概述 Muta-direct 定点突变试剂盒使用说明 Muta-direct 定点突变试剂盒可以在克隆于质粒 DNA 序列的特定位点诱导突变, 理论上可以保证突 变率达到 100%, 整个实验过程简单快捷 只有两步, 而不需要用到 M13 载体和甲基化步骤 该试剂盒 可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变 再突变成野生型 密码子突变 插入或者缺失等, 因 此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究 另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变, 又可以应用于 蛋白质工程学研究领域 定点突变试剂盒操作十分简单 ( 根据我们提供的引物设计原则设计引物 ; 用 Muta-direct 酶进行 15~18 个循环的 PCR 扩增反应 ;Mutazyme 酶处理选择突变克隆 ; 转化 ) 理论上在 LB 平板上的克隆 100% 是突变克隆, 通过对突变克隆的测序分析, 正确的突变可以应用于后续实验 PCR amplified Mutated Not Mutated Step 1. Inducing mutation PCR reaction Using Muta-direct Enzyme Step2. Selection Using Mutazyme Enzyme Not digested Digested by Mutazyme Not Transformed Step 3. Transformation Using competent cell (Nick recovering) Transformed Figure 1. Steps of Muta-direct Site-Directed Mutagenesis Kit 产品特点 i. 操作简便, 无需特殊的实验技能 ii. 2~3 天即可完成基因的定点突变
a) 整个实验过程只需要用到两种酶 :Muta-direct 酶和 Mutazyme 酶 b) 广泛的使用范围 : 可以用于点突变 (Point mutation), 缺失突变 (Deletion) 和插入突变 (Insertion) 等 c) 100% 的突变效率 贮存条件 请将试剂盒中提供的各种试剂于 -20 贮存 由于试剂盒中提供的反应缓冲液及 dntp 是为反应专门 优化的, 所以不要用其它的反应缓冲液及 dntp 代替 试剂盒组成 试剂盒提供的对照模板及引物, 可以完成 5 次对照实验 包括对照反应在内, 本试剂盒共可进行 15 次基因定点突变反应 ( 每次反应体系 50μl) 组成 次量 Muta -Direct Enzyme (2.5U/μl) 15μl Muta-Direct Reaction Buffer (10 ) 100μl dntp Mixture 30μl Mutazyme Enzyme (10U/μl) 15μl puc18 Control Plasmid (10ng/μl) 10μl Control Primer Mix (20pmol/µl) 15µl Competent cells Not provided 定点突变对照实验试剂盒中提供的对照质粒为 puc18, 通过它可以判断实验的成功与否 puc18 质粒包含 lac Z 基因, 用试剂盒中提供的对照引物可以诱导 puc18 中丝氨酸 (TCG) 突变为终止密码子 (TAG), 这样会导致 lacz 基因失活, 因此 LB 平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功 对于首次做突变实验的用户, 可以通过对照反应观察实验是否成功 引物设计 首先需要进行引物设计, 设计时请参考如下原则 通常引物长度为 25~45mer, 我们建议引物长度为 30~35mer 注 : 突变位点应该设计在引物的中央位置 如果设定的引物长度为 30mer, 接下来需要计算引物的 Tm 值, 看是否达到 78 (GC 含量应大于 40%) 如果 Tm 值低于 78, 则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78 (GC 含量应大于 40%) 1 设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置 2 计算引物的 Tm 值, 看是否达到 78, 如果 Tm 值低于 78, 则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78 (GC 含量应大于 40%) 3 最好使用经过纯化的引物 Tm 值计算公式 :Tm=0.41 (% of GC) 675/L+81.5 注 :L: 引物碱基数 ;% of GC: 引物 GC 含量
引物设计实例 以 GCG ACG 为例 : 5 -CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3 1 首先设计 30mer 长的上下游引物, 并将 A(T) 设计在引物的中央位置 Primer #1: 5 -CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5 -GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3 2 引物 GC 含量为 40%, L 为 30, 将这两个数值带入 Tm 值计算公式, 得到其 Tm=75.5 (Tm=0.41 40-675/30+81.5) 通过计算可以看出其 Tm 低于 78, 这样的引物是不合适的, 所以必须 调整引物长度 3 重新调整引物长度 Primer #1: 5 -CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer #2: 5 -CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3 在引物两端加 5mer( 斜体下划线处 ), 这样引物的 GC 含量为 45.7%,L 值为 35, 将这两个数值带入 Tm 值计算公式, 得到其 Tm 为 80.952(Tm=0.41 47.5-675/35+81.5), 这样的引物就可以用于突变实验了 实验前注意事项 试剂盒提供了优化的实验方案, 按步骤操作诱导目的基因突变率几乎可达 100% 白色菌落的形成与突变效率是不同的, 在实验过程中重要的是出现白色单菌落而不是菌落出现的数量 如果出现白色菌落则证明在目的基因上已经发生了突变 有时由于 Mutazyme 处理步骤的失误, 残留的模板质粒也能形成白色菌落 但如果您操作无误, 这种情况一般不会发生 白色菌落的数量与突变率是没有直接关系的, 而与 PCR 反应条件和感受态细胞转化效率有关 如果突变没有出现在目的核苷上时, 请检测合成引物的纯度 当 PCR 反应完成后,Mutazyme 酶的用量就会影响到实验结果 若模板过量会产生阴性结果, 因此 Mutazyme 和质粒模板的用量必须适当 试剂盒适用于 15kb 甚至大于 15kb 的模板突变, 但是当所用的质粒模板大于 10kb 时, 白色菌落数量会减少, 不过这与突变效率没有关系 定点突变操作步骤 [A] 诱导突变基因 (PCR 反应 ) 以待突变的质粒为模板, 用设计的引物及 Muta-direct 酶进行 PCR 扩 增反应, 诱导目的基因突变 设计点突变引物 [ 注 ] 参考引物设计指导 准备模板质粒 DNA [ 注 ] 用 dam + 型菌株 ( 例如 DH5α 菌株 ) 作为宿主菌 在 end + 型菌株中常有克隆数低的现象, 但是对 突变效率没有影响 提取质粒 DNA 时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒 [ 选项 ] 对照反应体系 (50μl 反应体系 ) 10 Reaction Buffer puc18 control plasmid(10ng/μl, total 20ng) 5μl
Control primer mix(20pmol/μl) dntp mixture(each 2.5mM) ddh2o Muta-direct Enzyme 样品反应体系 (50μl 反应体系 ) 10 Reaction Buffer Sample plasmid(10ng/μl,total 20ng) Sample primer (F)(10pmol/μl) Sample primer (R)(10pmol/μl) dntp mixture(each 2.5mM) ddh2o Muta-direct Enzyme PCR 反应条件 38μl 5μl 38μl [ 注 ] 按如下参数设置 PCR 扩增条件 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95 30sec 15cycle 95 55 72 30sec 1min 1min per plasmid Kb PCR 扩增反应完成后冰育 5 分钟, 然后置于室温 ( 避免反复冻融 ) [ 注 ] 按下列提供的 PCR 条件进行扩增, 控制 PCR 循环数 注意当突变点位点超过 4 个时会发生突变 率降低的现象 Mutation 1~2Nucleotide 3Nucleotides Cycles 15cycles 18cycles [B] 突变质粒选择 PCR 反应结束后使用 Mutazyme 酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒 DNA 1. 准备 PCR 反应产物 2. 加入 (10U/μl)Mutazyme 酶 37 温育 1 小时 [ 注 ] 当质粒 DNA 用量过多时 Mutazyme 酶可能发生与样品反应不完全的现象 因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作 如果突变率低, 可以适当延长反应时间或增加 Mutazyme 酶用量 [C] 转化反应完毕后在质粒 DNA 上会产生缺口, 当把这个质粒 DNA 转入 E.coli 中时请选择 dam + 型菌株, 例如 DH5α 1. 将 10μl 样品加到 50μl 感受态细胞里, 然后放置在冰上 30 分钟 2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行
序列分析 通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变 为了证实这一结果, 我们建议对白色单菌落进行测序分析 突变实例 以 GGC GAC 为例 [ 突变反应体系 ] 10 Reaction Buffer Sample plasmid(6.3kb,10ng/μl,total 20ng) Sample primer(f)( 10pmol/μl) Sample primer(r)( 10pmol/μl) dntp mixture(2.5mm each) dh 2O Muta-direct Enzyme 5μl 38μl [PCR 条件 ] [ 序列分析 ] 突变质粒测序结果 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95 30sec 15cycle 95 55 72 30sec 1min 1min per plasmid Kb
常见问题 无单菌落出现 突变率低 错误突变 通过电泳检测 PCR 反应体系 解决方案 如果是 PCR 反应的问题可以通过调节退火温度进行解决 检测感受态细胞的转化效率 Mutazyme 酶处理不当 增加 Mutazyme 酶用量或延长反应时间 检查模板质粒用量 质粒用量过多会引起突变率降低 检测合成引物的质量