色層層析的定性與定量原理 ( 實驗十與實驗十一皆用此原理, 但僅需於第一次做到層析實驗時抄寫 ) 色層層析法是二十世紀應用最廣泛的分析方法也是儀器分析化學中最重要的一門, 主要在於它可同時對混合物進行分離而達到定性與定量分析 樣品分離是利用混合物質在移動相 (mobile phase, mp) 中經過固定相 (stationary phase, sp) 時因各物質吸引力不同, 導致停留在管柱時間不同而將其分離 色層分析法依動相之不同主要可區分為 : (1) 氣相色層分析法, 其動相為氣體, 如實驗十所介紹 ;(2) 液相色層分析法, 其動相為液體, 如實驗十一所介紹 以下再介紹色層分析法的定性與定量的分析 : 一 定義 ( 一 ) 分配係數 (Distribution Coefficient, K) Solute m.p. K Solute s.p. K = [Solute] s.p. [Solute] m.p. K 值愈大表示分析物停留在管柱的時間愈長, 若要將混合物分離則需 改變 K 值, 其方法如下 : (1) 改變管柱溫度 (2) 改變固定相之組成 (3) 改變移動相之組成 ( 二 ) 滯留時間 (Retention Time, t R ) 毫 起點 滯留時間 t R 波峰 積分面積 伏 0 12 24 36 48 時間 ( 分 ) 圖一色層分析圖譜 72
圖一為層析圖譜, 橫軸為時間, 縱軸代表偵測器的輸出訊號值 當一物質流出固定相進入偵測器時, 層析圖譜上就會出現一訊號待物質完全流出偵測器後即訊號回歸基線, 物質進入層析儀開始到波峰 (Peak) 出現這段時間稱為滯留時間 (t R ), 而所需運送的體積稱為滯留體積 (Retetion Volume), 積分軟體會將波形積分所得到的面積則為波峰面積 (Peak area) ( 三 ) 半帶寬 (Half-Band Width, W 1/2 ) 與帶寬 (Band Width, W) (1) 半帶寬 : 以尖峰高度一半高的帶寬即 H J 點所連的直線寬, 如圖二 1 2 P H P A B C J 圖二半帶寬 H K P A D B E C J 圖三帶寬 (2) 帶寬 : 在波之前及波尾之反曲點 (H,J) 上描繪切線與基線圍成三角形, 如圖三, 波峰面積即約等於三角形面積 D 點與 E 點所連的直線即為帶寬 W 二 定性分析 ( 一 ) 滯留時間 : 若固定相與流動相相同且流速一定, 則滯留時間與滯留體積成正比, 且為常數 一般而言, 具有相同之滯留時間之兩物質, 其組成可視為相同 ( 二 ) 管柱對物質的分離效能之評估 : 理論板數及平板高度是最常被利用於描述管柱的分析效率 理論板數越高代表管柱分離效能越好 (1) 理論板數 (number of theoretical plates, N): 與物質的滯留時間 帶寬及半帶寬的關係式如下表示 : 73
N = 16 [ t R W ] 2 或 N = 5.54 [ t R W1 2 ] 2 (2) 平板高度 (Plate Hight, H): 理論板數與板高成反比,L 為管柱長度, 其關係式如下表示 : N = L H ( 三 ) 針對混合物的物質間分離效率之評估 : 以解析能力 (Resolution, R) 判別, 色層分析目的在使混合物成分通過管柱時, 於不同的時間離開分離管柱進入偵測器而明顯看出分離效果 以圖四的兩個波峰而言, 解析能力或稱鑑別率 R, 可由下式表示 : 當 W 1 = W 2 R = t r2 t r1 W 2 + W 1 2 R = t W 2 t r1 Δt = 2 t W 2 + W 1 t r2 t r2 > t r1 W 1 W 2 圖四解析能力示意圖 ( 四 ) 分離效果的影響因素 : 主要影響因素有三種, 可以以 Van Deemter equation 動相流速 (u) 與平板高度之關係式表示之 : H = A + B u + C u H: 平板高度以 cm 為單位 u: 動相的線性速度以 cm s -1 表示 A: 路徑因素, 不受流速影 B: 縱向擴散因素, 與流速成反比 C: 分析物質在動相與靜相間質量轉移係數, 與流速成正比 74
Peak area mv mv mv mv mv mv 三 定量分析定量分析法是根據注射物質量與波峰面積之大小成正比關係而與滯留時間之長短則無關, 故測定波峰面積之大小為定量分析之依據 常用的檢量線法 ( Calibration Mass ) 為先繪製純物質在不同濃度下注射相同量之層析圖 ( 如圖五 ), 再以波峰面積對濃度作圖, 即得檢量線 ( 如圖六 ), 然後在同一操作條件下測出未知物質的層析圖與波峰面積, 將未知物與純物質相同滯留時間的波峰面積對應到檢量線即可求未知物成分的含量如虛線所示 100 80 60 40 20 0 2 ppm 0 5 10 Time (min) 100 80 60 40 20 0 4 ppm 0 5 10 Time (min) 100 80 60 40 20 0 6 ppm 0 5 10 Time (min) 100 80 60 40 20 0 8 ppm 0 5 10 Time (min) 10 ppm 100 80 60 40 20 0 0 5 10 Time (min) 100 80 60 40 20 0 unknow 0 5 10 Time (min) 圖五不同濃度的標準品層析圖 12000 10000 8000 y = 1001.4x + 17.9 R² = 0.9997 6000 4000 2000 0 0 2 4 6 8 10 12 濃度 (ppm) 圖六檢量線圖 75
實驗十 以氣相色層分析儀測定酒中酒精的濃度 一 目的了解氣相色層分析儀之原理及操作方法, 並學習以檢量線法測定樣品中物質的濃度 管柱種類不同及管柱溫度的變化對分析結果的影響 二 儀器原理氣體色層分析是種伴隨著氣體流動相通過含有固定相管柱的分離技術, 它包括 (1) 氣 - 液色層分析 (Gas -Liquid Chromatography,GLC), 其固定相 ( 即層柱填充物 ) 是分配在惰性固體支持物上的液體物質 (2) 氣 - 固色層分析 (Gas-Solid Chromatography,GSC), 其固定相是介面活性吸附物質 ( 如木炭 矽膠凝體 活性礬土等 ) 氣相色層分析的管柱放置於一烘箱中, 烘箱的溫度是可調整的, 溫度越高, 氣體動能越大, 試樣行進的速度會變快, 減少滯留時間擴散機會變小而降低峰寬, 但可能使樣品峰重疊分離效果反而變差, 因此利用管柱溫度的控制, 我們可以找到最有效率的溫度來分析試樣 以偵測器測得流出管柱分析物的含量對流出管柱的時間所得的數據圖為層析圖 層析圖上分析物之層析帶面積正比於分析物之含量, 以標準濃度之層析圖做出檢量線求出分析物之含量 氣相色層分析儀之組成 : (1) 氣體供應器 ( 鋼瓶 ) (2) 氣體控制裝置 (3) 流速計 (4) 樣品與注射器 ( 氣化樣品用 ) (5) 管柱 ( 填充管柱 (Packing Column) 或毛細管管柱 (Capillary Column) ) (6) 烘箱 ( 可控溫 ) (7) 偵測器 ( 本實驗使用 FID (flame ionization detector) ) (8) 數據處理裝置 ( 可繪出層析圖 ) 如圖 10-1 所示 76
(4) (7) (3) (8) (1) (2) (5) (6) 圖 10-1 氣相層析儀示意圖 三 使用儀器與器材機型 靜相 動相 偵測器 SHIMADZU GC-14A 填充管柱 * 氮氣 火焰離子 (FID) SHIMADZU GC-2014 毛細管管柱 ** 氮氣 火焰離子 (FID) 器材 : 尖頭注射針 10μL *C18 5μm(50cm*3.5mm) ** OPTIMA-WAX-0.25μm(30m*0.25mmI D) 四 實驗步驟 1. 首先了解氣相色層分析儀之各部份的組件及其功能 2. 將儀器依操作說明設定條件 ( 注入口溫度 :130 管柱溫度:60 偵測器溫度: 130 ) 及變數 ( 管柱溫度 :50 ) A. 酒精檢量線的製作 3. 將層析軟體設定在等待接收信號的狀態 ( 參考操作手冊 ) 4. 取一 10μL 之注射針, 以注射液清洗數次, 每次抽取分析液 1μL, 注意注射針內不可 77
有氣泡, 否則須重新抽取分析液, 直到針中沒有氣泡為止 注意 1: 每次使用注射針取分析液時, 先吸取分析液並沖洗掉, 以清洗注射針 3-4 次後, 再取分析液 1µL 5. 將注射針垂直插入注射器中, 並且迅速將分析樣品注射入注射器中, 同時按下 start 鍵並抽出注射針 6. 當層析圖之層析帶出現後, 底線 ( baseline ) 變得平緩後, 即可停止數據擷取 ( 約 3 分鐘 ), 電腦將自動記錄分析物停留在管柱的時間及層析帶之面積 再注射下一個樣品前, 請將儀器之計時關閉 ( 按下 stop 鍵 ) 7. 重覆 3-6 步驟, 每次取不同之分析樣品, 計取 1% 2% 4% 6% 8% 樣品共約 5 針 8. 劃出層析帶之面積對濃度所作之檢量線 ( calibration curve ) B. 未知樣品的濃度分析 9. 分析樣品 unknown A-D 每組任選一種, 取 1μL( 報告上須註名樣品名稱 ) 依步驟 3-6 注射入儀器分析 10. 將所得積分面積帶入檢量線的 y 值, 求出未知樣品中酒精濃度為百分之幾 C. 溫度改變對分離效果的影響 11. 依操作手冊將烘箱溫度降低 10 如原來 60, 則改為 50, 測量 2% 酒精標準品的層析圖 12. 以 2% 酒精標準品之層析圖計算溫度的變化 (50 與 60 ) 對管柱理論板數的影響並討論之 13. 檢查所得之分析數據, 如時間許可, 可重做數據有問題的部分 注意 2 : (1) 層析圖面積隨濃度增加而增加 (2) 如果酒精的滯留時間在同溫度下差異很大, 請通知老師 14. 完成實驗後, 請助教協助檢視您的數據 五 注意事項標示於步驟中 78
八 實驗數據與結果 A. 檢量線的製作 : 1 2 3 4 5 6 7 濃度面積 檢量線圖形用電腦作圖, 檢量線方程式 = B. 分析樣品測量 : 分析樣品濃度值計算式 = 未知樣品 ( L ) 面積濃度 ( % ) C. 理論板數計算 ( 只計算分析樣品 ): N t R 16 W 2 D. 同ㄧ管柱下溫度對分離效果的影響, 管柱種類 : 溫度 ( ) 滯留時間 (min) 層析帶寬度 (min) 管柱理論板數 E. 同ㄧ溫度下管柱對分離效果的影響, 管柱溫度 : 管柱種類滯留時間 (min) 層析帶寬度 (min) 管柱理論板數 九 問題與討論問題 : 一 當管柱溫度增加, 對分離效果 ( 理論板數 ) 有何影響? 對滯留時間有何影響? 二 注射針內有氣泡對實驗結果有何影響? 三 如果沒有快速打入樣品, 對實驗結果有何影響? 討論 : 請針對本次實驗的結果與收穫加以探討 79
實驗十一 以高效能液相色層分析儀分析 Phenol 及 Anisol 在樣 品中的含量 一 目的 熟悉 JASCO 高效能液相色層分析儀 ( HPLC ) 之操作方法, 並用檢量線 法求出分析樣品的含量以及改變移動相的極性對分離效果的影響 二 儀器原理在本實驗中所使用 HPLC 之示意圖如圖 11-1 所示, 其包含了有 (1) 溶劑 (2) 泵 (Pump) (3) 樣品 (4) 注入器 (5) 分離管柱 (6) 偵測器 (7) 廢液收集和 (8) 記錄裝置等 由汞帶動動相流經注入器將樣品帶入管柱中分離, 再到偵測器偵測吸收值, 最後流入廢液瓶 偵測器的訊號再經電腦轉換成吸收波峰以便計算 (5) (4) (8) (1) (3) (6) (2) 圖 11-1 HPLC 示意圖 (7) 層析管柱是整個系統最重要的核心部分, 管柱的長短 內徑大小 填充 物的材質與顆粒大小, 都會對整個系統有影響 正常管柱的壽命為兩年以上, 80
填充物質都以二氧化矽為基底, 再接上不同的官能基而有不同的分離能力, 根據不同的官能基可以分成正相層析管柱與逆相層析管柱, 填充物鍵結表面為極性物質稱為正相 (normal phase), 反之填充物鍵結表面為非極性為逆相 (revers phase) 正相管柱所用的沖提液為極性較低有機溶劑( 不能有水 ) 而與逆相管柱沖提液大多為有機溶液與水混合 樣品在分離管柱的進口處注入, 因該處的壓力高需要特殊裝置, 圖 11-2 即為用樣品管圈注入的裝置, 此裝置可以在高壓下安全使用, 樣品先灌入管圈中, 扭轉鐵氟龍圈板使流體改道就將樣品帶入分離管柱中, 然後又可再轉回準備第二次使用 圖 11-2 樣品注入裝置圖本儀器所用的偵測器是紫外線偵測器 (UV detector ), 這種偵測器包括 : 紫外光光源 濾光分光設備和光電管, 此次波長固定在 271nm 的紫外光, 含苯環的分子將會被偵測到 在注入器和分離管柱及分離管柱和偵測器之間要儘量減少連接管路的體積, 以免樣品在此管路中散開而減低了分析的效果 液相層析儀所使用的溶劑要能滿足以下的條件 : 1. 樣品要很容易溶解在此溶劑中 2. 溶劑不會破壞分離柱內的填充料 3. 溶劑不能對偵測器有很強的敏感性, 溶劑的偵測訊號不能和樣品的訊號相混 81
因此選用何種溶劑必須要考慮樣品 填充料及偵測器種類而定 移動相組成的極性高低會決定分離的效果與滯留的時間 (t R ), 本實驗所使用之分離管柱為逆向層析管 ( 即低極性之靜相 ), 逆相層析法中分析物極性高的成分較早出現 t R 較小 本實驗利用動相的組成比例改變而改變分析物之 t R 並討論管柱分離效率 三 使用儀器與器材幫浦型式動相靜相偵測器 J sco PU-2089 R.O. Water, 逆相層析管柱 (Revers phase UV-1575 J sco PU-2080 Acetonitrile column) C18, 15cm*4.6mm, 5μm UV-2075 器材 : 平頭注射針 25μL 四 實驗步驟以液相色層分析儀分析 Phenol 及 Anisol 在樣品中的含量 A. 檢量線的製作 1 首先了解液相色層分析儀之各部份組件及其功能以及分析樣品的性質, Phenol 與 Anisol 的分子結構如圖 11-3 所示 OH OCH 3 Phenol Anisol 圖 11-3 Phenol 與 Anisol 的分子結構 2 儀器設定及操作請參考儀器旁及講義附錄之操作手冊 3 將 A 馬達 ( 動相組成 H 2 O:CH 3 CN = 30:70 ) 設定 1.0mL/min EDIT 1.0 ENTER ;B 馬達 ( 動相組成 H 2 O:CH 3 CN =40:60) 設定 0.0mL/min; 4 啟動馬達 將馬達電源打開 注意 : 管路內不可以有氣泡 5 標準品注射 : 82
a. 將層析軟體設定在等待接收信號的狀態 ( 參考操作手冊 ) b. 以 50μL 之注射針, 每次取分析液 25μL, 注意針內不可有氣泡, 否則須重新抽取分析液, 直到針中沒有氣泡為止 c. 將注射器轉在 "Load" 位置 d. 將注射針插入注射器, 並將樣品打入注射器中, 抽出注射針, 並將注射器 轉到 "Inject" 的位置, 此時同時自動啟動電腦記錄 e. 當層析圖之層析帶出現後, 底線 (baseline) 變得平緩後, 則停止電腦記錄, 電腦將自動記錄分析物停留在管柱的時間及層析帶之面積 注意 : 每次使用注射針取分析液時, 先吸取分析液, 並沖洗掉, 以清洗注射針,3-4 次後, 再取分析液 25μL 6 每次取不同濃度之 Phenol 標準溶液 (20 40 60 80 100ppm) 依步驟 5 注射入儀器分析 7 每次取不同濃度之 Anisol 標準溶液 (20 40 60 80 100ppm) 依步驟 5 注射入儀器分析 8 劃出層析帶之面積對濃度所作之檢量線 (Calibration Curve) B. 未知樣品的濃度分析 9 分析樣品 unknown A-D 每組任選一種, 取 25μL( 報告上須註名樣品名稱 ) 依步驟 5 注射入儀器分析 10 將所得積分面積帶入檢量線的 y 值中, 求出未知物 Phenol 及 Anisol 在樣品中的濃度是多少 C. 動相極性的改變 11 將 A 馬達設定為 0.0 ml/min,b 馬達設定 1.0 ml/min 12 重覆注射分析樣品( 標準溶液不用 ), 計算 : 管柱之平均理論板數 N t 16 W 2 R t 解析度 : r 2 tr1 R 2 W 1 W 2 注意 : 步驟十三只須進行分析樣品之分析, 不須分析標準溶液 83
13 比較動相極性不同, 所得到的理論板數與解析度有何差別 14 檢查所得之分析數據, 如時間許可, 可重做數據有問題的步驟 15 完成實驗後, 請將所有馬達流速設定在 0.0mL/min 16 請助教協助檢視您的數據 五 注意事項標示於步驟中 84
八 實驗數據與結果 A. 檢量線的製作 : Phenol 之滯留時間平均值 : min Phenol 1 2 3 4 5 濃度 面積 Anisol 之滯留時間平均值 : min Anisol 1 2 3 4 5 濃度 面積 檢量線圖形用電腦作圖 Phenol 的檢量線方程式 = R 2 = Anisol 的檢量線方程式 = R 2 = 85
B. 分析樣品測量 : 未知樣品滯留時間面積物質成份濃度 (ppm) 分析樣品濃度值計算式 (Phenol) = 分析樣品濃度值計算式 (Anisol) = C. 理論板數計算 ( 只計算分析樣品 ): D. 溶劑成份對分離效果的影響 : 溶劑成份 滯留時間 (min) 層析帶寬度 (min) 物質成份管柱理論板數解析度 H 2 O:CH 3 CN=3:7 H 2 O:CH 3 CN =3:7 H 2 O:CH 3 CN =4:6 H 2 O:CH 3 CN =4:6 九 問題與討論 問題 : 二 當溶劑成份極性增加, 對分離效果有何影響? 對 Retention time 有何影響? 三 注射針內有氣泡對實驗結果有何影響? 四 如果管柱換成 normal phase 的管柱, 對實驗結果有何影響? 討論 : 請針對本次實驗的結果與收穫加以探討 86
參考資料 1. Gary D. Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed., John Wiley & Sons, Inc. 2004 2. Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler, and Stanley R. Crouch; Fundamentals of Analytical Chemistry, 8th Ed. Brooks/Cole, 2004. 3. Harris, Daniel C., Quantitative Chemical Analysis, 6th Ed. W. H. Freeman and Company, New York, 2003. 4. 儀器分析實驗初版, 戴火木等編著, 高立圖書有限公司 5. G. H. Schenk, Boyer, F. H.; Miles, C. I. ;Wirz, D.R. Anal. Chem. 1972, 44, 1593. 6. Rendell, D., Fluorescence and phosphorescence Willey, New York, 1987. 7. 國科會高瞻自然科學教學平台 http://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=8858 8. 聯合新聞網 http://mag.udn.com/mag/life/storypage.jsp?f_art_id=74380 9. GChttp://hiq.linde-gas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.nsf/docbyalias/ anal_gaschrom 10. HPLChttp://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10049055&locale=zh_TW 11. Douglas A. Skoog and James J. Leary; Principles of Instrumental Analysis, 4 th Ed. 12. http://www.ecomsro.com/en/s40-product/sampling/c4-inject-valves/p596-valve-b -uni 87