Serum(Plasma) Direct qpcr Kit-Taqman Cat.No.DQT-0411T/04111/04112/04113 Serum(Plasma) Direct qpcr Kit(UNG) -Taqman Cat.No.DQT-0412T/04121/04122/04123 For fast blood direct qpcr using serum, plasma For performing qpcr directly from serum,plasma without prior DNA purification Research use only Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 1/16
目录 产品介绍........ 3 产品特点............ 4 试剂盒应用............. 4 产品质量控制............ 4 试剂盒内容.......... 5 试剂盒组分信息.......... 6 储存条件...... 7 注意事项............ 7 操作前准备事项............. 8 实验材料和设备........... 8 安全性............. 8 操作指南......... 9 Taqman 探针法血清 / 血浆直接 qpcr 操作步骤.... 10 操作示意图.............. 13 问题分析指南............... 14 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 2/16
产品介绍 本产品采用独特的裂解缓冲液体系, 能直接以血清或血浆作为模板进行 qpcr, 无需纯化血液 DNA, 极大的避免了操作过程中的外源污染, 缩短检测时间 特别适合于检测 分析血液中的 DNA 病毒及细菌等微生物 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman 包含本公司特有的 Foregene D-Taq DNA Polymerase dntps MgCl 2 Taq Reaction Buffer PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等, 对血清或血浆有极强的耐受性, 血清或血浆加入量最多能占体系的 30% 2 S-qPCR Easy TM Mix(UNG)-Taqman 在 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶 (Uracil-N-glycosylase) 在 PCR 反应前, 利用 UNG 酶降解含有尿嘧啶的 PCR 产物, UNG 酶对不含有尿嘧啶的模板不会造成任何影响, 从而保证扩增的特异性和准确性, 防止了大规模基因检测时可能出现的 PCR 产物污染问题 D-Taq DNA polymerase 是 Foregene 为直接 PCR 反应专门研制出的 DNA polymerase D-Taq DNA polymerase 对多种 PCR 反应抑制剂具有极强的的耐受性 在各种复杂反应体系中均能高效扩增痕量的 DNA, 扩增速度可达 2Kb/min, 特别适合进行直接 PCR 反应 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 3/16
产品特点 无需进行费时而昂贵的 DNA 纯化, 直接使用血清或血浆作为 qpcr 模板 体系对血液的耐受能力强, 可以灵敏的检测出血液中基因组和外源目的 DNA 片段 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman(2 S-qPCR Easy TM Mix(UNG)-Taqman) 耐受度高, 血清 / 血浆最大加入量为 PCR 体系的 30% 样本全封闭式操作, 无需担心样本污染和 qpcr 结果假阳性 防污染 PCR 体系 2 S-qPCR Easy TM Mix(UNG)-Taqman, 有效消除由 PCR 产物所引起的污染, 保证扩增的特异性和准确性 试剂盒应用 专用于血清或血浆直接 qpcr 鉴定 可以直接检测血清或血浆中的病原微生物 产品质量控制 按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 ( s Total Quality Management System), 每一批次的血清 / 血浆直接 qpcr 系列试剂盒 -Taqman 都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 4/16
试剂盒内容 Serum(Plasma) Direct qpcr Kit-Taqman 血清 / 血浆直接 qpcr 试剂盒 -Taqman 试剂盒组成 DQT-0411T DQT-04111 DQT-04112 DQT-04113 50 次 200 次 500 次 2000 次 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 20 ROX Reference Dye 100μl 200μl 500μl 1ml 2 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Serum(Plasma) Direct qpcr Kit (UNG)-Taqman 血清 / 血浆直接 qpcr 试剂盒 (UNG)-Taqman 试剂盒组成 DQT-0412T DQT-04121 DQT-04122 DQT-04123 50 次 200 次 500 次 2000 次 2 S-qPCR Easy TM Mix(UNG)-Taqman 500μl 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 12 20 ROX Reference Dye 100μl 200μl 500μl 1ml 2 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 5/16
试剂盒组分信息 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman: 包括 Foregene 为直接 PCR 反应特别改造的 D-Taq DNA Polymerase dntps MgCl 2 反应缓冲液 PCR 反应增强剂 优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的血清或血浆 引物 ddh 2 O 添加到 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman 中即可用于 qpcr 反应 2 S-qPCR Easy TM Mix(UNG)-Taqman: 在 2 S-qPCR Easy TM Mix-Taqman 的基础上用 dutp 替代了 dttp, 并同时加入能够降解含有 dutp 模板的 UNG 酶, 从而能够有效防止 PCR 扩增产物污染 ROX Reference Dye: 只使用在 ABI Stratagene 等公司的荧光定量 PCR 仪上, 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差 ( 具体用量见表 1) Roche Bio-Rad Eppendorf 等荧光定量 PCR 仪不必使用 ( 当使用以上未提及仪器时, 请参考仪器的说明书或与仪器厂家联系进行确认是否需要加入 ROX Reference Dye 进行校正 ) 表 1: 不同荧光定量 PCR 仪中 ROX Reference Dye 的用量 荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 1 ( 如 20μl 体系, 加入 1μl 20 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 0.5 ( 如 20μl 体系, 加入 0.5μl 20 ROX Reference Dye) Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 6/16
储存条件 1. 输运条件 全程低温冰盒运输, 保证整个试剂盒处于 <4 状态 2. 保存条件 本试剂盒保存在 -20 2 qpcr Mix 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 );20 ROX Reference Dye 可置于 4 或 -20 长期保存 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 不能使用全血或是含有血红细胞的样本作为 qpcr 模板, 请使用血清 血浆或者纯化的 DNA 作为模板 请尽量使用新近处理的样本进行相关实验 ; 若是冻存的样本, 避免反复冻融, 否则会导致作为 PCR 模板的 DNA 片段较小, 影响 PCR 效率 注意实验用具的清洁以及实验的操作手法, 避免样本间的交叉污染 2 qpcr Mix 应避免反复冻融, 否则会影响 PCR 效率 2 qpcr Mix 在环境温度较高时, 可能会变浑浊, 可置于冰上放置 1-2min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 7/16
操作前准备事项 使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 血清 / 血浆直接 qpcr 系列试剂盒 -Taqman 操作简单 方便 快速, 说明书提供了整个试剂盒的完整信息和正确使用方法 请在 使用前准备好必要的实验材料和设备 实验材料和设备 新鲜或保存好的血清或血浆或者纯化的 DNA 0.2ml 无菌 PCR 管 定量 PCR 仪 移液器等 安全性 本产品仅供科研使用, 请勿用于医药 临床医疗 食品及化妆品等用途 使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 8/16
操作指南 可根据实验的目的和要求选择普通试剂盒或防 PCR 产物污染系列试剂盒 材料取用说明 尽量取用新近处理的血清或血浆样本进行实验, 冻存样本避免反复冻融 若是进行基因组上的目的片段检测, 我们建议尽量使用少量的样本量作为模板 ; 若是检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段, 我们建议扩大 PCR 体系并使用较大量的模板 血清 / 血浆作为模板最多占 PCR 体系的 30% 全血预处理 如果样本为血清 血浆或是纯化的 DNA, 直接作为模板进行 qpcr 检测 如果样本为抗凝全血, 请先使用 Foregene Blood DNA Mini Kit 纯化基因组 DNA 或离心操作处理全血分离得到血清或血浆样本, 再以血清或血浆作为模板进行的 qpcr 检测 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 9/16
Taqman 探针法血清 / 血浆直接 qpcr 操作步骤 该试剂盒操作简便, 只需取适量的血清 血浆或 DNA 样本加入相应的 2 S-qPCR Easy TM Mix 中, 添加相应引物 ddh 2 O 等补齐体系即可进行 PCR 扩增 具体的操作见下详细操作步骤 : A:Real Time PCR 体系配制 1. 取出 2 S-qPCR Easy TM Mix 20 ROX Reference Dye 引物等置于碎冰上, 使 其自然融化 融化后, 上下颠倒混匀试剂, 可用离心机瞬时离心收集散落在管壁和 盖子上的液体 注意 :2 S-qPCR Easy TM Mix 放在室温或握在手中时间较长会变浑浊, 可将其置 于冰上 2-5min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 2. 将适量的血清 血浆或 DNA 样本 引物或 20 ROX Reference Dye 添加到 2 S-qPCR Easy TM Mix 中, 并用 ddh 2 O 使其稀释为 1 (qpcr 体系配制见下表 2) 注意 : 该操作应在冰浴上进行, 长时间的室温放置会降低产品性能 表 2:qPCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容 20μl 反应体系 50μl 反应体系 终浓度 2 S-qPCR Easy TM Mix 1* 10μl 25μl 1 Forward Primer(10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 2* Reverse Primer(10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 2* Probe(4μM) 1μl 2.5μl 0.2μM 3* Template (Serum/plasma/DNA) Xμl Xμl 20 ROX Reference Dye - 4* ddh 2 O( 灭菌蒸馏水 ) Add to 20μl Add to 50μl 1*: 根据试剂盒的不同,2 S-qPCR Easy TM Mix 分别为 :2 S-qPCR Easy TM Mix Taqman 或 2 S-qPCR Easy TM Mix (UNG)-Taqman 2*: 通常引物终浓度为 0.4μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.1-0.5μM 范围内调整引物浓度 3*: 通常探针终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果 反应性能较差时, 可以在 0.05-0.3μM 范围内调整探针浓度 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 10/16
4*: 根据不同的荧光定量 PCR 仪, 选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见荧光定量 PCR 仪的最适 ROX Reference Dye 浓度参照组分信息中表 1( 第 6 页 ) B:Real Time PCR 反应 根据 A 步骤配制好 PCR 体系, 混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 两步法反应条件见下表 3-1, 三步法反应条件见下表 3-2) 表 3-1: 两步法 步骤 温度 时间 循环数 内容 1 37 5 min 1 UNG 酶处理 1* 2 95 5min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 2( 两步 ) 94 10sec 循环中模板变性 35-40 60-65 2* 20-30sec 退火 / 延伸 / 荧光采集 1*: 可选步骤, 使用 2 S-qPCR EasyTM Mix (UNG)-Taqman 时, 通过该步骤有效去除污染 ; 若 使用 2 S-qPCR EasyTM Mix Taqman 可跳过该步骤 2*: 推荐退火 / 延伸温度为 60 在具体操作中, 需要根据目的片段大小 扩增片段的碱基序列和 引物的 GC 含量及长短等具体情况在 60-66 范围内优化 表 3-2: 三步法 步骤温度时间循环数内容 1* 1 37 5 min 1 UNG 酶处理 2 95 5min 1 灭活 UNG 酶 & 预变性 94 10sec 循环中模板变性 3( 三步 ) 55-65 20-30sec 30-45 退火 72 20-30sec 延伸 / 荧光采集注意 : 对于大多数模板, 预变性过程只需 94-95 1-2 分钟即可 如果模板的 GC 含量很高, 可以适当延长预变性时间 为了得到最佳的 PCR 效果, 针对不同的模板 不同的引物可采用梯度 PCR 优化反应条件 PCR 反应条件视模板 引物等的结构条件不同而各异 在具体操作中需要根据模板类型 目的片段大小 扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 延伸时间等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 11/16
PCR 对照反应 在 qpcr 结果分析时, 不管是阳性结果或阴性结果, 如果没有对照反应, 我们都不能确 定结果是否可靠 为了便于后续实验结果的分析, 我们建议在进行 qpcr 时, 设置阳性 和阴性 PCR 对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰 A: 阳性对照 采用纯化的样本 DNA(50-200ng) 作为模板, 加入 qpcr 预混液作为阳性对照, 以确定 qpcr 反应体系和条件的正确性以及 2 S-qPCR Easy TM Mix 有效性 B: 阴性对照 建议在每次试验过程中都加入除 DNA 模板外的 PCR 反应体系作为阴性对照, 以监控 试验过程中是否存在污染 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 12/16
操作示意图 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 13/16
问题分析指南 以下针对血清 / 血浆直接 qpcr 系列试剂盒在实验中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助 另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您 如有任何需要可联系我们 :028-83360257 或 E-mali: Tech@foregene.com 正对照 待测样本均无目的片段的扩增信号或 Ct 值过大 1. 荧光定量 PCR 仪的设置不正确 建议 : 确保荧光定量 PCR 仪在荧光的采集步骤 种类以及检测位置等参数设置正确, 然后再进行试验 2. PCR 试剂保存不当失去活性 建议 :2 S-qPCR Easy TM Mix 应保存于 -20, 使用时避免反复冻融 若使用频繁, 可在 4 短时间存放 3. qpcr 反应条件不合适 建议 : 使用推荐的 PCR 程序进行试验 必要时, 以纯化 DNA 为模板对反应条件进行优化后, 再进行大规模检测 4. 扩增产物过长 建议 :PCR 扩增产物长度以 60bp~200bp 为宜, 不能超过 300bp 5. 引物或探针浓度不合适 建议 : 适当调整反应体系中引物或探针的浓度 6. 引物或探针设计问题 建议 : 尝试重新设计引物或探针进行检查 试验重复性差 1. 未引入校正系统 建议 : 根据各自荧光定量 PCR 仪的要求, 进行系统校正 2. 加样误差 建议 : 规范使用微量移液器, 使用硅化处理后的枪头进行加样 3. 反应管侧壁残留液体或有气泡 建议 : 进行扩增反应之前, 将完成加样的反应管进行瞬时离心, 仔细检查反应管内是否有气泡残留 4. 模板浓度太低或抑制物浓度过高 建议 : 适当调整模板用量 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 14/16
5. 反应体系过小 建议 : 适当增大 PCR 反应体系 正对照扩增信号正常, 待测样本无目的片段的扩增信号或 Ct 值过大 1. 样本保存不当或保存时间过久,DNA 基因组已经降解 建议 : 尽量使用新鲜样本进行 qpcr 检测 2. 样本中抑制物过多 建议 : 在 PCR 反应体系 5-30% 范围内优化模板加入量 3. PCR 循环数不足 建议 : 适当增加 PCR 的循环数, 推荐在 35-40 循环为佳 空白对照出现目的片段的扩增曲线 1. 操作工具或试剂污染 建议 : 实验所有试剂或器材均应高压灭菌 操作时应小心轻柔, 防止将样品吸入加样枪内或溅出离心管外 2. 样本间交叉污染 建议 : 每个取样器只对一个样本使用 ; 或取完一个样本后, 将取样器刃口浸入 2% 的次氯酸钠溶液中, 反复涮洗, 然后用干净的纸巾擦干残液 3. PCR 产物污染 建议 : 如果实验室经常检测同类型样本, 最好使用含 UNG 防 PCR 产物污染系统的试剂盒进行实验 使用 ROX 染料校正后的荧光信号不正常 1. ROX Reference Dye 加入量过多或过少 建议 : 根据表 1 的推荐用量的 ROX Reference Dye 2. 荧光定量 PCR 仪器颜色校正不准确 建议 : 根据荧光定量 PCR 仪说明进行重新校正 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 15/16
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