中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2012,32(11):23 28 抗 IgE 单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效 表达条件的研究 1,2 刘启刚 2 代云见 2 张勇侠 2 王保成 2 王明蓉 (1 中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所成都 610052 2 成都生物制品研究所有限责任公司成都 610023) 摘要目的 : 以抗 IgE 单链抗体 (anti IgEscFv) 为研究对象, 以大肠杆菌周质高效表达可溶性单链抗体为目标, 研究不同宿主细胞 培养基及培养条件对可溶性单链抗体表达产量的影响 方法 : 构建 Roseta(DE3) BL21(DE3) 和 SoluBL21(DE3) 三种大肠杆菌工程菌, 研究不同碳源 氮源 培养基配方和培养条件对可溶性抗 IgE 单链抗体产量的影响 结果 : 携带抗 IgE 单链抗体基因的 pet IgE26 质粒在新型宿主 SoluBL21(DE3) 中的表达产量明显优于传统的 Roseta(DE3) 和 BL21 (DE3) 宿主菌 经碳氮源筛选 培养基和培养条件的优化, 确定 SoluBL21(DE3) 工程菌高效表达可溶性重组抗体的最佳培养基为 : 以 M9 培养基为基础, 添加 0.5% 葡萄糖 0.6% 酪蛋白胨和 0.02% 微量元素 最佳的培养条件为 : 以 LB 为种子培养基,37 过夜培养至 OD 600 为 3.0 左右, 以 5% 接种量接种于最佳发酵培养基中 ; 接种后细胞生长条件 :37,260r/min, 培养 3.5h; 细胞诱导培养条件 : 当 OD 600 为 1.5~1.8 时, 降温至 25, 添加 0.1mmol/LIPTG,220r/min 继续培养 16h 经抗原 ELISA 检测, 抗 IgE 单链抗体的可溶性表达量比原始对照组提高了 5 倍 结论 : 通过对宿主细胞类型的筛选 培养基及培养条件的优化, 可以显著提高重组单链抗体在大肠杆菌周质空间内的表达产量 该研究结果不仅为规模化制备抗 IgE 单链抗体提供了技术支持, 同时为大肠杆菌生产重组小分子抗体提供了有价值的参考 关键词可溶性抗体产量 IgE 单链抗体大肠杆菌表达条件优化中图分类号 Q78 免疫球蛋白 E(IgE) 是介导 I 型变态反应的抗体 特应性哮喘 鼻炎 食物过敏 特应性皮炎等均属 I 型变态反应性疾病 IgE 介导的变态反应依赖于其 FC 区与嗜碱性粒细胞 肥大细胞表面的 IgEFcεRI 受体的结合 [1 3] 利用拮抗剂中和血液中的 IgE 抗体, 可以降低血液中游离型 IgE 的含量, 阻断了 IgE 与其受体细胞上的 FcεRI 位点的结合, 由此降低肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放炎症因子, 从而达到治疗 I 型变态反应的目的 [4 7] 研究表示, 利用抗 IgE 单克隆抗体可阻止由 IgE 介导的变态反应 然而, 鼠源性抗 IgE 单克隆抗体具有免收稿日期 :2012 07 19 修回日期 :2012 09 03 国家 十二五 重大新药创制 科技重大专项资助项目 (2011ZX09506 005) 通讯作者, 电子信箱 :mignrongw2007@163.com 疫原性, 会使人体产生较强的人抗鼠抗体 (Humananti mouseantiboby,hama) 反应 单链抗体 (Singlechain fragmentvariable,scfv) 是具有完整抗原结合位点的最小抗体片段, 由 V H 片段 V L 片段及中间的连接肽 (Linker) 组成, 具有完整抗体的抗原亲和活性, 因分子量小其免疫原性低 因此抗 IgE 单链抗体作为新药研发具有抗 IgE 单克隆抗体的全部生物学功效, 且药物的安全性更高 单链抗体因为不需要蛋白表达后的糖基化修饰, 因此可以采用比哺乳动物细胞更为廉价的大肠杆菌生产技术制备 但是目前大肠杆菌原核细胞表达单链抗体以没有生物功能的包涵体形式为主, 经过包涵体变复性技术获得功能抗体的技术路线复杂 产率低且异构体严重影响产品质量, 因此迄今尚不能够应用该技
24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.112012 术路线生产抗体 [8 10] 应用大肠杆菌生产可溶性抗体是国内外小分子抗体的研究重点, 但目前原核表达可溶性抗体的产量还非常低 因而探索高效表达可溶性小分子抗体的相关技术十分迫切 在前期的工作中已成功利用大肠杆菌表达出可溶性抗 IgE 单链抗体, 但其表达量较低, 不利于该产品的大规模制备, 直接影响该原创性新药实施产业化 因此本实验重点对影响大肠杆菌表达可溶性单链抗体产量的重要因素, 包括表达宿主 培养基 诱导条件等进行优化, 以提高可溶性抗体的高效表达, 为后期大规模发酵和蛋白纯化提供支持 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒表达质粒 pet IgE26 由本实验室构建 ; 感受态细胞 Roseta(DE3) 菌株 BL21(DE3) 菌株购于 Novagen 公司 ; 感受态细胞 SoluBL21(DE3) 菌株购于 Genlantis 公司 1.1.2 试剂胰蛋白胨 酵母提取物为 Oxiod 公司产品 ; 琼脂粉 精解蛋白胨 牛肉膏 酪蛋白胨 甘油 Na 2 HPO 4 12H 2 O NaCl 甲醇等常用试剂为成都科龙化学试剂公司产品 ; 氯霉素 氨苄青霉素 IgE 抗体 IPTG Monoclonalanti polyhistidinehrp His TMB for membranes TMBforELISA 购自 Sigma 公司 ;BugBuster MasterMix 蛋白抽提液购自 Novagen 公司 ; 蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司 1.1.3 培养基及试剂配制 LB:10g/L 胰蛋白胨 5g/L 酵母提取物 10g/LNaCl ph7.0;lb 固体 :LB 中加入 12g/L 琼脂粉 ;2 YT:16g/L 胰蛋白胨 10g/L 酵母提取物 5g/LNaCl ph7.0;tb:12g/l 胰蛋白胨 24g/L 酵母提取物 0.4% (v/v) 甘油 2.31g/L KH 2 PO 4 16.4g/LK 2 HPO 4 3H 2 O ph7.0;soc:20g/l 胰蛋白胨 5g/L 酵母提取物 0.5g/LNaCl 2.5mmol/LKCl 10mmol/LMgCl 2 20mmol/L 葡萄糖 (G) ph7.0;m9: 15g/LNa 2 HPO 4 12H 2 O 3g/LKH 2 PO 4 0.5g/LNaCl 1g/LNH 4 Cl 0.1mmol/LCaCl 2 1mmol/LMgSO 4 0.3% (v/v) 甘油 ph 7.0; 微量元素 (Traceelements): 25mmol/LFeCl 3 6H 2 O 20mmol/L CaCl 2 10mmol/L MnCl 2 10mmol/L ZnSO 4 7H 2 O 2mmol/L CoCl 2 6H 2 O 2mmol/L CuCl 2 2mmol/L NiSO 4 2mmol/L Na 2 MoO 4 2H 2 O 2mmol/LH 3 PO 3 ;5 PBS(w/v):NaCl 4% KCl0.1% Na 2 HPO 4 12H 2 O 1.9% NaH 2 PO 4 0.12% ph7.0 1.2 方法 1.2.1 宿主菌的筛选表达质粒 pet IgE26 分别转化感受态细胞 Roseta(DE3) BL21(DE3) SoluBL21 (DE3), 涂布于含相应抗生素 (Roseta(DE3):50mg/L 氨苄青霉素 34mg/L 氯霉素 ;BL21(DE3) SoluBL21 (DE3):50mg/L 氨苄青霉素 ) 的 LB 固体平板,37 过夜培养 ; 分别挑取一定数量的单菌落至 5mlLB 液体培养基中,37 280r/min 振荡培养过夜, 次日以 5% 接种量转钟至 50mlLB 新鲜培养基中,37 260r/min 振荡培养至 OD 600 =0.6~0.8 时, 加入 0.5mmol/LIPTG, 诱导条件 :25 220r/min 诱导 16h; 离心收集等量菌体 ( 菌体湿重均为 0.1g), 分别加入 500μl 含 DNaseI 的 BugBusterMasterMix 蛋白抽提液, 混匀摇床振荡 20min, 于 4,13000r/min 离心 20min 后收集上清 ; ELISA 法检测抗体表达量确定最佳表达菌,10% 甘油保菌 1.2.2 培养基的选择 10% 甘油工程菌以 0.1% 接种量接种至 LB 种子培养基中,37 260r/min 过夜培养至 OD 600 为 3.0 左右, 次日以 5% 接种量转种至 LB 2 YT TB SOC 和 M95 种不同的培养基中,37 260r/ min 振荡培养至 OD 600 =0.6~0.8 时, 加入 0.5mmol/L IPTG, 诱导条件 :25 220r/min 诱导 16h 以 LB 为对照培养基,ELISA 法检测抗体表达量确定基础培养基 1.2.3 培养基成份筛选分别添加不同碳源 (0.5% 葡萄糖 0.5% 甘油 0.5% 蔗糖 ) 不同氮源 (0.5% 精解蛋白胨 0.5% 牛肉膏 0.5% 玉米浆 0.5% 酪蛋白胨 ) 0.02% 微量元素到基础培养基中, 种子及发酵培养条件不变, 以基础培养基为对照,ELISA 法检测抗体表达量确定有利于目的蛋白表达量提高的培养基成份 1.2.4 培养基优化研究将具有正效作用的培养基成份进行组合优化研究, 设计出不同复合培养基并用于工程菌表达,ELISA 法检测抗体表达量, 确定最优培养基 1.2.5 工程菌生长曲线的绘制 10% 甘油工程菌以 0.1% 接种量接种至 LB 种子培养基中,37 260r/min 过夜培养至 OD 600 为 3.0 左右, 次日以 5% 接种量转种至基础培养基和优化培养基,37,260r/min 振荡培养, 每隔 20min 取样测定菌液 OD 600 值, 并绘制工程菌的生长曲线 1.2.6 IPTG 最佳诱导时间的选择 10% 甘油工程菌种以 0.1% 接种量接种至 LB 种子培养基,37 260r/
2012,32(11) 刘启刚等 : 抗 IgE 单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究 25 min 过夜培养至 OD 600 为 3.0 左右, 次日以 5% 接种量转种至优化培养基,37 260r/min 细胞培养 分别于培养 2h(OD 600 =0.6) 2.5h(OD 600 =0.8) 3h(OD 600 = 1.0) 3.5h(OD 600 =1.6) 4h(OD 600 =2.2) 4.5h(OD 600 =2.6) 5h(OD 600 =3.0) 时加入 0.5mmol/LIPTG 诱导表达, 诱导条件不变,ELISA 检测抗体表达量确定 IPTG 最佳诱导时间 1.2.7 诱导剂浓度的优化 10% 甘油工程菌以 0.1% 接种量接种至 LB 种子培养基,37 260r/min 过夜培养至 OD 600 为 3.0 左右, 次日以 5% 接种量转种至优化培养基, 在最佳 IPTG 诱导时间分别加入 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9mmol/LIPTG 进行诱导表达, 诱导条件 :25 220r/min 诱导 16h ELISA 法检测抗体表达量确定 IPTG 最佳诱导浓度 1.2.8 目的蛋白 Westernbloting 鉴定表达产物经过 12%SDS PAGE 电泳后, 电转移至 PVDF 膜上, 清洗后将膜放入含 2% BSA 的 PBS 溶液中,37 封闭 2h; 用含 0.05% Tween20 的 PBS(PBST) 溶液清洗 3 次 ; 将膜放入含 Monoclonalanti polyhistidinehrp His(1 4000), 1%BSA 的 PBS 溶液中,37 反应 1h,PBST 洗膜 3 次, TMB 显色观察结果 1.2.9 抗体活性 ELISA 检测 100μlPBS 稀释的 0.25ng/μlIgE 抗体蛋白包被酶标板,37 包被 2h; PBST 洗 3 次, 拍干 ;2% BSA 的 PBS 溶液封闭, 每孔 200μl 封闭液,37 封闭 2h;PBST 洗 3 次, 拍干,4 保存备用 ; 将表达后细胞培养液经 4,6000r/min 离心 10min 收集菌体沉淀, 称取 0.1g 菌加入含 500μl 含 DNaseI 的 BugBusterMasterMix, 混匀振荡 20min 使其充分裂解, 于 4,13000r/min 离心 20min 后收集上清 ; 包被 IgE 抗体蛋白孔内加入 100μl 样品,37 恒温振荡 1h; 用 PBST 洗 3 次, 拍干 ; 每孔加入 100μl 含 1% BSA 按 1 4000 稀释 HRP 标记的抗 His 抗体 PBS 溶液, 37 恒温振荡 1h; 用 PBST 洗 5 次, 拍干 ; 加入 100μl TMB 显色液,37 室温避光显色 5 分钟 ;100μl1mol/L HCL 终止反应 ;450nm 酶标仪检测结果 2 结果与分析 2.1 宿主菌的筛选挑选三种不同宿主菌的单克隆进行蛋白表达, ELISA 法检测抗体的表达产量 结果显示 Roseta (DE3) 宿主和 BL21(DE3) 宿主的表达的目标抗体其产量很低, 而 SoluBL21(DE3) 宿主的平均表达产量为 Roseta(DE3) 宿主和 BL21(DE3) 宿主的 1.5 倍, 故选择 SoluBL21(DE3) 宿主作为目的蛋白的表达宿主菌 ( 图 1) 图 1 不同宿主菌中目的蛋白的可溶性表达对比 Fig.1 Comparisonofsolubleexpresionof targetproteinindiferenthoststrains 2.2 培养基的优化 2.2.1 基础培养基筛选以 pet IgE26/SoluBL21 (DE3) 为目标抗体的工程菌, 采用 5 种不同配方的培养基表达目的蛋白, 检测发酵液的细胞密度和单位湿重菌体目标抗体的含量, 计算出蛋白表达产量 结果发现 SoluBL21(DE3) 工程菌在 TB 培养基中生长最好 (12.2g/L), 但单位湿重菌体的蛋白表达产量最低, 而工程菌在 M9 培养基中, 细胞密度虽然不是最高 (8g/ L), 但是单位湿重菌体的蛋白产量明显高于 LB 2 YT TB 和 SOC 培养基, 其总目标抗体产量最高 (7.32mg/L), 故选择 M9 培养基作为基础培养基 ( 图 2) 图 2 不同培养基对目的蛋白的可溶性表达的影响 Fig.2 Influenceofculturemediaonsoluble expresionofanti IgEscFv 2.2.2 培养基成份的优化筛选添加不同碳源 氮源和微量元素于基础培养基中, 经细胞培养 表达并检测其目标抗体的产量, 结果发现 0.5% 葡萄糖 0.5% 酪蛋白冻和 0.02% 微量元素对工程菌的生长和蛋白表达均有正效应, 结果见图 3 选择这三个成份做进一步的优化因素 2.2.3 培养基的优化通过对葡萄糖, 酪蛋白胨和微
26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.112012 的生长情况, 以培养时间为横坐标, 细胞密度为纵坐标绘制生长曲线 结果表明 : 工程菌在最优培养基中生长更加旺盛,300min 达到生长饱和期, 而基础培养基需要在 420min 后才进入生长饱和期 ( 图 5) 图 3 不同培养基成份对目的蛋白的可溶性表达的影响 Fig.3 Efectsofdiferentaddfactorson solubleexpresionoftargetscfvs 量元素的组合优化,pET IgE26/SoluBL21(DE3) 工程菌经细胞培养后对发酵液进行细胞密度和蛋白产量检测, 结果分析发现 M9 中添加 0.5%G 0.6% 酪蛋白胨和 0.02% 微量元素培养基产量最高, 与基础培养基 M9 比较, 细胞密度提高了 2 倍, 蛋白产量提高了 1.8 倍, 达到 12.6mg/L, 因此最优培养基为 M9 基础培养基, 添加 0.5%G 0.6% 酪蛋白胨和 0.02% 微量元素 ( 图 4) 图 4 不同优化条件对目的蛋白的可溶性表达的影响 Fig.4 Efectsofdiferentoptimizationofconditions forsolubleexpresionoftargetscfvs 1:M9;2:M9with0.1%G 0.3% caseinpeptoneand0.02% trace elements;3:m9with0.1% G 0.6% caseinpeptoneand0.02% traceelements;4:m9with0.1% G 0.9% caseinpeptoneand 0.02% traceelements;5:m9with0.5% G 0.3% caseinpeptone and0.02% traceelements;6:m9with0.5% G 0.6% casein peptoneand0.02% traceelements;7:m9with0.5% G 0.9% caseinpeptoneand0.02% traceelements;8:m9with1%g 0.3% caseinpeptoneand0.02% traceelements;9:m9with1%g 0.6% caseinpeptoneand0.02% traceelements;10:m9with1%g 0.9% caseinpeptoneand0.02% traceelements 2.3 诱导条件的选择 2.3.1 工程菌的生长曲线考察了 pet IgE26/ SoluBL21(DE3) 工程菌在基础培养基和最优培养基中 图 5 工程菌在基础培养基和优化培养基中的生长曲线 Fig.5 Growthcurvesofengineeredbacteria inoriginalandoptimizedmedia 2.3.2 IPTG 诱导时间研究何时添加 IPTG 诱导对菌体目的蛋白产量有很大影响 重组大肠杆菌在摇瓶中的诱导时间研究比较多, 大多数在指数生长期的中后期, 但是不同菌株在不同培养基中的最佳诱导时间是有区别的 将 pet IgE26/SoluBL21(DE3) 工程菌在优化培养基中培养, 根据生长曲线上对数生长期的时间阶段, 分别在细菌生长期的对数生长早 中 晚期 (2~ 5h) 开始诱导, 经 ELISA 分析, 在细菌培养 3.5h,OD 600 =1.6 左右, 处于对数中前期时开始诱导表达目的蛋白, 其产量最高, 故选择培养 3.5h 为最佳诱导剂添加时间 ( 图 6) 图 6 IPTG 添加时间点对目的蛋白表达的影响 Fig.6 EfectsofIPTG inductionconditionson solubleexpresionoftargetscfvs 2.3.3 诱导剂浓度的优化在发酵培养 3.5h 分别添加终浓度为 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9mmol/LIPTG 于优化培养液中, 用 ELISA 分析其发酵产物的抗体产量, 发现目的蛋白表达量未见明显差别 考虑 IPTG 成本的因素, 选择 0.1mmol/LIPTG 进行诱导
2012,32(11) 刘启刚等 : 抗 IgE 单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究 27 2.4 优化过程中蛋白表达产量的提高在进行本实验优化前,pET IgE26/BL21(DE3) 工程菌在 LB 培养基中表达可溶性表达产量低, 仅有 3mg/L 实验通过对不同宿主细胞筛选 培养基及培养条件优化的探索, 确定可溶性 pet IgE26 质粒的最佳发酵培养条件为 : 以 E.coliSoluBL21(DE3) 为宿主菌, 以 M9 培养基中添加 0.5%G 0.6% 酪蛋白胨和 0.02% 微量元素为发酵培养基, 培养条件为 :37,260r/min 培养 3.5h, 添加 0.1mmol/LIPTG, 诱导条件为 :25, 220r/min, 诱导 16h 最终提高了目的蛋白表达产量, 达到 15mg/L, 比原始表达体系提高了 5 倍 2.5 目的蛋白分子量确认利用最佳工艺条件制备目的蛋白, 其表达产物经 SDS PAGE 及 Westernbloting 检测 ( 图 7) SDS PAGE 发现在 28kDa 有目的蛋白产生, 与预期的抗体分子量一致, 经 Westernbloting 进一步确定表达目的蛋白 图 7 SDS PAGE 及 Westernbloting 检检测结果 Fig.7 SDS PAGEandWesternblotoftargetscFvs (a)sds PAGEsilverstainingresults (b)westernblotresults; 1:Beforeinduction;2:Totalprotein;3:Solublesupernatant 3 讨论 大肠杆菌蛋白表达系统因具有细胞繁殖周期短 培养基相对廉价 易规模放大等哺乳动物细胞表达系统不可媲美的优势成为目前蛋白类药物最简单和经济的方法, 但大肠杆菌体系多数表达没有生物活性的包涵体, 而包涵体的变复性仍然是目前重组蛋白工业化生产的瓶颈技术问题, 迄今仍然是国内外本领域亟待解决关键技术之一 大肠杆菌的周质空间因具有蛋白质折叠的氧化还原内环境, 可以表达具有生物活性功能的可溶性蛋白, 是目前大肠杆菌制备可溶性蛋白的主要场所, 但由于周质空间体积小, 一般产量很低, 如生产重组抗体的产量为 0.5~1mg/L, 难以实现产业化 生产 最近国外报道通过对载体基因 宿主细胞 诱导方式 培养基等优化, 采用 E.coli 细胞生产 G CSF 和 IGF 1( 类胰岛素生长因子 ), 其周质可溶性蛋白产量高达 4g/L 以上, 为大肠杆菌规模生产可溶性蛋白带来了曙光 在大肠杆菌表达外源蛋白的体系中, 宿主对异源蛋白基因密码的偏性, 使得宿主菌的选择是至关重要的 不同的载体适合不同的宿主菌, 同种载体在不同的宿主菌中的表达速率并不相同, 有时甚至不能表达, 并且不同宿主菌之间的生长速度及表达能力也不相同 [11 14] 可溶性抗体的表达更加依赖于宿主, 不同的大肠杆菌菌株在培养基里的生长情况, 蛋白表达情况和可溶性表达的比例不一样, 因此首先对抗体表达的宿主菌进行筛选是非常必要的 其中,SoluBL21(DE3) 菌株是 BL21(DE3) 宿主的衍生株, 具有 BL21(DE3) 高转化率, 高表达的特点, 另外通过特殊选择标准获得的非特异性突变, 针对某些目的蛋白可以将部分包涵体转化为可溶性蛋白, 提高可溶性表达产量 除宿主菌筛选外, 培养基也是影响大肠杆菌异源蛋白表达的重要因素 培养基是微生物生长繁殖和目的产物积累的物质来源和能量来源, 只有合理的培养基组成和培养条件, 才能提高大肠杆菌异源生产目的蛋白产量的目的 虽然 LB 2YT M9 TB 培养基都是大肠杆菌培养的常用培养基, 但是实验结果显示它们不能高效表达 anti IgE 单链抗体, 通过优化培养基组分, 获得可以较好表达目的蛋白表达的结果 本文通过选择合适的宿主及细胞培养基及培养条件展开优化, 实现了抗 IgE 单链抗体在 E.coli 细胞中的高效表达, 其研究结果对该品种的后续品种工艺放大研究具有重要的指导意义 参考文献 [1]GouldHJ,SutonBJ.IgEinalergyandasthmatoday.Nature ReviewsImmunology,2008,8:205 217. [2]MaloneyJM,RudengrenM,AhlstedtS,etal.Theuseofserum specificigemeasurementsforthediagnosisofpeanut,treenut, and seed alergy. The Journal of Alergy and Clinical Immunology,2008,122(1):145 151. [3] 李明华, 殷凯生, 朱桂立. 哮喘病学. 北京 : 人民卫生出版社, 2005.65 75. LiM H,YinK S,ZhuG L.Asthmology.Beijing:People s MedicalPublishingHouse,2005.65 75. [4]LaferS,LupinekC,RauterI,etal.Ahigh afinitymonoclonal anti IgE antibodyfordepletionofige andige bearingcels.
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