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1 GMpure 微量樣本 DNA 提取試劑盒 產品編號 : DPT26 產品包裝 : 50 個反應 僅供研究用途使用 1

2 產品敘述 : GMpure 微量樣本 DNA 提取試劑盒採用 silica 管柱膜技術, 並提供特殊的緩衝液系統, 基因組 DNA 在高鹽存在下, 會和 silica 管柱膜結合, 同時汙染物會通過管柱, 將管柱膜徹底洗滌以去除任何殘留的汙染物後, 以低鹽緩衝液將純 DNA 從管柱膜上洗提下來 本試劑盒適用於廣泛的樣本材料, 如少量體積的血液 乾血漬 血清 / 血漿 微量的組織 漱口液及毛囊, 純化的基因組 DNA 可直接作為 PCR 限制酶切及雜交等實驗的模板 試劑盒包裝內容物 : 內容物 DPT26 (50 個反應 ) Buffer GA Buffer GB Buffer GD Buffer PW Buffer TB Proteinase K Carrier RNA RNase-Free ddh 2O 15 ml 15 ml 13 ml 15 ml 15 ml 1 ml 310 μg 1 ml Spin Columns 50 Collection Tubes 2 ml 50 * GMpure 微量樣本 DNA 提取試劑盒可於室溫 (15-25 C) 乾燥保存達 12 個月, 且不影響效能和品質, 本試劑盒也可於 2-8 C 長期儲存 如緩衝液在 2-8 C 保存下有沉澱形成, 請將緩衝液置於室溫, 或於 37 C 回溫 10 分鐘, 以溶解沉澱 Carrier RNA 的儲備溶液應儲存於 -20 C 注意事項 : 1. 使用者自備試劑 : 乙醇 (96-100%) 1M DTT ( 用於毛囊的基因組 DNA 提取 ) 1

3 2. GMpure 微量樣本 DNA 提取試劑盒技術指標 : GMpure 離心管柱最大容量 700 μl Buffer TB 最小洗提體積 20 μl 抗凝全血最大體積處理量 ( 哺乳動物 ) 100 μl 動物組織最大處理量 10 g 3. 如 Buffer GA 或 GB 有沉澱形成, 請於 37 C 回溫以溶解沉澱 4. 將樣本溫度平衡至室溫 (15-25 C) 5. 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照瓶身標籤指示加入至 Buffer GD 及 Buffer PW 6. 為提高 DNA 的產量, 本試劑盒提供 Carrier RNA, 建議直接進行基因組 DNA 的 PCR 分析, 因使用 Carrier RNA 會導致 OD260 產生誤差 製備 Carrier RNA 儲備溶液 : 第一次使用 Carrier RNA 時, 加入 310 μl 無 RNase 的 ddh 2 O 至含有 310 μg 凍乾的 Carrier RNA 的試管中, 以取得 1 μg/μl 的溶液, 將 Carrier RNA 完全溶解, 並分裝成方便使用的份量, 保存於 -20 C, 請勿重複凍融 Carrier RNA 的分裝溶液超過 3 次 操作步驟 <1> 少量體積之血液的基因組 DNA 提取 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 及 PW 1. 取 μl 的全血至 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ) 2. 如血液樣本少於 100 μl, 加入 Buffer GA, 將體積補足至 100 μl 3. 加入 10 μl Proteinase K 注意 : 如需不含 RNA 的 DNA, 可加入 5 μl RNase A (100 mg/ml), 震盪 15 秒, 於室溫 (15-25 C) 孵育 5 分鐘 4. 加入 100 μl Buffer GB ( 如血液的初始體積少於 10 μl, 請加入 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲 備溶液 ) 至 Buffer GB), 關上管蓋, 輕輕翻轉試管以混合均勻, 短暫 離心 1.5 ml 離心管, 以收集管蓋內的液滴, 於 56 C 孵育 10 分鐘, 並於此期間輕輕將 1.5 ml 離心管搖勻 注意 : 當加入 Buffer GB 時, 可能會有白色沉澱形成, 此沉澱不會影響提 2

4 取過程, 並於 56 C 加熱孵育時溶解, 如沉澱未溶解, 表示細胞 並未裂解完全, 可能導致 DNA 的產量低及含有雜質 5. 加入 50 μl 乙醇 (96-100%) ( 如室溫超過 25 C, 在加入 1.5 ml 離心管之 前, 請將乙醇置於冰上冷卻 ), 關上管蓋, 輕輕翻轉試管以混合均勻, 於室溫 (15-25 C) 孵育 3 分鐘, 短暫離心以收集管蓋內的液滴 6. 小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒 掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 使用前確保已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 使用前確保已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 9. 重複步驟 將離心管柱重新放回收集管, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分 鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 2-5 分鐘, 使管柱膜完 全乾燥 注意 : Buffer PW 殘留的乙醇可能會影響下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提高 DNA 的產量, 可將含有 DNA 的洗提液再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育管柱 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分 鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾 水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於水中易受酸水解 3

5 操作步驟 <2> 乾血漬的基因組 DNA 分離 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 和 Buffer PW 1. 從乾血漬切下 3 3 mm 的樣本, 並放置於 1.5 ml 離心管中 ( 未 提供 ) 2. 加入 180 μl Buffer GA 3. 加入 20 μl Proteinase K, 輕輕翻轉以混合均勻, 於 56 C 孵育 1 小時, 每 10 分鐘震盪試管 10 秒以促進裂解 4. 加入 200 μl Buffer GB 及 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參 閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備溶液 ), 關上管蓋, 翻轉混合均 勻, 於 70 C 孵育 10 分鐘, 每 3 分鐘震盪試管 10 秒以促進裂解, 離心 1.5 ml 離心管, 以收集管蓋內的液滴 注意 : 當加入 Buffer GB 時, 可能會有白色沉澱形成, 此沉澱不會影 響提取過程, 並於 70 C 加熱孵育時溶解, 如沉澱未溶解, 表 示細胞並未裂解完全, 可能導致 DNA 的產量低及含有雜質 5. 加入 200 μl 乙醇 (96-100%) ( 如室溫超過 25 C, 在加入至 1.5 ml 離心管之前, 將乙醇置於冰上冷卻 ), 關上管蓋, 輕輕翻轉試管 以混合均勻, 於室溫 (15-25 C) 孵育 5 分鐘, 短暫離心以收集 管蓋內的液滴 6. 小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管 中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 9. 重複步驟 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 4

6 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提高 DNA 的產量, 可將含有 DNA 的洗提液再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育管柱 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於水中易受酸水解 操作步驟 <3> 血漿 / 血清的循環核酸 / 游離核酸分離 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 及 Buffer PW 1. 取 μl 血清 / 血漿至 2 ml 離心管 ( 未提供 ), 如樣本少於 100 μl, 加入 Buffer GA, 將體積補足至 100 μl 2. 加入 20 μl Proteinase K, 震盪混合均勻 3. 加入 200 μl Buffer GB ( 如血清 / 血漿的初始體積少於 50 μl, 加入 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備溶液 ) 至 Buffer GB), 關上管蓋, 輕輕翻轉以混合均勻, 於 56 C 孵育 10 分鐘, 並在此期間輕輕搖勻 2 ml 離心管, 短暫離心 2 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 注意 : 當加入 Buffer GB 時, 可能會有白色沉澱形成, 此沉澱不會影響提取過程, 並於 56 C 加熱孵育時溶解, 如沉澱未溶解, 表 5

7 示細胞並未裂解完全, 可能導致 DNA 的產量低及含有雜質 4. 加入 200 μl 乙醇 (96-100%) ( 如室溫超過 25 C, 在加入至 2 ml 離心管之前, 將乙醇置於冰上冷卻 ), 關上管蓋, 輕輕翻轉以混合均勻, 於室溫 (15-25 C) 孵育 5 分鐘, 短暫離心 2 ml 離心管, 以收集管蓋內的液滴 5. 小心移取步驟 4 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 6. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 重複步驟 7 9. 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 10. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~134, 00 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提高 DNA 的產量, 可將含有 DNA 的洗提液再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於水中易受酸水解 6

8 操作步驟 <4> 漱口液的基因組 DNA 分離 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入 Buffer GD 及 Buffer PW 1. 加入 ml 漱口液至 50 ml 無菌管中 ( 未提供 ), 於 800 rpm (1,800 x ɡ) 離心 5 分鐘, 小心去除上清液 2. 加入 200 μl Buffer GA 重新使沉澱懸浮, 並移取所有懸浮溶液至 1.5 ml 離心管 3. 加入 20 μl Proteinase K, 震盪混合 10 秒, 於 56 C 孵育 60 分鐘, 每 15 分鐘震盪混合均勻 4. 加入 200 μl Buffer GB 及 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備溶液 ), 關上管蓋, 並翻轉混合均勻, 於 70 C 孵育 10 分鐘, 每 3 分鐘震盪 10 秒, 短暫離心 1.5 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 注意 : 當加入 Buffer GB 時, 可能會有白色沉澱形成, 此沉澱不會影響提取過程, 並於 70 C 加熱孵育時溶解, 如沉澱未溶解, 表示細胞並未裂解完全, 可能導致 DNA 的產量低及含有雜質 5. 加入 200 μl 乙醇 (96-100%), 關上管蓋, 翻轉試管以混合均勻, 短暫離心 1.5 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 注意 : 當加入乙醇時, 可能會有白色沉澱形成, 但並不會影響 DNA 產量 6. 小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液 9. 重複步驟 8 7

9 10. 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 2-5 分鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提高 DNA 的產量, 含有 DNA 的洗提液可再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於水中易受酸水解 操作步驟 <5> 毛囊的基因組 DNA 分離 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 及 Buffer PW 使用前請準備 1 M DTT 溶液 1. 材料處理 : 含有毛囊的頭髮取 250 μl Buffer GA 20 μl Proteinase K 及 20 μl 1 M DTT 至 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 並取頭髮底端約 1 公分長的毛囊至 1.5 ml 離心管中, 震盪混合 10 秒 2. 於 56 C 孵育至少 60 分鐘, 直到樣本完全裂解, 每 20 分鐘震盪 10 秒, 或於震盪式水浴孵育裂解, 短暫離心 1.5 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 注意 : 裂解時間從 1 小時至過夜取決於樣本型態, 裂解過夜並不會 8

10 影響結果 羽毛梗即使裂解過夜也無法完全溶解, 將殘留的羽毛梗樣本直接離心, 取上清液進行後續實驗 3. 加入 300 μl Buffer GB 及 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備溶液 ), 關上管蓋, 並翻轉混合均勻 4. 於 56 C 孵育 10 分鐘, 每 3 分鐘震盪 10 秒 5. 加入 300 μl 乙醇 (96-100%), 關上管蓋, 脈衝式震盪 15 秒以混合均勻, 短暫離心 1.5 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 6. 分兩次小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 9. 重複步驟 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 孵育數分鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15 25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~13, 400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提高 DNA 的產量, 含有 DNA 的洗提液可再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer 9

11 TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於水中易受酸水解 操作步驟 <6> 微量組織的基因組 DNA 分離 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96-100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 及 Buffer PW 1. 加入組織 (<10 mg) 至 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 立即加入 180 μl Buffer GA, 並平衡至室溫 (15-25 C) 2. 加入 20 μl Proteinase K, 震盪混合 10 秒 3. 於 56 C 孵育至少 分鐘, 直到樣本完全裂解, 在此期間, 每 15 分鐘震盪, 或於震盪式水浴孵育裂解, 短暫離心 1.5 ml 離 心管以收集管蓋內的液滴 4. 加入 200 μl Buffer GB 及 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參 閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備溶液 ), 關上管蓋, 翻轉混合均 勻, 於 70 C 孵育 10 分鐘, 每 3 分鐘脈衝式震盪 10 秒, 短暫離 心 1.5 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 5. 加入 200 μl 乙醇 (96-100%) ( 如室溫超過 25 C, 在加入至 1.5 ml 離心管之前, 將乙醇置於冰上冷卻 ), 關上管蓋, 翻轉試管以混 合均勻, 於室溫 (15-25 C) 孵育 5 分鐘, 短暫離心 1.5 ml 離心管 以收集管蓋內的液滴 6. 小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管 中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 10

12 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 9. 重複步驟 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 孵育數分鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提 高 DNA 的產量, 含有 DNA 的洗提液可再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 2 分鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於 水中易受酸水解 操作步驟 <7> 顯微解剖組織的基因組 DNA 分離, 包含福馬林固定的顯微解剖組織 : 確保第一次使用時, 乙醇 (96 100%) 已按照說明加入至 Buffer GD 及 Buffer PW 1. 取 15 μl Buffer GA 至 0.2 ml 離心管, 然後加入顯微解剖組織至 0.2 ml 離心管中 2. 加入 10 μl Proteinase K, 震盪混合 10 秒 3. 於 56 C 孵育 3 小時 ( 福馬林固定的顯微解剖組織於 56 C 孵育 16 小時 ), 並於此期間偶爾震盪, 直到樣本裂解, 或於震盪式水浴孵育裂解, 短暫離心 0.2 ml 離心管以收集管蓋內的液滴 11

13 4. 加入 25 μl Buffer GA, 震盪混合, 加入 50 μl Buffer GB 及 1 μl Carrier RNA 儲備溶液 (1 μg/μl, 請參閱第 2 頁的製備 Carrier RNA 儲備 溶液 ), 關上管蓋, 脈衝式震盪混合 10 秒, 短暫離心 0.2 ml 離心 管以收集管蓋內的液滴 5. 加入 50 μl 乙醇 (96-100%) ( 如室溫超過 25 C, 在加入至離心管之 前, 將乙醇置於冰上冷卻 ), 關上管蓋, 翻轉混合均勻, 於室溫 (15-25 C) 孵育 5 分鐘, 短暫離心 0.2 ml 離心管以收集管蓋內的 液滴 6. 小心移取步驟 5 的所有裂解液至離心管柱 ( 放置於 2 ml 收集管 中 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離 心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 7. 小心打開離心管柱, 加入 500 μl Buffer GD ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 8. 小心打開離心管柱, 加入 600 μl Buffer PW ( 確保使用前已加入乙 醇 ), 不需潤濕邊緣, 關上管蓋, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 30 秒, 倒掉廢液, 將離心管柱重新放回收集管中 9. 重複步驟 將離心管柱重新放回收集管中, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘, 倒掉廢液, 將離心管柱置於室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分 鐘, 使管柱膜完全乾燥 注意 : 此步驟為必需的, 因洗提液殘留乙醇會影響一些下游實驗 11. 將離心管柱放置於乾淨的 1.5 ml 離心管 ( 未提供 ), 加入 μl Buffer TB 至管柱膜中心, 關上管蓋, 在室溫 (15-25 C) 孵育 2-5 分鐘, 於 12,000 rpm (13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 注意 : 洗提體積不應少於 20 μl, 過少的體積會影響回收效率 為提 高 DNA 的產量, 含有 DNA 的洗提液可再次加入至離心管柱, 在室溫 (15-25 C) 孵育管柱 2 分鐘, 於 12,000 rpm (~13,400 x ɡ) 離心 2 分鐘 洗提緩衝液的 ph 值會影響洗提, 建議使用 Buffer TB 或蒸餾水 (ph ) 進行 DNA 洗提, 為長期保存 DNA, 12

14 建議以 Buffer TB 進行洗提, 並儲存於 -20 C, 因 DNA 保存於 水中易受酸水解 13

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