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1 農業環保篇 法規 行政院環境保護署公告 中華民國 99 年 3 月 9 日 環署檢字第 號 主旨 : 公告 水中退伍軍人菌檢測方法 (NIEA W238.50C), 並自九十九年六月十五日起實施 依據 : 行政院環境保護署環境檢驗所組織條例第二條第一款 公告事項 : 方法內容詳如附件 署 長沈世宏 水中退伍軍人菌檢測方法 NIEA W238.50C 一 方法概要水樣經濃縮及酸處理後, 塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養基 (Buffered charcoal yeast extract agar with selective supplements, BCYE with selective supplements), 在二氧化碳培養箱,36 ± 1, 培養 5 ± 2 天, 疑似退伍軍人菌 (Legionella spp.) 的菌落, 應進行半胱氨酸需求試驗 (L-cysteine requirement test) 革蘭氏染色(Gram stain) 及直接螢光抗體染色試驗 (Direct immunofluorescent antibody test,dfa) 或乳膠凝集試驗 (Latex agglutination test) 確認 凡生長於含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基 (BCYE), 但不生長於不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基 (BCYE without L-cysteine) 之菌落, 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌, 無莢膜 不產孢子 短胖型或長絲型, 及直接螢光抗體檢驗或乳膠凝集試驗呈陽性反應者, 即判定為退伍軍人菌陽性菌落 二 適用範圍 ( 一 ) 本方法適用飲用水水質 飲用水之水源水質及水塔冷卻水中退伍軍人菌之檢驗 ( 二 ) 生物安全等級二級以上之實驗室才能進行本方法之檢測 三 干擾 ( 一 ) 水樣中含有抑制或促進退伍軍人菌生長之物質 ( 如水樣中含有消毒劑或營養源會抑制或促進生長 ) 6109

2 ( 二 ) 檢測使用的器皿及設備含有抑制或促進退伍軍人菌生長的物質 ( 如器皿及設備含有清潔劑或營養源會抑制或促進生長 ) ( 三 ) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞, 將影響水樣的濃縮效率, 進而影響檢測結果 ( 四 ) 雜菌過多將遮蔽或抑制退伍軍人菌之生長 四 設備與材料 ( 一 ) 量筒 :100 至 1000 ml 之量筒 ( 二 ) 吸管 : 有 0.1 ml 刻度之 10 ml 滅菌玻璃吸管或市售無菌塑膠吸管, 或無菌微量吸管 (micropipet) ( 三 ) 試管 : 大小約 mm 之試管或有蓋螺旋試管 ( 四 ) 稀釋瓶 : 容量約 100 ml 可滅菌之硼矽玻璃製品 ( 五 ) 錐形瓶 :200 至 2000 ml 之可滅菌硼矽玻璃製品 ( 六 ) 採樣容器 : 容量 500 ml 以上無菌之硼矽玻璃瓶或無菌塑膠有蓋容器, 或市售無菌袋 ( 七 ) 冰箱 : 溫度能保持在 4 ± 2 者 ( 八 ) 培養皿 : 可滅菌硼矽玻璃製或可拋棄式無菌塑膠製培養皿, 大小為 90~ mm 或其他適當大小 ( 九 ) 過濾裝置 : 能耐高溫高壓滅菌的玻璃 塑膠 陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗, 以鎖定裝置 磁力或重力固定於底部 ( 十 ) 抽氣幫浦 : 水壓式或吸氣式, 壓力差最好在 138 至 207 kpa 者 ( 十一 ) 濾膜 : 直徑 47 mm, 孔徑 0.22 μm 的無菌聚碳酸濾膜 (polycarbonate membrane) ( 十二 ) 天平 : 待測物重量大於 2 g 時, 須能精秤至 0.01 g; 待測物重量不大於 2 g 時, 須能精秤至 g ( 十三 ) 二氧化碳培養箱 (CO 2 培養箱 ): 能提供 2.5~5.0% CO 2, 溫度能保持在 36 ± 1 者 ( 十四 ) 高壓滅菌釜 : 溫度能維持在 121 ( 壓力約 15 lb / in 2 或 1.1 Kg / cm 2 ) 滅菌 15 分鐘以上者 ( 十五 ) 高溫乾熱烘箱 : 如用於玻璃器皿等用具之滅菌, 溫度須能保持在 160 達 2 小時或 170 達 1 小時以上者 ( 十六 ) 加熱板 : 可調溫度, 並附磁石攪拌功能 ( 十七 ) 鑷子 : 前端平滑 內側無波紋, 使用前浸泡於 95% 酒精再以火燄燃燒滅菌 ( 十八 ) 接種環 : 為白金或鎳鉻合金製, 適用於細菌接種或移植, 亦可使用無菌塑膠製品 ( 十九 ) 水浴槽 : 溫度能保持在約 50 者 ( 二十 ) 第二級生物安全櫃 (Class Ⅱ BSC) ( 二十一 ) ph 計 :ph 計之精密度必須達到 0.1 ph 單位 用於內含瓊脂培養基之 ph 值測定時, 應搭配表面電極 (surface probe) ( 二十二 ) 解剖顯微鏡 : 能放大 10~20 倍 ( 二十三 ) 光學顯微鏡 : 能放大至 1000 倍油鏡 ( 二十四 ) 螢光顯微鏡 : 能放大至 1000 倍 6110

3 ( 二十五 ) 紫外光燈 : 波長 365 nm ( 二十六 ) 試管震盪器 (Vortex mixer) ( 二十七 ) 馬克法藍氏濁度標準計 (McFarland nephelometer standard units) ( 二十八 ) 玻片及蓋玻片 : 光學染色及螢光染色專用兩種 ( 二十九 ) 乳膠或 PVC 手套 ( 三十 ) 離心機 : 轉速可達 3000 g,30 分鐘以上, 能控制溫度在 4 ± 2 者 ( 三十一 ) 離心管 :10~50 ml, 具螺紋蓋為佳 五 試劑 ( 一 ) 試劑水 : 蒸餾水或去離子水, 導電度在 25 時小於 2 μmho / cm(μs / cm) ( 二 ) 0.2 M HCl: 配製方法可任選下列任一種方式 ( 用於配製 HCl-KCl 酸性緩衝液 ) 1 取 17.4 ml 35.4% 濃鹽酸 ( 試藥級 )( 比重 1.18), 加試劑水至 1 L 2 取 20.0 ml 31.5% 濃鹽酸 ( 試藥級 )( 比重 1.16), 加試劑水至 1 L ( 三 ) 0.2 M KCl:( 用於配製 HCl-KCl 酸性緩衝液 ) 秤取 g KCl( 試藥級 ), 先溶於少量試劑水中, 俟完全溶解後, 再加試劑水至全量為 1 L ( 四 ) 1 N HCl: 配製方法可任選下列任一種方式 ( 用於調整培養基之 ph 值 ) 1 取 8.8 ml 35.4% 濃鹽酸 ( 試藥級 )( 比重 1.18), 加試劑水至 100 ml 2 取 10.0 ml 31.5% 濃鹽酸 ( 試藥級 )( 比重 1.16), 加試劑水至 100 ml ( 五 ) 1 N KOH:( 用於調整培養基之 ph 值 ) 秤取 5.6 g KOH( 試藥級 ), 先溶於少量試劑水中, 俟完全溶解後, 再加試劑水至全量為 100 ml ( 六 ) 1 倍磷酸鹽緩衝液 :( 用於直接螢光抗體檢驗 ) 磷酸二氫鉀 (KH 2 PO 4 )( 試藥級 ) 2 g 氯化鉀 (KCl)( 試藥級 ) 2 g 氯化鈉 (NaCl)( 試藥級 ) 80 g 磷酸氫二鈉 (Na 2 HPO 4 )( 試藥級 ) 11.5 g 配製方法 : 將以上成分混合, 先溶於少量試劑水中, 俟完全溶解後, 再加試劑水至全量為 1 L ( 七 ) 1% 甲醛 ( 福馬林 ):( 用於直接螢光抗體檢驗 ) 取 2.67 ml 37.5% 福馬林 ( 試藥級 ), 加 1 倍磷酸鹽緩衝液至 100 ml ( 八 ) 3% 硫代硫酸鈉 : 取 3 g 無水硫代硫酸鈉 ( 試藥級 ), 先溶於少量試劑水中, 俟完全溶解後, 再加試劑水至全量為 100 ml ( 九 ) 培養基 1 活性碳酵母萃取物培養基 : 由下列 I II III 等成份配製而成 ( 用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗 菌株純化及次培養 ) I 基礎活性碳酵母萃取物培養基 (BCYE agar base)( 市售商品化培養基 ) 6111

4 酵母萃取物 (Yeast extract) 10.0 g 活性碳 (Activated charcoal) 2.0 g α- 酮戊二酸 (Alpha-ketoglutarate) 1.0 g 乙醯胺基 -2- 氨基乙磺酸 (ACES) 10.0 g (N-2-acetamido-2-aminoethanesulfonic acid) 焦磷酸鐵 (Ferric pyrophosphate) 0.25 g 瓊脂 (Agar) 15.0 g II 氫氧化鉀 (KOH)( 試藥級 ) 2.4 g III 半胱氨酸 (L-cysteine)( 試藥級 ) 0.4 g 配製方法 : 秤取 BCYE agar base g 溶於 500 ml 的試劑水中, 秤取氫氧化鉀 2.4 g 溶於 490 ml 的試劑水中, 混合兩者, 俟完全溶解後, 以 121 滅菌 15 分鐘, 冷 卻至約 50 備用 秤取半胱氨酸 0.4 g 溶於 10 ml 的試劑水中, 俟完全溶解後, 以 0.22 µm 或 0.45 µm 濾膜過濾除菌 兩者充份混合後, 以 1 N HCl 或 1 N KOH 調整 ph 值, 先倒出小部份培養基, 待凝固後以表面電極測定, 培養基最終 ph 值應為 6.9 ± 0.1 倒入約 20 ml 之培養基於無菌培養皿中, 室溫下凝固 未用完之培養基可保存於 冰箱中,4 ± 2 下保存期限為 30 天 2 不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養基 : 由下列 I II 等成份配製而成 ( 用於疑似退伍 軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗 ) I 基礎活性碳酵母萃取物培養基 ( 市售商品化培養基 ) 酵母萃取物 10.0 g 活性碳 2.0 g α- 酮戊二酸 1.0 g 乙醯胺基 -2- 氨基乙磺酸 10.0 g 焦磷酸鐵 0.25 g 瓊脂 15.0 g II 氫氧化鉀 ( 試藥級 ) 2.4 g 配製方法 : 秤取 BCYE agar base g 溶於 500 ml 的試劑水中, 秤取氫氧化鉀 2.4 g 溶於 500 ml 的試劑水中, 混合兩者, 俟完全溶解後, 以 121 滅菌 15 分鐘, 冷 卻至約 50, 以 1 N HCl 或 1 N KOH 調整 ph 值, 先倒出小部份培養基, 待凝固後以 表面電極測定, 培養基最終 ph 值應為 6.9 ± 0.1 倒入約 20 ml 之培養基於無菌培養 皿中, 室溫下凝固 未用完之培養基可保存於冰箱中,4 ± 2 下保存期限為 30 天 本培養基可以血液瓊脂培養基 (Blood agar) 替代 3 血液瓊脂培養基 (Blood agar)( 市售商品化培養基 ): 即胰蛋白大豆瓊脂培養基 (Tryptic soy agar) 添加 5% 馬或綿羊血 (Horse or sheep blood):( 用於疑似退伍軍人菌 菌落之半胱胺酸需求試驗 ) 胰化蛋白腖 (Tryptone) 15.0 g 6112

5 大豆蛋白腖 (Soytone) 或硫化蛋白腖 (Thiopeptone) 5.0 g 氯化鈉 (NaCl) 5.0 g 瓊脂 (Agar) 15.0 g 蒸餾水 (Distilled water) 加至 950 ml 馬或綿羊血 (Horse or sheep blood) 50 ml 配製方法 : 秤取培養基 40g, 溶於 950 ml 的試劑水中, 經 121 滅菌 15 分鐘後, 冷卻至約 50, 在無菌環境下加入 50 ml 馬或綿羊血, 充分混合後, 倒入約 20 ml 之培 養基於無菌培養皿中, 室溫下凝固 未用完之培養基可保存於冰箱中,4 ± 2 下保存期 限為 30 天 4 活性碳酵母萃取物選擇性培養基 : 可選用以下選擇性培養基任一種 (1) DGVP 選擇性培養基 : 由下列 I II III IV 等成份配製而成 (BCYE with Dye, Glycine, Vancomycin, Polymyxin B)( 用於篩選水樣中之退伍軍人菌 ) I 基礎活性碳酵母萃取物培養基 ( 市售商品化培養基 ) 酵母萃取物 10.0 g 活性碳 2.0 g α- 酮戊二酸 1.0 g 乙醯胺基 -2- 氨基乙磺酸 10.0 g 焦磷酸鐵 0.25 g 瓊脂 15.0 g II 氫氧化鉀 ( 試藥級 ) 2.4 g III 半胱氨酸 ( 試藥級 ) 0.4 g IV DGVP 染料及抗生素添加劑 ( 市售商品化抗生素添加劑 ) Glycine 3.0 g Vancomycin 1 mg Polymycin B IU Bromocresol purple 10 mg Bromothymol blue 10 mg 配製方法 : 秤取 BCYE agar base g 溶於 500 ml 的試劑水中, 秤取氫氧化鉀 2.4 g, 溶於 480 ml 的試劑水中, 混合兩者, 俟完全溶解後, 以 121 滅菌 15 分鐘, 冷卻至約 50 備用 秤取半胱氨酸 0.4 g 溶於 10 ml 的試劑水中, 俟完全溶解後, 以 0.22 µm 或 0.45 µm 濾膜過濾除菌 取 1 管市售之 DGVP 染料及抗生素添加劑溶於 10 ml 的試劑水中, 俟完全溶解後, 以 0.22 µm 或 0.45 µm 濾膜過濾除菌 三者充份混合 後, 以 1 N HCl 或 1 N KOH 調整 ph 值, 先倒出小部份培養基, 待凝固後以表面電極 測定, 培養基最終 ph 值應為 6.9 ± 0.1 倒入約 20 ml 之培養基於無菌培養皿中, 室 溫下凝固 未用完之培養基可保存於冰箱中,4 ± 2 下保存期限為 30 天 (2) CCVC 選擇性培養基 : 由下列 I II III IV 等成份配製而成 (BCYE with Cephalothin, 6113

6 Colistin, Vancomycin, Cycloheximide)( 用於篩選水樣中之退伍軍人菌 ) I 基礎活性碳酵母萃取物培養基 ( 市售商品化培養基 ) 酵母萃取物 10.0 g 活性碳 2.0 g α- 酮戊二酸 1.0 g 乙醯胺基 -2- 氨基乙磺酸 10.0 g 焦磷酸鐵 0.25 g 瓊脂 15.0 g II 氫氧化鉀 ( 試藥級 ) 2.4 g III 半胱氨酸 ( 試藥級 ) 0.4 g IV CCVC 抗生素添加劑 ( 市售商品化抗生素添加劑 ) Cycloheximide 80 mg Colistin 16 mg Vancomycin 0.5 mg Cephalothin 4 mg 配製方法 : 秤取 BCYE agar base g 溶於 500 ml 的試劑水中, 秤取氫氧化鉀 2.4 g, 溶於 480 ml 的試劑水中, 混合兩者, 俟完全溶解後, 以 121 滅菌 15 分鐘, 冷卻至約 50 備用 秤取半胱氨酸 0.4 g 溶於 10 ml 的試劑水中, 俟完全溶解後, 以 0.22 µm 或 0.45µm 濾膜過濾除菌 取 1 管市售之 CCVC 抗生素添加劑溶於 10 ml 的試劑水中, 俟完 全溶解後, 以 0.22 µm 或 0.45 µm 濾膜過濾除菌 三者充份混合後, 以 1 N HCl 或 1 N KOH 調整 ph 值, 先倒出小部份培養基, 待凝固後以表面電極測定, 培養基最終 ph 值 應為 6.9 ± 0.1 倒入約 20 ml 之培養基於無菌培養皿中, 室溫下凝固 未用完之培養基可 保存於冰箱中,4 ± 2 下保存期限為 30 天 ( 十 ) HCl-KCl 酸性緩衝液 (Acid buffer): 以 0.2 M HCl 調整 0.2 M KCl 之 ph 值為 2.2 ± 0.1 經 121 滅菌 15 分鐘後, 儲存於 冰箱中備用 4 ± 2 下保存期限為 30 天 ( 十一 ) 無菌稀釋液 : 不建議使用含鹽類之緩衝液 1 水樣以 0.22 µm 或 0.45 µm 濾膜過濾之過濾水 如欲用於水樣 10 倍序列稀釋, 分裝之 體積須為 90 ± 2.0 ml 4 ± 2 下保存期限為 3 個月 2 0.1% 蛋白腖 (Peptone) 溶液 : 秤取蛋白腖 ( 試藥級 )1 g 溶於 1 L 試劑水水中, 俟完全溶解後, 以 121 滅菌 15 分鐘, 置於 48 ± 2 的水浴槽中冷卻, 冷卻後分裝適量之蛋白腖溶液於稀釋瓶中, 作 為無菌稀釋液用 如欲用於水樣 10 倍序列稀釋, 分裝的無菌稀釋液滅菌後之體積須為 90 ± 2.0 ml 4 ± 2 下保存期限為 3 個月 ( 十二 ) 75% 酒精:消毒擦拭用 ( 十三 ) 革蘭氏染劑 : 市售商品化試劑, 含有結晶紫染劑 (Crystal violet) 革蘭氏碘液媒染劑 6114

7 (Gram iodine) 脫色劑(Decolorizer) 及碳酸複紅染劑 (Carbolfuchsin) 等四劑 ( 十四 ) 退伍軍人菌直接螢光抗體檢驗試劑組 備註 1 : 內含有 FITC 螢光標定, 對退伍軍人菌有專一性之單一及多價抗體 (Monospecific conjugates and Panvalent conjugates) 1 倍之磷酸鹽緩衝液 (1 x PBS) 封片膠(Mounting media) ( 十五 ) 退伍軍人菌乳膠凝集試驗試劑組 備註 2 : 內含有吸附抗體的藍色乳膠粒子, 包括抗 Legionella pneumophila serogroup 1 antigen 抗體乳膠粒子 抗 Legionella pneumophila serogroup 2~14 antigen 抗體乳膠粒子 抗 Legionella species 及 serotypes 抗體乳膠粒子 陽性對照菌液 (Positive control suspension ) 陰性對照菌液(Negative control suspension) 1 倍磷酸鹽緩衝溶液 凝集試驗紙卡 (agglutination reaction cards) 六 採樣及保存 ( 一 ) 採集適量水樣, 一般建議 100~1000 ml 採水樣時應使用清潔並經滅菌之玻璃或塑膠容器或市售無菌採樣袋, 且於採樣時應避免受到污染 水樣若含有餘氯時, 無菌容器中應加入適量之硫代硫酸鈉 ( 採取含氯之飲用水及冷卻水塔之冷卻水水樣時, 每 100 ml 之水樣加入 0.1 ml 之 3% 硫代硫酸鈉, 可中和之餘氯量約為 5 mg/l) ( 二 ) 飲用水及飲用水水源採樣方法, 請依據環保署公告方法, 飲用水水質採樣方法 - 自來水系統 (W101) 監測井地下水採樣方法(W103), 及河川 湖泊及水庫水質採樣通則 (W104) 執行採樣 ( 三 ) 冷卻水塔採樣 : 運行中之冷卻水塔, 採集滴落之水樣 無運轉之冷卻水塔, 則將無菌容器及採樣袋沉入水面下約 10 公分逕行採樣, 但應避免採集過多的沉積物 ( 四 ) 採樣前應清潔手部, 再行採水樣, 所採水樣應具有代表性 ( 五 ) 運送時水樣溫度應維持在小於 10 且不得凍結, 而實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2 ( 六 ) 水樣應於採樣後 24 小時內完成水樣塗抹步驟 ( 七 步驟 ( 三 )), 並置入培養箱中培養 ( 七 ) 若採樣時有吸入含退伍軍人菌水霧之虞者, 宜佩戴適當呼吸防護具 七 步驟 ( 一 ) 水中退伍軍人菌含量高, 直接以活性碳酵母萃取物選擇性培養基進行檢測, 水中退伍軍人菌含量低則應先行濃縮, 因為水樣濃度未知, 一般建議水樣先進行濃縮, 濃縮方式可以濾膜法或離心法實施, 水樣濁度高應以離心法進行水樣濃縮 1 濾膜法: 過濾前水樣必須劇烈搖晃 25 次以上, 以使樣品充分混合均勻 以無菌鑷子夾起無菌濾膜, 放在無菌過濾裝置之有孔平板上, 小心將漏斗固定, 將過濾裝置接上抽氣幫浦 加入適量無菌蒸餾水, 以測定過濾設備是否裝置妥當 取適量水樣進行過濾, 過濾後再以 20~30 ml 之無菌稀釋液 五 ( 十一 )1 或 2 沖洗漏斗, 沖洗過濾後, 解開真空裝置, 將漏斗移開, 儘速以無菌鑷子取出過濾後之濾膜置於離心管內 ( 亦可將濾膜以無菌剪刀剪成碎片後置入離心管 ), 加入適量無菌稀釋液使成 10 倍濃縮水樣, 並確認液體能全部覆蓋濾膜, 以試管震盪器劇烈震盪 3~5 分鐘, 懸浮液即為 10 倍過濾濃縮後之樣品 2 離心法: 取適量水樣加入離心管內, 以 6000 g 離心 10 分鐘以上, 或以 3000 g 離心 30 分 6115

8 鐘以上, 上清液應以吸管吸取丟棄, 不可將離心管以倒置之方式去除上清液, 上清液取完後加入適量無菌稀釋液使成 10 倍濃縮水樣, 以試管震盪器劇烈震盪, 使離心沉澱物 (pellet) 均勻分布於溶液中, 懸浮液即為離心法 10 倍濃縮後之樣品 ( 二 ) 水樣經濃縮後, 非退伍軍人菌之微生物也一併被濃縮, 微生物彼此競爭及抑制的情況下, 雜菌將會影響退伍軍人菌之生長, 所以應先將濃縮水樣進行酸處理去除雜菌, 再以活性碳酵母萃取物選擇性培養基進行檢測 酸處理之做法 : 取 1 份上述 ( 七 ( 一 )1 濾膜法) 或 ( 七 ( 一 )2 離心法) 之 10 倍濃縮水樣, 加 1 份 HCl-KCl 酸性緩衝液, 在室溫下作用 3~5 分鐘, 酸處理後之樣品應立即塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養基中 ( 三 ) 取 0.1 ml 原液 ( 上述七 ( 二 ) 之 10 倍濃縮酸處理水樣 ), 或 10 倍序列稀釋各稀釋度之水樣, 滴在 BCYE 選擇性培養基中, 將無菌之彎曲玻璃棒放在培養基上, 再用手或旋轉桌 (turn table) 旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面 水樣皆需進行二重複 ( 四 ) 倒置培養皿於二氧化碳培養箱中, 在 2.5~5.0% CO 2,36 ± 1 下, 培養 5 ± 2 天 ( 培養期間應於培養箱底部放置水盤, 以提供培養環境必要之溼度 ) ( 五 ) 培養完成後應以解剖顯微鏡進行菌落觀察, 典型菌落圓形邊緣平滑 白色或白灰色半透明具毛玻璃外觀, 但有些菌株呈藍白 藍灰 藍綠 藍紅 淡綠 淡紅或棕色菌落 在波長 365 nm 的紫外燈下觀察, 有些菌株產生藍綠色自發螢光, 有些菌株產生藍白色 紅色自發螢光, 具有上述特徵之菌落均屬退伍軍人菌疑似菌落 (Legionella-like organisms), 應進行半胱胺酸需求試驗 ( 六 ) 半胱胺酸需求試驗 : 首先用無菌接種環挑取疑似菌落, 以三區 ( 或四區 ) 劃線之方式接種於 BCYE 培養基, 進行純化, 倒置培養皿於二氧化碳培養箱中, 在 2.5~5.0% CO 2,36 ± 1 下, 培養 48 ± 3 小時, 觀察菌落之顏色及外觀判定是單一菌株後, 取一個菌落劃線於不含半胱胺酸之 BCYE 培養基 ( 可以血液瓊脂培養基代替不含半胱胺酸之 BCYE 培養基 ), 培養條件同純化培養, 結果陽性退伍軍人菌株應於 BCYE 培養基生長, 且不含半胱胺酸之 BCYE 培養基 ( 或血液瓊脂培養基 ) 不生長 陽性菌株需再進行改良式革蘭氏染色及直接螢光抗體染色檢驗確認 ( 七 ) 改良式革蘭氏染色 1 抹片製作: 挑取 BCYE 培養基上之疑似菌落, 於載玻片上製成薄抹片, 風乾並過火數次固定 2 初染 : 將已固定之抹片, 用結晶紫染劑染 1 分鐘, 水洗 5 秒鐘 3 媒染 : 加革蘭氏碘液媒染劑 (Gram iodine) 染 1 分鐘, 水洗 5 秒鐘 4 脫色 : 用脫色劑洗至不再有紫色褪出, 數秒即可, 水洗 5 秒鐘 5 複染 : 用碳酸複紅染劑染 30 秒鐘, 水洗 5 秒鐘 6 自然風乾 7 以光學顯微鏡鏡檢, 觀察是否為革蘭氏陰性桿菌, 無莢膜 不產孢子 短胖型或長絲型 ( 八 ) 直接螢光抗體檢驗法 6116

9 1 抹片製作 : 以無菌棉花棒或無菌接種環挑取若干單一菌落, 溶於 1% 福馬林中, 製成濃度為 McFarland No.1 的懸浮液 ( 約 CFU/mL), 將菌液滴入螢光染色專用玻片之圓圈內, 吸去多餘菌液, 自然風乾並過火固定 2 螢光抗體染色先以多價抗體及陰性對照組抗體進行篩選, 若多價抗體篩選為陽性反應, 且陰性對照組抗體篩選為陰性反應時, 再以合適之單一抗體進行確認 (1) 製備對照組抗原 : 將對照組抗原劇烈搖晃混勻後, 滴入螢光染色專用玻片之圓圈內, 吸去多餘菌液, 自然風乾並過火固定 可與菌株抹片同時製作 (2) 將多價抗體共軛物或單一抗體共軛物滴至每個樣品及相對應之對照組抗原 每個樣品皆須進行一個陰性對照組 (3) 室溫作用 20 分鐘 (4) 用磷酸鹽緩衝液輕輕沖洗以除去未鍵結之抗體或將玻片浸入磷酸鹽緩衝液泡 15 分鐘 (5) 用蒸餾水沖洗, 自然風乾 (6) 加一滴封片膠, 蓋上蓋玻片, 圓圈中應避免有氣泡產生, 以免妨礙鏡檢 (7) 以螢光顯微鏡鏡檢, 先用低倍物鏡 (10X) 觀察, 見到標的菌株後再轉至高倍 (40X), 可再以 100X 油鏡確認結果 3 結果判定 : 由鏡檢中可見到退伍軍人菌為單一桿狀, 同時出現非常亮的螢光 (3+~4+), 則認定為陽性結果 2+ 以下之螢光強度, 則判定為陰性反應 退伍軍人菌細胞壁螢光強度定義 4+ 菌體被染上非常耀眼之黃綠色 3+ 亮黃綠色 2+ 可觀察到但是有點模糊之染色 1+ 可觀察到但是很微弱之染色 - 沒有任何菌體出現黃綠色但是可能出現黃褐色之背景值 ( 九 ) 乳膠凝集試驗 1 取出相關乳膠試劑回溫 將乳膠懸浮液劇烈振盪充份混合均勻 2 在凝集試驗紙卡之四個圓圈內一角各滴一滴乳膠試劑 (latex reagent)( 四瓶分滴四個圓圈中 ) 3 在四個圓圈中另一角各加入一滴磷酸鹽緩衝液, 注意不要碰到乳膠試劑 4 使用接種環挑出可疑菌落 ( 至少 1 mm, 若菌落太小則 2 個或多個 ) 各與磷酸鹽緩衝液混合均勻 若待檢測之分離株為絲狀且粘稠則以接種環挑選 4-10 個相似菌株置入含 0.4 ml 0.85% 生理食鹽水試管 ( 或微量離心管 ) 中, 以振盪器劇烈混合 5 秒鐘後取 1 滴使用 ( 不必再加磷酸鹽緩衝液 ) 5 用接種環或牙籤將圓圈內兩種液體混合均勻, 塗布於整個圓圈內 6 將試驗紙以圓形旋轉方式輕輕搖勻一分鐘 6117

10 7 觀察凝集結果以判定血清型別 若藍色乳膠粒子在一分鐘內凝集且對照組 (control latex) 的圓圈內無凝集反應即判為陽性, 陽性結果表示所偵測的菌落含有該種血清型抗原 若藍色乳膠粒子在一分鐘以上仍沒有凝集反應且維持均勻藍色懸浮液, 即判為陰性 8 嗜肺性退伍軍人菌第 1 型試驗 (Legionella pneumophila serogroup 1 test) 嗜肺性退伍軍人菌第 2~14 型試驗 (Legionella pneumophila serogroup 2-14 test) 及退伍軍人菌屬其他菌種試驗 (Legionella species test) 均為陰性之菌落, 應進一步以直接螢光抗體試驗 ( 七步驟 ( 八 )), 進行退伍軍人菌屬 ( 非嗜肺性退伍軍人菌 ) 其他菌種之檢測, 均為陰性才能判定為非退伍軍人菌菌落 9 實驗完畢之凝集試驗紙卡應以高溫高壓滅菌處理 八 結果處理 ( 一 ) 退伍軍人菌陽性判定標準 : 將七 ( 五 ) 退伍軍人菌疑似菌落, 經半胱胺酸需求試驗 革蘭氏染色及直接免疫螢光抗體檢驗或乳膠凝集試驗, 均符合退伍軍人菌陽性反應之結果, 即判定為退伍軍人菌 ( 二 ) 每一培養皿之退伍軍人菌疑似菌落, 依據菌落形態 顏色及自發螢光加以歸類, 每一類至少挑選 3 個菌落 ( 不足 3 個菌落者全選 ), 進行八 ( 一 ) 陽性判定, 依挑選菌落數之陽性比例, 回推計算該類陽性菌落數 備註 3 某一類退伍軍人菌陽性菌落數 = 疑似菌落數 陽性菌落數挑選出進行陽性測試菌落數 ( 三 ) 加總每一類之陽性確認菌落數, 即為該培養皿之退伍軍人菌總數 ( 四 ) 以含 30 至 300 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數, 二重覆的兩個培養皿菌落數相加計算其平均值, 單位以菌落數 (CFU)/ ml ) 表示, 計算公式如下 : 培養皿陽性菌落數之總合退伍軍人菌濃度 (CFU / ml)= 取出塗抹之水樣體積總合 10 2 X + Y = / D + 0.1/ D X Y 代表 D 稀釋度的兩個培養皿之菌落數 D 代表 10 倍濃縮水樣的稀釋度 ( 五 ) 培養皿之菌落數不在 30 至 300 個菌落之間時, 則依菌落數實際數目以下列方式處理 : 1 若原液及各稀釋水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數在 30 至 300 個之間, 則以上述公式計算之 2 若原液培養皿中均無菌落生長, 則菌落數以小於 1(<1) 表示 ; 若僅原液有菌落產生且少於 30 個, 亦應計數菌落數 3 若各培養皿之菌落數均不在 30 至 300 個之間, 則選取最接近 300 個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算 ( 六 ) 數據表示 : 未檢出表示計算所得之菌落數小於 1, 以 <1 表示; 菌落數小於 100 時, 以 6118

11 整數表示 ( 小數位數四捨五入 ), 菌落數大於 100 以上時, 只取兩位有效數字, 例如菌落數為 142 時以 表示之, 菌落數 155 時以 表示之, 菌落數為 時以 表示 ( 七 ) 檢測紀錄須註明採樣時間 培養起始及終了時間 培養基名稱 培養溫度及各稀釋度的原始數據等相關資料 九 品質管制 ( 一 ) 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識 ( 二 ) 每批次採樣時, 應進行運送空白 ( 三 ) 每批次或每十個水樣需進行試劑空白實驗 ( 四 ) 用於結果計算之二重複數據, 其對數差異值不可超出精密度管制參考範圍 ( 計算方式參考 環境微生物檢測通則 細菌 (NIEA E101) ), 除非二重複之菌落數均小於 20 ( 五 ) 為確保培養基的品質, 應使用市售商品化之培養基進行配備, 不可依據藥品成分自行調配 每批次新製備的培養基 ( 活性碳酵母萃取物培養基及活性碳酵母萃取物選擇性培養基 ), 應以陽性菌株 如 Legionella pneumophila(bcrc 17854) 進行測試, 確認培養出來的微生物菌落大小及數量, 與先前使用的培養基一致 ( 同一樣品使用前後兩批培養基分別進行測試, 結果之對數差異值應落於精密度管制參考範圍內 ) 另活性碳酵母萃取物選擇性培養基每季應再以陰性控制菌株 如 Staphylococcus epidermidis(bcrc 10785) 測試, 以確保添加之抗生素仍有藥效 ( 沒有失效 ) ( 六 ) 本方法培養所得之細菌可能具有感染性, 檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理 十 精密度及準確度 略十一 參考資料 ( 一 ) 衛生署疾病管制局 傳染病標準檢驗方法手冊,2006 ( 二 ) Allegheny County Health Department, Pittsburgh, Pennsylvania. Approaches to prevention and control Legionella infection ( 三 ) APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9260 J. Legionella. American Public Health Association, Washington, D.C., ( 四 ) AS/NZS Waters - Examination for legionellae including Legionella pneumophila. Australian/New Zealand Standard TM ( 五 ) ISO Water quality-detection and enumeration of Legionella. International Organization for Standardization, Switzerland ( 六 ) Mietzner, S. M. and Stout, J. E. Laboratory Detection of Legionella in Environmental Samples. Clinical Microbiology Newsletter Vol. 24, No. 11. p81~85. Special Pathogens Laboratory, Pittsburgh Veterans Affairs Hearth Care System, Pittsburgh, Pennsylvania ( 七 ) TA, A. C., STOUT, J. E., YU, V. L., and WAGENER, M. M. Comparison of Culture Methods for Monitoring Legionella Species in Hospital Potable Water Systems and Recommendations or 6119

12 Standardization of Such Methods. Journal of Clinical Microbiology Vol. 33, p Veterans Affairs Medical Center and University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania ( 八 ) USEPA. Legionella: human health criteria document. EPA~822~R~99~ ( 九 ) Su, H. P., Tung, S. K., Tseng, L. R., Tsai, W. C., Chung,T. C.,Tsung, C. C. Identification of Legionella species by use of an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 47, No. 5, p , 十二 附錄退伍軍人菌檢測流程圖 6120

13 備註 1 退伍軍人菌直接螢光抗體檢驗法至少應能檢測出以下菌種 (species)33 種血清型水體 中常見且曾經造成人體致病之菌株 編號 種類 血清型 編號 種類 血清型 1 Legionella pneumophila 1~14 9 Legionella jordanis 1 2 Legionella bozemanii 1~2 10 Legionella oakridgensis 1 3 Legionella longbeachae 1~2 11 Legionella wadsworthii 1 4 Legionella feeleii 1~2 12 Legionella sainthelensi 1 5 Legionella hackeliae 1~2 13 Legionella anisa 1 6 Legionella dumoffii 1 14 Legionella santicrucis 1 7 Legionella gormanii 1 15 Legionella maceachernii 1 8 Legionella micdadei 1 16 Legionella parisiensis 1 備註 2 退伍軍人菌乳膠凝集試驗法至少應能檢測出以下 8 菌種 (species)25 種血清型之菌株 編號 種類 血清型 編號 種類 血清型 1 Legionella pneumophila 1~14 9 Legionella jordanis 1 2 Legionella bozemanii 1~2 10 Legionella micdadei 1 3 Legionella longbeachae 1~2 11 Legionella anisa 1 4 Legionella dumoffii 1 12 Legionella gormanii 1 8 Legionella micdadei 1 16 Legionella parisiensis 1 註 : 檢測結果若為陰性, 應進一步以直接螢光抗體試驗 ( 七 步驟 ( 八 )), 進行退伍軍人菌屬 ( 非 嗜肺性退伍軍人菌 ) 其他菌種之檢測 6121

14 備註 3 本方法八 ( 二 ) 退伍軍人菌陽性菌落數計數範例說明依據八 ( 一 ) 判定陽性退伍軍人菌疑似隨機挑選進行八 區分與陰性菌落數菌落數 ( 一 ) 陽性判定菌落數陽性陰性 退伍軍人菌陽性確認菌落數 第 1 類 /3 =120 第 2 類 /3 =60 第 3 類 /3 29 第 4 類 /2 =1 合計 退伍軍人菌陽性菌落總數 = =210 菌落數 6122

15 附錄 退伍軍人菌檢測流程圖 水樣 濁度高 濾膜法過濾濃縮七 步驟 ( 一 )1 離心法濃縮 七 步驟 ( 一 )2 酸處理 - 去除雜菌七 步驟 ( 二 ) 初步培養, 在二氧化碳培養箱 35~37, 培養 3~7 天 七 步驟 ( 三 四 ) 非疑似菌落 以解剖顯微鏡觀察七 步驟 ( 五 ) 疑似菌落 非退伍軍人菌屬 半胱胺酸需求試驗七 步驟 ( 六 ) 菌株不生長 菌株生長 革蘭氏染色七 步驟 ( 七 ) 非退伍軍人菌屬 乳膠凝集試驗七 步驟 ( 九 ) 直接螢光抗體檢驗七 步驟 ( 八 ) 結果處理 : 陽性判定標準計算菌落數 濃度及數據表示八 結果處理 ( 一 )~( 四 ) 6123

16 行政院環境保護署公告 中華民國 99 年 3 月 9 日 環署檢字第 號 主旨 : 公告 空氣粒狀污染物中元素含量檢測方法 - 感應耦合電漿原子發射光譜法 (NIEA A306.10C), 並自九十九年六月十五日起實施 依據 : 空氣污染防制法第四十四條第三項 公告事項 : 方法內容詳如附件 署 長沈世宏 空氣粒狀污染物中元素含量檢測方法 - 感應耦合電漿原子發射光譜法 NIEA A306.10C 一 方法概要本方法係以高量採樣器 PM 10 或 PM 2.5 採樣器, 將空氣粒狀物採集於濾紙上, 再將濾紙經微波消化或熱酸萃取前處理程序, 使樣品溶解或消化後, 以感應耦合電漿原子發射光譜法 (Inductively Coupled Plasma(ICP-AES)Spectrometry), 測定粒狀物中各待測元素之含量 二 適用範圍本方法適用於檢測大氣及周界中粒狀污染物之鋁 (Al) 砷 (As) 金(Au) 硼 (B) 鋇(Ba) 鈹(Be) 鉍(Bi) 鈣(Ca) 鎘(Cd) 鈰(Ce) 鈷(Co) 鉻 (Cr) 銅(Cu) 鐵(Fe) 鍺(Ge) 汞(Hg) 銦(In) 鉀(K) 鑭(La) 鋰 (Li) 鎂(Mg) 錳(Mn) 鉬(Mo) 鈉(Na) 鈮(Nb) 鎳(Ni) 磷(P) 鉛 (Pb) 鈀(Pd) 鉑(Pt) 錸(Re) 銠(Rh) 釕(Ru) 銻(Sb) 硒(Se) 矽 (Si) 釤(Sm) 錫(Sn) 鍶(Sr) 鉭(Ta) 碲(Te) 鈦(Ti) 鉈(Tl) 釩 (V) 鎢(W) 釔(Y) 鋅(Zn) 鋯(Zr) 等 48 種元素分析, 預估方法偵測極限詳如表一 ( 註 1) 三 干擾 ( 一 ) 光譜干擾 (Spectral Interferences): 光譜性干擾的產生原因, 主要係經由 (1) 連續光譜放射或再結合等現象所產生的背景發射譜線 (2) 高濃度元素發射譜線所導致的迷光 (3) 其它共存元素對分析元素之特定波長譜線所造成的譜線重疊 (4) 分子波段連續譜線的重疊等因素所造成 表二為各元素分析時所採用之建議波長以減低光譜干擾, 其干擾影響因子詳如表三 ( 二 ) 基質干擾 (Matrix Interference): 基質干擾主要來自於樣品及標準品之內部基質差異性, 在配製樣品及標準品時其所使用之酸的類型及量的不同也是造成基質干擾的原因, 因此在整個實驗過程中, 調製標準品 QC 溶液及樣品的過程中均需非常小心及仔細 ( 三 ) 其餘干擾請參閱 感應耦合電漿原子發射光譜法 (NIEA M104) 及 水中金屬及微量元素檢測方法 - 感應耦合電漿原子發射光譜法 (NIEA W311) 6124

17 四 設備與材料 ( 一 ) 採樣各別參照 空氣中粒狀污染物檢測法 - 高量採樣法 (NIEA A102) 之四 設備與材料, 空氣中懸浮微粒(PM 2.5 ) 之檢測方法 - 衝擊式手動法 (NIEA A205) 之四 設備與材料 ( 一 ) 至 ( 十 ) 或 大氣中懸浮微粒 PM 10 之檢測方法- 手動法 (NIEA A208) 之四 設備與材料 ( 一 ) 至 ( 三 ) ( 二 ) 微波消化 1 微波消化系統 : 必須具有程式功率 溫度控制設定之功能 2 碳氟化合物材質 (PFA Teflon 或同級材質 ) 之消化容器 : 需具有壓力監測及洩壓閥之裝置, 消化瓶至少可承受 120 psi 的壓力 當壓力超過 120 psi( 容積 60~120 ml) 時, 壓力瓶可控制壓力之減除 3 旋轉盤 : 微波消化過程具旋轉功能, 使樣品在消化裝置內接受微波之均勻性 4 玻璃器皿 : 硼矽玻璃, 容積 50~100 ml 或適當體積 5 樣品儲存瓶 : 聚乙烯 (PE) 或聚丙烯 (PP) 瓶附防漏蓋 6 標準溶液儲存瓶 :500 ml 125 ml 30 ml 或適當體積之 Teflon 瓶 7 離心管 :30 ml 或適當體積, 聚碸 (Polysulfone, PSF) 材質管, 附聚丙烯旋蓋 8 注射器濾膜 :0.45 μm,acrodisc No.4438 或同級品之 Nylon 或 Teflon 材質 9 附旋蓋試管 :15 ml 或適當體積,Falcon Model No 或同級品之聚丙烯試管 10 移液管: 自動分注可精確設定至 0.1 ml 或更佳,Grumman Automatic Dispensing Pipette, Model ADP-30DT 或同級品 11 防塵口罩 : 切割或處理玻璃纖維濾紙時穿戴 ;3M, No 或同級品 12 模板 (Template): 用於輔助玻璃纖維濾紙切割 其尺寸參考圖 1 13 披薩切刀 (Pizza cutter): 具薄細刀輪, 刀片厚度 <1 mm, 非金屬材質 14 漩渦混合器 (Vortex mixer): VWR2 可變速或同級品 15 分析天平 : 可精秤至 0.1 mg ( 三 ) 熱酸萃取 1 熱板 :Thermolyne Model 2200 或同級品 2 定容玻璃器皿 :A 級硼矽玻璃, 容積 50~100 ml 3 樣品儲存瓶 : 聚乙烯 (PE) 或聚丙烯 (PP) 瓶附防漏蓋 4 標準溶液儲存瓶 :500 ml 125 ml 30 ml 或適當體積之 Teflon 瓶 5 離心管 :30mL 或適當體積, 聚碸 (Polysulfone, PSF) 材質管, 附聚丙烯旋蓋 6 注射器濾膜 :0.45 μm,acrodisc No.4438 或同級品之 Nylon 或 Teflon 材質 7 附旋蓋試管 :15 ml 或適當體積,Falcon Model No 或同級品之聚丙烯試管 8 移液管 : 自動分注可精確設定至 0.1mL 或更佳 ;Grumman Automatic Dispensing Pipette, Model ADP-30DT 或同級品 9 防塵口罩 : 切割或處理玻璃纖維濾紙時穿戴 3M, No 或同級品 6125

18 10 模板 : 用於輔助玻璃纖維濾紙切割 其尺寸參考圖 1 11 披薩切刀 : 具薄細刀輪, 刀片厚度 <1 mm, 非金屬材質 12 漩渦混合器 :VWR2 可變速或同級品 ( 四 ) 分析儀器感應耦合電漿發射光譜儀請參閱 NIEA W311 四 設備 ( 一 )1 至 4 儀器調校條件請參閱 NIEA M104 七 步驟 ( 二 ) 儀器之調校 五 試劑 ( 一 ) 微波消化 / 熱酸萃取 1 濃鹽酸 : 用於樣品製備, 分析級以上 2 濃硝酸 : 用於樣品製備, 分析級以上 3 萃取溶液 (5.55 % HNO 3 / % HCl): 約 500 ml 試劑水中加入 55.5 ml 濃硝酸及 ml 濃鹽酸後, 再以試劑水稀釋至 1 L ( 二 ) 試劑水 : 不含待測元素之去離子水 ( 三 ) 氬氣 : 使用高純度氬氣或液氬 ( 四 ) ICP 分析試劑中若含有不純物會嚴重影響分析結果之準確度, 因此在本方法中使用的各種試劑, 均為分析級以上或經確認合乎品質要求之其他等級試劑 1 試劑水 : 不含待測元素之去離子水 2 濃硝酸 : 分析級以上或經確認合乎品質要求之其他等級試劑 3 硝酸 (1 %): 加入 10 ml 濃硝酸於約 500 ml 試劑水中, 稀釋至 1 L 4 濃鹽酸 : 分析級以上或經確認合乎品質要求之其他等級試劑 5 標準儲備溶液 (Standard stock solutions) 可為單一或多元素標準儲備溶液, 購買市售超高純度之濃縮溶液, 或自行以高純度 ( 純度至少為 99.99~99.999%) 之試劑配製而得, 其程序請參照 NIEA M104 五 試劑 ( 三 ) 6 多元素檢量線標準溶液多元素檢量線標準溶液保存期限 14 天 7 空白溶液檢測過程中必須使用二種空白溶液, 第一種為檢量線空白 (Calibration blank) 溶液, 製備檢量線 ; 第二種為方法空白 (Method blank) 溶液, 用來評估樣品配製過程的污染導入的可能性 (1) 檢量線空白溶液組成應與稀釋標準品所使用之溶液相同 ( 通常為 1%(v/v) 的 HNO 3 溶液 ) (2) 方法空白溶液除須含有與製備樣品時所使用之相同試劑外, 配製過程亦須與樣品的製備過程相同 6126

19 8 電漿調校溶液與光譜干擾檢核溶液: 請參考 NIEA W311 五 試劑 ( 六 ) 與 ( 八 ) 六 採樣及保存 ( 一 ) 各別依據 TSP PM 10 PM 2.5 (NIEA A102 NIEA A208 NIEA A205) 檢測方法 ( 二 ) 濾紙運送 1 樣品採集後, 將濾紙運送至實驗室, 運送途中應避免污染及樣品的損失 2 濾紙加以編號並登錄 3 接收濾紙如為 PM 10 或總懸浮微粒 (TSP), 應由短邊將粒狀污染物質向內對摺且封緘在保護封套內 分析前將這些護套保存在室溫 4 接收濾紙如為 PM 2.5, 運送時需保存在 4 ± 2, 分析前則保存在 20~23 之間 5 樣品保存最長期限 180 天 ; 如為 PM 2.5, 則依據 NIEA A205 六 採樣與保存 ( 一 ) 辦理 七 步驟 ( 一 ) 濾紙前處理 ( 濾紙萃取步驟 ): 樣品濾紙如為直徑 37 或 47 mm, 無須進行切割亦無需執行添加或重複樣品分析, 直接進行萃取 1 微波萃取步驟 (1) 濾紙切割步驟 a 應用模板 ( 見圖一 ) 及切刀 ( 見圖二 ) 將 20cm 25cm (8" 10") 之濾紙切割成 2.5 cm 20cm(1" 8") 條狀, 利用微波萃取系統以鹽酸 / 硝酸溶液萃取金屬, 冷卻後, 混合消化液並利用 Acrodisc 注射器濾膜濾除任何不溶物 最後以微波萃取製備樣品供 ICP 分析 b 在濾紙切割之前, 以酸沖洗 ( 註 2) 耐熱樹脂玻璃材質之濾紙模板 聚碸材質之離心管和蓋帽以及所有其他會與濾紙樣品接觸的實驗室設備, 以防污染 c 戴聚乙烯手套, 將濾紙模板與蓋子置放於供濾紙切割之用的排煙櫃內 d 以潔淨乾燥長纖維拭淨紙擦拭模板基座 蓋子及切割刀片, 以防樣品跨次 ( 交叉 ) 污染 e 在不擾動濾紙上採樣區域情況下, 將有溝槽的蓋子凹痕面朝下放置在樹脂基座模板邊框之內 用乾淨之切刀切下 2.5 cm 20 cm(1" 8") 之一長條 f 以戴指套之手指折疊或緊密捲起濾紙紙條, 然後由邊緣移置至酸洗過潔淨之聚碸離心管中, 並標號 ( 註 3) g 更換樣品之間用乾燥長纖維拭淨紙清潔濾紙模板 (50 張濾紙之後應更換手 ( 指 ) 套以降低交叉污染 ) h 將模板蓋子移動至濾紙之第二個部分, 切割另外一條濾紙長條, 用以製備重複樣品, 並重複七 ( 一 )2 (1)f 至七 ( 一 )2 (1)h 步驟, 使用另外一支離心管 (2) 微波功率校正 : 微波消化裝置絕對功率可經由測定 1 kg 之水, 在固定微波場中加熱一段時間後之上升溫度來推估 經由此測定, 可求得樣品在消化過程中實際吸收功率和微波設定功率間之關係 所需校正模式 ( 線性或非線性 ) 取決於製造廠商所提供之電 6127

20 子系統而定, 若微波消化裝置使用線性電路系統, 則校正曲線可用三點校正之方式來進行, 否則, 就必須使用多點校正 ( 註 4) (3) 微波裝置功率評估下列之公式係用於評估可供微波空腔 (Microwave cavity) 加熱之功率, 式中變數取決於量測 1kg 的水暴露在電磁輻射固定時段所上升之溫度 以下說明用於評估每一校正點, 代表各微波之輸出 % 功率的步驟 a 針對每一校正點, 量測並記錄在一厚壁微波可穿透燒杯 (Teflon 或 PE 材質 ) 中 1kg (1,000g ± 0.1g) 室溫下 (23 ± 2 ) 之蒸餾水樣品 b 精確量測並記錄水之初始溫度 (Ti) 至 0.1 以內 起始溫度應介於 22~26 c 將 Teflon 燒杯於置放微波中以全功率 (100 % 校正點 ) 照射 / 操作 2 分鐘 d 將燒杯移出微波裝置並精確量測記錄結束照射後 30 秒內之最終最高溫度 (T f ) 至 0.1 此步驟須在持續攪拌中完成( 電子攪拌器使用大攪拌子者為佳 ) e 依此類推, 每一校正點 ( 例如 100 % 50 % 或多點 ) 需要個別用內含室溫下蒸餾水之乾淨燒杯進行量測與記錄 f 依下式計算微波功率 K C M Power= t p T K C p t M = Power=34.87 T 功率 (Power)= 樣品吸收之表觀功率 (Apparent power), 瓦特 (W=joule-s -2 ) K= 熱化學卡 - 秒 -1 (cal-s -1 ) 轉換為瓦特 (W) 的單位轉換係數 =4.184 Cp= 熱容量 (heat capacity) 熱容量(thermal capacity) 或比熱 (specific heat)(cal-g =1.0, 針對水 ). M= 樣品的質量, 克 (g) T= T f - T i, t= 時間, 秒 g 推導以校正範圍的線性部分方程式, 用以確定任意設定標度 (scale) 相當之瓦特數 再由實際功率瓦特數定出所使用微波裝置之適當設定 每一台微波裝置各有其自身 (% 功率 ) 設定, 對應於實際傳送至樣品之功率 ( 瓦特 ) h 每台微波裝置皆應執行初始多點功率評估 如具線性關係, 應定期以例行三點校正確認方式檢核其校正 當使用單一輸出功率進行消化時則可適用單點確認 如果微波射源的任何部分經維護或更換, 則整體之校正必須重新加以評估 (4) PFA 容器之清潔所有消化瓶必須經酸洗淨且在使用前以試劑水潤洗以防污染 6128

21 a 每個 PFA 消化瓶需用去離子清潔劑清洗後以試劑水潤洗 b 在 12 個消化瓶中各加入 10 ml 濃硝酸, 加蓋放入微波裝置中 c 依微波裝置製造商建議在微波裝置 100 % 功率下加熱 10 分鐘 PFA 瓶在分析使用之前應以試劑水充分潤洗 若僅使用 6 組消化瓶, 對照毎一組約 5 %, 可用 70 % 之功率 (5) 微波萃取消化步驟 a 將七 ( 一 )2 (1)g 之濾紙長條, 用塑膠鑷子將濾紙條向下壓入離心管之下端部分, 以確認萃取溶液覆蓋整條濾紙 ( 註 5,6) b 用一預先設定經校正之自動分注移液管或 A 級玻璃移液管, 在每一支離心管中加入 10 ml 萃取溶液 溶液須完全覆蓋紙條 c 精稱每個離心管至 0.01 g 再將離心管置放於內含 31 ml 試劑水之 Teflon PFA 瓶中 配合微波裝置之最大容量, 可繼續此步驟至總數達 12 個或更多樣品 d 將具有壓力釋放閥之 Teflon PFA 瓶蓋蓋於瓶上以手旋緊, 再用蓋瓶把手依廠商使用說明旋緊 將消化瓶組件置於微波轉盤架 以 Teflon PFA 接管連接各樣品消化瓶至溢流容器 ( 見圖三 ) e 消化程式設定在使每個樣品約 10 分鐘內加熱到達 140 ± 5, 並在該溫度下維持加熱 13 分鐘 原則上加熱程式需依樣品基質及反應特性之不同而作適當之改變 ; 惟溫度在到達 140 ±5 後, 仍必須維持加熱 13 分鐘, 使樣品得以達到消化之目的 ( 註 7) f 樣品消化瓶數可由 1 至 14 瓶, 視微波消化裝置之設計 功率大小及使用試劑而定 g 微波消化結束時, 移出含消化瓶組件之轉盤架, 將消化瓶組件壓力釋放 ( 建議放置於排煙櫃內 ), 然後置於水中冷卻 10 分鐘 h 精稱每個離心管之重量至 0.01 g, 並與初始稱量比較確認無樣品漏失 消化前 後稱重比較應在 0.1 g 以內 如果前 後稱重量不相符在 0.1 g 以內, 必須剔除該消化樣品 i 利用蓋瓶座開啟微波消化瓶蓋, 取出含樣品之已標示離心管, 棄去 PFA 瓶中的試劑水 j 添加 10 ml 試劑水至每一支離心管 緊蓋離心管, 以漩渦混合器充分混合內容物 2~3 分鐘使能完全萃取 以尼龍或鐵氟龍 ( 聚四氟聚乙烯 ) 材質之注射器自離心管抽取部分樣品, 然後將 Acrodisc 濾膜置於注射器上, 將樣品注入乾淨試管中 繼續此抽取過濾動作至完全抽完離心管內消化濾液 k 依據前述步驟, 最終萃取體積為 20 ml 此時之樣品濾液準備供作後續分析之用 2 熱酸萃取步驟 (1) 方法概述 a 當無法使用微波消化技術時, 可利用熱酸萃取方法替代之 6129

22 b 將 20cm 25cm (8" 10") 之濾紙切割成 2.5 cm 20cm(1" 8") 長條狀 利用 HCl / HNO 3 熱酸萃取方法萃取濾紙條中成分 冷卻後, 將消化液移入定量瓶中稀釋至定體積 過濾移除所有之不溶物 (2) 熱酸萃取步驟 a 戴聚乙烯手套或用塑膠鑷子, 取出七 ( 一 )2 (1)a 濾紙長條將其置入已經標示體積之 150 ml 之高型燒杯 (Griffin beaker) 或同型中 將濾紙條置於燒杯之下端部分, 以確認萃取溶液體積足以覆蓋整條濾紙 b 使用經校正之自動分注移液管或移液管, 加入 10 ml 萃取溶液 c 將燒杯置放於排煙櫃內之熱板上, 蓋上錶玻璃, 緩慢迴流 30 分鐘, 勿使樣品蒸乾 隨後將燒杯自熱板移開並置放冷卻 d 以試劑水淋洗燒杯杯壁, 再添加約 10 ml 試劑水於燒杯中剩餘之濾紙殘留物並靜置至少 30 分鐘 e 將燒杯中萃出液移入 20 ml 量瓶或其他刻度容器中, 以試劑水淋洗燒杯及任何剩餘之固體物料並將淋洗液加入量瓶 再以試劑水稀釋至標線並搖勻 f 以尼龍或鐵氟龍材質之注射器自量瓶抽取部分樣品, 然後將濾膜置於注射器上, 將樣品注入乾淨試管中 繼續此抽取過濾動作至完全抽完離心管內消化濾液 g 依據上述步驟, 最終萃取體積為 20 ml 此時之樣品濾液準備供作後續分析之用 ( 二 ) 儀器調校 : 參照所使用儀器原廠說明書或參考 NIEA W311 NIEA M104 ( 三 ) 檢量線製備 1 以蠕動幫浦將樣品溶液導入至電漿後, 一般至少需經 30 秒後 ( 需隨儀器管路長短不同調整 ), 待系統達成平衡穩定後, 方可讀取訊號 2 在導入不同的溶液之間, 需以檢量線空白溶液清洗管路足夠時間 ( 約 60 秒, 或更長 ), 以避免記憶效應之干擾發生 3 首先分析檢量線空白溶液, 續依濃度由低至高之順序, 分析至少五個不同濃度的標準溶液, 建立檢量線與其線性相關係數 ( 四 ) 檢量線製備完成應即以第二來源標準品配製接近檢量線中點濃度之標準品 ( 若無第二來源標準品時, 至少應使用另一獨立配製之標準品 ) 進行分析作確認 其檢量線查核標準品之相對誤差值應在 ± 10% 以內 八 結果處理 ( 一 ) 空氣中粒狀污染物金屬濃度, 計算方式 : [( μ g 元素 / 毫升 ) ( 消化體積 ( 例如 : 20毫升 ) 毫升 / ) 9- Fm ]/Vstd C = 條 C= 濃度,μg 元素 /m 3 9= 濾紙切割成九分之一 F m = 空白濾紙平均元素濃度,μg 對大批之濾紙 (500 張以上 ), 可任意選擇 20 至 30 張濾紙, 而小批者, 可選擇較少 6130

23 之數量 (5%) 進行以下之檢驗, 依七 ( 一 )2 或七 ( 一 )3 進行分析 V std = 標準採樣空氣體積, 立方公尺 (m 3 ) ( 二 ) 若原樣品經稀釋處理, 則樣品測定值必須乘以稀釋倍數 九 品質管制 ( 一 ) 檢量線線性相關係數須大於或等於 ( 二 ) 檢量線查核 1 檢量線查核分析之相對誤差值應在 ± 10 % 以內, 否則必須立即檢查儀器之操作條件或進行儀器之維護保養, 並取另一份校正查核標準品或檢量線查核標準品注入儀器分析之, 若待分析物訊號仍無法落在上述範圍以內, 受影響樣品應利用重新製備之檢量線再次進行分析 2 每個元素之檢量線空白值須低於方法偵測極限 (MDL) 的 2 倍 如發現檢量線空白值未低於 MDL 的 2 倍時, 必須找出原因並加以改善, 受影響的樣品亦必須重新分析 ( 三 ) 方法空白樣品分析 : 空白分析值可接受標準須低於 2 倍方法偵測極限 ( 四 ) 查核樣品分析 : 每 10 個或每批次樣品至少執行一個查核樣品分析, 其回收率應在 80~ 120% 範圍內 ( 五 ) 重複樣品分析 : 每 10 個或每批次樣品至少執行一個重複樣品分析, 其相對差異百分比應小於 20% ( 六 ) 添加樣品分析 : 每 10 個或每批次樣品至少執行一個添加標準品分析, 其回收率應在 80~ 120% 範圍內 ( 註 8) ( 七 ) 現場空白樣品分析 : 每一批次採樣需製備一個現場空白樣品, 檢測值必須低於 MDL 的 2 倍 ; 每 10 個真實樣品應有一個現場空白樣品 該空白樣品不需抽引空氣通過空白濾紙, 但需如同真實樣品經過相同之處理與運送操作 十 精密度與準確度 : 檢附單一實驗室分析 SRM 標準品之相關數據, 詳如表四 十一 參考資料 ( 一 ) US EPA, Determination of metals in ambient particulate matter using inductively coupled plasma(icp) spectrometry, Method IO-3.4, ( 二 ) U.S. EPA, Selection preparation and extraction of filter material, Method IO-3.1, ( 三 ) US EPA, Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry, Method 6010C, Feb., 2007 ( 四 ) 行政院環境保護署檢測方法, 水中金屬及微量元素檢測方法 - 感應耦合電漿原子發射光譜法,NIEA W311 ( 五 ) 行政院環境保護署檢測方法, 感應耦合電漿原子發射光譜法,NIEA M104 ( 六 ) 蘇國澤 曹國田 雷一弘 程惠生 賴金郎, 空氣中多重重金屬調查研究 (2/2), 行政院環保署環境檢驗所 環境調查研究年報, 第 15 期,

24 註 1: 本方法係針對已初步具有光譜 化學和物理干擾校正知識的光譜儀器操作人員而制訂 因涉及複雜樣品基質的分析檢測工作, 故在使用本方法時, 分析人員必須充分瞭解光譜性 化學性和物理性等干擾問題, 並有能力利用適當的修正補償措施, 針對各類干擾進行校正的工作 註 2: 以 10% 硝酸溶液進行清洗, 再依序以自來水及試劑水沖洗乾淨 註 3: 微波消化樣品之識別, 切勿使用條碼或膠帶標示 註 4: 若所使用之微波消化裝置具有溫度回饋控制系統, 原則上可不需進行校正 惟功率校正能提供該微波消化裝置長期使用後功率之變化情況, 可作為微波功率穩定性之監測之用, 故建議仍宜定期進行此項校正 註 5: 為安全考量, 人員操作處理濾紙須穿戴呼吸面罩及戴聚乙烯手套 呼吸面罩是為防止吸入微小玻璃碎屑及粒狀污染物 手套則為防護皮膚且避免因皮膚分泌物污染樣品 針對使用呼吸面罩, 建議另一替代方式, 實驗室如有層流排煙櫃 (laminar flow hood), 宜將樣品濾紙之切割及移轉等操作在層流排煙櫃中完成 註 6: 一張濾紙應準備一條以上之濾紙條, 供萃取以確保能有適量之樣品體積, 供作樣品及品管樣品分析 空白濾紙樣品應與樣品同時進行萃取與分析 ; 消化空白則用於確認所使用試劑中之金屬為相對低濃度 註 7: 不同樣品加熱到達 140 ± 5 之時間可能不同, 但基本上由於樣品消化是在溫度到達 140 ± 5 後, 維持加熱 13 分鐘之步驟中進行, 故加熱溫度到達 140 ± 5 之時間長短 ( 從 5 分鐘至 10 分鐘左右 ), 並不會影響樣品消化之結果 註 8: 若回收率超出管制範圍, 且分析元素又不能以稀釋方式測得時, 可使用標準添加法進行分析 註 9: 一般清洗原則, 將所有可重複使用器皿 ( 玻璃 石英 聚乙烯 PE Teflon 等 ), 使用前以實驗級清潔劑隔夜浸泡, 再以自來水洗滌乾淨, 確認沖洗乾淨後浸泡硝酸 鹽酸混合液 (1 +2+9) 約 4 小時, 再以自來水洗淨, 最後再以試劑水沖洗乾淨並乾燥備用 註 10: 本方法引用之行政院環境保護署公告方法之內容及編碼, 以最新公告者為準 註 11: 檢測廢液, 依一般重金屬廢液處理原則處理 6132

25 表一 元素 工作標準溶液 1 2 與方法偵測極限 工作標準濃度估計方法偵測極限 (MDLs) 3 mg/l mg/l ng/m 3 Al( 鋁 ) As( 砷 ) Au( 金 ) B( 硼 ) Ba( 鋇 ) Be( 鈹 ) Bi( 鉍 ) Ca( 鈣 ) Cd( 鎘 ) Ce( 鈰 ) Co( 鈷 ) Cr( 鉻 ) Cu( 銅 ) Fe( 鐵 ) Ge( 鍺 ) Hg( 汞 ) In( 銦 ) K( 鉀 ) La( 鑭 ) Li( 鋰 ) Mg( 鎂 ) Mn( 錳 ) Mo( 鉬 ) Na( 鈉 ) Ni( 鎳 ) P( 磷 ) Pb( 鉛 ) Pt( 鉑 ) Re( 錸 )

26 1 2 3 Rh( 銠 ) Ru( 釕 ) Sb( 銻 ) Se( 硒 ) Si( 矽 ) Sm( 釤 ) Sn( 錫 ) Sr( 鍶 ) Te( 碲 ) Ti( 鈦 ) Tl( 鉈 ) V( 釩 ) W( 鎢 ) Y( 釔 ) Zn( 鋅 ) Zr( 鋯 ) 最低濃度之工作標準液不含金屬 數據來源 01/26/83-03/22/83 分析濾紙 以採樣速率 1.13 m 3 /min, 採樣時間 24 小時總體積 m 3, 切割濾紙九分之一與每張濾紙消 化體積 20 毫升之條件進行分析, 儀器使用 Thermo Jarrell Ash Model 975 Plasma Atom Comp ICP 6134

27 表二 ICP-AES 檢測元素建議波長 元素 波長 (nm) 元素 波長 (nm) 鋁 (Al) 鈮 (Nb) 砷 (As) 鎳 (Ni) 金 (Au) 磷 (P) 硼 (B) 鉛 (Pb) 鋇 (Ba) 鈀 (Pd) 鈹 (Be) 鉑 (Pt) 鉍 (Bi) 錸 (Re) 鈣 (Ca) 銠 (Rh) 鎘 (Cd) 釕 (Ru) 鈰 (Ce) 銻 (Sb) 鈷 (Co) 硒 (Se) 鉻 (Cr) 矽 (Si) 銅 (Cu) 釤 (Sm) 鐵 (Fe) 錫 (Sn) 鍺 (Ge) 鍶 (Sr) 汞 (Hg) 鉭 (Ta) 銦 (In) 碲 (Te) 鉀 (K) 鈦 (Ti) 鑭 (La) 鉈 (Tl) 鋰 (Li) 釩 (V) 鎂 (Mg) 鎢 (W) 錳 (Mn) 釔 (Y) 鉬 (Mo) 鋅 (Zn) 鈉 (Na) 鋯 (Zr)

28 表三 ICP-AES 光譜干擾影響因子 影響元素 影響因子 受影響元素 影響元素 影響因子 受影響元素 鉭 (Ta) 鈷 (Co) 鉍 (Bi) 銠 (Rh) 鉭 (Ta) 鐵 (Fe) 鉍 (Bi) 硒 (Se) 鋁 (Al) 鉭 (Ta) 鉍 (Bi) 矽 (Si) 鋁 (Al) 釩 (V) 鉍 (Bi) 鍶 (Sr) 硼 (B) 鋯 (Zr) 鍺 (Ge) 鋁 (Al) 鈹 (Be) 鈮 (Nb) 鍺 (Ge) 鈹 (Be) 鈹 (Be) 釩 (V) 鍺 (Ge) 鉬 (Mo) 鈰 (Ce) 釩 (V) 鍺 (Ge) 鈮 (Nb) 汞 (Hg) 鈷 (Co) 鍺 (Ge) 鉭 (Ta) 汞 (Hg) 鐵 (Fe) 磷 (P) 鋁 (Al) 鑭 (La) 鐵 (Fe) 磷 (P) 銅 (Cu) 鑭 (La) 釩 (V) 磷 (P) 鐵 (Fe) 鉛 (Pb) 鈮 (Nb) 磷 (P) 鎂 (Mg) 鈀 (Pd) 鈮 (Nb) 磷 (P) 鈮 (Nb) 鈀 (Pd) 釤 (Sm) 磷 (P) 矽 (Si) 鈀 (Pd) 鈦 (Ti) 磷 (P) 鋅 (Zn) 鉑 (Pt) 鉻 (Cr) 錸 (Re) 鋁 (Al) 鉑 (Pt) 鈮 (Nb) 錸 (Re) 硼 (B) 鉑 (Pt) 釩 (V) 錸 (Re) 錳 (Mn) 矽 (Si) 鈮 (Nb) 錸 (Re) 鉬 (Mo) 矽 (Si) 鉭 (Ta) 錸 (Re) 鈀 (Pd) 矽 (Si) 鋯 (Zr) 錸 (Re) 矽 (Si) 碲 (Te) 釩 (V) 錸 (Re) 釩 (V) 鉈 (Tl) 鈰 (Ce) 釕 (Ru) 鐵 (Fe) 鉈 (Tl) 鋯 (Zr) 釕 (Ru) 錳 (Mn) 鋅 (Zn) 鉭 (Ta) 釕 (Ru) 鉬 (Mo) 砷 (As) 鋁 (Al) 釕 (Ru) 鈮 (Nb) 砷 (As) 鉑 (Pt) 釕 (Ru) 鉭 (Ta) 砷 (As) 釩 (V) 釕 (Ru) 鈦 (Ti) 鉍 (Bi) 鋁 (Al) 釕 (Ru) 釩 (V) 6136

29 鉍 (Bi) 鉻 (Cr) 釕 (Ru) 鋯 (Zr) 鉍 (Bi) 鐵 (Fe) 鎢 (W) 鋁 (Al) 鉍 (Bi) 鑭 (La) 鎢 (W) 鎂 (Mg) 鉍 (Bi) 鎂 (Mg) 鎢 (W) 鋅 (Zn) 鉍 (Bi) 錳 (Mn) 砷 (As) 鍺 (Ge) 6137

30 表四 1 添加濾紙條 標準品 (NIST SRM 1648) 與添加濾紙之回收率 元素回收率 (%) RSD% As( 砷 ) Co( 鈷 ) Cu( 銅 ) Fe( 鐵 ) Mn( 錳 ) Ni( 鎳 ) Pb( 鉛 ) Sr( 鍶 ) V( 釩 ) Zn( 鋅 ) NIST SRM 1648 Ba( 鋇 ) Be( 鈹 ) 無資料 Cd( 鎘 ) Cu( 銅 ) Fe( 鐵 ) Mn( 錳 ) Mo( 鉬 ) 無資料 Ni( 鎳 ) Pb( 鉛 ) V( 釩 ) Zn( 鋅 ) : 回收率值係以 X - 射線螢光法分析數據進行計算比較 6138

31 30cm 可避免濾紙粘在塑膠上 25.5cm 硬塑膠 凹槽寬度 1cm 12.7cm 23cm 長邊對折之玻璃纖維濾紙 鍵鈕 2.5cm 10.8cm 所有凹槽深 2 mm 披薩切刀 25mm 寬度 凹槽寬度 6 mm 圖一濾紙切割模板範例 6139

32 1mm 縫隙 25mm 用於其它分析之長條 2.5cm*20cm 長條 圖二濾紙切割方法示意圖 6140

33 微波萃取 壓力監視器 MDS 裝置 壓力監視瓶組件 消化瓶組件 通氣螺帽 洩壓閥 通氣管 瓶蓋 瓶體 圖三微波消化系統範例 6141

34 6142