论著 秀丽隐杆线虫作为 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路的抗肿瘤 药物筛选模型研究 刘东玲１ꎬ２ꎬ３ ꎬ支德娟１ ꎬ白彦丽２ ꎬ周 (１.大学药学院ꎬ甘肃 婷２ ꎬ李红玉１ ７３００００ꎻ２.甘肃中医药大学药学院ꎬ甘肃 ３.甘肃省中药药理与毒理重点实验室ꎬ甘肃 摘要:目的 ７３００００) ７３００００ꎻ 采用秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / 有丝分裂原蛋白活化酶( ＭＡＰＫ) 信号通路上的过度激活系列突变 体研究该模式生物作为 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路的抗肿瘤药物筛选模型的可行性及其分子机制ꎮ 方法 采用 ９６ 孔板将索拉菲尼和依托泊苷作用于 Ｌ１ 期秀丽隐杆线虫( 每孔 ８０ ~ １００ 条) ꎬ并设空白对照ꎬ每个处理设 ３ 个重复ꎮ 培养秀丽隐杆线虫 ４ ~ ５ ｄ 后ꎬ于倒置生物显微镜下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目ꎮ 与空 白对照比较ꎬ野生型比例越高ꎬ说明药物效果越好ꎮ 结果 索拉菲尼能够剂量依赖性地逆转 ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) 和 ｍｅｋ / ｅｒｋ( ｇｆ) 双突变体多阴门表型ꎬ对其下游转录因子 ｌｉｎ １( ｌｆ) 和 ｌｉｎ ３１( ｇｆ) 多阴门突变体几乎没有影响ꎻ 依托泊苷对信号通路上游因子 ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) 及下游转录因子突变体 ｌｉｎ ３１( ｇｆ) 均有明显的抑制作用ꎬ不依 赖细胞信号通路ꎮ 结论 瘤细胞毒药物ꎮ 秀丽隐杆线虫模型不但能够筛选靶向 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路的抑制剂ꎬ还能评价肿 关键词:秀丽隐杆线虫ꎻＲａｓ / 有丝分裂原蛋白活化酶( ＭＡＰＫ) 信号通路ꎻ抗肿瘤ꎻ药物筛选模型 中图分类号:Ｒ９６５.１ 文献标志码:Ｂ 文章编号:１００３ ８４５０(２０１８)０２ ０００１ ０５ ＤＯＩ:１０.１６８４１ / ｊ.ｉｓｓｎ１００３ ８４５０.２０１８.０２.０１ 生长因子受体介导的 Ｒａｓ / 有丝分裂原蛋白活 化酶( ＭＡＰＫ) 信号通路是与细胞增殖 分化 凋亡等 密切相关的重要信号通路ꎬ该信号通路发生异常与 肿瘤的发生 发展密切相关ꎮ 在人类肿瘤细胞中 ｒａｓ 基因突变占 １５ ~ ３０ ꎬ其中 ９０ 的胰腺癌 ５０ 的 结肠癌及 ２０ ~ ３０ 的急性白血病中有 ｒａｓ 基因突 变 ꎮ Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路上 Ａ ｒａｆ 和 Ｃ ｒａｆ 基 因 突变较少ꎬＢ ｒａｆ 基因突变约占 ７ [２] ꎮ ３０ 的卵巢 癌 ３５ ~ ５０ 的甲状腺癌和 ５０ ~ ７０ 的恶性黑色 素瘤中有 Ｂ ｒａｆ 基因突变 [３] ꎮ 因此ꎬ该信号通路中 很多因子都可能成为肿瘤防治的潜在靶点 [４] ꎮ 秀丽隐杆线 虫 ( Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓꎬ 简 称 Ｃ. [１] ｅｌｅｇａｎｓ) 因其结构简单 生长周期短 基因与人类基 因具有高度同源性 易培养 适于高通量筛选等特 点ꎬ被广泛应用于药物初步毒性评价以及活性筛选 等领域 [５] ꎮ 秀丽隐杆线虫中的 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通 路是高度保守的ꎬ过度激活的 ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ 持续激活下 游的级联反应ꎬ导致多阴门表型ꎮ 可通过抑制多阴 门表型来筛选下调 ｒａｓ 过度激活的药物候选物ꎬ近 年来已经被应用于化合物及中药抗肿瘤药物的筛 选 [６ ７] ꎮ 目前ꎬ 关 于 秀 丽 隐 杆 线 虫 作 为 筛 选 靶 向 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路的药物候选物 的 模 型 研 究 较 少ꎮ 因此ꎬ本研究采用秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信 号通路上的过度激活系列突变体研究该模式生物作 为 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路的抗肿瘤药物筛选模型的 可行性及其分子机制ꎬ为建立 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路 的药物候选物的平台提供一定的理论依据ꎮ １ 材料 １.１ 秀丽隐杆线虫株及大肠杆菌 秀丽隐杆线虫株:ＭＴ２１２４ꎬｌｅｔ ６０ ( ｎ１０４６ｓｄꎬｇｆ) ＩＶ 多阴门 表 型ꎬ 由 Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 惠赠ꎻＣＢ１２７５ꎬｌｉｎ １( ｅ１２７５) ＩＶ 多阴门表型ꎬ温度敏 感性(１５ ~ １７ ꎬ突变体表型在 ８０ 左右ꎻ２０ 左 右ꎬ突变体表型几乎达 １００ ) ꎬ来源于 Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉ ｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ ( ＣＧＣ) ꎻ ＰＪ１１１５ꎬ ｇａｉｓ３７ ＩＶꎬ ｃｃｉｓ５５ Ｖ 双突变多阴门表型ꎬ大约 ２５ 培养突变体比例较 高ꎬ来源于 ＣＧＣꎻ ＭＴ３０１ꎬ ｌｉｎ ３１ ( ｎ３０１) ＩＩ 多 阴 门 表 型ꎬ来源于 ＣＧＣꎮ 大肠杆菌:Ｅ. ｃｏｌｉ ＯＰ５０ꎬ尿嘧啶渗 收稿日期:２０１６ １０ １８ 基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(８１６０３４０７) ꎻ国家自然科学基金地区基金项目( ８１７６０７８９) ꎻ甘肃省中药药理与毒理重点实验室开 放基金项目[ ＺＤＳＹＳ ＺＺＫＪ ２０１３( Ｃ) ００１] ꎮ 作者简介:刘东玲(１９８３ ) ꎬ女ꎬ副教授ꎬ理学博士ꎮ 研究方向:中药药理与毒理研究ꎮ 通信作者:李红玉(１９６４ ) ꎬ男ꎬ教授ꎬ理学博士ꎮ 研究方向:药物及保健品的开发与应用研究ꎮ Ｅ ｍａｉｌ:ｌｉｈｙ ｌｚｕ.ｅｄｕ.ｃｎ １
漏突变株ꎬ作为秀丽隐杆线虫的食物ꎬ购于 ＣＧＣꎮ １.２ 药品及主要试剂 依托泊 苷 注 射 液 ( 江 苏 恒 瑞 医 药 有 限 股 份 公 司ꎬ规格 ０.１ ｇ / ５ ｍｌ) ꎬ购于大学第一医院ꎬ批号 ｖｐ１０１２０２ꎻｒａｆ 抑制剂索拉菲尼( 纯度 ９８ ) ꎬ购自 ２４ ｈ 后ꎬ 于 浮 游 生 物 计 数 板 上 计 数ꎬ 定 量 至 ４ ~ ５ 条 / μｌꎬ备用ꎮ ２.２ 药物对秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路上 多阴门突变体活性的影响 药效实验在 ９６ 孔细胞培养板中进行ꎬ每孔中的 大连美仑生物技术有限公司ꎻ胆固醇( 分析纯) ꎬ上 终体积为 ２００ μｌꎮ 先用 Ｓ 液线虫培养基将索拉菲 １.３ 每孔加入 ２０ μｌ 的待测样品ꎬ使索拉菲尼终浓度分 海化学试剂研究所ꎮ 培养基 ＬＢ( ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ) 液体培养基:氯化钠 １０ ｇ / Ｌꎬ蛋 尼 依托泊苷母液系列稀释成 １０ 倍待测样品浓度ꎬ 别为 １ꎬ２ꎬ４ꎬ６ꎬ８ μｍｏｌ / Ｌꎬ 依托泊苷 终 浓 度 分 别 为 白胨 １０ ｇ / Ｌꎬ酵母粉 ５ ｇ / Ｌꎬ利用蒸馏水配制ꎬ并用 ４００ꎬ６００ꎬ８００ꎬ１ ０００ μｍｏｌ / Ｌꎮ 然后加入 ２０ μｌ 已制 菌２０ ｍｉｎꎮ Ｍ９ Ｂｕｆｆｅｒ ( １Ｌ ) : ２. ２ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ꎬ ２０ μｌ 已 制 备 好 的 １０ ｍｇ / ｍｌ 的 ＯＰ５０ 菌 液 以 及 ＭｇＳＯ ４ ꎬ１２１ 温度下灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ ＮＧＭ( ｎｅｍａｔｏｄｅ ２０ 生化培养箱中培养 ４ ~ ５ ｄꎬ在倒置生物显微镜 １ ｍｏｌ / Ｌ的 ＮａＯＨ 溶液调 ｐｈ 至 ７.０ꎬ１２１ 温度下灭 ４.２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ꎬ４８. ５５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ１ ｍｏｌ / Ｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ) 培养基(１Ｌ) :ＮａＣｌ ３ ｇꎬ蛋白胨２.５ ｇꎬ 琼脂 １７ ｇꎬ１ ｍｏｌ / Ｌ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ＫＨ ２ ＰＯ ４ 缓 冲 液 ( ｐｈ ６.０)２５ ｍｌꎬ蒸馏水 ９７５ ｍｌꎬ灭菌后加入分别过滤除 菌的 ５ ｍｇ / ｍｌ 胆 固 醇 溶 液 １ ｍｏｌ / Ｌ ＭｇＳＯ ４ 溶 液 １ ｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ ２ 溶液各 １ ｍｌꎮ １.４ 仪器 连续变倍体视显微镜( ＳＭＺ １８０ꎬ上海凤凰光学 股份有限公司) ꎬ倒置生物显微镜( ＸＤＳ １Ｂꎬ重庆光 电仪器总公司) ꎬ台式高速冷冻离心机( ＴＧＬ ２０Ｍꎬ 上海卢湘仪离心机仪器有限公司) ꎬ不锈钢手提式 高压灭 菌 器 ( ＳＹＱ ＤＳＸ ２８０ꎬ 上 海 申 安 医 疗 器 械 备好的 Ｌ１ 期秀丽隐杆线虫液(４ ~ ５ 条 / μｌ) ꎬ再加入 １４０ μｌ的 Ｓ 液培养基ꎮ 每个处理设 ３ 个重复ꎬ放在 下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目ꎮ 野生型 比例 / 野生型线虫数 / 线虫总数( 野生型数目 突 变体数目) １００ ꎮ 与空白对照比较ꎬ野生型比例 越高ꎬ说明药物效果越好ꎮ 线虫的野生型和突变体判定:在线虫中ꎬｌｅｔ ６０ / ｒａｓ(ｇｆ)突变体的过度激活能够持续地激活下游的因 子[Ｒａｆ Ｍｅｋ Ｅｒｋ(ＭＡＰＫ)] 发生级联反应ꎬ导致线 虫产生多阴门表型[８] ꎮ 成虫期野生型和突变体线虫 的假阴门表型很容易在普通生物学显微镜下观察和 区别(线虫野生型见图 １ Ａꎬ突变体见图 １Ｂ ~ Ｄ)ꎮ 厂) ꎬ恒温振荡器( ＨＺＱ Ｆ１６０Ａꎬ上海一恒科学仪器 有限公司) ꎮ ２ ２.１ 方法 秀丽隐杆线虫培养及同步化 Ｅ. ｃｏｌｉ ＯＰ５０ 的培养:将从 ＣＧＣ 购买的在固体 板上培养的 ＯＰ５０ 用接种环接种到 ＬＢ 液体培养基 里ꎬ放 在 摇 床 ( ３７ ꎬ１３０ ｒ / ｍｉｎ) 上 培 养 ２０ ｈ 后ꎬ ６ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎꎬ收集菌体ꎬ并称重ꎬ用 Ｓ 液 重悬ꎬ制成质量浓度为 １０ ｍｇ / ｍｌ 的 ＯＰ５０ 菌液ꎮ 秀 丽隐杆线虫培养:将冻存在 ８０ 冰箱中的秀丽隐 杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信 号 通 路 突 变 体 取 出ꎬ 迅 速 解 冻ꎬ铺于线虫 ＮＧＭ 培养基上ꎬ在 ２０ 生化培养箱中 培养至成虫ꎮ 秀丽隐杆线虫同步化:将几乎所有的 Ａꎬ野生型 ( 有 １ 个真阴门) ꎻＢꎬＣꎬＤ 为突变体ꎬ多阴门 表型( 均有 １ 个真阴门ꎬ此外 Ｂ 有 １ 个假阴门ꎬ 秀丽隐杆线虫培养至成虫后ꎬ将成虫收集到 １０ ｍｌ 离心管中ꎬ４ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ４ ｍｉｎꎬ弃上清后ꎬ剩下 液体少许ꎬ加入裂解液 ５ ｍｌꎬ涡旋振荡约 ６ ｍｉｎꎻ然 后４ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎꎬ小心弃去上清ꎬ加入 ９ ｍｌ Ｍ９ Ｂｕｆｆｅｒ 液ꎬ４ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎꎬ弃上清ꎬ剩余 ２ ｍｌ液体ꎬ放在 ２０ 生化培养箱中进行孵化ꎬ放置 ２ 图１ ２.３ Ｃ 有 ２ 个假阴门ꎬＤ 有 ３ 个假阴门) 线虫野生型和突变体比较示意图( ２００) 统计方法 实验数据采用 ＳＰＳＳ １７.０ 统计软件进行统计分 表示ꎬ采用单因 析ꎬ计量资料服从正态分布时以 ｘ±ｓ
素方差分析ꎬＰ<０.０５ 表示差异有统计学意义ꎮ 采用 逆转 ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) 和 ｍｅｋ / ｅｒｋ( ｇｆ) 双突变体多阴门 ３ 且具有 剂 量 依 赖 关 系ꎻ 对 其 下 游 转 录 因 子 ｌｉｎ ３１ Ｏｒｉｇｉｎ８.０ 软件绘制图形ꎮ ３.１ 结果 索拉菲尼对秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通 路上多阴门突变体的影响 结果表明:与空白对照比较ꎬ索拉菲尼能够明显 表型ꎬ差异均有统计学意义( 见图 ２ ＡꎬＢꎬＰ<０.０１) ꎬ ( ｇｆ) 和 ｌｉｎ １( ｌｆ) 多阴门突变体几乎没有影响( 图 ２ ＣꎬＤꎬＰ>０.０５) ꎮ 这与索拉菲尼靶向 Ｒａｆ / Ｍｅｋ / Ｅｒｋ 结 果相一致ꎮ Ａꎬｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) ꎻＢꎬｍｅｋ / ｅｒｋ( ｇｆ) ꎻＣꎬｌｉｎ ３１( ｇｆ) ꎻＤꎬｌｉｎ １( ｌｆ) ꎮ 与空白对照比较 Ｐ<０.０１ꎮ 图２ ３.２ 索拉菲尼对秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路上多阴门突变体的影响 依托泊苷对秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通 逆转信号通路上游因子 ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) 及下游转录因 结果表明:与空白对照比较ꎬ依托泊苷能够明显 意义(图 ３ ＡꎬＢꎬＰ<０.０１)ꎬ且具有剂量依赖关系ꎮ 路上多阴门突变体的影响 图３ 子突变体 ｌｉｎ ３１(ｇｆ)的多阴门表型ꎬ差异均有统计学 Ａꎬｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) ꎻＢꎬｌｉｎ ３１( ｇｆ) ꎮ 与空白对照比较 Ｐ<０.０１ꎮ 依托泊苷对秀丽隐杆线虫 Ｒａｓ / ＭＡＰＫ 信号通路上多阴门突变体的影响 ３
第 35 卷第 2 期 2018 年 4 月 J GANSU UNIVERSITY OF CHINESE MEDICINE Vol 35 No 2 Apr.2018 4 讨论 秀丽隐杆线虫是一种常见的小型土壤线虫 ꎬ 属 于线形动物门 线虫纲动物 ꎬ 以大肠杆菌 E. coli OP50 为食 ꎬ 在土壤中自由生长 ꎮ 秀丽隐杆线虫全身 透明 ꎬ 在发育过程中很容易在显微镜下对其细胞和 组织进行跟踪观察 ꎬ 并具有雄性和雌雄同体 2 种性 别 ꎬ 自然繁殖的线虫绝大多数为雌雄同体 [9] ꎮ 秀丽 隐杆线虫成虫长约 1 mmꎬ 体径约 50 μmꎬ 在实验室 易于观察与操作 ꎬ 在 20 生化培养箱中培养 ꎮ 线虫 从受精卵发育为成虫仅需 3. 5 dꎬ 野生型线虫在 20 可存活约 20.0 d [10] ꎮ 秀丽隐杆线虫是一种经 典的模式生物 ꎬ 因其在发育遗传方面的相关研究获 得了 2 次诺贝尔生理医学奖 (2002 年和 2006 年 )ꎮ 秀丽隐杆线虫遗传背景清楚 个体结构简单 生活史 短 ꎬ 它的基因组测序和细胞图谱已绘制完成 ꎬ 线虫的 蛋白质组序列中至少有 40% 的人类同源基因 [11-12] ꎬ 这为研究人员通过秀丽隐杆线虫探讨药物作用及其 作用机制奠定了基础 ꎮ 因此 ꎬ 秀丽隐杆线虫被广泛 应用于药物筛选及其毒理学等研究领域 [13-14] ꎮ Ras 是一种小分子蛋白鸟苷三磷酸酶 ( GTP ase)ꎬ 是肉瘤病毒基因的同源物 ꎮ Ras / MAPK 信号 通路是一条被广泛激活的 MAPK 通路 ꎬRas 被激活 能引起下游的蛋白激酶级联反应 ꎬ 将细胞外信号传 递进入细胞内 ꎬ 引起一系列细胞反应 ꎬ 从而调控细胞 增殖 凋亡 分化 转移等 [15] ꎮ 该信号通路的失调与 肿瘤的发生 发展有着密切的关系 ꎮ 在秀丽隐杆线 虫中 ꎬ let 60 编码的 Ras 蛋白与人类的 K Ras 和 N Ras 蛋白在前面的 164 个氨基酸 ( 总共 184 个氨基 酸 ) 中有 83% 是完全相同的 ꎬ 该基因是调节线虫阴 门发育的一个因子 [8] ꎮ 线虫中的 let 60 / ras 突变和 人类癌症中检测到的 ras 是相似的 ꎬ 而且 let 60 / ras 转导阴门发育信号通路是从 let 23 细胞膜受体开始 经 Sem 5 因子到下游的激酶因子这样的顺序激活 Lin 45 / Mek 2/ Mpk 1 MAPK 通路 [16] ꎮ 因此 ꎬ 线虫的 阴门发育过程由 Rtk / Ras / Raf / Map 激酶级联反应决 定 ꎬ 和哺乳动物中 Ras 调控的细胞增殖信号通路高 度保守 ꎮ [17] Hara 等首次利用秀丽隐杆线虫作为体内 模式生物来评价法尼基转移酶抑制剂 ( FTIs) 的活 性 ꎬ 以秀丽隐杆线虫 Ras / MAPK 信号通路上系列 多阴门表型突变体株作为观察指标 ꎮ 结果发现 ꎬ 该药能够明显将 ras 基因的活力过度激活型突变 体逆转为野生型 ꎬ 且对多产卵器表型的逆转作用 呈剂量依赖性 ꎮ 后来发现体外细胞实验中具有很 4 好效果的 FTIs 在临床应用时却和体外实验效果不 一致 ꎬ 这个结果吸引了 Lackner 等的注意 ꎬ 于是他 们利用线虫突变体 ꎬ 确定了 FTIs 的另一个直接作 用靶点 Rab 香叶烯基转移酶 ꎮ 这与他们推测 FTIs 的治疗效应可能是由其他的分子机制引起的结果 是一致的 ꎮ 这个结果不仅加强了对 FTIs 作用机制 的理解 ꎬ 也让人们对秀丽隐杆线虫在研究靶向肿 瘤药物筛选中的应用有了一个全新的认识 ꎮ 王 [6] 昉利用秀丽隐杆线虫突变体研究中药提取物的 抗 ras 活性 ꎬ 结果表明大黄 鸦胆子 钩藤和苦参的 中药提取物对 ras 基因突变体线虫的多阴门表型 [7] 有不同程度的抑制作用 ꎮ Reiner 等利用作为模 式生物评价 ras 靶向的抗肿瘤药物候选物 ꎬ 采用 Mek 抑制剂测试 U0126 对线虫 Ras / MAPK 信号通 路上多阴门突变体的抑制作用 ꎬ 发现 U0126 能够 剂量依赖性地抑制 Mek 上游 let 60 / ras( gf) 突变体 的多阴门表型 ꎬ 对下游转录因子 lin 1( lf) 多阴门突 变体几乎没有影响 ꎮ 这些应用将为秀丽隐杆线虫 作为靶向 Ras / MAPK 信号通路抗肿瘤药物筛选模 型提供了一定的应用前景 ꎮ 本研究选择了 Raf 靶向抑制剂索拉菲尼和细胞 毒药物依托泊苷评价秀丽隐杆线虫作为靶向 Ras / MAPK 信号通路药物筛选模型的可行性 ꎮ 索拉菲尼 是 Bayer 和 Onyx 公司共同研制的一种多靶点的生 物靶向新药 ꎬ 临床前研究和临床试验提示索拉菲尼 有广泛的抗肿瘤作用 ꎮ 研究表明 ꎬ 索拉菲尼可通过 抑制 Raf 活性从而阻断 Raf / Mek / Erk 信号传导通 路 ꎬ 抑制肿瘤细胞的增殖 ꎬ 直接抑制肿瘤生长 ꎮ 结果 发现索拉菲尼能够剂量依赖性地抑制 ras 过度激 活 ꎬ 对其下游转录因子 lin 1(lf) 和 lin 31(gf) 多阴门 突变体几乎没有影响 ꎬ 这与 Mek 抑制剂 U0126 抑制 其上游因子引起的多阴门表型 ꎬ 而对其下游因子突 变体多阴门表型却无影响的结果一致 [7] ꎮ 本研究 还进一步利用细胞毒药物依托泊苷间接验证了线虫 作为靶向 Ras / MAPK 信号通路药物筛选模型的可 行性 ꎮ 依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物 ꎬ 其 作用机制主要为抑制 DNA 拓扑异构酶 Ⅱꎬ 从而干扰 DNA 的结构和功能 ꎮ 其并不像索拉菲尼一样是一 个信号通路靶向药物 ꎬ 而是一个细胞毒的抗癌药物 ꎮ 结果发现依托泊苷对信号通路上游因子 let 60 / ras (gf) 及下游转录因子突变体 lin 31(gf) 都有明显的 抑制作用 ꎬ 不依赖细胞信号通路 ꎮ 因此 ꎬ 结果表明秀 丽隐杆线虫模型不但能够筛选靶向 Ras / MAPK 信 号通路的抑制剂 ꎬ 还能评价肿瘤细胞毒药物 ꎮ
参考文献: [１] Ｂｏｓ Ｊ Ｌ.Ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ:ａ ｒｅｖｉｅｗ[ Ｊ].Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓꎬ１９８９ꎬ４９(１７) :４ ６８２ ４ ６８９. [２] Ｇａｒｎｅｔｔ Ｍ ＪꎬＭａｒａｉｓ Ｒ.Ｇｕｉｌｔｙ ａｓ ｃｈａｒｇｅｄ:ｂ ＲＡＦ ｉｓ ａ ｈｕｍａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｅ[ Ｊ].Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌꎬ２００４ꎬ６(４) :３１３ ３１９. [３] Ｂｅｅｒａｍ ＭꎬＰａｔｎａｉｋ ＡꎬＲｏｗｉｎｓｋｙ Ｅ Ｋ. Ｒａｆ:ａ ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ｔａｒｇｅｔ [１０] Ｌｅｅ ＪꎬＮａｍ ＳꎬＨｗａｎｇ Ｓ Ｂꎬｅｔ ａｌ.ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａ ｃｈｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ[ Ｊ].Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ２００４ꎬ３７(１) :１０７ １１３. [１１] ＣｅＳ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ.Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃ. ｅｌｅ ｇａｎｓ: ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｙ [ Ｊ ]. Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９８ꎬ２８２(５ ３９６) :２ ０１２ ２ ０１８. ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ[ Ｊ].Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌꎬ [１２] Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｐ Ｗ. Ｗｏｒｋｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔ ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ [４] Ｒｏｂｅｒｔｓ ＰꎬＤｅｒ Ｃ.Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒａｆ ＭＥＫ ＥＲＫ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉ [１３] Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ Ｓ Ｄꎬ Ｓａｔｔｅｌｌｅ Ｄ Ｂ. Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ２００５ꎬ２３(２７) :６ ７７１ ６ ７９０. ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ[ Ｊ]. Ｏｎｃｏｇｅｎｅꎬ２００７ꎬ２６(２２) :３ ２９１ ３ ３１０. [５] 冀娇娇ꎬ董洁ꎬ王贝贝ꎬ等.秀丽隐杆线虫在中药研究领域 中的应用[ Ｊ].中国现代中药ꎬ２０１６ꎬ１８(４) :５２６ ５３０. [６] 王昉.利用线虫作为模式生物筛选能够抑制癌基因 ｒａｓ 活性的药物[ ＰＤＲ].上海:复旦大学ꎬ２００５:２１ ３０. [７] Ｒｅｉｎｅｒ Ｄ ＪꎬＧｏｎｚáｌｅｚ Ｐéｒｅｚ ＶꎬＤｅｒ Ｃ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｓｅ ｏｆ Ｃａｅ ｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｒａｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉ ｗｏｒｌｄ[ Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００１ꎬ１０５(２) :１７３ １７６. ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ[ Ｊ]. Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉꎬ２００８ꎬ８(３) :１２１ １３１. [１４] Ｃｒａｎｅ Ｍꎬ Ｃｈｕｎｇ Ｋꎬ Ｓｔｉｒｍａｎ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇꎬ ｉｍａｇｉｎｇａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａ ｎｉｓｍｓ[ Ｊ].Ｌａｂ Ｃｈｉｐꎬ２０１０ꎬ１０(１２) :１ ５０９ １ ５１７. [１５] Ｅ Ｏ ＮｅｉｌｌꎬＷ Ｋｏｌｃｈ. Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉ ｔｏｕｓ Ｒａｆ / ＭＥＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ[ Ｊ]. Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒꎬ２００４ꎬ ９０(２) :２８３ ２８８. ｖｏ[ Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌꎬ２００８ꎬ４３９: ４２５ ４４９. [ １６] Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｐ ＷꎬＨａｎ Ｍ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＲＡＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃ. ｅｌｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ ｖｕｌｖａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｒａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ [１７] Ｈａｒａ ＭꎬＨａｎ Ｍ.Ｒａｓ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ [８] Ｈａｎ ＭꎬＳｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｐ Ｗ.ｌｅｔ６０ꎬａ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｃｅｌｌ ｆａｔｅｓ [ Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ１９９０ꎬ６３(５) :９２１ ９３１. [ ９] Ｇｒａｎｔ Ｂ ＤꎬＷｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｈ Ａ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｍａｐｓ ｉｎ Ｃａｅ ｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ[ Ｊ]. Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌꎬ２００３ꎬ１５( ２) : ２０６ ２１２. ｇａｎｓ[ Ｊ].Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔꎬ１９９８ꎬ１４(１１) :４６６ ４７２. ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ[ Ｊ].Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡꎬ１９９５ꎬ ９２(８) :３ ３３３ ３ ３３７. [ 编辑:徐 燕] Ｕｓｉｎｇ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｉｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ / ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ＬＩＵ Ｄｏｎｇｌｉｎｇ １ꎬ２ꎬ３ ꎬＺＨＩ Ｄｅｊｕａｎ １ ꎬＢＡＩ Ｙａｎｌｉ ２ ꎬＺＨＯＵ Ｔｉｎｇ ２ ꎬＬＩ Ｈｏｎｇｙｕ １ (１.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｙꎬＬａｎｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬａｎｚｈｏｕꎬＧａｎｓｕꎬ７３００００ꎬＣｈｉｎａꎻ ２.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｙꎬＧａｎｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＬａｎｚｈｏｕꎬＧａｎｓｕꎬ７３００００ꎬＣｈｉｎａꎻ ３.Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｇａｎｓｕ ＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＬａｎｚｈｏｕꎬＧａｎｓｕꎬ７３００００ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ ｔｕｍｏｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅ ｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ( Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓｉｓ) ａｓ Ｒａｓ / ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｕｓｉｎｇ ｉｔｓ ｏｖｅｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｎｄ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ Ｌ１ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ(８０ ｔｏ １００ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｗｅｌｌ) ａｎｄ ａ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｅｔ. Ｅｖｅｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｅｔ ｕｐ ｗｉｔｈ ３ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ａｆｔｅｒ ４ ｔｏ ５ ｄａｙｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅꎬｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ａｎ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉ ｃｒｏｓｃｏｐｅ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌꎬｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｒａｔｉｏ ｍｅａｎｓ ｔｈｅ ｂｅｔｔｅｒ ｄｒｕｇ ｅｆｆｉｃａｃｙ. Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｏ ｒａｆｅｎｉｂ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｕｌｖａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ ( ｇｆ) ａｎｄ ｍｅｋ / ｅｒｋ ( ｇｆ) ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ａ ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒꎬｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｉｎ １( ｌｆ) ａｎｄ ｌｉｎ ３１( ｇｆ) ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｉｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ. Ｗｈｅｒｅａｓ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｈａｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｔ ６０ / ｒａｓ( ｇｆ) ａｎｄ ｔｈｅ ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｎ ３１( ｇｆ) ａｎｄ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ. Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ ｃａｎ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ Ｒａｓ / ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙꎬｂｕｔ ａｌｓｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｃ. ｅｌｇａｎｓꎻ Ｒａｓ / ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙꎻ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒꎻ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ５