 3N...Ag...NH 3 Lys Arg NH + - SO + + 3 N=N NH 2 H 2N... Ag NH 3 HN C OH SO - 還 3 - NH C SO Glutaraldehyde 3 2 - 原 SO C 3 C N=N NH Lys C C O OH SO - 3 C C H H C - RC C SO H O R 3 N N O C C C N C C R O N C R C C C H + R R C - O C N H O H O H N H N N C C R C C H O C O N C R O H R
電 泳 膠 體 蛋 白 質 的 溶 離 : 直 接 挖 出 膠 體 進 行 溶 離 或 定 序 Little Blue Tank ISCO: Little Blue Tank Concentrator
電 泳 槽 及 相 關 設 備 : 轉 印 三 明 治 轉 印 槽 電 泳 槽 鑄 膠 器 供 電 器
轉 印 及 免 疫 染 色 流 程 : A 轉 印 三 明 治 B 免 疫 染 色 流 程 及 結 果 塑 膠 夾 板 Filter Paper 轉 印 抗 體 HRP - + Gel Nitrocellulose 海 綿 墊 電 泳 膠 體 Coomassie Blue Staining 轉 印 紙 Ponceau Staining 抗 體 偵 測 呈 色
SDS-PAGE Disc-PAGE 澱 粉 磷 解 染 色 方 法 比 較 : 膠 體 過 濾 法 各 分 劃 免 疫 轉 印 硝 酸 銀 活 性 染 色
蛋 白 質 體 (Proteomics) 二 維 電 泳 (2-Dimensional protein gel electrophoresis) and HPLC were long used in protein separation. 近 年 生 物 質 譜 技 術 快 速 發 展 (development of mass spectrometry in recent years, ~2000 AD) 2002 Nobel prize: John B. Fenn (Virginia Commonwealth Univ.) Koichi Tanaka (Shimadzu Corporation, Japen) Soft desorption ionization( 軟 式 脫 附 離 子 化 ) methods for mass spectrometric analysis. proteins annotation( 蛋 白 質 註 解 ).
Functional Genomics (or Phenomics) The OMICS based sciences! 基 因 體 學 轉 譯 體 學 蛋 白 體 學 代 謝 體 學 系 統 生 物 學
Summary of the systems -ome--- Compete set. -ics --- the utility for analyzing these domains. 功 能 基 因 體 學 (Functional genomics) : hierachical approaches for studying the functional analysis of novel genes
Defining proteomics Functional proteomics: 利 用 2DE 及 MS 研 究 蛋 白 表 現 二 維 電 泳 (2DE): two dimensional gel analysis, 通 常 指 : sample first run a 等 電 位 電 泳 IEF (iso( iso- electrofocusing) ) electrophoresis. 再 以 SDS PAGE 分 離 蛋 白 的 方 法. 質 譜 (MS): mass spectrometry, basically, a method to accurate determine molecule weight.
比 較 蛋 白 質 體 學 與 蛋 白 質 化 學 Differences between protein chemistry and proteomics ---------------------------------------------------------------------------------------- Protein chemistry Proteomics --------------------------------------------------------------------------------------- Individual proteins complex mixtures Complete sequence analysis partial sequence analysis Emphasis on structure and function emphasis on identification by database matching Structural biology systems biology ---------------------------------------------------------------------------------------- Conventional ideas: Using physical biochemistry or mechanistic enzymology, study one protein or multisubunit protein complex at a time. Proteomic ideas: Study multiprotein systems, in which the focus is on the interplay of multiple, distinct proteins in their roles as part of a larger system or network. Proteomics: to characterize the behavior of the system
蛋 白 質 體 學 因 應 基 因 體 學 而 來 : Proteomics and Genomics Genomics Genome sequencing Complete DNA sequences from various organisms Bioinformatics Tools Tools for sequence comparison Identification of homologues Tools Tools for sequence interpretation Elucidation of coding sequences / protein functions Gene expression (protein) profiling Transcriptomics Differential expression of mrnas (MicroArray( MicroArray) 基 因 晶 片 已 知 mrna 表 現, 為 何 還 須 知 道 蛋 白 質 表 現?
DNA 基 因 基 因 體 學 (Genomics) 轉 錄 mrna 功 能 性 基 因 Microarray X (...) t-rna t-rna 核 糖 體 (...) 轉 譯 蛋 白 質 轉 譯 後 修 釋 蛋 白 質 體 學 (Proteomics) 功 能 性 蛋 白 質 ( 生 化 反 應 ) Proteomic 2001 Proteomics Group, Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica X CHO PO 4 醣 質 化 磷 酸 化 1. 蛋 白 質 體 學 與 基 因 體 學 兩 者 相 互 互 補 ( 如 表 現 量 ) 但 不 一 定 相 同 2. 蛋 白 質 體 學 能 發 現 在 基 因 體 學 無 法 完 成 得 到 的 結 果 ( 如 醣 質 化 及 磷 酸 化 ) X
蛋 白 質 體 的 四 個 關 鍵 技 術 : 1. Sample preparation, 樣 本 處 理 2. Protein information, 蛋 白 質 資 訊 3. Protein Identification and quantification, 蛋 白 質 註 解 及 定 量 4. Cell mapping: targeted proteomics (study of protein-protein interactions, posttranslational modifications (PTMs), cellular localization, etc.).
蛋 白 質 體 目 前 瓶 頸 : Protein determination range 不 同 蛋 白 質 表 現 量 差 異 很 大 :~ 10 6. e.g., 10 copies/cell for transcription factor, up to 10 6 copies/cell for abundant molecules. 2D gels, which usually separate ~1,500 spots, present most abundant proteins if a crude protein mixture is used.
Protein Copy number and cell quantity: 無 法 測 到 低 表 現 蛋 白 質 Detection in Silver stain range and coomassie stain range.
蛋 白 質 二 維 電 泳 2-D D gel electrophoresis 1st D - Isoelectric focusing ( 聚 膠 電 泳 ) - separation on basis of pi 2nd D - SDS gel electrophoresis (SDS 電 泳 ) - separation on basis of mass Isoelectric focusing - separation on basis of pi - ph gradient - migrate to their pi and stabilize ph gradient
1st -Dimensional gel Electrophoresis 1st PAGE precast gels: 提 供 高 解 析 及 高 範 圍 生 物 材 料 分 離 ( denatured proteins, polypeptides or nucleotides) from 2,000,000 to 5,000 Da.
Polyacrylamide gel electrophoresis Acrylamide : CH2 = CH - CO NH2 N,N' methylene bis acrylamide: CH2 = CH CO NH CH2 NH CO CH = CH2 Polymerization induced by free radicals produced from ammonium persulfate in presence of TEMED (N, N, N', N' tetra methylethylendiamine) TEMED causes free radicals to form from persulfate
利 用 起 始 劑 自 由 基 反 應 聚 合 : Chemical: TEMED and APS. Photochemical: riboflavin-5 - phosphate, or methylene blue. 電 泳 膠 孔 徑 ( 由 單 體 濃 度 及 比 例 決 定 ): %, and ratio: acrylamide and Bis-acrylamide Polymerization temp. Gel additives: Urea (smaller pore size) Polyethylene glycol: macroporous.
Isoelectric point (pi) Separation by charge: Stable ph gradient 4 5 6 7 8 9 10 Low ph: Protein is positively charged High ph: protein is negatively charged At the isolectric point the protein has no net charge and therefore no longer migrates in the electric field.
ph 值 的 選 擇 ph 梯 度 差 越 小, 解 析 度 越 高. 根 據 不 同 的 樣 品 選 擇 不 同 ph 梯 度, e.g., The known extreme pi : acidic glycoprotein of the chimpanzee: pi=1.8, Lysozyme from human placenta: pi=11.7. The most used pi range is ph=3 ~ 10.
IEF Ideal Lysis Buffer ( 標 準 配 方 ) 8M urea (or 7M urea + 2M thiourea in the case of fractions containing hydrophobic proteins) 2-4% CHAPS 1% IPG buffer (appropriate buffer for ph range to be analysed) 2 mg/ml DTT
Factors which may affect pi - amino acid composition - phosphorylation - glycosylation - other post-translational translational modifications
2 nd -Dimensional gel Electrophoresis 第 二 維 電 泳 通 常 以 SDS PAGE 進 行. 傳 統 SDS PAGE 須 使 用 聚 膠 電 泳 (stacking gel) 及 分 離 電 泳 (separating gel) 合 併 使 用 通 常 二 維 電 泳 中, 因 為 第 一 維 已 聚 膠, 不 使 用 stacking gel.
SDS (sodium dodecyl sulfate) 極 性 頭 部 非 極 性 尾 巴 切 勿 吸 入 SDS 塵 埃 以 免 引 起 呼 吸 困 難
SDS 在 蛋 白 質 表 面 均 勻 附 上 一 層 負 電 : SDS 原 態 蛋 白 質 boiling 變 性 蛋 白 質 成 一 線 狀 分 子
Fig 2.3 Kohlrausch boundary, a limited high-voltage gradient Stacking gel: ph6.8, resolving gel: ph8.8, electrode buffer, ph8.3 (Tris-glycine) Sampel(P1-P5) running between two solution: Cl-(leading), and trailing (Gly-) Laemmli system
單 元 體 分 子 量 的 測 定 : SDS-PAGE Mol mass kda 300 200 100 80 60 50 40 30 20 kda 330 220 67 60 36 kda 94 67 43 30 10 20.1 0.5 1.0 18.5 14.4 Migration (R f ) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis
Multiphor II IEF System Perform first- and second-dimension dimension separations with the same system. Run up to 12 IPG strips (7-24 cm) simultaneously. With DryStrip Reswelling Tray, samples can be loaded during IPG strip rehydration by including them in the rehydration buffer.
Step 1. Rehydration Use DryStrip Reswelling Tray. Step 2. IEF Use the parallel grooves Cap loading
Ettan IPGphor IEF System Accommodates all lengths of Immobline DryStrip gels (7, 11, 13, 18, and 24 cm) and can run 12 gels simultaneously. 8,000 V Max
BioRad system Isoelectric focusing (IEF) Pre-cast IPG strips Variable ph range (e.g.. 3-10, 3 4-7, 4 3-3 6, 6-12, 6 4-5) 4 Variable strip length (7, 11, 17, 24 cm) Optimised protein loading 10,000V Max
IPGphor ceramic strip holders are available in five lengths: 7, 11, 13, 18, and 24 cm.
IPG strips are rehydrated with IPG Buffer in regular strip holders. The sample can be added to the buffer for efficient loading during rehydration.
With movable electrodes and sample cup, the Cup Loading Strip Holder accommodates IPG strips up to 24 cm long.
1. Apply rehydration solution. 2. Remove protective film from 3.Drystrip in strip holder DryStrip gel. 4. Apply Cover oil 5. Cover on strip holder. 6. Place assembled strip holder on Ettan IPGphor platform.
TECHNICAL SPECIFICATIONS Instrument Voltage Current Platform temperature IPG strip lengths Number of strips Reswelling Strip holder material Sample application Software features Ports Operating temperature Relative humidity Line voltage Maximum power Dimensions (H W D) Weight Safety features Safety certifications Integrated Peltier cooling and high-voltage power supply 0 8000 VDC 0 1.5 ma 18 25 C 7, 11, 13, 18, or 24 cm Immobiline DryStrip Gels 12 maximum In strip holder or reswelling tray when using Cup Loading Strip Holder Base aluminum oxide Cover clear acrylic During rehydration or after rehydration when using Cup Loading Strip Holder 10 protocols, 9 voltage ramps or steps each; set rehydration delay; set maximum current limit; set temperature Serial port (RS232) 15 35 C 0 90% non-condensing 90 260 VAC 100 W 14 25 46 cm 6.8 kg Automatic voltage shut-off when safety lid is opened CE 73/23/EEC (LV directive); UL3101-1; 1; CSA22.2 1010-1
Multiphor II and ExcelGel System Perform second-dimension dimension separations using convenient precast gels and 7 11 18 or 24 cm IPG strips. Choose from ExcelGel precast SDS-polyacrylamide gels available as 12.5% homogeneous and 12-14% 14% gradient gels. Prepare multiple 2-D 2 D maps on a single gel using three 7 cm or two 11 cm IPG strips side-by by-side. Configure Multiphor II with MultiTemp III Thermostatic Circulator and the programmable EPS 1001 Power Supply for reproducible running conditions.
Hoefer SE 600 Ruby Vertical System Perform second-dimension dimension separations using 7 or 13 cm IPG strips. Prepare multiple 2-D 2 D maps on a single gel using two 7 cm IPG strips side-by by-side. Run up to four gels simultaneously and perform eight second-dimension dimension separations at once. Configure SE 600 with MultiTemp III Thermostatic Circulator and the programmable EPS 601 Power Supply for reproducible running conditions.
影 像 分 析 Complex protein patterns in 2D electrophoresis gels are captured in digital format to allow accurate, reproducible and quantifiable comparisons. Image Master (Melanie) (Pharmacia) PDQuest (BioRad)
Image Scanner ImageScanner has an extremely broad optical density range to give the high resolution required for reliable quantification of Coomassie and silver stained gels. Fast scanning and image acquisition rates ensure short scan times.
Typhoon Typhoon unites four-colour fluorescence, filmless autoradiography and chemiluminescence into a single system. Its broad dynamic range ensures accurate results at the first attempt. Highly sensitive optics facilitate extremely low limits of fluorescence detection and enable direct chemiluminescence imaging without intermediate exposures to film or screens.
2-DE Sample prep. Protein 蛋 白 質 體 分 析 流 程 Rehydration Mass IEF Protein identify from database SDS-PAGE MALDI-TOF Gel -Image Analysis In-Gel Digestion Reduction Alkylation Extraction Peptide