Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : NR180418 浓缩国际权威精华, 铸就 TIANGEN 优秀品质! TIANSeq Fast RNA Library Kit (illumina) TIANSeq 快速 RNA 文库构建试剂盒 (illumina 平台 ) 目录号 :NR102 产品内容 TIANGEN 为您提供国际化标准的生物学产品和服务 产品组成 NR102-01 NR101-02 (24 rxn) (96 rxn) Frag/1st Strand Buffer 120 μl 480 μl 1st Strand Enzyme Mix 40 μl 160 μl 2nd Strand Buffer 240 μl 960 μl PCR RT-PCR 系列 核酸 DNA RNA 分离纯化系列 DNA 分子量标准 克隆载体 感受态细胞 细胞生物学产品 蛋白分子量标准 蛋白质染色 检测及定量相关产品 2nd Strand Enzyme Mix 90 μl 360 μl 10 ERA Buffer 120 μl 480 μl 5 ERA Enzyme Mix 240 μl 960 μl TIANSeq DNA Ligase 240 µl 960 µl 5 Ligation Buffer 500 µl 2 1 ml 2 HiFi PCR Master Mix 600 µl 4 600 µl P5/P7 Primers Mix 120 µl 480 µl Nuclease-Free ddh 2 O 2 1 ml 8 1 ml 储存条件 请将试剂盒置于 -25~-15 保存, 避免反复冻融 保质期为一年 12 本产品仅供科研使用 请勿用于医药 临床治疗 食品及化妆品等用途
产品简介 TIANSeq Fast RNA Library Kit (Illumina) 是针对 Illumina 高通量测序平台开发的非定向转录组文库构建专用试剂盒, 可用于常规转录组分析及 lncrna 等非编码 RNA 的分析 本试剂盒采用快速一管式的操作流程, 可对 RNA 样本进行快速文库构建, 在双链 cdna 合成后, 样本的末端修复和 da 尾添加一步完成, 所得产物无需纯化即可直接用于接头的连接 此外, 试剂盒采用专门设计的高效高保真聚合酶, 所获得的 PCR 富集产物保真度高 无碱基偏好性 试剂盒所适用的起始样本为将总 RNA 中的 rrna 去除的 RNA ( 保留了 mrna 和其他的非编码 RNA) 或者从总 RNA 中直接分离获得的 mrna 总 RNA 样本的起始模板量为 10 ng~1 μg; mrna 样本的起始模板量低至 1 ng 适用范围 : 适用于 illumina 高通量测序平台 RNA 文库的构建 适用样本量 :10 ng~1 μg 的总 RNA ; 低至 1ng 起始的动 植物及真菌的 mrna 推荐使用的其他试剂 1 TIANSeq rrna Depletion Kit (H/M/R) (NR101) 2. TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (NG214-01/02/03) 3. TIANSeq Size Selection DNA Beads (NG306) 产品特点 1. 可针对 mrna 和除 rrna 外的非编码 RNA( 如 lncrna) 进行转录组分析 2. 操作流程简便, 可实现 RNA 样本的快速文库构建 3. 文库转化率高, 适用于极低起始量样本文库的高效转化 4.PCR 富集过程中保真度高, 不存在碱基偏好性 3.PCR 产物纯化向上述反应产物 (50 µl) 中加入 1 体积 (50 µl)tianseq Size Selection DNA Beads (NG306) 磁珠进行纯化, 具体步骤如下 : (2) 涡旋使磁珠充分悬浮, 加入 50 µl 磁珠至 PCR 产物溶液中, 用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 (3) 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5 min), 用移液器小心吸弃上清 (4) 样品始终置于磁力架上, 向反应管内加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇, 用移液器轻轻吹打漂洗磁珠, 室温孵育 30sec, 移液器小心吸弃上清 (5) 重复步骤 (4) 一次 (6) 反应管始终置于磁力架上, 室温开盖放置 5~10 min, 干燥磁珠 注意 : 加入 80% 乙醇漂洗磁珠时不要吹散磁珠 ; 两次洗涤后需要使用移液器尽量吸尽残留的上清液 ; 切勿过分干燥磁珠造成龟裂而降低回收效率 (7) 加入 32.5 µl 10 mm Tris-HCl(pH8.0) 至离心管内, 使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮, 室温静止 2min, 再将反应管放置于磁力架上 1~2 min, 待溶液澄清后, 转移 30 µl 上清至新的离心管中 注意 : 转移上清时切勿吸取磁珠, 以免影响后续文库质量 4. 用 Agilent 2100 Bioanalyzer 评价文库质量 (Agilent High Sensitivity Chip) 将所得文库适当稀释, 取 1 µl 用于 Agilent 2100 Bioanalyzer 分析 (Agilent High Sensitivity Chip), 良好的文库在预计的大小范围内会有一个比较集中的峰, 如图 1 所示 如果在 128bp 左右出现峰, 则提示文库中存在 adapter-dimer 污染, 此时将文库加入 Nuclease-free H 2 O 稀释至 50 µl, 重复 PCR 产物纯化步骤即可有效去除污染 注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项 1. 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染 2. 请使用不含 RNA 酶或 DNA 酶的枪头 EP 管进行试验 3. 试验开始前, 请清洁操作台, 并使用 RNA 酶及 DNA 酶清除试剂, 如 RNase Away (Molecular BioProducts, Inc) 处理台面 确保没有 RNA 酶和 DNA 酶的污染 4. 试验前请仔细阅读说明书, 可暂停步骤可按照说明书操作进行保存样品 5. 使用 RIN 值 7.0 完整性较好的高质量的 RNA 样本进行 rrna 去除或 mrna 的分离, 否则会影响建库质量 文库大小 :1,270-320 bp; 2, 320-420 bp; 3, 420-570 bp; 4, 570-670 bp 图 1. 200 ng Rat reference RNA, 四种不同片段化条件, 根据表一不同比例进行片段分选后结果 2 11
(8) 加入 22.5 µl10mm Tris-HCl (ph8.0) 至离心管内, 使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮, 室温静止 2 min, 再将反应管放置于磁力架上 1~2 min, 待溶液澄清后, 转移 20 µl 上清至 新的离心管中, 用于后续 PCR 富集实验 注意 : 转移上清时切勿吸取磁珠, 以免影响后续文库质量 此步纯化产物可在 -20 存 放 七 文库富集 1. 将 2 HiFi PCR Master Mix 和 P5/P7 Primers Mix 从 -20 取出, 冰上解冻后轻弹混匀, 在 PCR 管中建立如下反应体系, 并用移液器轻轻吹打充分混匀 : 纯化的接头连接产物 20 2 HiFi PCR Master Mix 25 P5/P7 Primers Mix 5 Total 50 2. 在 PCR 仪中进行文库富集反应,PCR 热盖温度设定为 105 : 反应步骤 反应温度 反应时间 循环数 1 98 2 min 1 2 98 20 sec 3 60 30 sec 6-12 4 72 30 sec 5 72 1 min 1 6 4 hold 1 操作步骤 一 RNA 片段化及随机引物结合 ( 一 ) 试验准备 : 1. 将去除 rrna 的总 RNA 或 mrna 样品从 -80 冰箱取出置于冰上缓慢化冻 2. 在开始实验前, 需要明确去除 rrna 的总 RNA 或 mrna 的样本量, 确保样本起始量在 1~100 ng 注意 : 确定去除 rrna 的总 RNA 或 mrna 上样量至关重要 推荐使用 Agilent 2100 生 物分析仪进行样品的质量及浓度检测, 要求 rrna 的残留控制在 10% 以内, 以免影响 建库后数据分析质量 rrna 去除推荐配合使用 TIANSeq rrna Depletion kit (H/R/ M)(NR101) ( 二 ) 试验步骤 1. 将 Frag/1st Strand Buffer 从 -20 取出, 解冻后轻弹混匀, 在 PCR 管中建立如下反应 体系, 用移液器轻轻吹打充分混匀, 将样品置于 PCR 仪中, 根据插入片段大小, 选 择片段化所需条件 : (1) 按照下表建立反应体系 去除 rrna 的总 RNA 或 mrna 5 Frag/1st Strand Buffer 5 Total 10 (2) 按照下表选择片段化条件插入片段大小 (bp) 反应温度 反应时间 150~200 94 15 min, 4 hold 200~300 94 10 min, 4 hold 300~450 94 8 min, 4 hold 450~550 94 5 min, 4 hold * 注意 : 选择插入片段大小 150~200 bp 范围时, 后续实验无需片段分选, 文库在预计大小范围内有相对较窄的峰, 如需插入片段范围大于 200 bp, 则在文库富集前需要进行片段分选步骤, 具体操作步骤参见下文文库片段筛选步骤 反应结束后将产物迅速置于冰上, 立即进行第一链 cdna 的合成反应 从片段化到第一链 cdna 合成过程中不可停留,mRNA 在该体系下容易降解 10 3
二 第一链 cdna 合成 1. 将 1st Strand Enzyme Mix 从 -20 取出, 轻弹混匀, 在 PCR 管中建立如下反应体系, 并用移液器轻轻吹打充分混匀 : 片段化的 RNA 样本 10 1st Strand Enzyme Mix 1.5 Nuclease-Free ddh 2 O 8.5 Total 20 * 注意 : 如同时进行多个样品反应, 可预先在合适的离心管中配制 1st Strand Enzyme Mix 和 Nuclease-Free ddh 2 O 的混合液, 再分装到各个反应管中, 建议按照实际反应数的 1.1 倍配制预混液 2. 在 PCR 仪中进行第一链 cdna 合成反应,PCR 热盖温度设定为 105 : 反应步骤 反应温度 反应时间 1 25 10 min 2 42 15 min 3 70 15 min 4 4 hold * 注意 : 反应结束后立即进行 cdna 第二链的合成反应 三 第二链 cdna 合成 1. 将 2st Strand Buffer 和 2st Strand Enzyme Mix 从 -20 取出, 轻弹混匀, 在 PCR 管中 建立如下反应体系, 并用移液器轻轻吹打充分混匀 : 合成的第一链 cdna 20 2st Strand Buffer 8.5 2st Strand Enzyme Mix 3.5 Nuclease-Free ddh 2 O 48 Total 80 (7) 加入 52.5 µl 10mM Tris-HCl (ph8.0) 至离心管内, 使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮, 室温静止 2min, 再将反应管放置于磁力架上 1~2 min, 待溶液澄清后, 转移 50 µl 上清至新的离心管中 注意 : 转移上清时请勿吸取磁珠, 以免影响后续文库质量 2. 两轮片段分选 ( 以插入片段 200~300 为例, 其他长度请根据表一选择相应的磁珠使用量 ), 所需方法如下 : 表一 : 不同插入片段大小的分选条件插入片段长度 (bp) 200~300 300~450 450~550 文库长度 (bp) 320~420 420~570 570~670 片段化条件 94-10 min 94-8 min 94-5 min 第一次筛选磁珠体积 30 µl (0.6 ) 25 µl (0.5 ) 20 µl (0.4 ) 第二次筛选磁珠体积 7.5 µl (0.1 ) 7.0 µl (0.1 ) 6.5 µl (0.1 ) 向上述接头连接纯化产物 (50 µl) 中加入 0.6 体积 (30 µl) 的 TIANSeq Size Selection DNA Beads (NG306) 磁珠进行筛选纯化, 具体步骤如下 : (2) 涡旋使磁珠充分悬浮, 加入 30 µl 磁珠至接头连接纯化产物溶液中, 用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 (3) 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5 min), 用移液器小心转移上清液 75µl 至一个新的离心管中 (4) 加入转移上清体积 (75 µl) 0.1 的磁珠 7.5 µl, 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5 min), 用移液器小心吸弃上清 (5) 样品始终置于磁力架上, 向反应管内加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇, 用移液器轻轻吹打漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 移液器小心吸弃上清 (6) 重复步骤 (5) 一次 (7) 反应管始终置于磁力架上, 室温开盖放置 5~10 min, 干燥磁珠 注意 : 加入 80% 乙醇漂洗磁珠时不要吹散磁珠 ; 两次洗涤后需要使用移液器尽量吸尽残留的上清液 ; 切勿过分干燥磁珠造成龟裂而降低回收效率 4 9
(3) 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5min), 用移液器小心吸弃上清 (4) 样品始终置于磁力架上, 向反应管内加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇, 用移液器轻轻吹打漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 移液器小心吸弃上清 (5) 重复步骤 (4) 一次 (6) 反应管始终置于磁力架上, 室温开盖放置 5~10 min, 干燥磁珠 注意 : 加入 80% 乙醇漂洗磁珠时不要吹散磁珠 ; 两次洗涤后需要使用移液器尽量吸尽残留的上清液 ; 切勿过分干燥磁珠造成龟裂而降低回收效率 (7) 加入 22.5 µl 10 mm Tris-HCl (ph8.0) 至离心管内, 使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮, 室温静止 2 min, 再将反应管放置于磁力架上 1~2 min, 待溶液澄清后, 转移 20 µl 上清至新的离心管中, 用于后续 PCR 富集实验 注意 : 转移上清时切勿吸取磁珠, 以免影响后续文库质量 方案 ( 二 ) 中, 获得插入片段长度为大于 200bp 的文库, 所需纯化方法如下 : 1. 纯化连接产物, 所需步骤如下 : 向上述接头连接产物 (100 µl) 中加入 1 体积 (100 µl) TIANSeq Size Selection DNA Beads (NG306) 磁珠进行纯化, 具体步骤如下 : (2) 涡旋使磁珠充分悬浮, 加入 80 µl 磁珠至接头连接产物溶液中, 用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 (3) 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5 min), 用移液器小心吸弃上清 (4) 样品始终置于磁力架上, 向反应管内加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇, 用移液器轻轻吹打漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 移液器小心吸弃上清 (5) 重复步骤 (4) 一次 (6) 反应管始终置于磁力架上, 室温开盖放置 5~10 min, 干燥磁珠 注意 : 加入 80% 乙醇漂洗磁珠时不要吹散磁珠 ; 两次洗涤后需要使用移液器尽量吸尽残留的上清液 ; 切勿过分干燥磁珠造成龟裂而降低回收效率 2. 在 PCR 仪中进行第二链 cdna 合成反应,PCR 热盖温度设定为 40 : 反应步骤反应温度反应时间 1 16 60 min 2 4 hold 注意 : 反应结束后,cDNA 第二链的合成产物可在 4 暂存 1 小时, 但是建议反应结束后即进行下步纯化步骤 四 双链 cdna 纯化向上述反应产物 (80 µl) 中加入 1.8 体积 (144 µl) TIANSeq Size Selection DNA Beads (NG306) 磁珠进行纯化, 具体步骤如下 : 1. 将磁珠置于室温平衡 20 min 2. 涡旋使磁珠充分悬浮, 加入 144 µl 磁珠至步骤三 (2) 的 cdna 双链合成产物溶液中, 用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 3. 室温孵育 5 min, 使 DNA 充分结合到磁珠上 再将反应管置于磁力架上约 5 min 待溶液澄清后 (3~5 min), 用移液器小心吸弃上清 4. 样品始终置于磁力架上, 向反应管内加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇, 用移液器轻轻吹打漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 移液器小心吸弃上清 5. 重复步骤 4 一次 6. 反应管始终置于磁力架上, 室温开盖放置 5~10 min, 干燥磁珠 注意 : 加入 80% 乙醇漂洗磁珠时不要吹散磁珠 ; 两次洗涤后需要使用移液器尽量吸尽残留的上清液 ; 切勿过分干燥磁珠造成龟裂而降低回收效率 7. 加入 37.5 µl Nuclease-free H 2 O 至离心管内, 使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮, 室温静止 2 min, 再将反应管放置于磁力架上 1~2 min, 待溶液澄清后, 转移 35 µl 上清至新的离心管中, 用于后续实验 注意 : 转移上清时切勿吸取磁珠, 以免影响后续文库质量 此步纯化产物可在 -20 存放 8 5
五 末端修复 /da 添加 1. 将 10 ERA Buffer 和 5 ERA Enzyme Mix 从 -20 取出置于冰上融化, 轻弹混匀, 在 PCR 管中建立如下反应体系, 并用移液器轻轻吹打充分混匀 : cdna 样本 35 10 ERA buffer 5 5 ERA Enzyme Mix 10 Total 50 注意 : 此步骤需要保持在冰浴中进行 如同时进行多个样品反应, 可预先在合适的离心 管中配制 10 ERA buffer 和 5 ERA Enzyme Mix 的混合液, 再分装到各个反应管中, 建 议按照实际反应数的 1.1 倍配制预混液 2. 在 4 预冷的 PCR 仪中进行如下反应,PCR 热盖温度设置为 70 操作步骤 温度 时间 1 4 1 min 2 20 30 min 3 65 30 min 4 4 hold 3. 反应程序结束后, 将反应产物置于冰上, 立即进入接头连接步骤 六 接头连接 1. 将 Adapter, 5 Ligase Buffer 和 TIANSeq DNA Ligase 从 -20 取出置于冰上融化, 轻弹 混匀, 按下表在 PCR 管中建立如下反应体系, 并用移液器轻轻吹打充分混匀 : da-tailing 产物 50 Adapter 5 5 Ligase Buffer 20 TIANSeq DNA Ligase 10 Nuclease-Free ddh2o 15 Total 100 注意 : 本试剂盒中不含测序 Adapter, 推荐配合 TIANSeq Single-Index Adapter Illumina)(NG214) 使用 详见 NG214 产品说明书 此步骤需要保持在冰浴中进行 如同 时进行多个样品反应, 可预先在合适的离心管中配制 5 Ligase Buffer, TIANSeq DNA Ligase 和 Nuclease-Free ddh 2 O 的混合液, 再分装到各个反应管中, 建议按照实际反应 数的 1.1 倍配制预混液 2. 在 PCR 仪中进行如下反应,PCR 热盖温度设置为 40 操作步骤 温度 时间 1 20 15 min 2 4 hold 3. 连接产物纯化及片段大小分选 该步骤提供两种备选方案 方案 ( 一 ) 为经过一轮磁珠纯化后无需分选, 该方案适合构建 插入片段为 150~200 bp 的文库, 由于经过 94 ~15 min 的片段化条件, 可有效获得 150~200 bp 的插入片段, 并去除接头残留 ; 方案 ( 二 ) 为经过一轮磁珠纯化后, 再进行两轮分选, 根据 不同的分选条件, 可得到 200 bp 以上不同的插入片段, 并去除接头残留, 此方案中片段分选 推荐配合 TIANSeq Size Selection DNA Beads (NG306) 进行 方案 ( 一 ): 获得插入片段长度为 150~200bp 的文库, 所需纯化方法如下 : 向上述接头连接产物 (100 µl) 中加入 1 体积 (100µl) TIANSeq Size Selection DNA Beads(NG306) 磁珠进行纯化, 具体步骤如下 : (2) 涡旋使磁珠充分悬浮, 加入 80 µl 磁珠至接头连接产物溶液中, 用移液器轻轻吸打 10 次充分混匀 6 7