T- 载体 PCR 产物克隆试剂盒 产品编号 :B522211_B522213 包装规格 :20 次 /100 次 试剂盒组成 组分 B522211,20 次 B522211,100 次 B522213,20 次 B522213,100 次 T Vector 1 µg 5 µg 1 µg 5 µg 10 Ligation Buffer 50 µl 200 µl 50% PEG 4000 50 µl 200 µl T4 DNA Ligase, 5 U/µl 100 U 500 U Sterilized ddh 2O 1 ml 1 ml 操作手册 1 份 1 份 1 份 1 份保存方法及注意事项该产品低温运输,-20 C 保存, 有效期见包装 产品介绍本试剂盒适用于克隆带有 3 - 末端 A 突出的 PCR 产物的克隆 本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在 1 小时的时间里完成连接反应 本公司的 pucm-t 载体是为简化 PCR 产物的克隆而设计的 许多高温 DNA 聚合酶, 如 Taq DNA 聚合酶 Tth DNA 聚合酶等扩增的 PCR 产物在 3 - 末端后都带有一个突出的碱基 A, 这样的 PCR 产物可以用 3 - 末端后带有一个突出碱基 T 的载体方便地进行克隆 Sangon 生产的 pucm-t 是一种新颖的 puc 系列 T 载体, 其多克隆位点更多的单切点和 b- 半乳糖苷酶阅读框架的调整大大方便了克隆的蓝 / 白筛选 插入位点两端独特设计的两个 PstI 位点使插入片段可以用 Pst I 单酶切进行检测, 也可以用非常廉价而高效的 EcoR I 和 Hind III 双酶切进行检测 可以用 M13 通用引物和 T 7 启动子引物对 PCR 产物进行测序 pucm-t 含有 T 7 RNA 聚合酶的启动子, 可以对插入片段进行体外转录 本文末列出了 pucm-t 相关的技术资料, 其全序列可参照 puc19(genbank Accession Number M77789), 只是其多 克隆位点部分的序列有所不同 实验准备 1. PCR 产物 3 末端带有突出的 A 碱基 :Taq Tth AmpliTaq KlenTaq DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物 3 末端均带有突出的 A 碱基 建议扩增的 PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收, 再进行连接转化实验, 可以使用生工产品柱式 DNA 胶回收试剂盒 (B518131/8132) 如果 PCR 扩增产物特异性很高, 可直接使用生工产品柱式 PCR 产物纯化试剂盒 (B518145/8146) 纯化 PCR 产物 2. PCR 产物 3 末端没有突出的 A 碱基 :Pfu Pwo Tli 或 DeepVent 等 DNA 聚合酶具有 3 5 外切酶活性, 其扩增的 PCR 产物末端可能不带有 3 A, 要对这种平末端 PCR 产物进行克隆, 应先对其进行 3 末端加 A, 再进行连接转化实验 建议选用生工产品 da-tailing Kit (B522291/2292) 进行加 A 实验 3. 自备试剂 :SOC 培养基 IPTG X-gal 等 标准操作步骤
1. 在 0.2 ml PCR 管中配制下列连接体系 : 反应组分 10 µl 反应体系 插入的目的片段 X µl(0.2 pmol) pucm-t Vector 1 µl(50 ng) 10 Ligation Buffer 1 µl 50% PEG 4000 1 µl T4 DNA Ligase 1 µl Sterilized ddh 2O 补足至 10 µl 一般最后加入 T4 DNA Ligase 2. 16 C 连接 1~12 h 为了达到最佳连接效果, 建议 16 C 连接过夜 3. 将 100 µl 感受态细胞置于冰上解冻后, 加入上述 10 µl 连接液, 轻轻混匀, 冰上放置 30 min 可选用一步法制备感受态细胞溶液 (B529307/9308) 快速 (5 min) 制备感受态细胞 4. 42 C 水浴热激 90 sec, 再冰上放置 5 min 5. 加入 900 µl SOC 培养基,37 C 振荡培养 1 h 6. 4000 rpm 离心 3 min, 用枪头吸掉 750 µl 上清液, 用剩余的培养基将细胞悬浮 7. 将细菌悬液均匀涂布在含 20 µl IPTG(100 mm ) 和 100 µl X-gal(20 mg/ml) 的氨苄青霉素抗性的 LB 平板上 涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整 8. 将平板于 37 C 培养 1 h, 然后倒置培养过夜 先将平板正向放置 1 小时, 以吸收过多的液体 9. 用牙签挑取白色菌落, 以 M13 通用引物或基因特异性引物进行 PCR 扩增, 确认载体中插入片段的长度大小 或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中 37 C 培养过夜, 提取质粒后进行酶切鉴定 操作提示 1. PCR 产物的纯度 a. 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物, 如果电泳检测 PCR 产物条带弥散, 或出现非特异条带, 则需要切下目的条带, 用胶回收试剂盒对目的片段进行回收 若 PCR 产物电泳检测只有预期大小的明显条带, 也应使用 PCR 产物纯化试剂盒直接纯化 PCR 产物, 以除去引物二聚体 不经纯化的 PCR 产物在某些条件下可直接用于连接, 但由于引物二聚体和 PCR 产物中其它物质的影响, 造成含有插入片段的阳性克隆数减少, 因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的 PCR 产物的阳性克隆 2. 平端 PCR 产物 a. 具有校正活性的热稳定性 DNA 聚合酶如 Pfu Pwo Tli 在进行 PCR 扩增时产生平端 PCR 产物 这种平端 PCR 产物 可以进行 3 末端加 A 尾后连接到 pucm-t 载体中, 采用这种方法进行连接, 可大大提高克隆的效率 3. 优化插入片段和载体的摩尔比 a. pucm-t 载体优化的插入 DNA 片段和载体的摩尔比为 3:1, 采用 3-10:1 的连接比例也可成功进行连接 如果你的 PCR 产物开始连接的不理想, 则有必要优化连接比例 b. PCR 产物的量可采用以下公式进行换算 : PCR 片段的量 (ng)= [ 加入载体的量 (ng) 插入片段大小 (kb)/ 载体大小 (kb)] 插入片段和载体的摩尔比 4. 筛选含插入片段的转化子 a. 插入片段成功克隆到 pucm-t 载体中, 可阻断 β 半乳糖苷酶的编码序列, 因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选 大多数情况下含有 PCR 产物的克隆菌为白色, 如果 PCR 片段和 LacZ 基因在同一读码框内, 即 PCR 片段碱基数是 3 的整数倍 ( 含 3 -A), 并且读码框无终止密码子, 则重组克隆菌可能为蓝色
附录 pucm-t 载体图谱 B. pucm-t 载体启动子和多克隆位点序列 M13/pUC Sequencing Primer(-20) EcoR I Sac I Kpn I T7 Transcription Start Nde I T7 Promoter 5 -G TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG ACA TAT GAT 3 -C AAC ATT TTG CTG CCG GTC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GCA TTA TGC TGA GTG ATA TCC CGC TGT ATA CTA A PCR Products Cla I EcoR V Nco I Not I Pst I A Bgl II BamH I Xho I CGA TGA TAT CCC ATG GGC GGC CGC CTG CAG ACC AGG TCT AGA CTG GAG ATC TGG ATC CCT CGA GTC GCT ACT ATA GGG TAC CCG CCG GCG GAC GTC TGG TCC AG Xba I Sal I Pst I Pae I Hind III T TCT GAC CTC TAG ACC TAG GGA GCT CAG TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG CAA GCT TGG CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG -3 ATC TCA GCT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC GCA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC -5 Lac Z M13/pUC Reverse Primer (-26) pucm-t 载体的酶切位点 不切割 pucm-t 载体的限制性内切酶
AcaI,AccIII,AceII,Afa24RI,AgeI,AmaI,AosIII,ApaI,ApeI,AscI,Asp78I,AtuCI,AvaIII,AvrII,BaeI,BalI,Bbf7411I,BbsI,BclI,Bco102I I,BfrBI,BlpI,BmgI,BplI,Bpu10I,Bpu1268I,BsaAI,BsaFI,BsaKI,BsaMI,BscEI,BscJI,Bse59I,BseRI,BsgI,BsiWI,BsmFI,BsmGI,B sp120i,bsp87i,bspgi,bsplu11iii,bsrgi,bsshii,bst1107i,bst29i,bst98i,bsteii,bstxi,bsu36i,cfrai,cspi,csp45i,draiii,drdii, EciAI,EciEI,Eco47III,Eco72I,EcoAI,EcoBI,EcoDI,EcoDXXI,EcoDR3,EcoEI,EcoNI,EcoR124I,EcoR124II,EcoRD3,FinI,FseI, HpaI,MluI,Mlu1106I,Mlu113I,Msp20I,MunI,NaeI,NgoMI,NheI,NruI,NsiI,PacI,PauI,PfuI,PmeI,Ppu10I,Ppu6I,PpuMI,PshAI,Rle AI,SacII,SanDI,SfiI,SgfI,SgrAI,SmaI,SnaI,SnaBI,SpeI,SrfI,Sse8647I,StuI,StySQ,SwaI,Uba1220I,Uba1221I,Uba1382I,UbaD I,Van91I,XmaI 切割 pucm-t 载体一次的限制性内切酶 497AacI,2708AatII,517AccI,408Acc65I,503AcrI,515Acs1371I,893AflIII,2263AflIV,503AhyAI,1309AlwNI,186ApaBI,396ApoI, 443Apu16I,533Asp52I,527Asp5HI,455AteI,504AvaI,498BamHI,406BanII,239BbeI,234BbeAI,534BbrI,2291BcgI,2325BcgI' 492Bco63I,492BglII,1852Bli49I,1847BsaI,756BsaXI,497BsaBI,117BsbI,449BshLI,462BsoDI,401Bsp117I,407BspJ106I,893 BspLU11I,529BspMI,455Bst224I,1866Cfr10I,515ChuII,445ClaI,456DsaI,515DsaVI,401Ecl137I,1786EclHKI,463Eco52I,39 5Eco82I,397EcoDR2,404EcoICRI,2443EcoKI,2762EcoO109I,396EcoRI,452EcoRV,541EcoprrI,237EheI,50Esp16I,45Esp3 I,474FsuI,518HincII,534HindIII,235KasI,412KpnI,236NarI,456NcoI,508Nli387/7I,463NotI,1801Pfl1108I,2703Ppu1253I,276 5PssI,406SacI,516SalI,777SapI,2266ScaI,506SciI,476SexAI,532SphI,526Sse8387I,2590SspI,456StyI,158StySJ,2443Sty SPI,2380SynII,478Tth111I,1490Tth111II,2760Uba1326,510XbaI,484XcmI,504XhoI,2385XmnI. 注 : 在多克隆位点上游 255bp 处存在第二个 NdeI 位点 TA 克隆常见问题分析及其解决方案 : 问题可能的原因建议 转化过程有问题或感受态细胞失活转化后无转化的宿主不正确板上的抗生素浓度过高 10 快速连接缓冲 插入对照 DNA 片段的 阳性率低 采用插入对照 DNA 片段, 连接转化时白色克隆菌数低于 60% 液稀释不当 连接反应存在问题 T 突出端丢失, 引起载体 平端连接, 因而蓝色菌落数高于白色菌落数目的片段不纯 PCR 产物是大片段 DNA 10 快速连接缓冲液稀释不当 T 突出端丢失, 引起载体 可通过转化 puc18/19 等未切割的可用于抗性筛选的质粒, 检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确本制品的载体来源于 puc19 载体, 因此, 适合于 puc19 载体的感受态细胞都可使用, 如 JM109 等 提供的 T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加 1μl T4 连接酶 缓冲液连接缓冲液只有低的活性 10 快速连接缓冲液含有 ATP, 温度波动时 ATP 易降解 使用一次性分装的缓冲液, 避免其反复冻溶 用大约 20ng DNA 分子量标准 ( 如 Lambda DNA/Hind III 分子量标准 ) 建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力避免核酸外切酶的引入, 降解 T 突出端 只使用无外源核酸酶的 T4 连接酶, 含有 pucm-t 载体的溶液也也要减少反复冻溶的次数 纯化 PCR 产物, 切胶回收的 PCR 片段最好, 可以除去残存的引物, 引物二聚体, 非特异性扩增产物等杂质 PCR 产物是大片段时其两端在液体中与 T 载体两端接触的机会减少, 连接效率下降 提供的 T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加 1μl T4 连接酶缓冲液避免核酸外切酶的引入, 降解 T 突出端 只使用系统自己提供的 T4 连
PCR 产物连接时白色菌落数很少或根本没有 PCR 产物连接反应只产生白色克隆 ( 没有蓝色克隆 ) 含有目的 PCR 产物的克隆菌数不够 插入的 PCR 产物进行测序时, 可使用何种引物 平端连接, 因而蓝色菌落接酶, 这种连接酶外切酶活力最低数高于白色菌落数 连接温度太高 10 快速连接缓冲液稀释不当连接孵育时间不够长 PCR 产物中含有抑制连接的成分, 导致连接的失败 PCR 产物没有 3 -A 突出端, 不能连接 由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体,PCR 产物不能连接 PCR 产物已经插入, 但未破坏 lacz 基因的翻译框 插入片段 : 载体连接比例不理想 连接的 PCR 片段中可能 有引物二聚体 DNA 重排 氨苄失活, 因而氨苄敏感 菌可生长 连接温度过高 (>28 ) 可使背景增加, 使重组克隆菌减少 降低连接温度可以提高白斑率, 一般以 16 度为宜 提供的 T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加 1μl T4 连接酶缓冲液连接过夜可得到理想结果将 PCR 产物和连接反应对照混合, 观察是否存在抑制效应 如怀疑有 抑制成分存在, 应重新纯化 PCR 产物 并非所有 DNA 聚合酶都产生 3 -A 突出端, 如 Pfu 酶的 PCR 产物为平 端 平端 PCR 产物可先通过聚合酶及 datp 进行加尾反应产生 3 -A 突 出端, 再与 T 载体连接 请注意将 PCR 产物从胶中切出时,UV 照射时间不能够过长, 推荐使用长波长的 UV 光源 造成 lacz 基因的翻译框的移框突变 一般在一个反应体系中, 需要连接的 PCR 产物分子数与 T 载体的分子 数比例为 3-10:1 为适宜 应重新纯化 PCR 产物检测大量克隆观察重排是否是随机的 如果是随机重排, 通过筛选可得到有目的 DNA 片段的克隆菌, 而如果所有克隆是一种重排方式, 则需要使用修补缺陷的菌株保护插入片段, 减少重排事件的发生 检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用 检测背景对照, 如果菌落不是蓝色的, 则可能是宿主菌细胞丢失 F 因子菌株丧失 F 因子 ( 假设 aciqz.m15 位于宿主菌的 F 因子上, 并使用正常平板 ) 用于 T- 载体系统的感受态细胞一定要正确制备 检测背景对照, 如果克隆菌不是蓝色的, 检查平板是否含有氨苄平板不适合蓝白斑筛选 /IPTG/X-Gal 以及是否新鲜 如平板有问题, 重新制备新鲜平板. PCR 片段很多没有 A 尾 插入片段 : 载体比例不理想 如果是具有 3-5 外切酶活性的酶 PCR 产物需要进行加尾反应 样品纯化后进行连接反应, 如果酶是具有在 3 端附加 A 的功能, 请确保 PCR 最后的 72 5-10 分钟的伸长时间 凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性及产量, 优化插入片段与 T 载体分子数的比例. PCR 产物的量不足多次 PCR 扩增, 用大梳子制胶回收. 每个孔多加些 PCR 产物, 进行回收. PCR 片段 A 尾丢失 PCR 结束后请立即使用或 -20 度保存, 避免合温放置. 本制品的载体来源于 puc19 载体 因此, 用于 puc19 载体测序的引物都可以使用