AB SCIEX 公司临床研究应用文献 目 录 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 衍生化方法 )...1 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 非衍生化方法 )...4 血清和血浆样品中 25-OH 维生素 D2 和 D3 快速检测方法

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1 新一代最给力液相色谱质谱平台 AB SCIEX 4500系列 + AB SCIEX 6500系列 临床研究应用专辑 AB SCIEX 6500系列质谱 AB SCIEX质谱系统整体解决方案 极致灵敏 无限精准 定性定量完美结合 检测和确证同时完成 双倍提高生产力 多种扫描方式快速切换 提供更全面更丰富的化合物信息 兼容离子淌度差分质谱技术 多一维的选择性 为复杂生物 样品的痕量分析提供更多解决方案 AB SCIEX 4500系列质谱 AB SCIEX中国各办事处 北京办事处 北京市朝阳区酒仙桥中路24号院1号楼5层 电话 传真 上海办事处 上海市田林路888号 科技绿洲一号楼102室 电话 传真 广州办事处 广州市体育西路109号 高盛大厦15C室 全国免费垂询电话 电话 网址 传真 仅供临床研究应用参考

2 AB SCIEX 公司临床研究应用文献 目 录 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 衍生化方法 )...1 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 非衍生化方法 )...4 血清和血浆样品中 25-OH 维生素 D2 和 D3 快速检测方法 在线前处理快速检测血浆中 25-OH-VD2 和 25-OH-VD3...9 血浆中同型半胱氨酸的 LC/MS/MS 分析方法 血清样品中类固醇的快速 LC/MS/MS 测试方法 人体血清中雌激素类的 LC/MS/MS 分析方法 人体血清中痕量睾酮的 LC/MS/MS 分析方法 人体血清中睾酮的日常 LC/MS/MS 分析方法 全血中四种免疫抑制剂的直接进样快速 LC/MS/MS 分析方法...27 全血中四种免疫抑制剂在线固相萃取 LC/MS/MS 分析方法 血浆中霉酚酸 (Mycophenolic Acid)LC/MS/MS 快速测定方法...33 血浆样品中抗逆转录病毒治疗药物的 LC/MS/MS 分析方法 抗抑郁药和安定药的 LC/MS/MS 快速分析方法...38 尿里镇定止痛类药物定量分析的快速检测方法 体液中 45 种氨基酸的快速串联质谱分析方法...49 氨基酸的快速串联质谱分析方法

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4 临床研究应用专辑 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 衍生化方法 ) Cliquid 新生儿遗传代谢病研究方法 V1.1 LC/MS/MS 是研究代谢异常的主要工具, 氨基酸和酰基肉碱类化合物的同时测定可以提供超过 40 个代谢异常的相关信息, 如 :PKU 苯丙酮酸尿症和长链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症 (MCAD) AB SCIEX 新生儿遗传代谢病研究 LC/MS/MS imethod 是基于流动 - 注射的分析方法, 该法在 AB SCIEX 3200 和 4000 系列质谱上都得到了验证 该法通过对干血点样本进行氨基酸 酰基肉碱衍生化处理后, 进行筛查分析 方法样品前处理简单快捷,MRM 监测氨基酸和酰基肉碱衍生物的选择性高 方法采用 Chromsystems 干血片氨基酸和酰基肉碱分析方法包, 该方法包含样品盘, 提取试剂, 衍生试剂, 缓冲液, 内标物, 校正物 将干血片经过简单提取后直接衍生, 进入质谱系统 图 1. 酰基肉碱的衍生物及其内标的色谱图 结论方法采用一系列的血点质控样本进行方法验证 空白 低浓度 高浓度 3 个浓度的质控样品, 每个浓度的质控样品平行处理 5 次, 每个样品重复进样 3 次 这里列出的是低浓度目标分析物 %CV 值 (n=15) 表 1. 目标分析物的精密度数据 目标化合物 中文名称 Level1 对照 ( 平均浓度 µmol/l) %CV Level1 对照 ( 平均浓度 µmol/l) %CV Alanine 丙胺酸 Alanine(by MRM) 丙胺酸 Arginine 精氨酸

5 Aspartic acid 天冬氨酸 Citrulline 瓜氨酸 Glutamic acid 谷氨酸 Glycine 氨基乙酸 Leucine 亮氨酸 Methionine 甲硫氨酸 Methionine(by MRM) 甲硫氨酸 Ornithine 鸟氨酸 Phenylalanine 苯基丙氨酸 Tyrosine 酪氨酸 Valine 缬氨酸 Carnitine 肉碱 C2-Carnitine C2- 肉碱 C3-Carnitine C3- 肉碱 C4-Carnitine C4- 肉碱 C5-Carnitine C5- 肉碱 C5-DC-Carnitine C5-DC- 肉碱 C6-Carnitine C6- 肉碱 C8-Carnitine C8- 肉碱 C10-Carnitine C10- 肉碱 C12-Carnitine C12- 肉碱 C14-Carnitine C14- 肉碱 C16-Carnitine C16- 肉碱 C18-Carnitine C18- 肉碱 注 : 以上结果为一台仪器 一套标准与样品测试, 结果未必适合所有仪器 因此, 在实际工作前, 必 须使用大量的真实样品对方法进行评价 化学试剂的变化 环境 仪器性能 样品的制备过程都会影响结果 所以, 结果由上述等复杂因素评价而不是特定条件 需要的仪器 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 ) 或者 4000 系列 (4000 QTRAP or API 4000 )LC/MS/MS 系统 安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统 G1312 A, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱或岛津 HPLC 系统, 包括系统控制器 2 个 LC-20AD 液相色谱泵,SIL-20AC 自动进样器或 CTC 自动进样器, 柱温箱 Chromsystems 干血片氨基酸和酰基肉碱分析方法包, 该方法包含样品盘, 提取和衍生试剂, 缓冲液, 内标物 (www. Chromsystems.com) 流动相 (www. Chromsystems.com) 2

6 临床研究应用专辑 一个微孔板的振动器 600 rpm 1/8" 英寸打孔器 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 imethod Test for Research Into Inborn Errors of Metabolism Version 1.1 for Cliquid Software 订货号

7 新生儿遗传代谢病研究的串联质谱分析方法 ( 非衍生化方法 ) Cliquid 新生儿遗传代谢病研究方法 V1.1 LC/MS/MS 是研究代谢异常的主要工具, 氨基酸和酰基肉碱类化合物的同时测定可以提供超过 40 个代谢异常的相关信息, 如 :PKU 苯丙酮酸尿症和长链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症 (MCAD) AB SCIEX 新生儿遗传代谢病研究 LC/MS/MS imethod 是基于流动 - 注射的分析方法, 该法在 AB SCIEX 3200 和 4000 系列质谱上都得到了验证 该法通过对干血点样本直接进行氨基酸和酰基肉碱的筛查分析 方法样品前处理 工作流程简单 快捷 试验结果与衍生化法相符 同样采用 Chromsystems 干血片氨基酸和酰基肉碱分析方法包 ( 但该 imethod 方法包内不含该套试剂包 ), 该方法包含样品盘, 提取和衍生试剂, 缓冲液, 内标物, 校正物 干血点样品直接提取, 然后进上清夜进行质谱检测 结论方法采用一系列的血点质控样本进行方法验证 空白 低浓度 高浓度 3 个浓度的质控样品, 每个浓度的质控样品平行处理 5 次, 每个样品重复进样 3 次 这里列出的是低浓度目标分析物 %CV 值 (n=15) 表 1. 目标分析物的精密度数据 目标化合物 中文名称 Level1 对照 ( 平均浓度 µmol/l) %CV Level1 对照 ( 平均浓度 µmol/l) %CV Alanine 丙胺酸 Alanine(by MRM) 丙胺酸 Arginine 精氨酸 Aspartic acid 天冬氨酸 Citrulline 瓜氨酸 Glutamic acid 谷氨酸 Glycine 氨基乙酸 Leucine 亮氨酸 Methionine 甲硫氨酸 Methionine(by MRM) 甲硫氨酸 Ornithine 鸟氨酸 Phenylalanine 苯基丙氨酸 Tyrosine 酪氨酸 Valine 缬氨酸 Carnitine 肉碱 C2-Carnitine C2- 肉碱 C3-Carnitine C3- 肉碱

8 临床研究应用专辑 C4-Carnitine C4- 肉碱 C5-Carnitine C5- 肉碱 C5-DC-Carnitine C5-DC- 肉碱 C6-Carnitine C6- 肉碱 C8-Carnitine C8- 肉碱 C10-Carnitine C10- 肉碱 C12-Carnitine C12- 肉碱 C14-Carnitine C14- 肉碱 C16-Carnitine C16- 肉碱 C18-Carnitine C18- 肉碱 注 : 以上结果为一台仪器 一套标准与样品测试, 结果未必适合所有仪器 因此, 在实际工作前, 必 须使用大量的真实样品对方法进行评价 化学试剂的变化 环境 仪器性能 样品的制备过程都会影响结果 所以, 结果由上述等复杂因素评价而不是特定条件 需要的仪器 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 ) 或者 4000 系列 (4000 QTRAP or API 4000 )LC/MS/MS 系统 安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统 G1312 A, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱或岛津 HPLC 系统, 包括系统控制器 2 个 LC-20AD 液相色谱泵,SIL-20AC 自动进样器或 CTC 自动进样器, 柱温箱 Chromsystems 干血片氨基酸和酰基肉碱分析方法包, 该方法包含样品盘, 提取和衍生试剂, 缓冲液, 内标物 (www. Chromsystems.com) 流动相 (www. Chromsystems.com) 一个微孔板的振动器 600 rpm 1/8" 英寸打孔器 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 imethod Test for Research Into Inborn Errors of Metabolism Version 1.1 for Cliquid Software 订货号

9 血清和血浆样品中 25-OH 维生素 D2 和 D3 快速检测方法 Cliquid 维生素 D 定量分析方法包 1.0 版本文讲述了在 AB SCIEX 3200 系列 LC/MS/MS 系统上运用 imethod 检测维生素 D3 和 D2 的 25- 羟基代谢物方法包进行检测所需的仪器要求及可以达到的预期实验结果 该方法也在 4000 系列 LC/MS/MS 系统上进行开发和验证 该方法包含人类血清和血浆样本中 25- 羟基维生素 D3 和 D2( 羟基胆钙化醇和羟基麦角骨化醇 ) 的常规分析检测 方法使用已知浓度的冻干血清样本进行校正 使用在临床相关的低和高浓度范围的冻干血清样本, 来建立目标分析物的范围 此方法使用氘代羟基 Vitamin D3 作为内标 样品制备基于简单的正己烷液液萃取, 甲醇 / 水复溶后总运行时间 4 分钟 图 1. OH- 维生素 D3 和 OH- 维生素 D2 的层叠 MRM 离子流示例色谱图, 含定性和定量离子对 ( 仪器型号 :3200 QTRAP 与岛津 LC 系统联用 ), 运行时间 4.0 分钟 该法使用单点校准进行检测 对照样本使用临床观察到的最低的低浓度 (22.4 ng/ml 或 56 nmol/l 羟基 - 维生素 -D ng/ml 或 40 nmol/l 羟基 - 维生素 D2) 和最高浓度 (92.5 ng/ml 或 231 nmol/l OH-Vitamin-D ng/ml 或 160 nmol/l OH- 维生素 -D2) 下面的表 1 概述了这种测定方法的预期检测限和精密度 二十次重复进样用以确定方法的重现性, 每个化合物 %CV 都小于 10% 基于最低标准曲线的最低浓度点大于 10:1 的信噪比来预测方法的检出限 从分析物的预期检测限可以看出, 该分析方法完全可用于筛选或确认 表 1. 对照样本的定量 MRM 离子对观察到的信噪比, 包括从 20 个重复样本计算而得的 %CV Analyte Q1 (amu) Q3 (amu) 定量 Q3 (amu) 定性 S/N * %CV 预期检出限 (ng/ml) OH-Vitamin-D OH-Vitamin-D * 信噪比 (S/N) 由 3 倍标准偏差计算而得 6

10 临床研究应用专辑 标准曲线 下面是典型的标准曲线, 使用羟基 - 维生素 D3 和羟基 - 维生素 D2 校准样品和高 低浓度水平对照样, 显示了用于检测预期的浓度范围和线性 图 2. 羟基 - 维生素 D3 和羟基 - 维生素 D2 主要定量离子代表性标准曲线, 羟基 - 维生素 D3 浓度包括 22.4,61.3,92.5 ng/ml, 羟基 - 维生素 D2 的浓度包括 16.5,42.7,66.0 ng/ml 请注意上面给出的结果使用一台仪器和单套标准样品来获得的 在真正用于检测之前, 方法需要通过真实样品进行完整的验证, 这里的结果可能并不适用于所有的仪器 LC 色谱柱 化学试剂 环境 仪器性能及样品制备程序的变化将会对试验结果产生影响, 因此上述结果应该被视为参考而不是真正的试验结果 需要的设备 : 为了达到上述的试验效果, 需要如下设备支持 ; AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP 或 API 3200 ),4000 系列 (4000 QTRAP 或 API 4000 ) LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器,CTO-20AC 柱温箱或者安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统 G1312A( 无静态混合器 ), 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 冻干的血清标样和对照样本 25- 羟基维生素 D3 医学用同位素内标 HPLC 级水 甲醇 乙腈和正己烷 1.5 ml Eppendorf 试管 Phenomenex 分析色谱柱,3 µm 100Å, Luna C8, mm 离心机 ( 可容纳 1.5 mleppendorf 试管 )14000 rpm 移液枪和标准的实验室玻璃器皿 订购信息 产品名称 货号 imethod 维生素 D 检测方法包 1.1 版

11 重要提示上文所述的 imethod 检测方法是由 AB SCIEX 设计并提供所需的样品准备和仪器参数, 用于加速此方法用于常规测试的实际应用 提供此方法是仅用于参考 这种方法最终性能会因包括仪器性能 调整与维修 化学材料和使用程序的差异 经验技术 样品基质和环境条件的不同存在很多差异 可能需要最终用户从实验室 实验室设备和 / 或材料的微小差异来进行微调, 以确定和验证这种方法对于给定的仪器和样品的最终性能 请注意, 只有充分了解 Analyst 软件的用户才能被允许这样做 8

12 临床研究应用专辑 在线前处理快速检测血浆中 25-OH-VD2 和 25-OH-VD3 Cliquid 维生素 D 方法 ( 应用 Spark Pico1.0) 本文概述了应用荷兰 Spark 公司的 PICO 联合在线固相萃取 (SPE) HPLC 与 AB SCIEX 4000 系列 (API 4000 或 4000 QTRAP ) 质谱, 在人体血浆样品中检测 25- 单羟基 -Vitamin D2(MHVD2) 和 25- 单羟基 -Vitamin D3(MHVD3) 的仪器要求和预期结果 血浆样品通过使用蛋白沉淀剂, 并稀释混合后, 用 Spark HySphere C8EC SE 吸附柱 SPE 小柱进行在线净化 更多的样品前处理方法和仪器参数信息作为 imethod 方法包的一部分, 但这其中不含溶剂 标样和其它样品前处理需要的试剂 流动相含有甲酸 水和甲醇, 色谱柱为 KGaAChromolithSpeedROD RP-18e( 默克公司 ), mm 液相色谱柱, 图 1 是方法得到的典型色谱图 图 1. API 4000 上血浆样品中 100 ng/ml MHVD3 的色谱图 结论 下图是 MHVD2 和 MHVD3 代表性的标准曲线图 图 2. MHVD2 的标准曲线 (R=0.999,1/X) 图 3. MHVD3 的标准曲线 (R=0.999,1/X) 9

13 标准曲线和质量控制样品的准确度和精密度 (CV%) 见下表 表 1. 标准曲线的准确度和精密度数据 (n=4) 浓度 (ng/ml) MHVD3 MHVD2 %CV 准确度 %CV 准确度 表 2. 不同进样量下 (100 µl 和 250 µl)mhvd2 和 MHVD3MRM 离子对的信噪比 (S/N) 浓度 (ng/ml) MHVD3 MHVD2 100 µl 250 µl 100 µl 250 µl 需要的仪器 AB SCIEX API 4000,4000 QTRAP LC/MS/MS 系统 Spark PICO 在线固相萃取液相色谱系统, 配有吹风式柱温箱 Vitamin D 标准品和内标 (Sigma Aldrich) HPLC 级别水, 甲醇, 甲酸 ( 默克 KGaAChromolithSpeedROD RP-18e( 封端 ) 色谱柱 mm Spark 固相萃取小柱 (Applied Biosystems POROS R1 吸附剂填料 ) 移液管和其他实验室玻璃器皿 注 : 该 imethod 不包括菲罗门色谱柱 10

14 临床研究应用专辑 血浆中同型半胱氨酸的 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 同型半胱氨酸方法 V1.0 本文概述了将 AB SCIEX 3200 QTRAP 和岛津 LC 或者 Agilent 1200SL 联用, 应用 AB SCIEX imethod 测试包, 用于血浆中同型半胱氨酸检测的预期结果及所需设备 该方法同样包含应用于 4000 系列的 LC/ MS/MS 系统, 并经过验证 imethod 测试包包括所有方法文档以及可应用于 Cliquid 软件的 MS 和 LC 的方法文件, 以及计算和文档的模板 建议实际做样前认真阅读所有方法文档 方法可用于人血浆样品中同型半胱氨酸的常规定量分析 血浆样品经过蛋白沉淀, 离心, 混合后直接进样 标准曲线通过使用试剂级的水稀释 ClinCal 标准品获得 色谱柱为 Supelco LC-CN 3.0 µm, 流动相为含 0.1% 甲酸水溶液和含 0.1% 甲酸乙腈溶液, 样品运行时间为 2.0 min 图 1. ClinChek 对照样本中 1.36 µg/ml 同型半胱氨酸的典型色谱图 方法采用单点校正 (ClinCal 血浆校正样本 Lot No. 743) 和两个对照样本 (ClinChek 血浆对照样 本 Levels I and II Lot No. 626) 对照样本的响应参照了临床最低 (1.36 µg/ml) 和最高 (3.17 µg/ ml) 的浓度水平 方法的准确度,%CV 和 S/N 值由连续 3 天,18 次 ( 每天测 6 次 ) 重复测得 ; 最低浓 度 QC 样本的精密度在 %CV 范围之间, 准确度是 106%-113% 最高浓度 QC 样本的精密度在 %CV 范围之间, 准确度是 99%-108% 每个化合物的估算检测限完全适用于筛查和确证的分析 表 1. RECIPE ClinCheck 对照 Level1 样本的典型信噪比 (S/N),%CV 值是由 18 次重复测定所得 目标化合物 ( 离子对 ) S/N* %CV LOQ( µg/ml)@s/n =10 同型半胱氨酸 2268 < * 信噪比通过 3 倍标准偏差计算, 检测仪器为 3200 QTRAP 系统 11

15 标准曲线 标准曲线使用标准样和临床相对低浓度和相对高的浓度对照样本获得 同型半胱氨酸 1( 定量 ) 同型半胱氨酸 2( 定性 ) 表 2. ClinCal 血浆校正样本和 ClinChek 对照样本的浓度 目标化合物 分析物浓度 ( µg/ml) 对照 1 校正样本对照 2 同型半胱氨酸 1( 定量 ) 同型半胱氨酸 2( 定性 ) 注意 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而有所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 需要的仪器 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 ) 或者 4000 系列 (4000 QTRAP or API 4000 )LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱或安捷伦 1200SL HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进 12

16 临床研究应用专辑 样器以及可加热的柱温箱 RECIPE ClinCal 校正血浆样本 ( RECIPE ClinChek 对照血浆样本 ( HPLC 级别水, 乙腈, 甲酸 带 5 µm 柱前过滤器的 Supelco LC-CN 3.3 cm 4.6 mm, 3 µm 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Homocysteine Version 1 for Cliquid Software

17 血清样品中类固醇的快速 LC/MS/MS 测试方法 Cliquid 类固醇类方法包 1.0 版本文概述了在 AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quad 5500 或 API 5000 LC/MS/MS 系统上, 运用 imethod 类固醇类方法包进行检测满足实验要求, 即一次进样即可同时分析血清样品中 11 种类固醇类化合物 本方法分析以下 11 种类固醇类化合物 : 脱氢表雄酮硫酸盐 (DHEAS) 脱氢表雄酮(DHEA), 皮质醇 皮质酮 11- 脱氧皮质醇, 雄烯二酮 睾酮 17- 羟基 - 黄体酮 黄体酮 雌二醇和 25- 羟基维生素 D3 同位素内标: 雌二醇 -d3 皮质醇-d4 睾酮-d3 DHEA-d2 皮质酮-d8 11- 脱氧皮质醇 -d2 17- 羟基 - 黄体酮 -d8 孕酮-d9 和 25- 羟基维生素 D3-d6 将 200 µl 人血清样品进行蛋白沉淀后, 上清液经稀释后直接进行 LC-APCI/MS/MS 分析, 色谱柱为 : Phenomenex Kinetex, 2.6 µ C18, mm, 分析时间为 17 分钟 图 1. 人血清基质加标色谱图, 浓度为 : 校正曲线定量上限 ( 见表 1) 标准曲线利用经活性炭净化的血清空白样本配制成一系列浓度的标准溶液, 建立校正工作曲线 根据临床样本的浓度高低确定标准曲线的范围 由于分析物存在内源性本底, 在实验前需对空白血清样本进行检测 各个化合物校正曲线浓度见表 1 表 1. 标准曲线浓度 (ng/ml) Compound 中文名称 STD 1 STD 2 STD 3 STD 4 STD 5 STD 6 STD 7 Androstenedione 雄烯二酮 Cortisol 皮质醇 Corticosterone 皮质脂酮

18 临床研究应用专辑 11-Deoxycortisol 11- 脱氧皮质醇 DHEA 脱氢表雄酮 DHEAS 脱氢表雄酮硫酸盐 Estradiol 雌二醇 Hydroxyvitamin D3 25- 羟基维生素 D Progesterone 黄体酮 OH-Progesterone 17- 羟基 - 黄体酮 Testosterone 睾丸激素 Compound 表 2. 血清样品加标实验的准确度和精密度 中文名称 Q1 (amu) Q3 (amu) 定量 Q3 (amu) 定性 LOQ (ng/ml) %CV at LOQ (n=4) 准确度 at LOQ DHEAS 脱氢表雄酮硫酸盐 Cortisol 皮质醇 Deoxycortisol 11- 脱氧皮质醇 Androstenedione 雄烯二酮 Estradiol(water loss) 雌二醇 ( 脱水 ) Testosterone 睾丸激素 OH-Progesterone 17- 羟基 - 黄体酮 DHEA 脱氢表雄酮 Progesterone 黄体酮 Hydroxyvitamin D3 25- 羟基维生素 D * Corticosterone 皮质脂酮 * 经血清样本中内源性含量校正 以下为其中四种类固醇的校准曲线, 线性范围为 :0.1~20 ng/ml 15

19 图 2. 标准曲线 (n=4) 系统要求 : 本方法中所需的仪器和试剂如下 : 注意 :imethod 测试方法包的许可证为一年有效期, 需每年进行更新, 方可继续使用 AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quad 5500 或 API 5000 LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,150 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱或者安捷伦 1200SL HPLC 二元泵系统, 自动进样器及柱温箱 经活性炭净化的血清空白样本 ( 标样 : 雌二醇, 脱氢表雄酮硫酸盐 (DHEAS),17- 羟基 - 黄体酮, 黄体酮, 脱氢表雄酮 (DHEA), 皮质酮 25- 羟基维生素 D3( 脱氧皮质醇, 皮质醇 ( 雄烯二酮 睾酮 ( 同位素内标 : 睾酮 -d3( 皮质醇 -d4 雌二醇-d3 皮质酮-d8 11- 脱氧皮质醇 -d2 17- 羟基 - 黄体酮 -d8 孕酮-d9 DHEA-d2 DHEAS-d2( com);25- 羟基维生素 D3-d6( HPLC 级水 甲醇和乙腈 试剂级异丙醇 甲酸 七水合硫酸锌 1.5 ml Eppendorf 管 Phenomenex Kinetex 2.6 µ C18, mm (Phenomenex,P/N 00 D-4462-Y0)( 方法包含有色谱柱 ) 离心机 ( 可用于 Eppendorf 管离心 ) 涡旋混合机 移液枪和玻璃器皿 订购信息 产品名称 货号 imethod 类固醇类方法包 1.0 版

20 临床研究应用专辑 重要提示上文所述的 imethod 方法测试包已经经过验证, 按照 AB SCIEX 提供样品前处理准备步骤和仪器测试参数可以加快该方法在实验室的应用 但是该方法能达到的效果还是与给定实验室的仪器状态 维护 化学品的使用流程, 人员的技术经验, 样本基质和环境条件有关, 可能会需要最终用户进行一些微调 在本文档中标识的供应商提供仅用于参考, 没有详尽无遗列出所有制造商 AB SCIEX 不保证此处引用供应商的质量 AB SCIEX 不承担任何买方将使用供应商产品出现不良情况带来的产品责任, 包括间接或必然的损害 您使用此处的任何资源表示您理解和接受这些条款, 其中还包括 imethods 类固醇方法测试包 1.0 版本的最终用户许可协议 (EULA) 如果您不同意 imethods 类固醇方法测试包 1.0 版的最终用户许可协议, 您无权使用这里提供的任何资源 17

21 人体血清中雌激素类的 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 雌激素检测方法 V.1.0 本文概述了在 AB SCIEX API 5000 和 Triple Quad 5500 LC/MS/MS 系统上, 用于人体血清中雌激素类定量分析的 imethod 方法包和所需的仪器设备 因前处理方法的不同, 该 imethod 方法包含有两个方法 : 方法一为雌激素酮和雌二醇, 方法二为雌三醇 血清样品经过正己烷 / 乙酸乙酯液液萃取后直接进样 离子源为 Turbo V 离子源, 色谱柱为 Phenomenex Phenyl C6 3 µm( 方法包内含 ) 方法运行时间为 6.0 min 图 pg/ml 的雌激素酮 雌二醇及其氘代内标的离子对色谱图,(API 5000 ) 液相为岛津 LC, 其中 D4- 雌激素酮和 D3- 雌二醇为内标 结果表明 : 雌激素酮 (E1) 和雌二醇 (E2) 检测方法的灵敏度满足定量分析的要求, 方法的线性范围为 pg/ml 对低浓度的质控样品( 浓度为 15 pg/ml) 分析得到, 雌激素酮的 CV 值为 <10% (n=3), 准确度为 >90%, 信噪比 S/N 值为 55; 雌二醇的 CV 值为 <10%(n=3), 准确度为 >90%, 信噪比 S/N 值为 43 S/N 计算方式为噪音的三倍标准偏差 图 pg/ml 雌三醇及其氘代内标的离子对色谱图 (API 5000 ), 液相为岛津 LC 其中 D3- 雌三醇为内标物 18

22 临床研究应用专辑 结果表明 : 雌三醇检测方法的灵敏度满足定量分析的要求, 方法的线性范围为 pg/ml 对低 浓度的质控样品 ( 浓度为 30 pg/ml) 分析得到, 雌三醇的 CV 值为 10%(n=3), 准确度为 90%, 信 噪比 S/N 值为 40;S/N 计算方式为噪音的三倍标准偏差 标准曲线 以下为雌激素酮 (E1) 和雌二醇 (E2) 的标准曲线以及雌三醇的标准曲线, 线性范围分别为 pg/ml 和 pg/ml; 图 3. 在 API 5000 LC/MS/MS 系统上雌激素酮的标准曲线, 液相为岛津 LC, 运行时间 6 min, 线性范围为 pg/ml 图 4. 在 API 5000 LC/MS/MS 系统上雌二醇的标准曲线, 液相为岛津 LC, 运行时间 6 min, 线性范围为 pg/ml 注 :imethod 方法包中包含 Phenomenex Phenyl C6 色谱柱, 同时, 这个方法也可应用于其他 Cliquid 支持的液相色谱系统 需要的仪器 AB SCIEX API 5000,Triple Quad 5500 LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AD 自动进样器, 柱温箱 或安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 自动进样器以及柱温箱 Phenomenex Phenyl C6 3 µm 50 2 mm HPLC 色谱柱 经活性炭净化的血清空白样品和除去纤维蛋白的血清空白样品 ( HPLC 级正己烷, 乙酸乙酯 HPLC 级水, 乙腈, 甲醇和甲酸 玻璃试管 19

23 离心管 涡旋混合仪 移液管和常见玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Estrogens V.1.0 for Cliquid Software

24 临床研究应用专辑 人体血清中痕量睾酮的 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 痕量睾酮检测方法本文概述了在 AB SCIEX API 5000 和 Triple Quad 5500 LC/MS/MS 系统上, 用于人体血清中痕量睾酮定量分析的 imethod 方法包和所需的实验设备 本方法可用于人体血清中痕量睾酮的日常分析, 利用经活性炭净化的血清空白样本配制成一系列浓度的标准溶液, 建立校正工作曲线 根据临床样本的浓度高低确定标准曲线的范围 以 D3- 睾酮作为内标 血浆样品经过正己烷 / 乙酸乙酯溶液萃取, 浓缩复溶后直接进样 色谱柱为菲罗门 Luna 2.5 µm C18,100 2 mm, 分析时间为 5.5 min, 线性动态范围为 pg/ml 图 pg/ml 的睾酮及其氘代内标的色谱图 (API 5000 ), 其中 D3- 睾酮为内标物 结果表明, 该方法灵敏度高, 满足人体血浆中痕量睾酮的定量检测对低浓度的质控样品分析得到, 睾 酮的精密度 (n=4,cv<10%), 准确度 (>80%), 信噪比 (S/N=20) S/N 计算方式为噪音的三倍 标准偏差 化合物 ( 离子对 ) STD 水平 ( pg/ml) 平均 %CV 平均 S/N LOD( pg/ml)@s/ N =5 睾丸激素 -1(289/97) 睾丸激素 -2(289/109)

25 标准曲线 睾丸激素的定量和定性离子对的标准曲线, 线性范围为 pg/ml 图 2. 在 API 5000 LC/MS/MS 上睾酮定量离子对的标准曲线, 液相为岛津 LC, 运行时间为 5 分钟, LLOQ 为 20 pg/ml,cv 值为 <7%(n=6), 所有标样和质控样品的准确度偏差均在 ±3% 以内 图 3. 在 API 5000 LC/MS/MS 上睾丸激素定性离子对的标准曲线, 液相为岛津 LC, 运行时间为 5 分钟, LLOQ 为 20 pg/ml,cv 值为 <7%(n=6), 所有标样和质控样品的准确度偏差均在 ±3% 以内 注意 : 以上结果仅在一台仪器 一组标准物质和样品上实验得到的 因 LC 色谱柱分离效果 化学试 剂 仪器性能和样本制备方法不同, 得到的结果也会有所不同 建议在实际使用之前对实验方法进行充分验证 系统要求 : AB SCIEX API 5000,Triple Quad 5500 LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD XR 液相泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱 或安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 自动进样器及柱温箱 经活性炭净化的血清空白样品 ( 离心机和试管 睾酮标准物质和氘代内标 ( HPLC 级正己烷, 乙酸乙酯 HPLC 级水, 乙腈, 甲醇和甲酸 1.5 ml Eppendorf 管 BetaBasic Javelin C18 保护柱,5 µm mm(fisher Scientific) Phenomenex Luna 色谱柱,2.5 µm C18, mm HPLC column( 方法包内含 ) 22

26 临床研究应用专辑 离心机 rpm, 可用于 Eppendorf 管离心 移液管和常见的玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Low Testosterone Levels Version 1.1 for Cliquid Software

27 人体血清中睾酮的日常 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 睾丸激素方法 V1.0 本文概述了在 AB SCIEX API 3200 和 3200 QTRAP LC/MS/MS 系统上, 用于睾酮定量分析的 imethod 方法包和所需的仪器设备 本方法可用于人体血清样品中睾酮含量的日常分析, 利用经活性炭净化的血清空白样本配制成一系列浓度的标准溶液, 建立校正工作曲线 根据临床样本的浓度高低确定标准曲线的范围 使以 D3- 睾丸激素作为内标 血清样品利用甲醇进行简单的蛋白沉淀后直接进样 色谱柱 : 菲罗门 Luna 3.0 µm C18(2),50 2 mm( 方法包内含 ), 离子源为 APCI 源, 样品运行时间为 3 min 图 1. 在 3200 QTRAP LC/MS/MS 系统上, 液相为岛津 LC 30 pg/ml 的睾酮的色谱图 : a) 定量离子,b) 定性离子,c) 内标 D3- 睾丸激素, 运行时间为 3 min 结果表明, 该方法灵敏度, 满足人体血浆中痕量睾酮的定量分析要求 线性动态范围为 ng/ml, 对低浓度的质控样品 ( 浓度为 1 ng/ml) 进行分析得到,CV 值 5%(n=6), 准确度偏差 ±5%, 信噪 比 (S/N=30)S/N 计算方式为噪音的三倍标准偏差 化合物 ( 离子对 ) STD 水平 (ng/ml) 平均 %CV 平均 S/N LOD(ng/mL)@S/N =5 睾酮 -1(289/97) 睾酮 -2(289/109)

28 临床研究应用专辑 标准曲线 睾酮的定量和定性离子对的标准曲线, 线性范围为 1-400ng/mL 图 2. 在 3200 QTRAP LC/MS/MS 上, 液相为岛津 LC 睾酮定量离子对 (289/97) 的标准曲线, 运行时间为 3 min,lloq 为 1 ng/ml,cv 值 (n=6)<7%, 标样和质控样品的准确度偏差均在 ±3% 以内 图 3. 在 3200 QTRAP LC/MS/MS 上, 液相为岛津 LC 睾酮定性离子对 (289/109) 的标准曲线, 运行时间为 3 min,lloq 为 1 ng/ml,cv 值 (n=6)<7%, 标样和质控样品的准确度偏差均在 ±3% 以内 注意 : 以上结果仅在一台仪器 一组标准物质和样品上实验得到的 因 LC 色谱柱分离效果 化学试 剂 仪器性能和样本制备方法不同, 得到的结果也会有所不同 建议在实际使用之前对实验方法进行充分验证 需要的仪器 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 ) 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD XR 液相泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱 或安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 自动进样器及柱温箱 经活性炭净化的血清空白样品 ( 离心机和试管 睾酮标准物质和氘代内标 ( HPLC 级正己烷, 乙酸乙酯 HPLC 级水, 乙腈, 甲醇和甲酸 1.5 ml Eppendorf 管 25

29 BetaBasic Javelin C18 保护柱,5 µm mm(fisher Scientific) Phenomenex Luna 色谱柱,2.5 µm C18, mm HPLC column( 方法包内含 ) 离心机 rpm, 可装 Eppendorf 管 移液管和玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Testosterone V.1.0 for Cliquid Software

30 临床研究应用专辑 全血中四种免疫抑制剂的直接进样快速 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 免疫抑制剂可立快分析方法本文概述了在 AB SCIEX 3200 和 4000 系列质谱上应用免疫抑制剂方法包进行检测的预期实验结果和需要的仪器设备 这种方法基于环孢素 A 他克莫司 西罗莫司 依维莫司和全血中内标环孢素 D 和子囊霉素的分析 该方法利用 Chromsystems 全血校准和质控样, 用于测定环孢素 A 他克莫司 西罗莫司和依维莫司, 总运行时间约为 2.0 分钟 总循环时间一针进样至下一针约 3 分钟 样品制备是先进行蛋白沉淀, 离心后直接注入 LC/MS/MS 分析 环孢霉素 D 和囊霉素做为内标 关于仪器和样品制备的完整详细信息包含在 imethod 中, 血浆样品的前处理提取过程也包含在所提供的方法文档中 结论 下面是 imethod 的典型实验结果 图 1. Chromsystems 标准系列样本中水平 1 的典型性色谱图, 典型 %CVs 如下表所示 表 1. Chromsystems 标准系列样本中水平 1 的 MRM 离子对的信噪比, 含 %CV 值 (n=6) Substance 中文名称 Q1(amu) Q 3(amu) S/N * %CV@ Level 1 calibrator Cyclosporine A 环孢素 A Everolimus 依维莫司 Sirolimus 西罗莫司 Tacrolimus 他克莫司 * 此处信噪比 (S/N) 是指 RMS 27

31 标准曲线 图 2. 上面是方法的标准曲线, 表 2 显示的是 Chromsystems 标准系列样本的浓度水平 标样浓度 (ng/ml) Compound 中文名称 Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5 Level 6 Cyclosporine A 环孢素 A Tacrolimus 他克莫司 Sirolimus 西罗莫司 Everolimus 依维莫司 空白标样 (Level 0) 中四种免疫抑制剂的浓度为零 标准样本的浓度每个批次会略有不同 注意 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而有所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 方法可使用 Chromsystems 的全血校正样本套装 ( 货号 :2907) 以及全血对照样品 Levels I, II, III and IV( 货号 :1408) 来进行评价 利用校正系列样本的 Level1 来检测目标化合物的准确度,%CV 和 S/N 比 (n=6), 准确度范围 %,%CV 值范围 由此预期的定量检出限远优于药物治疗监测所需的分析浓度, 最低浓度 QC 的精密度 (n=6)%cv 范围 %, 准确度范围为 93-99% 需要的仪器 AB SCIEX API 3200,3200 QTRAP LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱或者安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 Cliquid 软件 28

32 临床研究应用专辑 全血校正及对照样本 Chromsystems 公司 ( 环孢素 A 他克莫司 西罗莫司 依维莫司标样( 内标环孢素 D 和子囊霉内标 ( HPLC 级别水, 甲醇 ( 高纯度乙酸铵, 甲酸, 硫酸锌 菲罗门保护柱及柱套 菲罗门保护柱 Luna C18 4 mm 3 mm 涡旋仪 移液管和标准玻璃器皿 请注意, 该 imethod 方法包包含一套菲罗门保护柱及保护柱卡套, 该方法也同样可适用于 imethod 支持的其它液相色谱系统 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Immunosuppressants Version 1.0 for Cliquid Software (Includes imethod Test for Mycophenolic Acid Version 1.0 for Cliquid Software) 29

33 全血中四种免疫抑制剂在线固相萃取 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 软件 imethod 免疫抑制剂在线固相萃取分析方法本文概述了在 AB SCIEX 3200 和 4000 系列质谱上应用在线固相萃取 LC/MS/MS 免疫抑制剂方法包检测的预期实验结果和需要的仪器设备 这种方法基于环孢素 A 他克莫司 西罗莫司 依维莫司和全血中内标环孢素 D 和子囊霉素的在线固相萃取 LC/MS/MS 分析 该方法利用 Chromsystems 全血校准样和质控样, 测定环孢素 A 他克莫司 西罗莫司和依维莫司 方法采用硫酸锌进行蛋白沉淀, 然后直接进行在线 SPE 净化,LC/MS/MS 分析 同时分析四种免疫抑制剂, 总运行时间约为 2.5 分钟 关于仪器和样品制备的完整详细信息包含在 imethod 中, 血浆样品的前处理提取过程也包含在所提供的方法文档中 结论 下面是 imethod 的典型实验结果 图 1. Chromsystems 标准系列样本中水平 1 的典型色谱图, 典型 %CVs 如下表所示 表 1. Chromsystems 标准系列样本中水平 1 的 MRM 离子对的信噪比, 含 %CV 值 (n=6) Substance 中文名称 Q1(amu) Q 3(amu) S/N * %CV@ Level 1 calibrator Cyclosporine A 环孢素 A Everolimus 依维莫司 Sirolimus 西罗莫司 Tacrolimus 他克莫司 * 此处信噪比 (S/N) 是指 RMS 30

34 临床研究应用专辑 标准曲线 图 2. 上面是方法的标准曲线, 表 2 显示的是 Chromsystems 标准系列样本的浓度水平 标样浓度 (ng/ml) Compound 中文名称 Level 1 Level 2 Level 3 Level 4 Level 5 Level 6 Cyclosporine A 环孢素 A Tacrolimus 他克莫司 Sirolimus 西罗莫司 Everolimus 依维莫司 空白标样 (Level 0) 中 4 个免疫抑制剂浓度为零 标准样本的浓度每个批次会略有不同 注意 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而 有所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 方法验证方法使用 Chromsystems 的全血校正样本套装 ( 货号 :2907) 以及全血对照样品 Levels I, II, III and IV( 货号 :1408) 来进行验证评价 利用校正系列样本的 Level1 来检测目标化合物的准确度,%CV 和 S/ N 比 (n=6), 准确度范围 %,%CV 值范围 由此预期的定量检出限远优于药物治疗监测所需的分析浓度, 最低浓度 QC 的精密度 (n=6)%cv 范围 %, 准确度范围为 90-99% 需要的仪器 AB SCIEX API 3200,3200 QTRAP LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统控制器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道 31

35 脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱 或安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 Cliquid 软件 全血校正及对照样本 Chromsystems 公司 ( 环孢素 A 他克莫司 西罗莫司 依维莫司标样( 内标环孢素 D 和子囊霉素内标 ( HPLC 级别水, 甲醇 ( 甲酸铵 冰醋酸 99.8% 硫酸锌 99.9% POROS R1 20 µm 固相萃取小柱, 不锈钢 SPE 柱套, mm(imethod 内含有 ) 菲罗门 Luna 分析柱 5 µm Phenyl-Hexyl, mm(imethod 内含有 ) 涡旋仪 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Immunosuppressants using On-LineSolid Phase Extraction Version 1.0 for Cliquid

36 临床研究应用专辑 血浆中霉酚酸 (Mycophenolic Acid)LC/MS/MS 快速测定方法 可立快免疫抑制剂方法包 1.0 本文描述了在 API 3200 上应用霉酚酸 (Mycophenolic Acid)iMethod 检测方法包来进行血浆中霉酚酸检测的预期结果和需要的实验设备, 该方法同样适合 4000 系列的质谱 该法用于 LC/MS/MS 分析血浆中霉酚酸 (MPA), 及它的葡萄糖苷酸代谢物 (MPAG) 和它的内标 (indomethacin 消炎痛 ), 方法利用了 Chromsystems 公司的血浆标样和对照样本来进行霉酚酸的检测 样品制备是先用硫酸锌做为沉淀剂, 直接注射到 C18 保护柱上进行分析, 运行时间为 5.5 min 图 1. 血浆样品中霉酚酸 (MPA) 及其葡萄糖苷酸代谢物 (MPAG), 内标 indomethacin 消炎痛的典型性色谱图 此方法使用从 Chromsystems 血浆校正样本进行评估,Chromsystems 血浆控件样本 Levels I 和 II( 批 号 :No.2307) 每个分析物的定量检出限远高出筛选和定量分析方法所需的要求 低 QC 浓度下典型的 方法测定精度 RSD 为 1.3%(n=6) 和准确度为 98%, 信噪比 (S/N) 为 488(RMS) 化合物 Q1(amu) Q 3(amu) S/N * LOQ %CV 霉酚酸 ng/ml 1.3 * 此处 S/N 是指 P:P; 标准曲线 用 Chromsystems 血浆校正样本进行单点校正 33

37 需要的仪器 AB SCIEX API 3200,3200 QTRAP 或者 API 4000 LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统对照器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱 或者安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 霉酚酸和消炎痛标样 ( 全血校正及对照样本 Chromsystems 公司 ( 水, 乙腈, 甲酸及乙酸铵 ( 均为 HPLC 级 ) 醋酸 ( 冰 )99.8% 七水合硫酸锌 99.9% 菲罗门保护柱及柱套 菲罗门保护柱 Luna C18 4 mm 3 mm( 包含在 imethod 测试包里 ) 离心机 5 min rpm/min 离心管 涡旋仪 移液管和标准玻璃器皿请注意, 该 imethod 方法包包含一套菲罗门保护柱及保护柱卡套, 该方法也同样可适用于 imethod 支持的其它液相色谱系统 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Immunosuppressants Version 1.0 for Cliquid Software (Includes imethod Test for Mycophenolic Acid Version 1.0 for Cliquid Software) 34

38 临床研究应用专辑 血浆样品中抗逆转录病毒治疗药物的 LC/MS/MS 分析方法 Cliquid 抗逆转录病毒治疗药物方法 V1.0 本文概述了在 AB SCIEX 3200 QTRAP 和岛津 LC 或者 Agilent 1200SL 联用系统, 应用 AB SCIEX imethod 测试包用于血浆中痕量抗逆转录病毒治疗药物检测所得到预期的定量分析结果及所需的试验设备 imethod 测试包包括所有方法文档以及可应用于 Cliquid 软件的 MS 和 LC 的方法文件, 以及计算和文档的模板 建议实际做样前认真阅读所有方法文档 方法可用于人体血浆样品中痕量抗逆转录病毒治疗药物的常规定量分析, 样品制备方法是先进行蛋白沉淀, 离心, 稀释后, 进样 色谱柱为 Restek DB 联苯 HPLC 分析柱, 流动相为甲醇 - 醋酸 - 醋酸铵溶液, 样品运行时间为 7 min 图 1. 中浓度 QC 样品定量 定性离子对以及内标样品的典型色谱图, 样品在 3200 QTRAP LC/MS/MS 系统上运行 3200 QTRAP 上使用已知浓度的碳过滤 Spiked 血浆样品做标准曲线, 浓度范围是 ng/ml, 表 1 是每种目标化合物的定量检出限, 结果显示, 该分析方法的定量灵敏度可用于抗逆转录病毒治疗药物的筛查和定量检测分析 目标分析物内标的使用可有效提高方法的准确度和重现性, 同时也提高了复杂基质中结果的可靠性 以下数据来源于血浆 Spike 样品 方法同样适用血浆 ( 血浆, 肝素钠,Bioreclamation Inc. Westbury, NY) 等样品基质 目标化合物 (IS) 中文名称 LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) 线性范围 (ng/ml) %CV at LOQ LOQ 的准确度 Saquinavir 沙奎那维 ,

39 Ritonavir 利托那韦 , Indinavir 印地那韦 , Nelfinavir 奈非那韦 , Amprenavir 安普那韦 , Lopinavir 洛匹那韦 , Nevirapine 奈韦拉平 , Atazanavir 阿扎那韦 , Maraviroc 马拉韦罗 , Tipranavir 替拉那韦 , Efavirenz 依法韦仑 , Delavirdine 地拉韦啶 , Raltegravir 雷特格韦 , Darunavir 地瑞那韦 , 标准曲线 下面是利托那韦 (Ritonavir), 雷特格韦 (Raltegravir) 和替拉那韦 (Tipranavir) 等这三种抗逆转 录病毒治疗药物的标准曲线 图 2. 利托那韦标准曲线, 利托那韦 -d6 做为内标, 浓度范围为 20 to 20,000 ng/ml 图 3. 雷特格韦标准曲线, 雷特格韦 -d3 做为内标, 浓度范围为 20 to 20,000 ng/ml 36

40 临床研究应用专辑 图 4. 替拉那韦标准曲线, 替拉那韦 -d4 做为内标, 浓度范围为 30 to 30,000 ng/ml 需要的仪器 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 )LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统对照器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD XR 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱或安捷伦 1200SL HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 碳过滤血浆样品 ( 标样和氘代内标来自 Toronto Research Chemicals( 离心机和样品处理试管 HPLC 级别乙酸铵和二甲亚砜 HPLC 级别水, 甲醇和乙酸 A Restek Pinnacle DB Biphenyl 分析柱,5 µm, mm( 方法内含有 ) 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Anti-retrovirals Version 1 for Cliquid Software

41 抗抑郁药和安定药的LC/MS/MS快速分析方法 Cliquid 抗抑郁药和安定药套件的分析方法 应用Chromsystems Mass Tox 版 本文概述了在AB SCIEX 3200系列 API 3200 or 3200 QTRAP 质谱上应用相应的iMethod 方法包进行血浆和血清样本中11种抗抑郁药和9种安定药 Chromsystems Mass Tox 包 检测的预期实 验结果和需要的仪器设备 该方法在AB SCIEX 4000系列 API 4000 or 4000 QTRAP LC/MS/MS 系统上的应用同样经过验证 用多级已知浓度的冻干血浆样本作为标准曲线 冻干血浆对照样本临床上的最低和最高浓度做为目标 化合物的浓度范围 方法是用3个内标 可减少样本和仪器的可变性 方法采用ESI离子源 图1. Chromsystems校正样本Level1中抗抑郁药的色谱图 3200 QTRAP system + Shimadzu LC 运行时间为3.5 min 图2. Chromsystems校正样本Level1安定药的色谱图 3200 QTRAP system + Shimadzu LC 运行时间为3.5 min 38

42 临床研究应用专辑 使用岛津 Prominence LC 系统或者安捷伦 1200LC 系统,Chromsystems 分析色谱柱进行分离, 同时进行抗抑郁药和安定药的检测, 运行时间为 3.5 min 方法评估采用的是 Chromsystems 3PLUS1 多水平校正样本, 详细浓度见表 1 对照样本的浓度参照了临床低和高浓度的浓度水平, 见表 2 %CV(RSD) 和 S/N 比见表 3 和表 4(n=18) 评估结果表明, 分析方法的定量灵敏度可满足血清和血浆样品中痕量抗抑郁药和安定药的筛选确证和定量分析 表 1. Chromsystems 3PLUS1 多水平校正血浆样本中抗抑郁药的浓度 (Lot No.4608) µg/l Compound 中文名称 Level 1 Level 2 Level 3 Citalopram 西酞普兰 Fluoxetine 氟西汀 Mirtazapine 米氮平 Paroxetine 帕罗西汀 Sertraline 舍曲林 Venlafaxine 文法拉辛 O-Desmethylvenlafaxine O- 去甲文拉法辛 Duloxetine 度洛西汀 Fluvoxamine 氟伏沙明 Desmethylfluoxetine 去甲氟西汀 N-Desmethylsertraline N- 去甲舍曲林 含样品空白, 校正浓度每批略有不同 表 2. Chromsystems 3PLUS1 多水平校正血浆样本中安定药的浓度 (Lot No.4608) µg/l Compound 中文名称 Level 1 Level 2 Level 3 Aripiprazole 阿立哌唑 Clozapine 氯氮平 Desmethylclozapine 去甲氯氮平 Haloperidol 氟哌啶醇 Olanzapine 奥氮平 Desmethylolanzapine 去甲奥氮平 Quetiapine 喹硫平 Risperidone 维思通 OH-Risperidone 9-OH- 维思通 含样品空白, 校正浓度每批略有不同 39

43 表 3. Chromsystems 校正 Level1 抗抑郁药的结果 (n=18) 目标分析物 中文名称 浓度 ( µg/l) S/N * %CV 准确度 % Citalopram 西酞普兰 Fluoxetine 氟西汀 Mirtazapine 米氮平 Paroxetine 帕罗西汀 Sertraline 舍曲林 Venlafaxine 文法拉辛 O-Desmethylvenlafaxine O- 去甲文拉法辛 Duloxetine 度洛西汀 Fluvoxamine 氟伏沙明 Desmethylfluoxetine 去甲氟西汀 N-Desmethylsertraline N- 去甲舍曲林 注 : 仪器型号为 3200 QTRAP, 信噪比 (S/N) 是指 RMS 表 4. Chromsystems 校正 Level1 安定药的结果 (n=18) 目标分析物 中文名称 浓度 ( µg/l) S/N * %CV 准确度 % Aripiprazole 阿立哌唑 Clozapine 氯氮平 Desmethylclozapine 去甲氯氮平 Haloperidol 氟哌啶醇 Olanzapine 奥氮平 Desmethylolanzapine 去甲奥氮平 Quetiapine 喹硫平 Risperidone 维思通 OH-Risperidone 9-OH- 维思通 注 : 仪器型号为 3200 QTRAP, 信噪比 (S/N) 是指 RMS 标准曲线下面是 2 种抗抑郁药和 2 种安定药的标准曲线, 其它同类药物的标准曲线类似 注意 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而有所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 40

44 临床研究应用专辑 需要的仪器 AB SCIEX API 3200,3200 QTRAP 和 API 4000,4000 QTRAP LC/MS/MS 系统 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统对照器,100 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器, 柱温箱或者安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 MassTox Reagent kit for Antidepressants and Neuroleptics( 2 ml HPLC 样品瓶内含 250 µl 内插管 PTFE 样品瓶盖 离心机 rpm 41

45 移液枪 ( 可调 )0-200 µl; µl 移液枪枪头 请注意, 该方法也同样可适用于 imethod 支持的其它液相色谱系统 订购信息 产品名称 imethod Test for MassTox Antidepressants and Neuroleptics Kit from Chromsystems for Cliquid Software 订货号

46 临床研究应用专辑 尿里镇定止痛类药物定量分析的快速检测方法 Cliquid 镇定止痛类药物定量方法包 1.0 版本文讲述了在 AB SCIEX API 3200 或 3200 QTRAP LC/MS/MS 系统上使用 imethod 镇定止痛类药物定量方法包进行人尿中止疼类药物定量分析的预期试验结果, 该方法包包括与尿液样本中的 15 种 ( 短效 ) 和 41 种 ( 长效 ) 镇定止痛药物的常规分析方法 样品制备非常简单, 基本采用通过稀释后进样的方式, 采用的是 Restek Ultra 联苯 5 µm 高效液相色谱柱, 与 Turbo V 离子源质谱仪联用, 每个样本大概运行 6.6 min; 图 种镇定止痛药物 ( 短效 ) 的典型色谱图 ( 仪器型号 :3200 QTRAP 与岛津 LC 联用系统 ), 运行时间 6.6 分钟 除了纳络酮外, 每个分析物都添加了氘代内标 图 种镇定止痛药物 ( 长效 ) 的典型色谱图 ( 仪器型号 :3200 QTRAP 与岛津 LC 联用系统 ), 运行时间 6.6 分钟 具体的化合物种类和保留时间在下表给出 43

47 表 1. 图 2 中的 41 种止痛药物 ( 长效 ) 及保留时间列表 英文名 化合物中文名 RT 英文名 化合物中文名 RT 6-MAM 6- 单乙酰基吗啡 3.35 Meprobamate 氨甲丙二酯 3.86 α-hydroxylalprazolam α- 羟基阿普唑仑 4.97 Methadone 美沙酮 5.45 Alprazolam 阿普唑仑 5.16 Methamphetamine 甲基苯丙胺 3.07 Amphetamine 安非他明 2.47 Midazolam 咪达唑仑 4.94 Benzoylecgonine 苯甲酰芽子碱 3.87 Morphine 吗啡 1.96 Buprenorphine 丁丙诺啡 4.79 Naloxone 纳洛酮 3.18 Carisoprodol 异丙基甲丁双脲 4.50 Naltrexone 环丙甲羟二羟吗啡酮 3.51 Clonazepam 氯硝安定 4.85 Norbuprenorphine 去烷基丁基原啡因 4.43 Codeine 可待因 3.32 Nordiazepam 去甲西泮 5.01 Diazepam 安定 5.31 Norfentanyl N- 苯基 -N-(4- 哌啶 基 ) 哌啶酰胺 3.90 EDDP 美沙酮代谢物 5.22 Normeperidine 4- 乙酯基 -4- 苯基哌啶 4.13 Fentanyl 芬太奴 4.78 Norpropoxyphene 去丙养芬 5.17 Flunitrazepam 氟硝西泮 5.06 Oxazepam 去甲羟基安定 4.85 Flurazepam 氟胺安定 4.90 Oxycodone 羟考酮 3.44 Hydrocodone 氢可酮 3.53 Oxymorphone 羟吗啡酮 2.10 Hydromorphone 氢吗啡酮 2.42 PCP 苯环己哌啶 ( 天使粉 ) 4.98 Lorazepam 劳拉西泮 4.80 Propoxyphene 丙氧芬 4.96 MDA MDEA MDMA 3,4 亚甲二氧基苯丙胺亚甲基二氧乙基安非他命 3,4 亚甲二氧基甲基苯丙胺 3.08 Sufentanil 苏吩坦尼 Temazepam 替马西泮 Tramadol 曲马多 4.02 Meperidine 度冷丁 4.15 图 ng/ml 的可卡因和吗啡的典型色谱图 ( 仪器型号 :3200 QTRAP 与岛津 LC 联用系统 ), 运行时间 6.6 分钟 如上图所示 : 该方法具有很好的峰形和分离效果 44

48 临床研究应用专辑 标准曲线短效镇定止痛药物使用完整的校准和三点标定曲线进行定量, 长效镇定止痛药物使用四点标定曲线进行定量 在这两种情况下, 结果都同时显示测定是准确的, 精确的和可重现的 以下是 AB SCIEX 3200 QTRAP 系统具有代表性的校准曲线 : 图 4. 氢可酮 纳曲酮和曲马多从为代表的短效镇定止痛药的定量标准曲线 ( 仪器型号 :3200 QTRAP 与岛津 LC 联用系统 ), 运行时间 6.6 分钟 测定的是每个分析物的线性浓度范围 图 5. 四个长效类镇定止痛药物的典型性标准曲线 表 2. 短效类镇定止痛药物典型性准确度和精密度数据 ( 尿液加标样品 ) Analyte 中文名称 %CV at 40% Cutoff Accuracy at 40% Cutoff (%) %CV at Cutoff Accuracy at Cutoff (%) %CV at 3x Cutoff Accuracy at 3x Cutoff (%) Buprenorphine 丁丙诺啡 Codeine 可待因

49 Fentanyl 芬太奴 Hydrocodone 氢可酮 Hydromorphone 氢吗啡酮 Meperidine 度冷丁 Methadone 美沙酮 Morphine 吗啡 Naloxone 钠洛酮 Naltrexone 环丙甲羟二羟吗啡酮 Norbuprenorphine 去丙养芬 Norfentanyl 去芬太奴 Oxycodone 羟考酮 Oxymorphone 羟吗啡酮 Tramadol 曲马多 表 3. 长效类镇定止痛药物典型性准确度和精密度数据 ( 尿液加标样品 ) Analyte 6 MAM 中文名称 6- 单乙酰基 吗啡 %CV at 40% Cutoff Accuracy at 40% Cutoff (%) %CV at Cutoff Accuracy at Cutoff (%) %CV at 3x Cutoff Accuracy at 3x Cutoff (%) %CV at 10x Cutoff Accuracy at 10x Cutoff (%) hydroxyalprazolam α- 羟基阿普唑仑 Alprazolam 阿普唑仑 Amphetamine 安非他明 Benzoylecgonine 苯甲酰芽子 碱 Buprenorphine 丁丙诺啡 Carisoprodol 异丙基甲丁 双脲 Clonazepam 氯硝安定 Codeine 可待因 Diazepam 安定 EDDP 美沙酮代谢 物 Fentanyl 芬太奴 Flunitrazepam 氟硝西泮 Flurazepam 氟胺安定

50 临床研究应用专辑 Hydrocodone 氢可酮 Hydromorphone 氢吗啡酮 Lorazepam 劳拉西泮 MDA MDA MDEA MDEA MDMA MDMA Meperidine 度冷丁 Meprobamate 氨甲丙二酯 Methadone 美沙酮 Methamphetamine 甲基苯丙胺 Midazolam 咪达唑仑 Morphine 吗啡 Naloxone 纳洛酮 Naltrexone Norbuprenorphine 环丙甲羟二羟吗啡酮去烷基丁基原啡因 Nordiazepam 去甲西泮 Norfentanyl Normeperidine N- 苯基 -N- (4- 哌啶基 ) 哌啶酰胺 4- 乙酯基 -4- 苯基哌啶 Norpropoxyphene 去丙养芬 Oxazepam 去甲羟基安 定 Oxycodone 羟考酮 Oxymorphone 羟吗啡酮 PCP PCP Propoxyphene 丙氧芬 Sufentanil 苏吩坦尼 Temazepam 替马西泮 Tramadol 曲马多 需要的设备 : 为了达到上述的试验效果, 需要如下设备支持 ; AB SCIEX 3200 QTRAP API 3200 LC/MS/MS 系统 47

51 岛津 20A HPLC 系统,CBM-20A 系统对照器,150 µl 混合器,2 个 LC-20AD 液相色谱泵,3 通道脱气机,SIL-20AC 自动进样器,CTO-20AC 柱温箱 Restek Ultra Biphenyl 5 µm mm 在线过滤芯 0.5 µm(p/n A-102X) 和过滤器 (P/N A-316) (Upchurch Scientific, 阴性的尿液样品 ( 水 甲醇 乙腈和异丙醇 ( 均为 HPLC 级 )( 棕色样品小瓶 涡旋搅拌机 离心机 移液枪和标准的实验室玻璃器皿请注意 Restek Ultra 联苯液相色谱柱是附带此 imethod 测试包内的 此外, 这个方法也可以运行在其他 Cliquid 软件支持的其它高效液相色谱系统上, 可根据使用的液相系统来更新保留时间 订购信息 产品名称 货号 imethod 镇定止痛类药物定量方法包 1.0 版 重要提示应用 AB SCIEX imethod 镇定止痛方法测试包能达到的预期的试验结果, 是需要 LC/MS/MS 的一些使用经验和样品制备程序的, 然而基于 web 的培训和一些现场培训都可以帮助和确保那些缺乏经验的用户去取得同样的运行效果 更多详细信息, 咨询您当地的销售代表 上文所述的 imethod 镇定止痛类方法测试包已经经过验证, 按照 AB SCIEX 提供样品前处理准备步骤和仪器测试参数可以加快该方法在实验室的应用 但是该方法能达到的效果还是与给定实验室的仪器状态 维护 化学品的使用流程, 人员的技术经验, 样本基质和环境条件有关, 可能会需要最终用户进行一些微调 在本文档中标识的供应商提供仅用于参考, 没有详尽无遗列出所有制造商 AB SCIEX 不保证此处引用供应商的质量 AB SCIEX 不承担任何买方将使用供应商产品出现不良情况带来的产品责任, 包括间接或必然的损害 您使用此处的任何资源表示您理解和接受这些条款, 其中还包括 imethods 类固醇方法测试包 1.0 版本的最终用户许可协议 (EULA) 如果您不同意 imethods 类固醇方法测试包 1.0 版的最终用户许可协议, 您无权使用这里提供的任何资源 48

52 临床研究应用专辑 体液中 45 种氨基酸的快速串联质谱分析方法 Cliquid 氨基酸分析 AA45 软件 3.0 本文概述了利用放射性同位素标记联合 LC/MS/MS 方法检测体液中 45 种氨基酸的方法 本文包括所需仪器, 预期结果 该方法可应用于 AB SCIEX 3200 和 4000 系列 LC/MS/MS 系统上 该方法和 Cliquid AA45/20 软件联用, 可用于尿液 血清和血浆样品中 45 种氨基酸的常规检测分析 注 : 该方法包内不含液相色谱柱和 AA45/32 或者 AA20/20 的启动包 氨基酸同分异构体由于化学特性不同因而分离, 每种氨基酸都使用内标来做标准曲线, 进而补偿不同仪器带来的差异 样品先进行蛋白沉淀, 然后用 itraq 试剂进行衍生 总运行时间为 13 分钟 图 种氨基酸的分离色谱图, 运行时间为 13 min 标准曲线标准曲线使用的是 AA45/32 启动包的对照样本, 定量检出限从 µm, 动态线性范围为 个数量级 注意 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而有所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 图 2. 上面是方法中丝氨酸的典型性标准曲线 49

53 需要的仪器 AB SCIEX API 3200,3200 QTRAP LC/MS/MS 或者 API 4000,4000 QTRAP LC/MS/ MS 系统 安捷伦 1100/1200 HPLC 二元泵系统, 带 96 孔板的自动进样器以及可加热的柱温箱 AA45/32 启动包, 货号 :No (iTRAQ 试剂, 内标, 血浆对照样本, 用户使用手册 ) AB SCIEX AAA 液相分析柱, 货号 :No LC/MS 水, 甲醇, 正己烷和乙腈 移液管和标准玻璃器皿 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for Amino Acids Analysis with Cliquid AA45 Software

54 临床研究应用专辑 氨基酸的快速串联质谱分析方法 Cliquid 氨基酸分析 atraq 联用方法 V1.0 AB SCIEX imethod atraq 包可用于常规的氨基酸分析, 方法易学易用, 适用于广泛推广 该 imethod 含 Cliquid 3.0 软件的密钥, 使该方法包可以在 Cliquid 平台上进行无缝联机, 进而使样品的仪器分析和生成结果报告过程更加自动化 该方法充分利用三重四极杆质谱或者 QTRAP 质谱 MRM 监测技术的高灵敏度和高选择性 HPLC 的分 离是在 C18 色谱柱上进行的, 运行时间包括平衡时间, 共 18 min, 极大地提高了样品通量 Scheduled MRM (MRM 智能运算法则 ) 可以在保证监测最大数量的 MRM 离子对的同时, 让监测每对 MRM 离子 对的时间最大化, 进而得到更好的试验结果和重现性 方法中同时使用 atraq 试剂和氨基酸内标来进 一步提高精密度和定量的准确性 atraq 试剂的使用可以通过标样的保留时间和分子量来进行每一种 氨基酸的进一步确证 该方法可适用于各种体液 水解物中离氨基酸的分析 一次运行同时分析 45 种氨基酸 一个样品可在 18 min 内分析完, 实现高通量 方法适用于各种体液和基质, 比如 : 血浆, 尿液, 组织提取物以及组织培养物 需要的样品量很小,40 µl 氨基酸内标, 让定性和定量结果更准确, 重复性更好 线性范围宽 (1-10,000 µm), 定量检出限可 <1 µm 氨基酸混标的色谱分离图, 每种氨基酸的浓度都在 10 pmol( 除胱氨酸浓度为 5 pmol 以外 ), 检测仪器为 3200 QTRAP 系统 51

55 血浆样本中氨基酸混标的色谱分离图, 检测仪器为 3200 QTRAP 系统 注 : 实际获得的结果可能会由于 LC 色谱柱分离效果 化学试剂 仪器性能和样本制备方法不同而有 所不同 建议在实际使用之前先对方法进行充分验证 液相色谱设备和条件该方法在 3 种不同的 HPLC 系统上都进行测试过 : Agilent 1100 LC 系统 Agilent 1200 LC 系统 Shimadzu Prominence LC 系统 色谱柱 :AAA C18 反相柱,5 µm, mm(ab SCIEX) 流动相 A: 水 +0.1% 甲酸 +0.01% 七氟丁酸 ( 流动相修饰剂 ) 流动相 B: 甲醇 +0.1% 甲酸 +0.01% 七氟丁酸 ( 流动相修饰剂 ) 流速 :0.8mL/min 柱温 :50 进样体积 :2 µl MS/MS 检测条件 AB SCIEX 3200 系列 (3200 QTRAP or API 3200 ) 和 4000 系列 (4000 QTRAP or API 4000 )LC/MS/MS 系统 Turbo V 离子源 正离子检测 Analyst 软件 1.5 或者 和 Cliquid 软件 3.0 订购信息 产品名称 订货号 imethod Test for atraq Kits 1.0 including Cliquid AA 3.0 SW License 注 : 该货号不含 atraq 试剂包和色谱柱 52

56 新一代最给力液相色谱质谱平台 AB SCIEX 4500系列 + AB SCIEX 6500系列 临床研究应用专辑 AB SCIEX 6500系列质谱 AB SCIEX质谱系统整体解决方案 极致灵敏 无限精准 定性定量完美结合 检测和确证同时完成 双倍提高生产力 多种扫描方式快速切换 提供更全面更丰富的化合物信息 兼容离子淌度差分质谱技术 多一维的选择性 为复杂生物 样品的痕量分析提供更多解决方案 AB SCIEX 4500系列质谱 AB SCIEX中国各办事处 北京办事处 北京市朝阳区酒仙桥中路24号院1号楼5层 电话 传真 上海办事处 上海市田林路888号 科技绿洲一号楼102室 电话 传真 广州办事处 广州市体育西路109号 高盛大厦15C室 全国免费垂询电话 电话 网址 传真 仅供临床研究应用参考