北京市人源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及分子分型研究王丽丽等 冰淇淋引起 人 感 染其 中 人 死 亡 近 年 来 京市李斯特菌病患 者 的 株 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 我国及欧 美 国 家 经 食 品 感 染 的 李 斯 特 菌 病 患 者 呈 菌均分 离 自 胎 盘 株 外 周 血

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1 ?Y AWWZ 9[A\9FF99]Y^ 年第 卷第 期 论著 北京市人源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及分子分型研究 王丽丽陈倩 北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室北京 摘要 目的研究北京市人源性单核细胞增生李斯特菌的血清学分型耐药及分子特征 方 法 对 年北京市李斯特菌病专项监测中分离的 株单核细 胞 增 生 李 斯 特 菌 进 行 a?法 血 清 学 分 型 和 afw分 型并 采 用?\和 W[?K推荐的微量肉汤稀释法检测菌株对 种 抗 生 素 的 敏 感 性 结 果 株 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 N 和 分别为 株和 株N 血清型 株 血清型 菌共分为 种血清型其中位居前 位的血清型是 株 株菌经 0 酶切共分为 种 afw带型分为 个簇相同血清型李斯特菌的 afw带型聚集成簇两种 株单核细胞增生李斯特菌均对青霉素氨 苄 西 林复 方 新 诺 明 及 红 霉 素 敏 分型方法一致性为 0b?值 较 小 但 有 少 数 菌 株 对 苯 唑 西 林 和 四 环 素 的 _?值 较 大 高 达 感大部分菌株对其他 种 抗 生 素 的 _ M 结论北京市人源性单核细胞增生李斯特菌血清型以 N 和 为主aFW图谱与血清学分型存在 一定相关性耐药率普遍较低但需加强耐药趋势监测 关键词 患者 单核细胞增生李斯特菌 血清型 耐药性 脉冲场凝胶电泳 北京 食源性致病菌 中图分类号文献标志码文章编号 A F? TA\?YWAg > A> F Y I? ] a? I V \ N ] K N K 7 F a I? ] a? I?7? K > 7 >N O M N M > 7 M O I A M O M L O7 afw M N > O N 7 Q N O L 7 a? O> > O N N ] N0 afwo L > K7aFWO 7 M OL 7 M > K7 7 L M 7 L 0b L O MO > M 7 Q 7 M _ 7 7 L_? > 7 7 S N N> L _? > M K7 M O M O I L N K7 L M N L O afwo L L N>M 7 > NO 7 M 7 a O > O> O7 I N O 7 N 单核细胞增 生 李 斯 特 菌 \M 收稿日期 基金项 目 国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会 公 益 性 行 业 科 研 专 项 是一种较强致病性 的 食 源 性 人 畜 共 患 病 的 病 原 菌 首都卫生科 研 发 展 专 项 北 该菌具有潜在广泛 扩 散 性健 康 人 群 和 牲 畜 为 该 菌 IZ ^Z 京市预防研究中心公益应用类课题- 的携带者 低 温 冷 藏 的 即 食 食 品 特 别 是 动 物 性 食 作者简介王丽丽女主管技师研究方向为食源性疾病 WM L X M 通信作者陈倩女主任技师研究方向为病原微生物实验室检测 WM 7 f X 品被认为是主要的 传 染 源曾 引 起 多 次 世 界 范 围 的 大流行 年 李 斯 特 菌 污 染 的 哈 密 瓜 导 致 人 死亡 名孕妇流产 年美国蓝铃 I >I

2 北京市人源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及分子分型研究王丽丽等 冰淇淋引起 人 感 染其 中 人 死 亡 近 年 来 京市李斯特菌病患 者 的 株 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 我国及欧 美 国 家 经 食 品 感 染 的 李 斯 特 菌 病 患 者 呈 菌均分 离 自 胎 盘 株 外 周 血 株 脑 脊 液 上升趋势特 别 是 妊 娠 期 女 性 新 生 儿 和 免 疫 力 低 株 胸水 株 等人体的无菌 部 位其中 孕产 妇 下的患者 更 易 感 染 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 进 入 分离株 株新生 儿 及 婴 幼 儿 分 离 株 株免 疫 力 人体是否发病与食 用 菌 量 和 宿 主 的 年 龄免 疫 状 态 低下患者分离 株 株 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 研 有关感染后主要 表 现 为 败 血 症脑 膜 炎单 核 细 胞 究用标准 菌 株?_?? 药 敏 质 控 菌 为 肺 炎 增 多 及 孕 妇 流 产 等 且 临 床 死 亡 率 高 达 b c 链球 菌 K?? 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 K?? b 普通 人 群 的 发 病 率 为 0 万而 妊 娠 均购 自 北 京 陆 桥 技 术 股 份 有 限 公 司 脉 冲 万 \M 可 侵 袭 母 胎 界 面 导 致 胎 儿 期女性为 场凝胶电泳分子量标准菌株沙门菌 Y 由 中国 严重感染胎儿死亡率高达 b 疾病预防控制中心提供 单核细胞增生李斯特菌的血清型有 种食源 N 性及 人 源 性 菌 株 的 血 清 型 别 集 中 在 和 N 等 少 数 血 清 型 00主要仪器与试剂 KWV 全自 动 细 菌 生 化 鉴 定 系 统 法 国 梅 里 传统血清凝集方法步 [\I9 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 仪 埃 水浴摇床 德 国 Z 骤繁琐耗 时 目 前 多 采 用 特 异 性 扩 增 单 核 细 胞 增 及配 套 设 备 凝 胶 成 像 系 统?F8 a?仪 均 购 自 IK LLLM 和开 放阅 生李斯特菌 \_9 基因 美国 I 读框 9F 基因 NOMLQNOLLI 的多重 a?方 \M 显 色 培 养 基 法 国?Y9_ KWV 法对单核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 进 行 血 清 学 分 型 基 _p > S M 琼脂糖 a鉴定卡 法 国 N 于核酸分析的脉冲场凝胶电 泳 技 术 O> 美国? MN I S 蛋白酶 V 德 O7 afw 具 有 分 辨 率 高 重 复 性 好 分 S 限制性内切酶 日本 K S 限 制 国 _ 型能力强的 特 点 已 成 为 食 源 性 疾 病 溯 源 的 金 标 美 国 AWI 溶 菌 酶 美 国 M 性内切酶 0 准 通过对电泳条 带 的 分 析 比 较 可 以 鉴 定 菌 株 是 李氏 菌 增 菌 肉 汤 \I\I 及 脑 心 浸 液 培 养 基 均 购 否同 源 通 过 afw技 术 包 括 中 国 在 内 的 多 个 国 自北京陆桥技术股 份 有 限 公 司调 节 阳 离 子 浓 度 的 家卫生部 门 成 功 溯 源 并 控 制 了 多 起 食 源 性 疾 病 的 营养肉汤 培 养 液 及 革 兰 阴 性 需 氧 菌 药 敏 检 测 板 均 暴发 由 \M 引 起 的 李 斯 特 菌 病 通 常 需 要 青 霉 购自上海 星 佰 有 限 公 司 引 物 由 上 海 生 工 生 物 技 素氨苄青霉素复 方 新 诺 明庆 大 霉 素 等 抗 生 素 治 术有限公司合成 疗 由于抗生素在 动 物 饲 养 中 的 广 泛 应 用临 床 治 0方法 疗中的滥用及过度 治 疗单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 在 00血清学分型 应对抗生素 生 存 压 力 的 条 件 下 会 产 生 耐 药 性 研究表明我国食源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 的 耐 采用 a?方 法 对 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 进 行 血清学分型 目 的 基 因 引 物 序 列 及 产 物 片 段 大 多 重 耐 药 小如表 所 示 将 待 检 菌 株 划 线 接 种 IY平 板 菌株数量逐 渐 增 加 耐 药 谱 也 随 之 发 生 改 变 这 给 h培养 7挑 取 菌 落 溶 解 于 无 菌 纯 水 临床用药的选择提出很大的挑战 的离 心 管 中 制 成 浓 菌 悬 液 h 煮 沸 M 药性已由单一耐药 向 多 重 耐 药 发 展 北京市自 年起开展李斯特菌病专项 监测 M 离心 M 取 上 清 保 存 于 q h 备 截至 年共监测到 名李斯特菌病患者其中 0 模 板 ]A 用 a?反应体系 ka?m 包括孕产妇新生 儿老 人儿 童 及 免 疫 力 低 下 的 患 M \ 的 上 下 游 引 物 各 纯水 者 为了解 北 京 市 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 0 总体积 a?反 应 参 数 h 预 变 性 的血清型耐药特征及 afw型别 分布为北京 市人 M h 变 性 退 火 时 间 h 延 长 源性单核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 的 分 子 诊 断 和 溯 源 提 M 个循环再 h延长 M 取 a? 供依据本研究对 年李斯特菌病 患 者中 中染 扩增产物在 b 琼 脂 糖 中 电 泳 胶 块 在 分离的单核细胞增 生 李 斯 特 菌 进 行 了 血 清 型抗 生 色观察电泳结果并对其进行分析 素敏感性分析和 afw分型 00抗生素敏感试验 和欧洲 根据临床 和 实 验 室 标 准 化 协 会?\ 材料与方法 抗菌药物敏感试验委员会 W[?K 推 荐 的 单 核 细 0材料 胞增生李斯特菌耐 药 试 验 抗 生 素 选 择 原 则结 合 相 00菌株来源 关临床用药和研 究选 择 种 抗 生 素分 别 为 青 霉 本次试验 所 用 菌 株 为 年 分 离 自 北 素 awa 苯唑西林 98 氨苄西 林 _a 万 古

3 ?Y AWWZ 9[A\9FF99]Y^ 表 单核细胞增生李斯特菌血清学分型引物 酶酶切 K N a M O n 引物序列n 目的基因 IK A>M 软件对电泳图像进行 数据分析用 I NO 片段大小 F?KK??KK??? 数据分析构建 聚 类 树 状 图 聚 类 图 类 型 根 据 非 加 权配对算术平均法 [a_ 构建条带位置差异 容?KKK?K?KK??KK? LLLM 年第 卷第 期 FK?KKK??K 许度设为 0b??KKKK??K?KK NOMLQ F?K???K?K 结果?K??K??K???KK NOLLI FK?KKKKK 0血清分型结果?K??K???KK?KKK? F?KKK? 株 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 分 属 为???KKKKK? 种血 清 型 N 和 N 以 N 和 四 环 素 KWK 庆 大 霉素 A 克 林 霉 素?\ 为主 分 别 为 株 0b 和 株 霉素 WA 达托霉素 ]a 红霉素 W^ 氯 霉 0b N 血清型有 株 血清型有 株 a 和 复 方 新 诺 明 K_a素?Y\ 环 丙 沙 星? 0耐药结果 _d 采用?\推荐的微量肉汤稀 释法开 展 抗生 株 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 对?\推 荐 监 素敏感 性 试 验 定 量 测 定 致 病 菌 的 最 低 抑 菌 浓 度 测的 种 抗 生 素 青 霉 素氨 苄 西 林 及 复 方 新 诺 明 均 b 敏 感 参 照 年 W[?K的 标 准 全 _? 参照 年?\药 敏 标 准 _ 及 年 W[?K标准 部 研 究 菌 株 对 红 霉 素 b 敏 感 对 其 他 没 有 国 进行结果判读?值 稍 有 不 同 其 中 际 统 一 标 准 的 种 抗 生 素 _ 00aFW分型 参照国 际 食 源 性 致 病 菌 病 原 细 菌 分 子 分 型 监 株 菌 对 万 古 霉 素 庆 大 霉 素 的 _?值 完 全 一 A 中单核细胞增生李斯特菌 afw分 测网络 a> M 大部分菌株对其他 致 分 别 为 0 进 行主 要 试 验 参 数 如 下 细 种 无 国 际 统 一 标 准 抗 生 素 的 _?值 较 小 但 有 _p >麦 氏 比 浊 仪 调 至 0 c 菌悬 液 浓 度 用 N?值 差 异 较 少 数 菌 株 对 苯 唑 西 林 和 四 环 素 的 _ 限 制 性 内 切 酶 [ h 酶 切 0使用 0?值 高 达 M 株 单 核 细 胞 增 生 大 _ 7 电 泳 参 数 为 c 7 胶 块 电 泳 后 使 用?值 的 李 斯 特 菌 对 种 抗 生 素 不 同 浓 度 测 试 _ 染色纯水脱色读 取 电 泳 图 谱沙 门 菌 标 准? 值 范 围 _? 以 及 _? 如 表 菌 株 数 量 _ 限 制 性 内 切 株 Y 作为分子 量 标 准 使 用 所示 型的标准操 作 方 法 表 株单核细胞增生李斯特菌对 种抗生素的敏感性结果 K N N > O N N _? 0 _?范围 M _? 0 M M 青霉素 awa 苯唑西林 98 氨苄西林 _a 0 c c c 0 c 0 0 万古霉素 A 克林霉素?\ 四环素 KWK 0 c 0 c 庆大霉素 WA 达托霉素 ]a 红霉素 W^ 氯霉素?Y\ a 环丙沙星? _d 复方新诺明 K_a- 抗生素?值的菌株数量 不同浓度测试 _ 株 0 c 0 c0 c 0 c 0 c M 注浓度单位为 0aFW分型与聚类结果 对 株 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 分 离 株 酶 切 后 将 afw图 谱 进 行 聚 基因组 ]A经 0 菌的 种 afw带型分为 个簇各簇包含菌株数 不等其中簇和簇 菌 株 数 较 多分 别 为 株 和 株簇和簇分别为 株和 株 类分析结果如图 所示 株 人 源 性 单 核 细 胞 增 从图 中 可 以 看 出 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 生李 斯 特 菌 共 分 为 种 afw 型 别 同 源 性 为 afw图谱的聚集性 与 血 清 型 有 一 定 的 联 系 簇 0b cb 带 型 分 布 分 散 优 势 带 型 不 明 显 N 血 清 型簇 为 血 为 N 血清 型簇 为 A>M 进行菌 株 间 聚 类 分 析可 将 株 采用 I 血清型 株 为主另 有 N 和 清型簇以

4 北京市人源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及分子分型研究王丽丽等 图 北京市 株人源性单核细胞增生李斯特菌 afw聚类图 F > afw > M O 血清型各 株 株 N 血清型单核细 胞增 N 和 为 主 分 别 占 符 研 究 菌 株 以 生李斯 特 菌 分 为 种 afw带 型其 中 株 聚 集 0 b 和 0 b 血 清 型 有 株 这 与 \M 的 菌 株 与 株 血 成簇 株 编 号 为 IZ N 年河南 省 食 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 中 \M 菌 株 相 似 度 为 b 同 为 清型的 编 号 为 IZ 血 清 型 为 主 0 b 一 致 8?AIZ 带 型 位 于 簇 中 株 为 优 势 血 清 型 占 0 b 不 样 本 中 以 血清型分为 种 afw带型主要构 成簇 和 其 同 中簇 中 株 菌 afw带 型 相 似 度 为 b 同 为 血 清 型 应 引 起 关 注 但 与 北 京 地 区 生 肉 同 时 研 究 菌 株 中 有 株 致 病 性 较 强 的 N 8?AIZ 带型 株 N 血 清 型 分 为 种 本研 究 所 用 株 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 不 同 的 afw带 型 聚 为 簇 相 似 度 为 0b 菌的 afw型别 呈 散 在 分 布 说 明 菌 株 来 自 不 同 的 株 血清型为 种 afw带型位于簇中 A>M 聚 克隆株即菌株之间 的 相 关 性 不 大 I 类分析 结 果 表 明 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 讨论 afw图谱的聚集性 与 血 清 型 有 一 定 的 联 系 大 部 近年来散在的 李 斯 特 菌 病 病 例 在 很 多 国 家 时 N 血清型单核细胞增生李斯特菌聚集成簇 分 有报道 我 国 目 前 没 有 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 暴 血清型构成簇和簇 株 N 血清型单 独 成 发的相 关 报 道 但 存 在 由 该 菌 引 起 的 散 发 病 例 报 簇少数菌株存在 血 清 型 与 簇 之 间 的 交 叉 如 株 告针对临 床 分 离 菌 株 分 子 特 征 的 研 究 尚 属 较 少 N 血清型菌株与 株 菌株经 0 酶切后带 本研究对 年北京市监测到的 名 李斯 酶 型相似度为 b可能 是由 于这 株 菌 的 0 特菌病病 例 分 离 到 的 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 进 行 血 清 型 切位点相同 所 致 簇 虽 与 簇 同 由 了血清型抗生素敏感性分析和 afw分 型病 例来 N 血清型构成的簇的亲缘关系更近 构成但与 源包括孕产妇新 生 儿老 人儿 童 及 免 疫 力 低 下 的 0b 有待 进 一 步 研 究 另 外 虽 然 株 患者初步掌握了北 京 市 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 血清型菌株 及 部 分 菌 株 具 有 相 似 度 b 的 afw 特菌的血清型耐药及分子特征 带型但结 合 流 行 病 学 调 查 结 果 菌 株 间 不 具 有 同 本 研 究 的 株 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 源性 afw分型对于 散 发 病 例 分 离 菌 株 的 意 义 没 血清分型结果与国内外报道的常见致病 血 清 型 相 有暴发溯源明显但 获 得 的 分 型 结 果 可 作 为 数 据 积

5 ?Y AWWZ 9[A\9FF99]Y^ 累为将来可能的 暴 发 溯 源 提 供 数 据 支 持 本 研 究 所获得的 菌 株 信 息 可 以 作 为 该 菌 在 北 京 市 流 行 的 背景信息为 持 续 性 监 测 打 下 基 础 对 于 减 少 北 京 市特殊人群 孕 产 妇新 生 儿免 疫 低 下 人 群 等 李 斯特菌病发病率降 低 疾 病 社 会 负 担 具 有 重 要 的 经 济与社会效益 抗生素能够有 效 治 疗 李 斯 特 菌 病但 是 近 年 来 不断出现临床耐 药 株 本 研 究 对 株 人 源 性 单 核 年第 卷第 期 M 7 M \ N I\ Z? ] 郁庆 福现 代 卫 生 微 生 物 学 _ 北 京 人 民 卫 生 出 版 社 ] \ O Z Z_ L T M Y 7 L M 7 I M M ak7 O M 7>M Z _ N a >MNZ] I > S_ V _ W O N Q M S MM> N 细胞增生李斯特菌 进 行 了 种 抗 生 素 的 耐 药 表 型 分析建立了北京市 人 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 Z Z? _ N MM> N M O > > N 耐药图谱 库 依 据?\及 W[?K标 准 株 菌 王丽丽马晓 晨滕 仁 明等一 起 由 肠 炎 沙 门 菌 所 致 食 源 性 均对临床 治 疗 李 斯 特 菌 病 的 一 线 药 物 氨 苄 西 林 和 中 华 预 防 医 学 疾病暴发疫情的病 原 学 研 究 及 溯 源 分 析 Z 青霉素及 二 线 治 疗 药 物 复 方 新 诺 明 红 霉 素 敏 感 其他 种抗生素虽然没有国际推荐的抗生素耐药敏?值_?范围_? 及 感性折点但是长期监测? 的变化对于研究单核细胞增 生李 斯特菌 的耐 药趋势意义重大 如 对 于 某 一 种 抗 生 素大 部 分 菌?值较小少数菌株的 _?值明显高于 其他 株的 _ 菌株则可 以 用 分 子 生 物 学 的 方 法 如 耐 药 基 因 或 者 afw分 型 研 究 其 耐 药 机 制 例 如 四 环 素 极 少 耐药基因阳 性的 单 用于治疗李斯特菌病但已有? 为 核细胞增生李斯特菌报道 本试验中四环素 _ M 但有 株菌的四环素 _?值为 M 而 血 清型且 在 聚 类 中 单 独 为 簇 这 株菌同为 的一个小的分枝 图 中星号所示 相似度为 b 杂志 ] Z _ \ > 7 Z Y>M W> O OO > MO W> O > Z W> > \> > I 9r I? _> 7 N O > Z F N a 7 ] 闫韶飞裴晓燕杨 大 进等 年 中 国 食 源 性 单 核 细 胞 增 中 国 食 品 生李斯特菌耐药特 征 及 多 位 点 序 列 分 型 研 究 Z 卫生杂志 赵悦付萍裴晓 燕等中 国 食 源 性 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 耐药特征分析 Z 王天姝王艳贺 春 月等中 国 部 分 食 品 分 离 单 增 李 斯 特 菌 疾 病 监 测 的抗菌药物敏感性 及 耐 药 基 因 检 测 Z ] >M 7 _ I> 7? a ] 7?值提示可能有耐药倾向 加 强 这些异常增高的 _ N M> O a? Z M 对临床分离株进行 分 子 特 征 和 耐 药 分 析通 过 耐 药 Z >? _ N 监测为临床医生提 供 及 时准 确 的 抗 生 素 敏 感 性 资 料对指导临床合 理 选 药提 高 疗 效控 制 多 重 耐 药 菌流行有重大实用 价 值并 可 用 于 协 助 制 定 抗 生 素 在人和动物中的用药和供应政策?\ _ M 7 M N > S > O N f> > N OO > W[?K N Q M 0 N SO _? > a> A [?]? O O > a> A 参考文献?]?_> > N S S L7 >O MZ F M? >O WI 9\ 7 O LLL > N S >O M 7 M?]?_> > N S S N > N M O > >O WI 9\ 7 O LLL > N S - [? ] afw? a 炊慧霞李文杰张 秀 丽等 年 河 南 省 食 源 性 单 核 细 胞 中 国 卫 生 检 验 杂 增生李斯特菌血清 分 型 及 耐 药 性 分 析 Z 志 马爱静王艳王 毅等北 京 市 一 些 地 区 生 肉 标 本 中 单 增 李 中 国 人 兽 共 斯特菌的分离及其 分 子 流 行 病 学 特 征 分 析 Z 患病学报 -

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