189 文章编号 :1673 8640(2013)03 0189 05 中图分类号 :446.5 文献标志码 :A DOI:10.3969/j.isn.1673 8640.2013.03.005 血流感染患者金黄色葡萄球菌 erm 基因检测及流行病学研究 王立新 1, 胡 明 2, 胡志东 1, 田彬 1, 李静 1, 王凤霞 1 1, 杨华 (1. 天津医科大学总医院医学检验科, 天津 300052;2. 天津医科大学检验学院, 天津 300203) 摘要 : 目的了解 2006 年 1 月至 2011 年 8 月临床血流感染患者红霉素耐药金黄色葡萄球菌红霉素核糖体甲基化酶 (erm) 基因分布特点及流行情况 方法收集 2006 年 1 月至 2011 年 8 月引起血流感染的 39 株红霉素耐药金黄色葡萄球菌 应用 VITEK2Compact 全自动细菌鉴定仪及配套鉴定卡 药物敏感性卡对细菌进行鉴定及药物敏感性试验 头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA), 并以 D 试验测定红霉素对克林霉素的诱导耐药表型 聚合酶链反应 (PCR) 分别检测 erma ermb ermc 基因 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 和葡萄球菌染色体 mec(sccmec) 分型方法了解产 erma 金黄色葡萄球菌的流行情况 结果 39 株红霉素耐药金黄色葡萄球菌对克林霉素 青霉素 庆大霉素的耐药率高, 分别为 100.0% 92.3% 53.8% 8 株 (20.5%) 红霉素耐药而克林霉素敏感株 D 试验全部为阳性结果 erm 基因的携带率为 100.0%,ermA ermb ermc 基因检出率分别为 25.6%(10/39) 46.2% (18/39) 46.2% (18/39); 红霉素对克林霉素诱导耐药株 ermc 基因携带率为 75.0%(6/8),ermA 基因携带率 25.0%(2/8) PFGE 分型结果显示 10 株携带 erma 基因的 MRSA 为 6 个不同克隆株,SCCmec 分型结果显示 8 株为 SCCmecⅢ 型菌株,2 株未能分型 结论在引起血流感染的红霉素耐药金黄色葡萄球菌中 erm 基因携带率高,ermA 基因多分布于 MRSA 中, 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA) 主要携带 ermb 基因, 红霉素对克林霉素诱导耐药株主要携带 ermc 基因 携带 erma 基因菌株全部为 MRSA, 主要是 SCCmecⅢ 型, 对多种药物耐药, 并存在散在克隆传播现象 关键词 : 红霉素核糖体甲基化酶基因 ; 金黄色葡萄球菌 ; 血流感染 ; 红霉素 ; 克林霉素 Detectionoferm genesandepidemiologyresearchofstaphylococcusaureusinpatientswithbloodstream infection WANGLixin 1,HU Yiming 2,HU Zhidong 1,TIAN Bin 1,LIJing 1,WANG Fengxia 1,YANG Hua 1. (1. DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China;2.Schoolof MedicalLaboratory,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300203,China) Abstract:Objective Toinvestigatethedistributionandepidemicsituationoferythromycinribosomemethylase (erm)genesinerythromycin resistantstaphylococusaureusinpatientswithbloodstreaminfectionfromjanuary2006to August2011.Methods A totalof39isolatesoferythromycin resistantstaphylococusaureuswerecolectedfrom January2006toAugust2011amongpatientswithbloodstreaminfection.Thebacteriumidentificationandantimicrobial susceptibilitytestwereconductedbyvitek2compactautomaticsystem,matchedidentificationcardandantimicrobial susceptibilitycard.methicilin resistantstaphylococusaureus(mrsa)wasidentifiedbydiskdifusionmethodwith cefoxitin.phenotypicexpresionofinducibleresistancewasasesedbydtest.polymerasechainreaction(pcr)was usedtodetecterma,ermb andermc genes.theepidemicsituationoferma producingstaphylococusaureuswas analyzedbypulsed fieldgelelectrophoresis(pfge)andstaphylococalcasetechromosomemec(sccmec)typing. Results Theresistantratesof39erythromycin resistantstaphylococusaureustoclindamycin,penicilinandgentamicin werehigh,andwere100.0%,92.3% and53.8%,respectively.atotalof8(20.5%)isolatesofstaphylococusaureus withdiscordantresistancepatern(erythromycinresistantandclindamycinsensitive)werealpositiveindtest.the positiveratesoferma,ermbandermcwere25.6%(10/39),46.2%(18/39)and46.2%(18/39),respectively.a totalof75.0% (6/8)and25.0% (2/8)isolateswithphenotypicexpresionofinducibleresistancebyDtestharbored ermcandermagenes.pfgeanalysisoftheal10mrsaisolatesharboringermageneproduced6distinctpulsotypes, 8MRSA isolatesweresccmecⅢ genotype,and2 MRSA isolatescouldnotbedeterminedbysccmectyping. 作者简介 : 王立新, 女,1975 年生, 学士, 主管技师, 主要从事细菌耐药机制研究 通讯作者 : 胡志东, 联系电话 :022 60814186
190 检验医学 2013 年 3 月第 28 卷第 3 期 Conclusions Thepositiverateofermgenesinerythromycin resistantstaphylococusaureusinpatientswithbloodstream infectionisrelativelyhigh.theerma and ermb genesaremainlyharbored bymrsa and methicilin sensitive Staphylococusaureus(MSSA),respectively.Theisolateswitherythromycininducibletoclindamycinresistancemainly harboredermcgene.atotalof10isolatesharboringermagenearealmrsa,andaremultidrug resistant.thereis scateredcloningspreadofmrsabelongingtosccmecⅢ genotypewithermagene. Keywords:Erythromycinribosomemethylasegene;Staphylococusaureus;Bloodstreaminfection;Erythromycin; Clindamycin 金黄色葡萄球菌是引起医院和社区感染的主要病原体, 其感染有较高的发病率和死亡率 [1] 金黄色葡萄球菌可以引起多种感染, 由其引起的血流感染由于发生率高 预后差而备受关注 对多耐药株, 特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 引起的感染已成为抗感染治疗中的一个难题 MRSA 可同时对 β 内酰胺类 酶抑制剂复合抗菌药物及碳青霉烯类药物耐药, 因此临床医生在治疗由其引起的感染时常使用大环内酯类 (macrolide) 林可酰胺类 (lincosamide) 和 B 类链阳霉素类 (streptogramintypeb) 奎奴普丁 [2], 但目前的研究显示引起血流感染的金黄色葡萄球菌已对红霉素 克林霉素有较高的耐药率 [3] 本研究对 2006 至 2011 年临床分离的 39 株引起血流感染的红霉素耐药金黄色葡萄球菌进行红霉素核糖体甲基化酶 (erm) 基因检测, 并进行同源性分析, 以了解耐药基因的分布及其流行情况 材料和方法一 材料 1. 菌株来源收集 2006 年 1 月至 2011 年 8 月自临床分离的 39 株引起血流感染的红霉素耐药金黄色葡萄球菌, 剔除同一患者重复分离菌株, 标本主要来源于感染科 肾科 重症监护病房 (ICU) 血液科等临床科室 全部菌株经 VITEK 2Compact 全自动细菌鉴定仪鉴定 质控菌株为 金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 2. 试剂与仪器 VITEK2Compact 全自动细菌鉴定仪 ( 法国生物梅里埃公司 ),9700 型基因扩增仪 ( 美国 PerkinElmer 公司 ), 电泳仪 ( 北京市六一仪器厂 ), 凝胶成像仪 CHEFⅢ 型脉冲电泳仪 ( 美国 Bio Rad 公司 ), 红霉素 (15μg) 克林霉素 (2μg) 纸片和其他药物敏感性纸片 ( 北京天坛公司 ), 聚合酶链反应 (PCR) 试剂 DNAMaker 和限制性内切酶 SmaI[ 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ], 溶葡萄球菌素 ( 意大利 BBI 公司 ) 二 方法 1. 细菌鉴定及药物敏感性试验应用 VITEK2Compact 全自动细菌鉴定仪及配套鉴定卡 药物敏感性卡对细菌进行鉴定及药物敏感性试验 药物敏感性试验结果解释标准按照美国临床实验室标准化协会 (CLSI) 指南 (2010 年版 ) [4] 进行 头孢西丁纸片扩散法筛选 MRSA 2.D 试验测定红霉素对克林霉素的诱导耐药表型 D 试验操作按 CLSI 指南 (2010 年版 ) [4] 进行 3.erm 基因的检测煮沸法制备 DNA 模板, 25μL 反应体系, 引物序列和 PCR 反应条件参考文献 [5], 见表 1 PCR 产物进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析, 主要 PCR 阳性产物测序结果与 Gen Bank 数据库进行比对 表 1 用于 erm 基因检测的引物序列及反应条件 基因名称引物序列 (5 3 ) 退火温度 ( ) 产物长度 (bp) erma ermb ermc F:GTTCAAGAACAATCAATACAGAG R:GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC F:CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC R:GAATCGAGACTTGAGTGTGC F:GCTAATATTGTTTAAATCGTCAATTCC R:GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC 53 421 53 359 50 572
191 4. 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分型参考 Goe ring 等 [6] PFGE 方法, 略加改动 制备完成的小胶经 30U 限制性内切酶 SmaI 在 30 酶切 4h 后放入电泳槽, 电泳温度 14, 电泳时间 18h, 电泳方向角度变换 120, 电压 6V/cm, 线性梯度变化 4~40s 电泳结束后, 将胶放入含 0.5μg/mL 的溴化乙啶 (EB) 中染色 30~40min, 放入凝胶成像系统成像 结果判读按美国疾病预防控制中心 [7] (CDC)Tenover 等推荐的方法判读 : 图谱完全相同的定义为一个型 ; 彼此之间相差 1 个条带的定义为同一型的不同亚型 ; 相差 2~3 个条带的认为亲缘关系密切 ; 相差 4~6 个条带的认为可能相关 ; 条带相差 7 个以上的则认为无亲缘关系 随机选择不同字母, 如 A B C D 等的字母顺序分型 5. 葡萄球菌染色体 mec(sccmec) 分型按 [8] Zhang 等介绍的多重 PCR 进行 SCCmec 分型 反应体系为 25μL, 共 9 对引物 反应条件 :94 预变性 5min, 然后 94 变性 45s,65 退火 45s,72 延伸 90s,10 个循环, 随后 94 变性 45s,55 退火 45s,72 延伸 90s, 循环 25 次, 最后 72 延伸 10min 电泳结果用凝胶成像系统观察 筛选结果 结 果 一 D 试验测定诱导耐药表型结果及 MRSA 39 株红霉素耐药金黄色葡萄球菌中有 8 株为红霉素耐药而克林霉素敏感,D 试验全部为阳性, 为诱导性耐药, 阳性率 20.5% 31 株为结构性耐药, 见图 1 10 株金黄色葡萄球菌对头孢西丁的抑菌圈直径 21mm, 判定为 MRSA 7 株 (17.9%) 红霉素对克林霉素诱导耐药株 ermc 基因携带率为 75.0%(6/8),ermA 基因携带率为 25.0%(2/8) 主要 PCR 产物部分测序结果经 GenBank 比对证实,ermA ermb ermc( 登录号依次为 :AF466413 HQ683763 Y09002) 同源性均为 99% 电泳结果见图 2 图 3 注 :1~3 为 erma(421bp) 阳性标本 ;4 为阴性对照 ;M 为 DNAMaker 图 2 erma 基因电泳图注 :1 8 为阴性对照 ;2~4 为 ermc(572bp) 阳性标本 ;5~7 为 ermb(359bp) 阳性标本 ;M 为 DNAMaker 图 3 ermb ermc 基因电泳图 三 erm 基因在不同菌株中的分布 erm 基因在 MRSA 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA) 中及在结构性耐药株和诱导性耐药株中的分布见表 2 表 2 erm 基因在不同菌株中的分布菌株类型株数 erma ermb ermc erma+ermc MRSA 10 3 0 0 7 MSSA 29 0 18 11 0 结构性耐药株 31 1 18 5 7 注 :a 图为 D 试验阳性的诱导性耐药 ;b 图为结构性耐药图 1 红霉素对克林霉素的诱导性耐药及结构性耐药 二 erm 基因检测结果 39 株红霉素耐药金黄色葡萄球菌中 erm 基因的携带率为 100.00%, 检出 erma 基因 10 株 (25.6%) ermb 基因 18 株 (46.2%) ermc 基因 18 株 (46.2%), 其中同时携带 erma 和 ermc 基因 诱导性耐药株 8 2 0 6 0 四 药物敏感性试验结果 39 株红霉素耐药金黄色葡萄球菌对克林霉素 青霉素 庆大霉素的耐药率高, 分别为 100.0% 92.3% 53.8%, 携带 erma/a+c ermb 和单独携带 ermc 株的耐药率见表 3
192 检验医学 2013 年 3 月第 28 卷第 3 期 表 3 携带不同 erm 基因的金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率 (%) 抗菌药物 所有菌株 (39 株 ) 携带 erma/a+c 株 (10 株 ) 携带 ermb 株 (18 株 ) 携带 ermc 株 (11 株 ) 克林霉素 100.0 100.0 100.0 100.0 青霉素 92.3 100.0 94.4 81.8 苯唑西林 25.6 100.0 0.0 0.0 庆大霉素 53.8 90.0 66.7 0.0 四环素 33.3 80.0 27.8 0.0 复方磺胺甲口恶唑 38.5 20.0 72.2 9.1 莫西沙星 15.4 60.0 0.0 0.0 利福平 17.9 70.0 0.0 0.0 环丙沙星 33.3 90.0 11.1 18.2 氨苄西林 舒巴坦 35.9 70.0 33.3 9.1 呋喃妥因 0.0 0.0 0.0 0.0 替加环素 0.0 0.0 0.0 0.0 万古霉素 0.0 0.0 0.0 0.0 利奈唑胺 0.0 0.0 0.0 0.0 五 PFGE 分型结果 10 株携带 erma 基因的 MRSA 共分为 6 型, 分别为 A 型 (2 株 ) B 型 (1 株 ) C 型 (2 株 ) D 型 (1 株 ) E 型 (2 株 ) F 型 (2 株 ) 见图 4 CmecⅢ 型,2 株未能分型 见图 5 注 :1 为阴性对照 ;2~4 为 SCCmecⅢ 型 (280 和 147bp) 阳性标本 ;M 为 DNAMaker 图 5 SCCmec 分型电泳图 讨 论 注 :1 7 为 A 型 ;2 为 B 型 ;3 4 为 C 型 ;5 为 D 型 ;6 为 E 型 ; 9 为 E1 型 ;8 10 为 F 型图 4 erma 基因阳性株的 PFGE 图谱 六 SCCmec 分型结果 10 株携带 erma 基因的 MRSA 中,8 株为 SC 金黄色葡萄球菌是临床常见的病原菌 目前临床分离自血流感染的金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药率均 >50.0% [3] 金黄色葡萄球菌对大环内酯类如红霉素 林可酰胺类如克林霉素和 B 类链阳霉素类抗菌药物的耐药机制有能量依赖的主动泵出和核糖体靶位改变 2 种 前者由 msra msrb 基因编码, 对大环内酯及链阳霉素类耐药, 后者与 erm 基因相关, 由 erm 基因编码产生的 erm 导致 23SrRNA 的甲基化作用, 降低了大环内酯类 林可酰胺类和 B 类链阳霉素抗菌药物对核糖体的结合从而产生耐药 由 erm 基因
193 介导的耐药可以是诱导型和结构型 2 种 诱导型通常的耐药表型是红霉素耐药但克林霉素敏感, 必须进行 D 试验才能检测出来 [9], 结构型通常的耐药表型是红霉素和克林霉素均耐药 [2] 本研究结果显示,39 株分离自血流感染患者的红霉素耐药金黄色葡萄球菌全部携带 erm 基因 携带 erma 基因的菌株均为 MRSA, 多表现为多药耐药, 单独携带 erma 和同时携带 erma ermc 的金黄色葡萄球菌对多种药物的耐药率明显高于携带 ermb 和单独携带 ermc 的菌株 携带 ermb 基因的菌株全部为 MSSA(62.1%,18/29), 同时 ermb 基因也是引起分离自血流感染金黄色葡萄球菌结构性耐药的主要基因 (58.1%,18/31), 本研究中 ermb 的检出率明显高于先前的研究 [2,10], 可能存在地区性差异, 也可能与标本来源有关, 有待进一步研究 8 株红霉素对克林霉素诱导耐药株中 6 株携带 ermc 基因 (75.0%,6/8),2 株携带 erma 基因 (25.0%,2/8), 未检出 ermb 基因, 本结 [2] 果与沈定霞等的研究结果一致, 表明 ermc 基因是引起诱导性耐药的主要机制 SCCmec 分型显示 10 株携带 erma 基因的 MRSA 其中 8 株为 SCCmecⅢ 型 (2 株未能分型 ), 表明引起血流感染的红霉素耐药的 MRSA 主要 [11] 为 SCCmecⅢ 型 这与陈荣等的研究结果一致 PFGE 分型结果显示 10 株 MRSA 共分为 6 型, 部分菌株具有高度的同源性, 同时某些型别之间亲缘关系密切, 此类菌株分布于同一病房或不同病房, 提示携带 erma 基因的金黄色葡萄球菌引起的医院感染存在病房内部和病房之间的散发克隆传播 本研究结果表明,erm 基因在引起血流感染的红霉素耐药金黄色葡萄球菌中分布广泛, 是引起大环内酯类 林可酰胺类和 B 类链阳霉素抗菌药物耐药的主要机制, 同时由于 MRSA 均携带 er ma 基因, 并存在散在克隆传播现象, 故应加强医务人员生物安全观念以及病区的消毒隔离意识, 切断病原菌传播途径, 防止引起临床感染的金黄色葡萄球菌在院内引起进一步传播流行 参考文献 [1] LiDZ,ChenYS,YangJP,etal.Preliminary molecularepidemiologyofthestaphylococusaureus inlowerrespiratorytractinfections: amulticenter studyinchina[j].chinmedj(engl),2011,124 (5):687 692. [2] 沈定霞, 罗燕萍, 徐雅萍, 等. 葡萄球菌对红霉素和克林霉素的诱导耐药性研究 [J]. 中华检验医学杂志,2005,28(4):400 402. [3] 王进, 梁军, 肖永红.2008 年 Mohnarin 血流感染病原菌构成及耐药性 [J]. 中华医院感染学杂志,2010,20(16):2399 2404. [4] ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute. Performancestandardsforantimicrobialsusceptibility testing[s].m100 S20,CLSI,2010. [5] LinaG,QuagliaA,ReverdyME,etal.Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins among Staphy lococi[j].antimicrobagentschemother,1999,43 (5):1062 1066. [6] GoeringRV,WintersMA.Rapidmethodforepidemio logicalevaluation ofgram positive Cociby field inversiongelelectrophoresis[j].jclinmicrobiol, 1992,30(3):577 580. [7] TenoverFC,ArbeitRD,GoeringRV,etal.Interpre tingchromosomaldna restrictionpaternsproduced by pulsed field gel electrophoresis: criteria for bacterialstraintyping[j].jclinmicrobiol,1995,33 (9):2233 2239. [8] ZhangK,McClureJA,ElsayedS,etal.Novelmultiplex PCR asayforcharacterizationandconcomitantsub typingofstaphylococcalcasetechromosomemec typesⅠ toⅤ inmethicilin resistantstaphylococus aureus[j].jciinmicrobiol,2005,43(10):5026 5033. [9] 孙建文, 万新亮, 任孔华, 等. 金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素诱导耐药分析 [J]. 检验医学, 2010,25(9):675 677. [10] 贾伟, 赵志军, 杨晓燕, 等. 葡萄球菌对克林霉素诱导耐药表型及基因型检测研究 [J]. 分子诊断与治疗杂志,2010,2(2):94 97. [11] 陈荣, 沈定霞, 闫中强, 等.47 株金黄色葡萄球菌临床血流感染分离株的基因分型研究 [J]. 中华流行病学杂志,2010,31(3):312 315. ( 收稿日期 :2012 06 29) ( 本文编辑 : 姜敏 )