(19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (21) 申请号 202010131669.X (10) 申请公布号 (43) 申请公布日 2020.06.19 (22) 申请日 2020.02.28 (71) 申请人中国人民解放军总医院第三医学中心地址 100039 北京市海淀区永定路 69 号 (72) 发明人常德 (74) 专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 代理人邓宇 (51)Int.Cl. C12N 15/85( 2006.01) C40B 50/06( 2006.01) C12Q 1/02( 2006.01) C12Q 1/6886( 2018.01) 权利要求书 1 页 5 页附图 1 页 (54) 发明名称一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用 (57) 摘要一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用, 属于癌症诊断技术领域 针对如何检测患者体内胰腺癌发生的技术问题, 本发明利用随机基因突变调控技术筛选获得一种与胰腺癌成瘤相关的关键基因 BRE 基因, 并证实了 BRE 基因的表达增加可作为胰腺癌发生检测 筛查或胰腺癌患者预后判断的指标 利用 BRE 基因在胰腺癌高危人群中进行检测, 能够快速有效的做到胰腺癌的早期诊断, 而且为预测诊断胰腺癌的发生发展提供治疗靶点和重要依据, 可应用于胰腺癌的诊断 治疗 监测及预后
权利要求书 1/1 页 1. 一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法, 其特征在于, 步骤如下 : 1) 用 CAT-tTA 质粒转染人肿瘤细胞株, 获得稳定表达转录激活因子的 Tet-off 细胞株 ; 2) 将基因搜寻载体和有效表达转座酶 MPB 的质粒, 按照各 50ng/10 5 个细胞的转染量, 转染步骤 1) 获得的 Tet-off 细胞株, 转染 24h 后加入终浓度为 600μg/ml 的 G418 筛选, 建立全基因组随机基因突变文库 ; 3) 筛选高成瘤能力的胰腺癌细胞株 : 使用下层琼脂终质量浓度为 0.6% 琼脂, 含有细胞的上层琼脂终质量浓度为 0.3%, 细胞数量为 6 10 4 /10cm 细胞培养板, 向上层琼脂上加入 2ml 的培养液,14-21 天后挑取单个克隆并扩大培养 传代和冻存, 获得单克隆细胞株 ; 4) 候选克隆细胞株成瘤能力的检测 : 使用下层琼脂终质量浓度为 0.6% 琼脂, 含有细胞的上层琼脂终质量浓度为 0.3%, 细胞数量为 6 10 4 /10cm 细胞培养板, 向上层琼脂上加入 500μl 的培养液,37,5%CO2 培养箱中培养 ; 实验设置强力霉素实验组与不加强力霉素对照组, 分别记为 +DOX 和 -DOX 组, 每组设立三个复孔,14~21 天后进行统计学分析, 筛选受强力霉素调控且具有较高成瘤能力的候选突变克隆 ; 5) 胰腺癌成瘤相关候选基因的克隆 : 提取步骤 4) 筛选获得的候选突变克隆, 提取基因组 DNA, 经 Sau3A1 限制性内切酶后连接接头 DNA, 利用 Splinkette PCR 和测序获得 GSV 插入两端的 DNA 序列, 获得胰腺癌成瘤相关候选基因 ; 所述基因搜寻载体包含四环素反应元件 piggybac 转座子 新霉素抗性基因和质粒复制起点, 所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到 ; 所述有效表达转座酶 MPB 的质粒为 mpb; 所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌 Aspc-1 细胞株 2. 根据权利要求 1 所述的筛选方法, 其特征在于, 所述胰腺癌成瘤基因为人 BRE 基因 3. 人 BRE 基因在制备胰腺癌诊断或筛查的试剂盒中的应用 4. 人 BRE 基因在制备确定胰腺癌肿瘤存在的试剂盒中的应用 5. 人 BRE 基因在制备胰腺癌患者预后判断的试剂盒中的应用 6. 人 BRE 基因在制备确定胰腺癌患者的手术 放疗或者化疗治疗后是否有效的试剂盒中的应用 7. 一种检测或辅助诊断胰腺癌的试剂盒, 其特征在于, 所示试剂盒含有 BRE 基因试剂, 所述 BRE 基因作为胰腺癌成瘤检测的标志物 2
1/5 页 一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用 技术领域 [0001] 本发明属于癌症诊断技术领域, 具体涉及一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选 获得基因的应用 背景技术 [0002] 胰腺癌恶性程度高, 诊断和治疗难, 其发病率和死亡率近年来明显上升 5 年生存率小于 1%, 是预后最差的恶性肿瘤之一, 有 癌中之王 的称呼 胰腺癌早期很难诊断, 发现时候已属于晚期, 失去了手术机会, 而又没有特效化疗药物, 导致治愈率很低 胰腺癌发病呈快速上升趋势 2017 年美国癌症协会发布的数据显示, 美国胰腺癌新发病例数男性列第 11 位 女性列第 8 位, 居恶性肿瘤死亡率第 4 位 胰腺癌位列中国城市男性恶性肿瘤发病率的第 8 位, 居大城市 ( 北京 上海 ) 人群恶性肿瘤死亡率的第 5 位 人类面临癌症最主要的三大问题是癌症发生 癌症转移和治疗中的化疗耐药, 也是导致癌症患者死亡的最主要原因 绝大多数病人在诊断时已发生转移, 由于手术治疗已不适合, 化学药物治疗成为治疗癌症患者的最主要手段 然而, 在化疗过程中癌细胞化疗耐药导致的化疗药物治疗效果差甚至无效 因此, 研究癌症发生机理, 尤其是分子机制是解决这一难题的重要突破口 [0003] 肿瘤的发病机制较为复杂, 过去认为单一物理因素 化学因素 病毒感染导致突变致癌, 目前理论认为癌症的发生是一个多步骤 多因素综合作用 以美国霍普金斯大学 Vogelstein 教授对结肠癌的研究为例, 癌症在发生过程中经过增生 良性腺瘤 原位癌和浸润癌等多个步骤 早起由于 APC 基因的缺失或者 Wnt 信号通路的作用, 导致正常的表皮出现增生, 随后 KRAS 基因突变引起逐渐增大的良性腺瘤, 在后续 SMAD4 CDC4 TP53 等系列基因突变导致了恶性腺瘤的发生 从腺瘤到癌的演变过程中有多种基因发挥不同的功能, 因此, 癌症的发生是一个多基因参与的多步骤过程 筛选和鉴定控制癌症发生的关键基因 进而研究癌症发生的分子机理是研究癌症发生的一个重要突破口, 也是开发新型癌症预防 诊断和治疗产品的关键步骤 [0004] 随着分子生物学 遗传学 基因组学 转录组学和蛋白质组学的发展, 很多方法都被用来筛选癌症发生的相关基因, 包括基因芯片 microrna 芯片 小分子 RNA 干扰 (sirnas) 化学诱变 DNA 高通量测序和逆转录病毒插入突变等技术 大体上可将这些技术为正向遗传学和反向遗传学技术, 前者从恶性肿瘤细胞入手, 研究基因变化, 包括基于 DNA 测序的基因突变分析 基因表达谱分析和全基因组关联研究等 ; 后者从基因变化反向研究癌症发生, 包括 cdna 文库技术 RNAi 文库技术 反义 RNA 技术 转基因技术和插入突变技术等 高通量基因组测序和表达谱分析是通过比较肿瘤细胞和正常细胞的基因 蛋白质或者 MicroRNA 的差异, 可获得大量差异分子, 然后该方法最大的缺陷在于基因 蛋白或 MicroRNA 分子的时空表达差异性, 癌症发生是一种动态过程, 比较的是两种或几种静止的状态, 无法再现生物学过程, 筛选到的性状相关分子同表型之间无因果关系, 后续需要大量的验证工作 另外, 这些技术产生的数据量巨大, 如何从中挖掘出有意义的信息也是后续分析中的核心问题 cdna 文库 RNAi 文库 反义 RNA 等技术可从正常细胞入手, 研究癌症的发生, 甚至再现癌症发 3
2/5 页 生过程, 然而该技术需要提前获知靶基因的序列, 这样会缩小基因筛选的范围, 往往会漏掉一些未知基因 因此, 为鉴定出胰腺癌发生的基因, 亟需一种研究方法能鉴定出同癌症发生具有因果关系的关键基因 [0005] 随机基因突变调控技术 (Controlled Random Gene Perturbation Technology, CRGP) 是基于整合转座子插入突变技术 反义 RNA 技术和真核基因表达调控技术发明的一种功能基因组学技术 CRGP 能产生全基因组纯合基因突变 ; 提供全基因组基因筛选和基因功能分析 ; 同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系 ; 系统性基因功能定位和分析其在遗传和生化通路中的功能特点 ; 快速分离与疾病有关基因和变阻器式基因表达调控 利用随机基因突变调控的方法筛选控制胰腺癌成瘤的关键基因, 为开发新型胰腺癌预防 诊断和治疗产品奠定基础 发明内容 [0006] 针对如何检测患者体内胰腺癌发生的技术问题, 本发明提供了一种胰腺癌成瘤基因及其用途, 具体技术方案如下 : [0007] 本发明的目的在于提供了一种胰腺癌成瘤相关基因的筛选方法, 步骤如下 : [0008] 1) 用 CAT-tTA 质粒转染人肿瘤细胞株, 获得稳定表达转录激活因子的 Tet-off 细胞株 ; [0009] 2) 将基因搜寻载体和有效表达转座酶 MPB 的质粒, 按照各 50ng/10 5 个细胞的转染量, 转染步骤 1) 获得的 Tet-off 细胞株, 转染 24h 后加入终浓度为 600μg/ml 的 G418 筛选, 建立全基因组随机基因突变文库 ; [0010] 3) 筛选高成瘤能力的胰腺癌细胞株 : 使用下层琼脂终质量浓度为 0.6% 琼脂, 含有细胞的上层琼脂终质量浓度为 0.3%, 细胞数量为 6 10 4 /10cm 细胞培养板, 向上层琼脂上加入 2ml 的培养液,14-21 天后挑取单个克隆并扩大培养 传代和冻存, 获得单克隆细胞株 ; [0011] 4) 候选克隆细胞株成瘤能力的检测 : 使用下层琼脂终质量浓度为 0.6% 琼脂, 含有细胞的上层琼脂终质量浓度为 0.3%, 细胞数量为 6 10 4 /10cm 细胞培养板, 向上层琼脂上加入 500μl 的培养液,37,5%CO2 培养箱中培养 ; 实验设置强力霉素实验组与不加强力霉素对照组, 分别记为 +DOX 和 -DOX 组, 每组设立三个复孔,14~21 天后进行统计学分析, 筛选受强力霉素调控且具有较高成瘤能力的候选突变克隆 ; [0012] 5) 胰腺癌成瘤相关候选基因的克隆 : 提取步骤 4) 筛选获得的候选突变克隆, 提取基因组 DNA, 经 Sau3A1 限制性内切酶后连接接头 DNA, 利用 Splinkette PCR 和测序获得 GSV 插入两端的 DNA 序列, 获得胰腺癌成瘤相关候选基因 ; [0013] 所述基因搜寻载体包含四环素反应元件 piggybac 转座子 新霉素抗性基因和质粒复制起点, 所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到 ; 所述有效表达转座酶 MPB 的质粒为 mpb; 所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌 Aspc-1 细胞株 [0014] 进一步地限定, 所述胰腺癌成瘤的相关基因为人 BRE 基因 [0015] 本发明还提供了人 BRE 基因在制备胰腺癌诊断或筛查的试剂盒中的应用 [0016] 本发明还提供了人 BRE 基因在制备确定胰腺癌肿瘤存在的试剂盒中的应用 [0017] 本发明还提供了人 BRE 基因在制备胰腺癌患者预后判断的试剂盒中的应用 [0018] 本发明还提供了人 BRE 基因在制备确定胰腺癌患者的手术 放疗或者化疗治疗后 4
3/5 页 是否有效的试剂盒中的应用 [0019] 本发明还提供了一种检测或辅助诊断胰腺癌的试剂盒, 所述试剂盒含有 BRE 基因试剂, 所述 BRE 基因作为胰腺癌成瘤检测的标志物 [0020] 有益效果 [0021] 本发明通过随机基因突变调控技术筛选到了一种与胰腺癌相关的基因 BRE, 并证实了 BRE 基因的表达增加可作为胰腺癌发生检测 筛查或胰腺癌患者预后判断的指标 利用 BRE 基因在胰腺癌高危人群中进行检测, 能够快速有效的做到胰腺癌的早期诊断, 而且为预测诊断胰腺癌的发生发展提供治疗靶点和重要依据, 可应用于胰腺癌的诊断 治疗 监测及预后 附图说明 [0022] 图 1 筛选的具有高成瘤能力的候选突变克隆 A2; [0023] 图 2 候选突变克隆 A2 对 DOX 的调控反应, 其中 2D2 代表 Tet-off-#2D2 细胞株, 纵坐标为克隆形成的数量 ; [0024] 图 3BRE 基因在候选克隆 A2 中的表达情况 具体实施方式 [0025] 以下实施例用于说明本发明, 但不用来限制本发明的范围 若未特别指明, 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段, 所用的试剂可以商业购买得到 其中 : [0026] 限制性内切酶 T 4 DN A 连接酶购自 NEB 公司, 引物 测序 Taq 聚合酶均购自 Invitrogen 公司, 质粒提取试剂盒 凝胶回收试剂盒购自 OMEGA 公司,Aspc-1 细胞株 ( 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心 ), 胎牛血清 DMEM 培养基 PBS 购自 Hyclone 公司, FugenHD 购自 Roche 公司, 各种细胞培养耗材均购自 Corning 公司, 嘌呤霉素 (puromycin) Luciferin 底物购自 Invivo 公司, 新霉素 (neomyicn,g418) 购自 Merck 公司 [0027] 实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常为本领域常规方法, 按照常规条件如 Sambrook 等人, 分子克隆, 实验手册 ( 第三版 )( 科学出版社,2002) 中的所述条件, 或按照试剂制造厂家所建议的条件 [0028] 本发明所述的 B R E 基因, 全称为 : 大脑再生表达基因 ( T h e b r a i n a n d reproductive expression), 又称 BABAM2 基因, 该基因是在本发明之前的已知基因, Genbank 登录号 :NM_004899, 来源于人类基因组 [0029] CAG-tTA 质粒 Luciferase 报告基因 -puhc13-3 质粒 基于 PiggyBac 的基因搜寻载体 GSV 转座酶 (MPB) 的质粒记载在已公开的专利 CN102747096A 基因搜寻载体 随机基因突变调控方法及用途 中 本发明的 BRE 基因的核苷酸全长序列可以用 PCR 扩增法 或人工合成的方法获得 本发明通过随机基因突变调控技术经研究分析确定了 BRE 基因具有促进胰腺癌发生的作用 [0030] 实施例 1. 胰腺癌成瘤基因 BRE 筛选及其功能研究 [0031] 在筛选目的基因之前, 本发明先对高成瘤能力胰腺癌细胞株筛选条件进行了摸索, 方法如下 : 5
4/5 页 [0032] 将终浓度为 0.6% 琼脂铺入 6 孔板中 (2ml/ 孔 ), 其中含 1 DMEM 和 10%FBS, 室温冷却待其凝固, 作底层琼脂用, 置 CO2 温箱中备用 ; 培养 Asp-1 细胞至对数生长期, 消化 离心 收集细胞, 重悬并计数细胞 ; 利用六孔板按 104/ 孔的细胞浓度依次混合在不同琼脂浓度的培养基中 ( 含 1 DMEM 和 10%FBS), 琼脂终浓度依次设置为 0.6% 0.5% 0.4% 0.3% 0.2% 和 0.1%, 向上层琼脂上缓慢轻轻加入 500μl 的培养液, 每隔 3-4 天换一次培养液,14-21 天后观察结果, 拍照记录并统计数据 结果提示 0.3% 浓度下, 大部分细胞死亡, 不能成瘤, 因此, 将上层琼脂浓度 0.3% 设置为筛选浓度 [0033] 胰腺癌成瘤的相关基因 BRE 基因的筛选 : [0034] ( 一 ) 建立随机基因突变文库 : 用 CAG-tTA 质粒转染人肿瘤细胞株, 获得稳定表达转录激活因子的 Tet-off 细胞株 ; 具体方法如下 : [0035] 1) 将线性 CAG-tTA 质粒转染 Aspc-1 细胞, 利用荧光素酶报告基因技术筛选高效表达的 Tet-off 细胞株 按照罗氏 FugeneHD, 在转染前一天接种 5 10 5 Aspc-1 细胞至 60mm 细胞培养皿, 待细胞长至约 80% 时, 用无血清无抗生素的 DMEM 培养基将 CAG-tTA 质粒稀释成 0.02μg/μl, 取 250μl, 向其中加入 15μl FugeneHD, 轻轻混匀, 常温孵育 15min 后, 慢慢滴入已准备好的细胞中, 轻轻混匀, 放置 37 的 CO2 培养箱中继续培养 ;24h 后消化细胞, 平均分至 3 个 10cm 培养皿中, 加入含嘌呤霉素 (puromycin,2μg/ml) 的培养基中继续培养, 每隔 2 天换一次液继续筛选 ;2 周后形成肉眼能够观察到的克隆 [0036] 2) 荧光素酶报告基因筛选稳定表达的 Tet-off 的 Aspc-1 细胞株, 将经嘌呤霉素筛选后的克隆挑取并扩大培养, 消化并接种 10 4 细胞于 96 孔板, 每个克隆接种 6 个平行孔, 置于 5%CO2 饱和湿度的 37 培养箱内培养过夜, 待细胞密度达到 80% 时, 按 FuGeneHD 用前述相同方法向细胞内转染 Luciferase 报告基因 -puhc13-3 质粒, 每孔加质粒 DNA0.05μg, FuGeneHD DNA 按 3 1 转染, 然后在每个克隆的一半孔中加强力霉素 (Doxycycline,DOX) 溶液 (0.2μg/ 孔 ) ; 置于培养箱中培养,48 小时后用冰冷的 PBS 洗涤细胞, 弃去上清, 利用 Harvest Buffer 裂解细胞 (4,30min), 将裂解液混合均匀之后每孔取 50μl 至 96 孔酶标板中, 按照 ATP Luciferin Buffer=1 3.6 的比例配制适当反应液, 然后在生物发光检测仪上读取吸光度值, 根据结果计算加了 DOX 各孔与未加 DOX 各孔相比荧光素酶表达强度的下调倍数 ; 在所挑选的克隆中, 有 3 个克隆荧光强度相对较高 ( 克隆编号为 2B6 2D2 5A3) 且加入 DOX 后, 其相对光单位能大幅度下降, 加入 DOX 前后的差异能达到几百到几千倍, 本发明选择荧光强度相对较高的 2D2 克隆, 记为 Tet-off-#2D2 细胞株 [0037] ( 二 ) 根据 FugeneHD 将基于 PiggyBac 的基因搜寻载体 GSV 转染至 ASPC-1 Tet-off-#2D2 细胞株, 按每 10 5 共转染 50ng GSV 和 50ng 转座酶 (MPB), 转染 24h 后将细胞转入 10cm 培养皿中, 加入终浓度为 600μg/ml 的 G418 筛选, 每 2-3 天更换一次培养液, 建立全基因组随机基因突变文库, 根据 G418 抗性克隆估算突变文库大小, 共获得大于 10 万个突变细胞克隆 [0038] ( 三 ) 筛选高成瘤能力的胰腺癌细胞株 : 下层继续使用 ( 终质量浓度 )0.6% 琼脂, 上层 ( 含细胞 ) 的琼脂终质量浓度为 0.3%, 细胞数量为 6 10 4 /10cm 细胞培养板, 向上层琼脂上缓慢轻轻加入 2ml 的培养液, 每隔 3-4 天换一次培养液,14-21 天后大部分细胞死亡, 可见少量的克隆形成, 挑取单个克隆并扩大培养 传代和冻存, 共获得 5 株克隆, 依次命名为 A1 A2 A3 A4 和 A5, 其中候选 A2 如图 1 6
5/5 页 [0039] ( 四 ) 候选克隆细胞株成瘤能力的检测 : 按以上摸索好的琼脂克隆形成能力检测方法, 下层继续使用 ( 终质量浓度 )0.6% 琼脂, 上层 ( 含细胞 ) 的琼脂终质量浓度为 0.3%, 利用六孔板细胞数量为 10 4 / 孔, 板, 向上层琼脂上缓慢轻轻加入 500μl 的培养液, 需要添加 DOX 组提前配制好含有 DOX 的 DMEM 培养基 (DOX 在培养基中的终浓度均为 1ug/ml), 放置 37,5% CO2 培养箱中培养 ; 每隔 3-4 天换一次培养液, 实验设置 +DOX 和 -DOX 组, 每组设立三个复孔, 14~21 天后观察结果, 拍照记录并统计数据, 结果如图 2 所示,** 代表 P<0.01,ns 代表没有统计学意义, 可见候选克隆 A2+DOX 和 A2-DOX 组存在统计学差异, 表明 DOX 对突变克隆 A2 具有调控性,A2 克隆中 GSV 所突变的基因同肿瘤细胞株的成瘤能力具有明确的因果关系 [0040] ( 五 ) 胰腺癌成瘤相关候选基因的克隆 : 利用天根公司基因组提取试剂盒提取 A2 细胞株基因组, 按照 NEB 公司 Sau3A1 限制性内切酶酶切 1ug 基因组 DNA 后, 按照 T4DNA 连接酶同接头 (5μl 100μm SPL 和 5μl 100μm SPR, 加入 90μl 水, 加热至 100 反应 10min 后, 缓慢冷却至常温 ) 常温下连接过夜, 具体反应体系包括为 Sau3AI 单切后基因组 DNA 5μl Adaptor 1μl 10 T4 连接 Buffer 1μl ATP(0.01M)0.1μl T4 连接酶 0.5μl 及加入去离子水至总体积 10μl 利用 Splinkette PCR 和测序获得 GSV 插入两端的 DNA 序列, 插入位点选择在 piggybac 转座子常见的整合位点 TTAA 处, 见图 3( 接头和 Splinkette PCR 所用的引物的序列均记载在已公开的专利 CN102747096A 基因搜寻载体 随机基因突变调控方法及用途 中 ) [0041] 将测序后所得的序列通过 UCSC 基因组的 Blat 比对定位插入位点,GSV 插入位点位于基因 BRE 的第三个内含子, 具体位置在 2 号染色体的 27931921 位点 (Chr2:27931921), 生成反义 RNA, 干扰了该基因 mrna 的转录和翻译, 从而调控该基因的表达水平 [0042] ( 六 )BRE 基因在候选克隆 A2 中的表达情况 : 实验分候选克隆 A2(+DOX) A2(-DOX) 对照 ASPC-1-2D2(+DOX) 和 ASPC-1-2D2(-DOX) 四组, 所述 ASPC-1-2D2 即为前述的 Tet-off-# 2D2 细胞株, 图中所示 Actin 为对照 β-actin(β-actin 是一种细胞骨架蛋白, 表达固定, 进行 Western Blot 检测时, 常作为内参 ) 培养细胞至对数生长期, 消化 离心 收集并计数细胞, 接种 5 10 5 细胞至 60mm 培养皿内, 置 37 5%CO2 培养箱培养 待细胞铺满后, 加入 200μl 裂解液在冰上裂解细胞 15min, 其中每隔 3-5min 不断拍打培养皿, 使裂解液分布均匀 ; 将裂解后产物转移至 1.5ml EP 管内, 至 4 12000g 离心 10min; 转移上清至一新的离心管内, 放置冰上 利用 Thermofisher 公司的 BCA 试剂盒测定蛋白样品的浓度, 取 50μg 总蛋白, 利用 5 蛋白上样 Buffer 稀释样品,100 加热 3min 使蛋白样品变性, 制备出用于上样的蛋白样品 ; 经过电泳和转膜后, 利用 5% 脱脂奶粉 (5g 脱脂奶粉,100ml TBS-T)37 封闭 1h,TBS-T 冲洗 3 次, 每次 3min; 利用 5% 脱脂奶粉稀释的抗 BRE 抗体 4 杂交过夜, 第二天利用 TBS-T 洗 3 次, 每次 3min; 利用二抗杂交 1h 后,TBS-T 洗 3 次, 每次 3min; 用 ThermoWB 显色试剂盒 (A 液 B 液各数滴等量混匀 ), 采用压片暗盒进行压片, 压片结束后使用 X 光片自动洗片机洗片, 可见候选克隆 A2 中 BRE 基因表达上调, 而加入 DOX 后基因的表达受调控降低, 表明 BRE 基因的上调导致了肿瘤细胞株成瘤能力的增加, 即可促进肿瘤细胞的发生和生长 7
附图 1/1 页 图 1 图 2 图 3 8