302 上海海洋大学学报 26 卷验对摇瓶发酵的温度转速装液量初始 ph 碳源氮源和无机盐进行优化正交实验采用三因素三水平的正交实验对碳源氮源和无机盐的配比进行优化生长曲线绘制以最优培养基和培养条件在摇床上进行发酵, 每隔 4h 取样 1 次测定菌体生物量,

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镳桑
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1 文章编号 : (2017) DOI: /jsou 鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化 1,2 2,3 1,2,3 2,3 1 4 张洪玉, 唐夏, 夏磊, 王海波, 赵明军, 吕永辉 (1. 中国水产科学研究院, 北京 ;2. 中国水产科学研究院无公害渔药创制中心, 北京 ;3. 北京鑫洋水产高新技术有限公司, 北京 ;4. 全国水产技术推广总站, 北京 ) 摘要 : 鲍鱼希瓦氏菌有望用于对虾养殖和海水石油污染的治理为探索鲍鱼希瓦氏菌的最优培养基和培养条件, 运用单因素实验和正交实验对发酵条件进行优化, 并在 70L 发酵罐上进行扩大培养最优培养基为蔗糖 6%, 蛋白胨 2.5%, 碳酸钙 0.7%, 初始 ph6.8 最优摇瓶培养条件为温度 30, 转速 130r/min, 装液量 100mL/500mL, 接种量 6%, 收获时间 24h 70L 发酵罐生物量达到 cfu/ml 鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化为其工业生产提供了实验数据支持关键词 : 鲍鱼希瓦氏菌 ; 发酵 ; 生物量中图分类号 :TQ920.6;S476 文献标志码 :A 目前, 微生态制剂已成为水产动物疾病防治的重要手段之一, 具有广阔的应用前景 [1] 其中, 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等益生菌的生产和应用已较为成熟 [2 5] 新的益生菌的分离鉴定功能研究和发酵条件的摸索将会进一步推动微生态制剂领域的发展鲍鱼希瓦氏菌最初由 KIM 等 [6] 2007 年在鲍鱼肠道菌群中分离鉴定研究发现, 该菌能够促进对虾生长, 增强对虾免疫力和抗病害能力 [7 8] ; 此外, 有研究表明该菌能有效降解石油, 有望用于海水石油污染的治理 [9] 而且, 在安全性实验中, 未发现该菌对实验动物有明显的致病作用 [10] 综上所述, 鲍鱼希瓦氏菌在水产养殖和海水污染治理中具有一定的应用前景, 但尚未见其发酵条件探索的相关报道本研究通过单因素实验和正交实验对鲍鱼希瓦氏菌的发酵条件进行优化, 以期为工业生产提供实验数据支持 1 材料与方法 1.1 菌株鲍鱼希瓦氏菌斜面菌种由本实验室分离保存 [7], 并提交到中国普通微生物菌种保藏管理中心, 保藏号 CGMCCNo 主要仪器摇床 (DSHZ 300A, 苏州培英实验设备有限公司 ); 生化培养箱 (LRH 250, 上海一恒科技有限公司 );70L 发酵罐 (GUJS 70, 镇江东方生物工程设备技术有限责任公司 ); 超净工作台 (SW CJ ICU, 苏州安泰空气技术有限公司 ) 1.3 培养基平板培养基 : 蛋白胨 1%, 牛肉膏 0.3%, 氯化钠 0.5%, 琼脂 1.5%,pH7.0 基础液体培养基 : 蛋白胨 1%, 牛肉膏 0.3%, 氯化钠 0.5%,pH 实验方法摇瓶种子培养挑取斜面培养基上的菌种, 接种于基础液体培养基培养过夜, 取母瓶培养物接种至子瓶, 按基础培养条件 ( 接种量 6%, 温度 30, 转速 230 r/min, 装液量 100mL/500mL) 培养 18h 作为摇瓶种子单因素实验在基础培养基和培养条件下, 采用单因素实收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (2012C016) 作者简介 : 张洪玉 (1981 ), 男, 博士研究生, 助理研究员, 研究方向为渔用药物研发 E mail:zhanghy@cafs.ac.cn 通信作者 : 夏磊,E mail:xialei666@126.com

2 302 上海海洋大学学报 26 卷验对摇瓶发酵的温度转速装液量初始 ph 碳源氮源和无机盐进行优化正交实验采用三因素三水平的正交实验对碳源氮源和无机盐的配比进行优化生长曲线绘制以最优培养基和培养条件在摇床上进行发酵, 每隔 4h 取样 1 次测定菌体生物量, 直至 32 h 发酵罐扩大培养采用最优培养基和培养条件, 在 70L 发酵罐上进行扩大培养菌体生物量测定采用平板计数法,3 个重复, 用 Excel2007 进行数据分析, 数据以均数 ± 标准误表示 2 结果与讨论 2.1 培养条件优化培养温度优化将培养温度设置为和 38, 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图转速优化将摇床转速分别设置为和 260r/min 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图 2 图 2 摇床转速对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.2 Efectofrotationrateongrowthof 摇瓶转动可以增加溶解氧, 分散营养物质和代谢产物图 2 数据显示, 在 0~130r/min 范围内, 菌体生物量随转速的增加而增加在 130~ 260r/min 范围内, 菌体生物量随转速的增加而减少, 但减少不明显因此, 最优摇床转速为 130r/ min 装液量优化将 500mL 三角瓶装液量设置为和 300mL 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图 3 图 1 培养温度对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.1 Efectoftemperatureongrowthof 微生物的繁殖可以看作是一系列的酶促反应, 而繁殖最适温度反映着相应酶促反应系统的最适温度图 1 数据显示, 在 20~32 培养条件下菌体生物量随温度升高而增加, 选取 30 作为最优发酵温度温度大于 32 时, 菌体生物量下降, 有可能是温度超过了细菌繁殖的最适温度, 也有可能是由于实际最适温度大于 32, 细菌生长过早进入衰退期所致需要绘制生长曲线以进一步明确图 3 装液量对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.3 Efectofloadingvolumeongrowthof 摇床培养条件下, 装液量与溶氧密切相关图 3 数据显示, 装液量为 100mL 时菌体生物量最高

3 2 期张洪玉, 等 : 鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化培养基优化初始 ph 优化在最优培养条件下, 将培养基的初始 ph 分别设定为和 8.0 培养 24 h, 测定菌体生物量见图 4 图 4 初始 ph 对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.4 EfectofinitialpH ongrowthof 图 4 数据显示, 当初始 ph 在 5.5~7.0 范围内, 菌体生物量随 ph 升高而升高,pH7.0 时最高随着 ph 的进一步增大, 菌体生物量逐渐降低由此可见, 适合该菌繁殖的 ph 范围为 6.5~ 7 因此, 最优初始 ph 设置为碳源优化在最优培养条件下, 比较蔗糖葡萄糖可溶性淀粉玉米淀粉和土豆淀粉这 5 种碳源, 添加量均为 6% 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图 5 够分泌多种多样的水解酶, 将细胞外的大分子降解后进而吸收利用图 5 数据显示, 蔗糖的菌体生物量最大, 其次是葡萄糖, 而淀粉类多糖的生物量较低, 这可能是由于该菌分泌淀粉酶类的能力较弱但如果有实验能够证实该菌可以分泌一定量的淀粉水解相关酶类, 那么将速效碳源蔗糖和迟效碳源淀粉搭配使用可能更有利于细菌生长并减少发酵成本 [11] 此外, 研究表明鲍鱼希瓦氏菌能够降解石油 [9] 所以, 也有可能使用石油产品作为其发酵的碳源目前, 选择蔗糖作为最优碳源氮源优化在最优培养条件下, 选择酵母膏蛋白胨牛肉膏混合氮源 ( 蛋白胨牛肉膏酵母膏 =5 1 1 w/w) NH 4 Cl 和 (NH 4 ) 2 SO 4 替换基础培养基中的氮源, 添加量均为 3.5% 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图 6 图 6 氮源对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.6 Efectofnitrogensourcesongrowthof 图 5 碳源对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.5 Efectofcarbonsourcesongrowthof 微生物能够利用复杂的大分子是由于其能天然培养基营养丰富, 不仅能作为碳源氮源, 还能为微生物的生长提供微量元素和维生素类物质图 6 数据显示, 有机氮源更有利于细菌的生长繁殖, 其中以单独使用蛋白胨效果最好考虑到培养基配方以简单为佳, 选择单用蛋白胨作为最优氮源无机盐优化在最优培养条件下, 比较 NaCl K 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 +Na 2 HPO 4 (1 1 w/w) NaH 2 PO 4 + K 2 HPO 4 (1 1w/w) MgSO 4 和 CaCO 3 这 6 种无机盐或无机盐组合, 添加量均为 0.5% 培养 24h 后, 取样测定菌体生物量见图 7

4 304 上海海洋大学学报 26 卷图 7 无机盐对鲍鱼希瓦氏菌生长的影响 Fig.7 Efectofinorganicsaltsongrowthof 天然培养基如蛋白胨已含有满足微生物生长繁殖基本要求的无机盐, 但由于微生物生理特性不同, 其对无机盐的需求量也有差别钙离子是构成细胞的重要组分, 也是多种生物酶的辅因子研究显示, 碳酸钙可以促进微生物生长 [12 13], 还可以通过缓冲培养基 ph 的作用促进发酵产物的积累 [14] 图 7 数据显示, 培养基中添加碳酸钙后的菌体生物量最大, 一方面可能是因为鲍鱼希瓦氏菌对钙离子的需求量较大, 而溶解度小的碳酸钙不仅能够持续提供钙离子, 还能避免钙离子水平过高 ; 另一方面可能是碳酸钙能缓冲细菌代谢过程中产生的酸, 起到稳定 ph 的作用所以, 选择碳酸钙作为最优无机盐正交实验优化培养基配比通过单因素实验选定了碳源氮源和无机盐, 共 3 个因素, 每个因素取 3 个水平采用 L 9 (3) 4 正交设计优化培养基配比 ( 表 1) 实验编号 No. 表 1 鲍鱼希瓦氏菌发酵培养基优化的正交实验 Tab.1 Orthogonaldesignforfermentationmedium optimizationof A. 蔗糖 /% D(+) sucrose B. 蛋白胨 /% Peptone C.CaCO 3 /% 菌体生物量 /( cfu/ml) Biomas 1 1(8) 1(4.5) 1(2.8) (3.5) 2(1.4) (2.5) 3(0.7) (6) (4) K K K R 由表 1 直观分析结果可知, 各因素影响大小的顺序为碳源 > 无机盐 > 氮源, 表明碳源对鲍鱼希瓦氏菌生长影响最大, 其次是无机盐, 最后是氮源该菌最优培养基配比为 A 2 B 3 C 3, 即蔗糖 6% 蛋白胨 2.5% 和碳酸钙 0.7% 同时, 从表 1 中可见如果能进一步降低蛋白胨和碳酸钙的浓度, 就有可能继续提高菌体生物量 2.3 摇瓶发酵生长曲线的测定在最优培养基和培养条件下进行摇床发酵实验 : 温度 30, 转速 130r/min, 装液量 100 ml/500ml, 接种量 6%, 蔗糖 6%, 蛋白胨 2.5%, 碳酸钙 0.7%, 初始 ph6.8 绘制生长曲线以选择最优种龄和收获时间 ( 图 8) 图 8 鲍鱼希瓦氏菌生长曲线 Fig.8 Thegrowthcurveof

5 2 期张洪玉, 等 : 鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化 305 由图 8 可知,0~4h 生物量较低 ( 延滞期 ), 4~20h 生物量快速增长 ( 对数期 ),20~28h 生物量趋于稳定 ( 稳定期 ),28h 时生物量开始下降 ( 衰退期 ) 处于对数生长晚期的种子增殖能力强菌体量大, 是接种的最佳时机因此, 鲍鱼希瓦氏菌最优种龄是 18h, 最优收获时间为 24h 2.4 发酵罐扩大培养使用 70L 发酵罐扩大培养进行验证, 在最优培养基配比下, 设置发酵条件 : 装填系数 0.6, 罐压 0.05MPa, 温度 30, 接种量 6%, 搅拌速度 260r/min 发酵 24 h 后, 测定生物量达到 (1.14±0.14) cfu/ml, 可以满足工业生产的需求和分批发酵相比, 补料发酵可以解除底物抑制产物反馈抑制和分解产物阻遏, 更有利于菌体生长和发酵产物的积累 [15] 但本实验菌体生物量已较为满意, 而补料会增加操作及污染风险, 故未采用 3 结论鲍鱼希瓦氏菌在水产养殖和海水污染治理中具有一定的应用前景本实验对鲍鱼希瓦氏菌的发酵培养基和摇瓶发酵条件进行了优化最优培养基为蔗糖 6%, 蛋白胨 2.5%, 碳酸钙 0.7%, 初始 ph6.8 最优摇瓶培养条件为温度 30, 转速 130r/min, 装液量 100mL/500mL, 接种量 6%, 收获时间 24h 在 70L 发酵罐进行验证, 生物量达到 cfu/ml, 为其工业生产提供了实验数据支持参考文献 : [1] 张连水, 张慧霞, 孟会贤, 等. 微生态制剂的研究现状及前景 [J]. 河北渔业,2016(2):56 59,70. ZHANG L S,ZHANG H X,MENG H X,etal.The progresand future developing trend on microecological agents[j].hebeifisheies,2016(2):56 59,70. [2] 汤保贵, 徐中文, 张金燕, 等. 枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用 [J]. 淡水渔业,2007,37(3): TANGB G,XU ZW,ZHANG JY,etal.Cultivation conditionsand application in waterpurification efectof Bacilussubtilis[J].FreshwaterFisheries,2007,37(3): [3] LIUKF,CHIUCH,SHIUYL,etal.Efectsofthepro biotic,bacilussubtilise20,onthesurvival,development, stres tolerance, and immune status ofwhite shrimp, Litopenaeus vannamei larvae [J]. Fish &Shelfish Immunology,2010,28(5/6): [4] 杨莺莺, 李卓佳, 陈永青, 等. 益生菌 D 1 液体发酵工艺的研究 [J]. 南方水产,2005,1(6): YANGY Y,LIZ J,CHEN Y Q,etal.Fermentation technologyofprobioticstraind 1[J].SouthChinaFisheries Science,2005,1(6): [5] BURBANKDR,SHAHDH,LAPATRASE,etal.Enhanced resistancetocoldwaterdiseasefolowingfeedingofprobiotic bacterialstrainstorainbowtrout(oncorhynchusmykis)[j]. Aquaculture,2011,321(3/4): [6] KIMD,BAIKKS,KIMMS,etal.sp. nov.,isolatedfrom thegutmicrofloraofabalone,haliotis discushannai[j].internationaljournalofsystematicand EvolutionaryMicrobiology,2007,57(12): [7] HAOK,LIUJY,LINGF,etal.Efectsofdietaryadmini strationofd4, BaciluscereusD7 and Aeromonasbivalvium D15, single or combined, on the growth,innateimmunityanddiseaseresistanceofshrimp, Litopenaeusvannamei[J].Aquaculture,2014, : [8] 夏磊, 赵明军, 张洪玉, 等. 不同比例复合益生菌对凡纳滨对虾生长免疫及抗氨氮能力的影响 [J]. 中国水产科学,2015,22(6): XIAL,ZHAOMJ,ZHANGHY,etal.Efectsofdiferent proportionsofagroup ofcompound bacteriaon growth, innateimmunity,andammonianitrogenresistanceinpacific whiteshrimp,litopenaeusvannamei[j].journaloffishery SciencesofChina,2015,22(6): [9] BAYATZ,HASSANSHAHIANM,HESNIM A.Enrichment andisolation ofcrude oildegrading bacteria from some muselscolectedfromthepersiangulf[j].marinepolution Buletin,2015,101(1): [10] LIS F, ZHANG JD, QIU D Q, etal. Biological characteristicsandpathogenicitiesofshewanelaalgaeand Shewanelaabalonefrombabylonia[J].AgriculturalScience &Technology,2015,16(9): ,1859. [11] 刘惠知, 孔利华, 周映华, 等. 益生菌枯草芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化 [J]. 饲料研究,2009(7): LIU H Z,KONG LH,ZHOU Y H,etal.Fermentation mediumandconditionsoptimizingofprobioticbacilussubtilis [J].FeedResearch,2009(7): [12] 刘立明, 李寅, 堵国成, 等. 碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中 α 酮戊二酸的形成 [J]. 生物工程学报,2003,19(6): LIU L M, LIY,DU G C,etal. CaCO 3 stimulatesα ketoglutarateaccumulationduringpyruvatefermentationby Torulopsisglabrata[J].ChineseJournalofBiotechnology, 2003,19(6): [13] YIJS,KIMM,KIMSJ,etal.Efectsofsucrose,phosphate, andcalciumcarbonateontheproductionofpikromycinfrom Streptomycesvenezuelae[J]. JournalofMicrobiologyand Biotechnology,2015,25(4):

6 306 上海海洋大学学报 26 卷 [14] ZOUM Y,GUOFF,LIXZ,etal.Enhancingproduction ofalkalinepolygalacturonatelyasefrom Bacilussubtilisby fed batchfermentation[j]. PLoS One, 2014, 9(3): e [15] 王剑, 蒋霞云, 卢梦琪, 等. 浅玫瑰色链霉菌壳聚糖酶罐发酵工艺及其优化 [J]. 上海海洋大学学报,2015,24 (6): WANGJ,JIANG X Y,LU M Q,etal.Optimizationof chitosanase production from Streptomyces roseolus by fermentation proces[j]. Journal of Shanghai Ocean University,2015,24(6): Optimizationoffermentationprocesof ZHANGHongyu 1,2,TANGXia 2,3,XIALei 1,2,3,WANGHaibo 2,3,ZHAOMingjun 1,L Yonghui 4 (1.ChineseAcademyofFisherySciences,Beijing ,China;2.Research&CreationCenterofGrenFisheryMedicineof ChineseAcademyofFisherySciences,Beijing ,China;3.BeijingSeasunFisheryCo.Ltd,Beijing ,China; 4.NationalFisheriesTechnicalExtensionCenter,Beijing ,China) Abstract:haspotentialbiotechnologicalapplicationsinshrimpculturingandoilpolution abatement.todeterminetheoptimalfermentationmedium andcultureconditionsof, singlefactorexperimentsandorthogonaldesignwereconducted.furtherconfirmationwascariedoutin70l bioreactorundertheoptimalmediumandcultureconditions.theresultsshowedthattheoptimalmediumwas 6% sucrose,2.5% peptoneand0.7% CaCO 3 atinitialph6.8,andoptimalcultureconditionsinshaking flaskwere30,130r/min,100ml/500mlloadingvolume,6% inoculum sizeand24hfermentation cycle.theaverageoffinalbiomasin70lbioreactorreached cfu/ml.thefermentation optimizationprovidesexperimentdataforfurtherindustrialproduction. Keywords:;fermentation;biomas

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