中华检验医学杂志 2000 年第 23 卷第 4 期 流式细胞术分析血液淋巴细胞免疫表型方法学研究 王建中 摘要目的研究流式细胞术 (FCM) 分析血液淋巴细胞免疫表型 ( 亚群 ) 方法学因素对实验结果的影响 方法多参数 FCM 分析 结果血液采集后 1 h 和 6 h 测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著意义 (P>0.05), 而且批内 批间和总重复性均较好, 但单核细胞和中性粒细胞表面白细胞共同抗原 (CD45) 表达有差别 (P<0.01) 用荧光 / 散射光设门 (Back-Gating) 和三色荧光 / 侧向散射光设门 (CD45-PerCP/SSC-Gating) 设置淋巴细胞门 (LG) 时, 门中淋巴细胞的百分比和门中淋巴细胞占标本中总淋巴细胞的百分比明显高于散射光设门 (FSC/SSC-Gating) 用 FSC/SSC-Gating 和 Back-Gating 分析双色标记淋巴细胞免疫表型结果有显著差别 (P<0.01), 但 Back-Gating 和 T 淋巴细胞门 (T-Gating) 分析 T 细胞亚群结果大致相同 (P>0.05) 单色 双色 三色免疫荧光技术分析淋巴细胞免疫表型 ( 亚群 ) 结果差异有显著意义 (P<0.01) 结论 FCM 分析血液淋巴细胞免疫表型结果受多种因素影响 血液采集后应尽快进行免疫荧光染色和固定, 最迟不能超过 6 h;cd45-percp/ssc-gating 和 Back-Gating 分析淋巴细胞亚群优于 FSC/SSC-Gating,T-Gating 对 T 细胞亚群分析更特异 FCM 分析血液淋巴细胞免疫表型 ( 亚群 ) 三色优于双色免疫荧光分析, 单色免疫荧光分析应尽可能不采用 关键词 : 流式细胞术 ; 淋巴细胞 ; 免疫表型 血液中淋巴细胞免疫表型 ( 亚群 ) 分析是流式细胞术 (FCM) 最主要的临床应用之一 由于 FCM 的高灵敏度 高速度和多参数分析, 对血液中淋巴细胞免疫表型检测比其他方法更精确, 故 FCM 被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法 [1] 然而, 在实验过程中多种因素均可影响 FCM 的分析结果 [1-3] 本研究对血液标本采集后不同放置时间 不同方法设置淋巴细胞门, 不同免疫荧光染色方法等重要因素对淋巴细胞免疫表型分析的影响进行了深入探讨, 并评价了 FCM 分析淋巴细胞免疫表型的精密度, 以期对日益广泛开展的 FCM 分析淋巴细胞免疫表型的方法选择 质量保证和临床应用等有所裨益 表 1 血标本采集后放置不同时间三种白细胞 CD45 PerCP 荧光强度 (X±s) 比较 细胞类型 1 h 6 h 8 h P 值 淋巴细胞 615.55±59.56 620.36±47.49 609.98±58.56 0.4752 单核细胞 349.64±69.06 418.65±40.68 405.35±37.66 <0.0001 中性粒细胞 86.35±24.58 172.37±30.82 214.28±32.56 <0.0001
注 : 方差分析后两两 Q 检验 : 单核细胞 1 h 与 6 h 1 h 与 8 h 比较 P<0.01, 6 h 与 8 h 比较 P>0.05; 中性粒细胞 1 h 与 6 h 1 h 与 8 h 6 h 与 8 h 比较 P<0.01 材料与方法 一 主要试剂与仪器 1. 主要试剂 : 流式细胞仪校准微球 ( 包括双色 三色微球 ), 免疫表型分析质控细胞 (CD-Chex) 荧光素标记单克隆抗体(McAb):(1) 单色标记 McAb: CD3 CD4 CD8 CD19 CD16 CD45 CD56 鼠 IgG1 鼠 IgG2a (2) 双色标记 McAb 试剂盒 (Simultest IMK ): LeucoGATE (CD45/CD14) 鼠 IgG1/IgG2a CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3/CD16+56 (3) 三色标记 McAb:IgG1/IgG1/CD45 CD3/CD19/CD45 CD3/CD4/CD45 CD3/CD8/CD45 CD3/CD16+56/CD45 CD4/CD8/CD3 红细胞溶解剂 (FACS 溶解剂 ) 以上均为美国 BD 公司产品 2.FAC Sort 流式细胞仪, 美国 BD 公司产品 二 实验方法血液采集 免疫荧光染色 溶血 洗涤及固定 流式细胞仪的调试 荧光标 [4] 记样本的 FCM 分析均按美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐方法完成 三 数据分析数据以 X±s 表示 多组间数据用方差分析, 两两比较用 Q 检验 所有数据在计算机上用 SPSS 统计软件分析 结果 一 血液采集后放置时间的影响 1. 对白细胞 CD45 抗原表达的影响 :15 名正常人血液标本在采集后置室温 (20~22 ) 不同时间 (1 6 8 h) 测定淋巴细胞 单核细胞和中性粒细胞表面的白细胞共同抗原 (CD45) 表达量, 以 CD45 PerCP(Peridinin 叶绿素蛋白 ) 的平均荧光强度 (MFI) 表示, 结果见表 1 2. 对 T 淋巴细胞免疫表型分析结果的影响 :15 名正常人血标本在采集后不同时间, 用 IgG1/IgG1/CD45 作对照,CD3/CD8/CD45 三色免疫荧光染色, CD45-PerCP/SSC-Gating 设定淋巴细胞门分析 CD3 + ( 总 T 细胞 )% 和 CD3 + CD8 + (T 抑制 / 细胞毒细胞 )%,1 6 8 h 测定 CD3 + % 分别为 (61.46±9.99)% (61.11±9.13)% (64.52±7.37)%,CD3 + CD8 + % 分别为 (24.12±7.12)% (24.81±7.67)% (27.62±7.21)%,1 h 和 6 h 结果差别无显著意义 (P> 0.05), 但 1 h 和 8 h,6 h 和 8 h 结果差别有显著意义 (P<0.01) 二 不同方法设置淋巴细胞门的影响 1. 三种方法设门对淋巴细胞百分比的影响 :15 名正常人血液标本分别用散射光设门 (FSC/SSC-Gating) 荧光 / 散射光设门 (Back-Gating) 三色荧光 / 侧向角散射光设门 (CD45-PerCP/SSC-Gating) 三种方法设置淋巴细胞门后, 门内淋巴细胞的百分比 (GL%) 和门内淋巴细胞占标本中总淋巴细胞的百分比 (TL%) 测定结果见表 2 三种方法设门时,GL% 和 TL% 结果差别有显著意义 (P<0.01), 比较荧光 / 散射光设门和三色荧光 / 侧向角散射光设门,GL% 与 TL% 结果差别无显
著意义 (P>0.05); 用散射光设门时,GL% 和 TL% 与荧光 / 散射光设门和三色荧光 / 侧向角散射光设门结果差别有显著意义 (P<0.01) 2.Back-Gating 和 FSC/SSC-Gating 对双色免疫表型分析结果的影响 :15 名正常人血液标本用 Simultest 双色免疫荧光染色后, 用 Back-Gating 和 FSC/SSC-Gating 设门并分析淋巴细胞免疫表型 : 除 CD3 + CD4 + /CD3 + CD8 + 比值差别无显著意义外 (P=0.439 8),Back-Gating 设门分析的 CD3 + CD19 - % CD3 + CD4 + % CD3 + CD8 + % CD3 - CD19 + % CD3 - CD16+56 + % 均显著高于 FSC/SSC-Gating 的测定结果 (P <0.01) 比较淋巴细胞免疫亚群总和 (T 细胞 B 细胞 NK 细胞之和 ),Back-Gating [(97.60±1.50)%] 显著高于 FSC/SSC-Gating[(92.43± 2.37)%] 测定结果 (P<0.000 1) 表 2 三种方法设门时淋巴细胞百分比结果 (X±s) 比较 淋巴细胞 (%) 散射光设门 荧光 - 散射光设门 三色荧光 / 侧向角散射光设门 P 值 GL(%) 89.53±2.80 94.47±1.19 96.13±1.30 <0.000 1 TL(%) 90.80±2.54 97.80±1.01 97.80±1.08 <0.000 1 表 3 15 名正常人血标本三种免疫荧光染色方法分析淋巴细胞免疫表型结果 (X±s) 比较 分析项目 单色分析 1 双色分析 2 三色分析 3 P 值 T 淋巴细胞 (%) 66.80±7.49 * 66.93±7.71 68.33±7.67 <0.000 2 T 辅助细胞 (%) 38.13±7.26 ** 36.40±6.23 37.27±6.84 <0.000 1 T 抑制细胞 (%) 38.06±8.36 ** 29.80±8.42 30.86±8.93 <0.000 1 B 淋巴细胞 (%) 12.67±4.27 ** 12.13±4.18 11.47±4.31 0.002 6 NK 细胞 (%) T 辅助 /T 抑制细胞比值 T+B+NK 细胞 (%) 26.6 ±13.28 ** 18.47±7.50 18.40±7.85 0.000 5 1.08±0.41 ** 1.38±0.62 1.36±0.58 0.003 4 106.7 ±9.35 *** 97.60±1.50 98.33±1.11 0.003 4 * 注 : 方差分析后 Q 检验结果 : 与 2 比较 P>0.05, ** P<0.05, *** P<0.01; 与 3 比较 P>0.05, P<0.05, P<0.01; 与 1 比较 P>0.05, P<0.05, P<0.01 3.Back-Gating 和 T-Gating 对 T 细胞亚群分析的影响 :19 例随机病人标本
用 Simul test 双色免疫荧光染色和 IgG1/IgG1/CD45 CD4/CD8/CD3 T 细胞三色免疫荧光染色后, 分别用 Back-Gating 和 CD3-PerCP/SSC-Gating(T-Gating ) 设门分析 T 淋巴细胞亚群 CD3 + % CD3 + CD8 + % CD3 + CD4 + /CD3 + CD8 +, 其结果差别无显著意义 (P>0.2), 但 CD3 + CD4 + %:Back-Gating[(36.97±6.45)%] 显著高于 T-Gating[(34.24±7.22)%] 测定结果 (P<0.000 1) 三 三种免疫荧光染色方法分析淋巴细胞免疫表型结果比较 15 名正常人标本, 分别用单色 双色和三色免疫荧光染色, 淋巴细胞设门分别用 FSC/SSC-Gating Back-Gating 和 CD45-PerCP/SSC-Gating 并分析淋巴细胞免疫表型, 结果比较见表 3 四 三色免疫荧光染色分析淋巴细胞免疫表型的精密度选择 5 例临床血液标本 ( 含常见病理变化范围 ), 分别于采血后 1 6 8 h, 用 IgG1/IgG1/CD45 CD3/CD8/CD45 进行三色免疫荧光染色 ( 每个时间点重复测定 3 份 ),CD45-PerCP/SSC 设置淋巴细胞门, 分析 CD3 + 和 CD3 + CD8 + 细胞百分比, [6] 根据国际血液标准化委员会 (ICSH) 推荐的方法计算 CD3 + 细胞 (45%~72%) 和 CD3 + CD8 + 细胞 (14%~35%) 的批内 批间和总重复性 (CV%),1~6 h 的批内 批间和总重复性 (CV%):CD3 + 分别为 1.80% 1.82% 1.97%,CD3 + CD8 + 分别为 3.79% 4.17% 5.36% 1~8 h 的批内 批间和总重复性 (CV%):CD3 + 分别为 1.97% 3.56% 5.21%,CD3 + CD8 + 分别为 4.03% 8.24% 12.51% 讨论 流式细胞术 (FCM) 分析血液淋巴细胞免疫表型 ( 亚群 ) 对血液病 肿瘤 免疫性疾病如自身免疫病 免疫缺陷病的诊治, 器官移植排斥反应的监测和免疫系统功能如淋巴细胞活化研究等有重要价值 虽然 FCM 取代了传统的荧光显微镜法和免疫组化法在基础和临床医学中普遍应用, 但由于方法学中存在的一些问题使血液淋巴细胞免疫表型分析结果差别较大 [1,5], 有时甚至导致错误的结果 [2] 因此, 有必要对 FCM 分析淋巴细胞表型方法学中的诸因素进行深入研究 本研究 [5] 中考虑到用淋巴细胞分层液分离单个核细胞可导致 CD8+ T 细胞选择性丢失和 [3] 操作步骤复杂等因素, 故选择溶解全血法进行研究 一 血液标本采集后放置时间的影响血液标本采集后置室温, 不同时间对 FCM 分析淋巴细胞免疫表型结果产生显著影响 中性粒细胞 单核细胞的人白细胞共同抗原 (CD45) 表达随放置时间延长而显著增高, 从而影响 Back-Gating CD45-PerCP/SSC-Gating 淋巴细胞门的准确设置 不同时间分析 T 淋巴细胞免疫表型 :1 h 和 6 h 结果差异无显著意义 (P>0.05),1 h 和 8 h 6 h 和 8 h 结果差异均有显著意义 (P<0.01) 6 h 内三色分析 CD3 + 和 CD3 + CD8 + 淋巴细胞的批内 批间和总重复性均很好, 而 8 h 内的批内 批间和总重复性均较差 血液标本采集后在 6 h 内完成标本制备, 虽可获得较高的精密度, 但由于白细胞 CD45 表达有时间依赖性, 仍可影响淋巴细胞门设置, 故取血后应尽快测定为最佳 二 不同方法设置淋巴细胞门的影响 FCM 分析淋巴细胞免疫表型时, 必须设置淋巴细胞门 (LG) 去除外, 其他细胞 细胞碎片 仪器噪声的影响, 从而保证所分析的细胞是淋巴细胞 LG 中淋巴细胞的百分比 (GL%) 和 LG 中淋巴细胞占标本中总淋巴细胞的百分比 (TL%)
极大地影响免疫表型结果的准确性 [3] 从 FSC/SSC-Gating Back-Gating 和 CD45-PerCP/SSC-Gating 三种 LG 设置方法比较,GL% 以 CD45-PerCP/SSC-Gating 最高, Back-Gating 次之, FSC/SSC-Gating 最低 ;TL% 则表现为 CD45-PerCP/SSC-Gating 和 Back-Gating 相近, 均达到 98% 左右, 显著高于 FSC/SSC-Gating[(90.80±2.54)%] 用双色免疫荧光染色 FSC/SSC-Gating 和 Back-Gating 两种设门方法分析 15 名正常人血液淋巴细胞免疫表型, Back-Gating 分析的各类淋巴细胞亚群百分比显著高于 FSC/SSC-Gating(P< 0.01), 可能是由于 FSC/SSC-Gating 分析时淋巴细胞门中非淋巴细胞成分较高所致 [2,4,5], 仅 CD3 + CD4 + /CD3 + CD8 + 比值未见差别 (P=0.438 9) 用 Back-Gating 和 T-Gating 两种方法设门分析 19 例随机患者标本 T 细胞免疫表型,CD3 + CD3 + CD8 + CD3 + CD4 + /CD3 + CD8 + 三项结果虽然差别无显著意义 (P>0.05), 但 Back-Gating 分析的 CD3 + CD4 + 百分比明显高于 T-Gating (P<0.000 1), 可能是由于 T 细胞经三色免疫荧光染色后 采用 T-Gating 分析可获得 CD3 + CD4 + CD8 - CD3 + CD4 - CD8 + CD3 + CD4 + CD8 + CD3 + CD4 - CD8 - 四个亚群所致 由此可见, 不同淋巴细胞门设置方法可导致淋巴细胞免疫表型分析结果出现显著差别 FSC/SSC-Gating 误差较大, 应尽可能不采用 ;Back-Gating 是对 FSC/SSC-Gating 的改进 [5], 既能手工完成, 又能实现计算机软件自动分析 ( 如 SimulSET 分析软件 ), 从而被美国变态反应与传染病研究院 (NIAID) 美国疾病控制中心(CDC) 和美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐使用 [3-5] 虽然 Back-Gating 改进了淋巴细胞门设置的主观性误差, 但实质仍是光散射门, 不可避免地会受到非淋巴细胞如不溶血的红细胞 有核红细胞等的干扰 [4], 正在被更特异的设门方法如 CD45-PerCP/SSC-Gating T-Gating 所取代 [5] 上述实验结果也表明 CD45-PerCP/SSC-Gating 和 T-Gating 比 Back-Gating 更优越, 尤其是分析 T 细胞亚群时,T-Gating 的特异性更高 三 三种免疫荧光染色方法对淋巴细胞免疫表型分析的影响用单色 双色和三色免疫荧光染色方法分析 15 名正常人淋巴细胞免疫表型, 单色分析时 T 抑制细胞 NK 细胞百分比显著高于双色和三色分析 (P<0.01); CD4 + /CD8 + 比值显著低于双色和三色分析 (P<0.01);T+B+NK 细胞之和 : 三色分析最接近 100%[(98.33±1.11)%] 双色分析次之[(97.60±1.50)%] 单色分析显著高于 100%[(106.73±9.35)%], 出现这些差异的主要原因可能是单色分析将非 T-CD4 + 非 T-CD8 + 和非 NK-CD16+56 + 等细胞计入所致 由此可见, 单色分析对 T 细胞亚群 NK 细胞的分析误差较大, 应尽可能不采用 ; 双色和三色分析的结果虽然很接近, 但三色分析结果更可靠 若只分析 T 淋巴细胞免疫表型,T 细胞三色免疫荧光染色 (CD4/CD8/CD3) 分析可获得更精确的结果 [5] 如果用 CD4/CD8/CD3/CD45 四色免疫荧光染色则更有价值, 但四色分析对流式细胞仪的配置 调试和校准等要求更高 作者单位 : 王建中 (100034 北京大学第一医院检验科 ) 参考文献 1,Islam D, Lindberg AA, Christens B. Peripheral blood cell preparation influences the level of expression of leukocyte cell surface markers as assessed with quantitative multicolor flow cytometry. Cytometry, 1995,22:128-134.
2, Pattanpanyasat K, Kyle DE, Tongtawe P, et a1. Flow cytometric immunophenotyping of lymphocyte subsets in samples that contain a high proportion of non-lymphoid cells. Cytometry, 1994,18:199-208. 3,Calvelli T, Denny TN, Paxton H, et al. Guideline for flow cytometric immunophenonotyping: a port form the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry, 1993,14:702-715. 4,NCCLS. Clinical applications of flow cytometry: quality assurance and immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes. NCCLS Document H42-T, 1992,12:1-15. 5,Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. 3rd ed. A John Wiley and Sons: Publication USA,1995, 25-32. 6,ICSH. Guidelines for the evaluation of blood cell analyzers including those used for differential leukocyte and reticulocyte counting and cell marker applications. International Council for Standardization in Hematology: prepared by the ICSH Expert Panel on cytometry. Clin Lab Haemat, 1994,16:157-174.