肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法 The Detection of Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry 金静思 #, 杨超 #, 邓刘福 * 上海市免疫学研究所, 上海交通大学医学院, 上海 * 通讯作者邮箱 :dengliufu@shsmu.edu.cn # 共同第一作者 / 同等贡献 引用格式 : 金静思, 杨超, 邓刘福. (2019). 肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法. Bio-101 e1010311. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010311. How to cite: Jin, J. S., Yang, C. and Deng, L. F. (2019). The Detection of Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry. Bio-101 e1010311. Doi:10.21769/BioProtoc.1010311. (in Chinese) 摘要 : 肿瘤的发生进展及治疗预后, 与其赖以生存的肿瘤微环境息息相关 免疫细胞作为机体重要的监视防御力量, 在肿瘤内部可能扮演着截然不同的角色 M2 极化型的巨噬细胞呈现出免疫抑制状态, 能够促进肿瘤发生, 血管再生及转移 (Noy 和 Pollard, 2014); 而 M1 极化型巨噬细胞对抗肿瘤免疫效应有着关键作用 (Mantovani 等,2017) 明晰肿瘤微环境内 M1/M2 巨噬细胞细胞的极化状态, 对于研究肿瘤免疫治疗及预测临床预后有着重要的指导意义 本文旨在运用流式手段检测肿瘤微环境内巨噬细胞的极化状态, 这是探究肿瘤相关巨噬细胞功能的重要内容之一 关键词 : 肿瘤相关巨噬细胞, 巨噬细胞极化, 肿瘤微环境, 流式技术 材料与试剂 材料 : 1. 眼科剪及眼科镊 2. 1 ml 移液枪及枪头 3. 6 孔细胞培养平底板 (NEST, catalog number: 032819AA01) 4. 96 孔细胞培养 U 底板 (NEST, catalog number: 112518AA03) 5. 15 ml 离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc TM, catalog number: 339650) Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1
6. 50 ml 离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc TM, catalog number: 339652) 7. 无菌注射器 ( 上海康德莱企业发展有限公司,KDL ) 8. 70 μm 孔径滤网 (Corning, Falcon, catalog number: 352350) 9. 5 ml 无菌圆底管 ( 带滤网 ) (Corning, Falcon, catalog number: 352235) 试剂 : 1. 胎牛血清 (Gemini, Foundation TM, catalog number: 900-108) 2. 胶原蛋白酶 I (Worthington Biochemical, catalog number: LS004186,-20 C 储存 ) 3. 脱氧核糖核酸酶 I, 来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich,catalog number: DN25,-20 C 储存 ) 4. DMEM 基础高糖培养液 (Hyclone TM, catalog number: SH30243.01) 5. PBS (Hyclone TM, catalog number: SH302560.31) 6. 乙醇 7. 5% DMEM 培养液 ( 见溶液配方 ) 8. FACS buffer ( 见溶液配方 ) 9. 肿瘤组织消化液 ( 见溶液配方 ) 抗体 : 1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307) 2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience, BD,catalog number: 565388) 3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend, catalog number: 109839) 4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend, catalog number: 128035) 5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend, catalog number: 127643) 6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend, catalog number: 101216) 7. Anti-mouse-F4/80-BV421 (Biolegend, catalog number: 123137) 8. Anti-mouse-CD86-FITC (Biolegend, catalog number: 105005) 9. Anti-mouse-MHC class II (I-A/I/E)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend, catalog number: 107625) 10. Anti-mouse-CD206-PE (Biolegend, catalog number: 141706) Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2
仪器设备 1. 37 C 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific) 2. 电热恒温水槽 ( 上海一恒科学仪器有限公司, model: DK-8AXX) 3. 低温离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 4. 微型台式真空泵 GL-802B 型 (Kylin-bell, model: GL-802B 型 ) 5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent) 6. 恒温细胞培养箱 7. 超净工作台 实验步骤 1. 前期准备工作 1.1 分组标记 : 根据实验分组需求取若干六孔板, 标记荷瘤小鼠信息 六孔板中每孔加入 3 ml DMEM 高糖培养基, 将六孔板置于冰上待用 1.2 配制肿瘤组织消化液 : 将预先配制的 100 消化液母液 ( 含 100 mg/ml 胶原酶 I 和 20 mg/ml DNA 酶 I) 用含 5% FBS 的 DMEM 高糖培养基稀释 100 倍, 即最终工作浓度为 1 mg/ml 胶原酶 I 和 200 μg/ml DNA 酶 I 将 1 消化液置于 37 C 水浴锅预热待用 1.3 器械准备 : 根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子, 用双蒸水洗净后 75% 乙醇消毒, 烘干备用 2. 肿瘤组织的分离采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死, 喷洒 75% 乙醇消毒 左手持弯镊, 右手持剪刀在肿瘤右侧 1 cm 处沿肿瘤边缘剪开一长约 2 cm 口子 左手捏住剪开处的皮肤向外翻折, 可清晰见到肿瘤附着于皮下 用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开, 将肿瘤剥离, 注意肿瘤若有溃烂, 则避开溃烂之处 将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内 3. 肿瘤组织的剪碎待全部肿瘤剥离完毕, 用移液枪吸出预留 DMEM 高糖培养基, 余大约 0.1 ml, 以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥 手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织, 将肿瘤组织剪成泥浆状, 肉眼无法看见清晰组织块 注意以上步骤均在冰上操作 Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 3
4. 肿瘤组织的消化将肿瘤组织剪成泥浆状后, 每孔加入 2 ml 1 消化液, 用 1 ml 枪头将肿瘤组织碎末打散, 置于 37 C 恒温细胞培养箱消化 30 min, 每隔 10 min 将六孔板取出晃动混匀一次 注意严格按照时间消化, 以免影响免疫细胞活性 ; 可根据肿瘤大小调整 1 消化液的用量 5. 制备肿瘤细胞悬液消化完毕后, 将六孔板取出放于冰板上, 每孔加入 4 ml DMEM 高糖培养基 ( 含 5% FBS) 终止消化 用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至 70 μm 细胞滤网过滤, 同时用 1 ml 注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 ( 注意研磨时切勿用力, 易将脂肪等带入细胞悬液中 ), 用 DMEM 高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块, 所得肿瘤悬液 4 C, 850 g, 离心 5 min 6. 染色前封闭由于髓系细胞表面表达较多 Fc 受体, 容易对流式抗体有非特异性结合, 故采用预先阻断 Fc 受体封闭 离心后弃上清, 根据沉淀多少加入适量 FACS 缓冲液混匀, 取 1 0 μl 细胞悬液计数, 将悬液细胞密度调至 2 10 7 个 /ml 取 100 μl 细胞悬液于 U 底 96 孔内, 按 100:3 比例加入抗 Fc 受体抗体 ( 即每 100 μl 细胞悬液加入 3 μl 抗 Fc 受体抗体 ),4 C 孵育 30 min 7. 配制流式染色抗体按照表 1 配制流式抗体混合液 ( 用 FACS 缓冲液配制 ), 每孔加入 70 μl 流式抗体混合液, 根据需要计算每个流式抗体所需体积 注 : 由于 F4/80 MHCII CD86 CD206 染色均显示漂移, 没有明显分群, 需要额外增加空白对照 ( 不加相应的流式抗体 ) 和荧光扣除对照 ( 加入与相应流式抗体一样的只带荧光的流式抗体 ) 以 anti-mouse-cd206-pe 为例, 空白对照即不加 CD206-PE 这支流式抗体, 而荧光扣除对照则是添加 anti-rat-igg-pe Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 4
表 1. 肿瘤微环境内 MDSCs 流式染色配色 流式抗体 荧光通道 稀释比例 Fixable Viability Stain 7 APC/Cy7 1000 80 Anti-mouse-CD45.2 BV785 200 Anti-mouse-Ly6C BV605 200 Anti-mouse-Ly6G BV711 200 Anti-mouse-CD11b PE/Cy7 200 Anti-mouse F4/80 BV421 200 Anti-mouse MHCII PerCP/Cy5.5 200 Anti-mouse CD206 PE 200 Anti-mouse CD86 FITC 200 注 : 流式抗体使用配色可自行调整, 注意不要使用补偿过大的荧光通道 8. 流式染色封闭结束后,4 C,850 g 离心 5min 弃上清, 每孔加入 70 μl 流式抗体混合液, 轻柔吹打混匀, 注意不要有气泡 将 96 孔板置于 4 C 避光, 染色 30 min 9. 洗涤 上机染色结束后每孔加入 200 μl FACS 缓冲液,4 C,850 g 离心 5min 弃上清后再次加入 200 μl FACS 缓冲液洗涤一次,4 C,850 g 离心 5min 弃上清, 加入 300 μl FACS 缓冲液重悬细胞, 将细胞悬液转移至带滤网的流式管中 ( 同时过滤细胞悬液 ) 制备好的流式染色样品用 BD Fortessa 进行分析, 数据处理软件采用 FlowJo Version 10.0 结果与分析设门方式 ( 图 1): 肿瘤相关巨噬细胞 :Single cell, live, CD45+Ly6C-Ly6G-CD11b+F4/80+ M1 巨噬细胞表面标志 :MHCII,CD86 M2 巨噬细胞表面标志 :CD206 Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 5
图 1. 肿瘤相关巨噬细胞的设门方式 溶液配方注 : 以下溶液均在超净台内配制 1. 5% DMEM 培养液 DMEM 基础高糖培养液 + 5% 胎牛血清 Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 6
4 C 冷藏,1 个月内使用 2. FACS buffer PBS + 2% 胎牛血清 4 C 冷藏,1 周内使用 3. 肿瘤组织消化液 5% DMEM 培养液 + 胶原蛋白酶 I ( 工作浓度 :1 mg/ml) + 脱氧核糖核酸酶 I ( 工作浓度 :200 μg/ml) 参考文献 1. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L. and Allavena, P. (2017). Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol 14(7): 399-416. 2. Noy, R. and Pollard, J. W. (2014). Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity 41(1): 49-61. Copyright 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 7