A5284 Protein A40 Plus 亲和层析预装柱 使用说明 专业实验仪器耗材提供商

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A5284 Protein A40 Plus 亲和层析预装柱 使用说明 预装柱介绍 芯硅谷 A40 Plus 预装柱是专为实验室抗体快速 简单分离纯化而设计的亲和柱, 有 1ml 和 5ml 两种规格 柱管采用生物耐受性的聚丙烯材料, 具有无毒 不与生物分子结合及低溶解度的优点 预装柱的 1/16 英寸接口, 可随实验条件不同与注射器 蠕动泵或色谱系统配套使用 预装芯硅谷 A40 Plus, 是以单分散高交联度聚苯乙烯 - 二乙烯基苯微球为载体, 重组 Protein A 为配基的亲和色谱填料, 其载体的刚性结构 快速传质能力以及 Protein A 的正确键合, 使 芯硅谷 A40 Plus 成为抗体纯化的理想填料 预装柱规格 柱体积 1 ml 5 ml 柱尺寸 I.D. 7 25 mm I.D. 16 25 mm 最大流速 4 ml/min 15-20 ml/min 推荐流速 0.5-1 ml/min 1-5 ml/min 最大压力 5 bar 5 bar 注意 : 芯硅谷 A40 Plus 预装柱不可拆开或自行填装 两端的堵头确保拧紧以免贮存液泄漏 填料规格 参数 描述 载体 单分散高交联度聚苯乙烯 - 二乙烯基苯 (PS-DVB) 配基 重组 A 蛋白 粒径 40 µm 动态载样量 约 30 mg higg/ml 填料 ( 通过 10% 前沿分析法, 流速 500 cm/hr, 柱长 50 mm,residence time = 0.6 min) 最大压力 <1000 psi 缩胀性 < 1% from 1 100% organic solvent ph 稳定范围 ph 3 12( 常用 ) ph 2 14(CIP) CIP 清洗剂 0.1-0.5 M NaOH 温度稳定范围 4 30 储存条件 4-8 20% 乙醇 操作说明 由于 Protein A 与 IgG 的结合可以在较宽的 ph 范围里进行, 选择何种缓冲体系取决于所应

用的样品 洗脱过程通常采用降低 ph 的方式进行, 而不同来源的 IgG 因其亚基不同, 适宜 的洗脱缓冲液 ph 也不相同 下表提供了各种常见 IgG 亚体与 Protein A 结合能力以及适宜的上样 洗脱 ph Antibody Affinity Binding ph Elution ph Human IgG1 very high 6.0 7.0 3.5 4.5 IgG2 very high 6.0 7.0 3.5 4.5 IgG3 low-none 8.0 9.0 7.0 IgG4 low-high 7.0 8.0 3.0 6.0 Mouse 缓冲液的准备 IgG1 low 8.0 9.0 4.5 6.0 IgG2a moderate 7.0 8.0 3.5 5.5 IgG2b high ~7.0 3.0 4.0 IgG3 low-high ~7.0 3.5 5.5 推荐采用下列缓冲液 : 上样缓冲液 :20 mm 磷酸盐缓冲液, 含 0.15 M NaCl,pH 7.5 洗脱缓冲液 :0.1 M 甘氨酸盐酸盐缓冲液,pH 2.5~3.6 注意 : 若用芯硅谷 A40 Plus 预装柱纯化鼠源 IgG1, 上样缓冲液中添加 2.5 M NaCl 可以提高 载量 配制缓冲液所用的水及各种试剂必须为高纯度的, 并且使用前需经过 0.22 μm 或 0.45 μm 滤 膜过滤 样品准备 如果需要, 可采用下列方法调整样品至上样缓冲体系中 : 用上样缓冲液稀释样品 通过凝胶色谱法进行缓冲液臵换 样品在进样前需经过 0.45 μm 滤膜过滤或者离心, 以避免微粒杂质堵塞柱子, 延长柱子使用 寿命 纯化步骤 1 取下预装柱顶端堵头, 将其接入色谱系统中或注射器上, 操作时应避免空气进入柱中 ; 2 取下预装柱底部堵头, 用至少 5 个柱体积的纯水或上样缓冲液将柱子中乙醇冲洗出 ; 3 用 10 个柱体积的上样缓冲液平衡柱子, 流速 1ml/min(1ml 预装柱 ) 或 5ml/min(5ml 预装柱 ); 4 通过泵或者注射器上样 ; 5 用 5~10 个柱体积的上样缓冲液过柱子直到色谱图中曲线回到基线附近 ; 6 洗脱 : 如使用注射器, 通常以 2-5 个柱体积的洗脱液流过柱子即可 ; 如使用泵, 可采用梯度或等度方式洗脱 : 梯度洗脱 : 在 10~20 个柱体积内 0-100% 洗脱缓冲液 等度洗脱 : 用 2~5 个柱体积洗脱缓冲液洗脱 7 再生 : 用 5 个柱体积洗脱缓冲液冲洗柱子 ;

8 用 3 个柱体积上样缓冲液过柱 ; 9 如果需要可进行一次在线清洗 CIP, 用 0.1-0.5 M NaOH 溶液冲洗 5 个柱体积 ; 10 用 5~10 个柱体积上样缓冲液平衡柱子至基线 流出液 ph 及电导率达到预设值 注意 : 不可超过柱子耐压上限 清洗清洗的目的是除去柱子中残余的蛋白及污染物 柱子在使用过程中, 由于样品或杂蛋白 的沉积 脂类物质不可逆的吸附及其他污染引起柱子的堵塞 柱压升高 载量下降等现象, 因此为了避免上述污染的累积以延长柱子寿命, 当出现下列情况时便需要对柱子进行一次清 洗 发现柱压增加时 发现柱效下降时 同一根柱子在进行不同样品分离时 分离同一样品至少进行 5 次循环时 清洗流程 1 用平衡缓冲液冲洗柱子 3 个柱体积 ; 2 用 0.1-0.5 M NaOH 冲洗柱子至少 2 个柱体积, 保持 10-15 分钟 ; 3 立即用至少 5 个柱体积的平衡缓冲液冲洗柱子 CIP 过程通常在洗脱步骤之后, 但在用 0.1-0.5 M NaOH 冲洗前, 建议用中性的平衡缓冲液将柱子调整至中性 ph, 以避免低 ph 的洗脱液与高 ph 清洗液直接接触导致柱内温度升高 NaOH 的浓度 接触时间以及清洗频率需要客户根据实际情况进行适当调整和优化, 我们建议通常每 5 次分离后进行一次 CIP, 以及分离不同类样品间隔时 提示 : 不论哪一种清洗方法, 推荐采用反向冲洗以驱赶柱中微粒, 防止柱子下部分受到污染 消毒消毒的目的是降低柱子中微生物的污染 所有的柱子都应定期进行消毒, 方法如下 : 用 3 个柱体积平衡缓冲液冲洗柱子 ; 用 0.1-0.5 M NaOH 冲洗柱子并保持至少 15 分钟 ; 立即用平衡缓冲液冲洗柱子至少 5 个柱体积 注意 : 更高的 NaOH 浓度或更长的接触时间能够更有效的除去微生物, 但同时这种条件可能导致填料动态载量的下降, 因此需综合考虑以最低的载量损失达到最优的微生物清除效果 存放 短时间或过夜存放 : 以 20% 乙醇臵换柱子中缓冲液并存放于 4~8 下 长时间保存柱子前, 最好先进行一次 CIP, 再用 20% 乙醇保存于 4~8 下 不可冷冻! 确保柱子两端堵头拧紧以避免柱子干裂!

问题及解决办法 出现的问题 引起原因及解决措施 使用过程中柱压升高柱子堵塞引起, 清洗柱子使用黏度高的溶液时, 应 降低流速上样过程中压力波动较大样品中的气泡引起, 洗脱峰变宽 如果可能应对样品进行真空脱气 洗脱缓冲液强度不够或污染物在柱子中积累所 引起优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗 频率 产率下降洗脱强度及清洗不够引起, 优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗频率 洗脱过程中出现沉淀洗脱条件及清洗不够理想引起, 清洗过程中压力过高 柱效下降, 优化洗脱条件及清洗无效 优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗频率 柱子中的蛋白沉淀引起 优化洗脱条件和 / 或在清洗前用酸性溶液 (ph3 或更低 ) 进行再生, 采用低流速 更换新柱子, 柱子的寿命主要取决于样品及样品 预处理 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. Suite 601,No.196 New Jinqiao Road, Shanghai,201206,China +86-21-20337333(tel) +86-21-50323701(fax) www.aladdin-e.com