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1 第 29 卷 第 13 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No 年 7 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jul 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 刘 成 国 1,2, 易 文 芝 1, 周 辉 (1. 湖 南 农 业 大 学 食 品 科 学 技 术 学 院, 湖 南 长 沙 ; 2. 食 品 科 学 与 生 物 技 术 湖 南 省 重 点 实 验 室, 湖 南 长 沙 ) 1,2 摘 要 : 益 生 菌 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 是 保 证 其 功 能 特 性 的 关 键 因 素, 为 提 高 益 生 菌 发 酵 乳 中 的 活 菌 总 数, 以 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 复 合 菌 种 为 试 验 对 象, 以 发 酵 过 程 中 的 ph 值 和 吸 光 度 平 均 值 OD 值 为 试 验 指 标, 在 单 因 素 试 验 的 基 础 上, 利 用 Box-Benhnken 中 心 组 合 试 验 和 响 应 面 分 析 法 研 究 了 接 种 量 益 生 菌 接 种 比 例 发 酵 温 度 葡 萄 糖 添 加 量 以 及 大 豆 多 肽 添 加 量 对 发 酵 乳 ph 值 和 活 菌 数 的 影 响, 并 建 立 了 复 合 益 生 菌 发 酵 模 型 响 应 面 优 化 试 验 结 果 表 明 复 合 益 生 菌 发 酵 的 最 佳 工 艺 条 件 是 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12%, 接 种 量 为 6%, 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 接 种 体 积 比 为 3 1, 葡 萄 糖 添 加 量 为 2.9%, 大 豆 多 肽 添 加 量 为 0.8%, 发 酵 温 度 为 34, 在 此 条 件 下 OD 预 测 值 为 1.076, 验 证 试 验 得 到 实 际 OD 值 为 1.087, 与 理 论 预 测 值 相 比, 相 对 误 差 为 1.0% 发 酵 乳 最 大 活 菌 数 为 cfu/ml, 与 已 有 研 究 相 比, 活 菌 数 提 高 了 1~2 个 对 数 级 在 4 条 件 下 贮 藏 21 d 后, 发 酵 乳 的 活 菌 数 仍 然 保 持 在 cfu/ml 研 究 结 果 为 工 业 化 生 产 高 活 菌 数 的 益 生 菌 饮 料 提 供 参 考 关 键 词 : 发 酵, 优 化, 模 型, 益 生 菌, 干 酪 乳 杆 菌, 双 歧 杆 菌 doi: /j.issn 中 图 分 类 号 :Q 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2013) 刘 成 国, 易 文 芝, 周 辉. 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 [J]. 农 业 工 程 学 报,2013,29(13): Liu Chengguo, Yi Wenzhi, Zhou Hui. Optimization of fermentation conditions of milk with blend probiotic strains based on high viable count[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(13): (in Chinese with 0 引 言 益 生 菌 是 一 类 可 通 过 改 变 肠 道 菌 群 平 衡 而 对 动 物 产 生 有 利 影 响 的 活 微 生 物 添 加 剂, 并 广 泛 应 用 于 食 品 生 产 中 [1-2] 益 生 菌 不 仅 可 加 工 成 为 各 种 食 品 通 过 消 化 道 产 生 有 益 功 效, 还 可 以 外 用 于 同 样 存 在 固 有 菌 群 的 泌 尿 系 统 和 皮 肤 [3] 研 究 发 现 [4-5], 益 生 菌 在 人 体 肠 道 内 的 存 活 和 增 殖 对 益 生 菌 发 挥 保 健 功 效 起 到 决 定 性 作 用, 要 获 得 理 想 的 治 疗 效 果, 益 生 菌 必 需 达 到 足 够 多 的 数 量 然 而, 益 生 菌 最 大 的 缺 点 是 活 菌 期 时 间 短 [6] 在 加 工 过 程 和 贮 藏 期 间 保 证 其 存 活 和 保 持 生 物 活 性 仍 是 益 生 菌 产 品 面 临 的 挑 战 之 一 [7] 益 生 菌 进 入 人 体 并 发 挥 重 要 功 效 的 主 要 产 品 载 体 是 益 生 菌 发 酵 乳 市 场 上 的 益 生 菌 乳 饮 料 普 遍 含 菌 数 量 少, 随 着 货 架 期 延 长, 益 生 菌 数 量 逐 渐 下 降 [8-9] 相 关 研 究 表 明, 有 些 市 售 产 品 货 架 期 结 束 后 活 菌 数 可 达 90% 的 衰 减 [10] 因 此, 提 高 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 是 目 前 益 生 菌 乳 饮 料 需 要 解 决 的 重 大 技 术 难 题 之 一 收 稿 日 期 : 修 订 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 作 者 简 介 : 刘 成 国 (1964-), 男 ( 汉 族 ), 湖 南 常 德 人, 副 教 授, 研 究 方 向 为 农 产 品 加 工 及 质 量 控 制 长 沙 湖 南 农 业 大 学 食 品 科 技 学 院, [email protected] 目 前 相 关 研 究 主 要 集 中 在 某 一 成 分 或 发 酵 条 件 的 探 究, 对 于 系 统 地 研 究 整 个 发 酵 体 系, 包 括 发 酵 条 件 营 养 物 质 之 间 的 相 互 作 用 尚 无 文 献 报 导 本 试 验 将 乳 酸 菌 高 密 度 培 养 技 术 应 用 于 发 酵 乳 的 发 酵 工 程 中 为 实 现 益 生 菌 的 高 密 度 培 养, 应 提 供 一 个 适 宜 环 境 供 其 生 长, 包 括 温 度, 溶 氧 量, 营 养 [11] 条 件 等 而 发 酵 乳 的 发 酵 过 程 中, 提 供 营 养 的 主 要 为 牛 乳, 牛 乳 的 乳 糖 不 足 以 满 足 益 生 菌 生 长 的 需 求, 葡 萄 糖 能 为 菌 种 生 长 提 供 额 外 的 能 源 物 质 [12] 大 豆 多 肽 是 大 豆 蛋 白 质 的 酶 分 解 产 物, 具 有 促 进 菌 种 繁 殖 和 代 谢 的 作 用 [13] 将 葡 萄 糖 和 大 豆 多 肽 添 加 到 牛 乳 中 作 为 菌 种 的 生 长 因 子, 同 时 研 究 发 酵 温 度 益 生 菌 ( 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 ) 比 例 接 种 量 等 发 酵 条 件 对 益 生 菌 生 长 的 影 响 相 关 研 究 表 明, 复 合 菌 种 发 酵 存 在 共 生 机 制 时, 其 发 酵 能 力 要 优 于 单 菌 种 发 酵 [14] ; 而 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 复 合 发 酵 的 产 酸 能 力 和 活 菌 数 都 明 显 高 于 其 他 复 合 菌 种 为 简 化 生 产 工 艺 缩 短 生 产 周 期, 本 试 验 选 择 直 投 式 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 为 研 究 对 象 在 单 因 素 试 验 基 础 上, 利 用 Box-Benhnken 中 心 组 合 试 验 和 响 应 面 分 析 法 建 立 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 复 合 益 生 菌 发 酵 的 数 学 模 型 [15] 通 过 优 化 发 酵 条 件, 提 高 益 生 菌 发 酵 乳 中 的 活 菌 数, 为 工 业 化 生 产 高 活 菌 数 的 益 生 菌 饮 料 提 供 技 术 支 持

2 第 13 期 刘 成 国 等 : 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 材 料 与 方 法 1.1 试 验 材 料 菌 种 干 酪 乳 杆 菌 : 丹 麦 科 汉 森 有 限 公 司 ; 双 歧 杆 菌 : 丹 尼 克 斯 ( 中 国 ) 有 限 公 司 材 料 与 试 剂 脱 脂 奶 粉 : 新 西 兰 恒 天 然 脱 脂 奶 粉 ; 大 豆 多 肽 : 陕 西 汇 能 达 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 葡 萄 糖, 市 售 一 级 ; MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) 合 成 培 养 基 : 广 东 环 凯 微 生 物 科 技 有 限 公 司 ; 氢 氧 化 钠 乙 二 胺 四 乙 酸 (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, EDTA), 均 为 分 析 纯 仪 器 与 设 备 SW-CJ-1FD 型 单 人 单 面 净 化 工 作 台 : 苏 州 净 化 设 备 有 限 公 司 ;MJ-250BS-Ⅱ 型 霉 菌 培 养 箱 : 上 海 新 苗 医 疗 器 械 制 造 有 限 公 司 ;101 型 电 热 鼓 风 干 燥 器 : 北 京 市 永 光 明 医 疗 器 械 厂 ;S20 型 ph 计 : 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 有 限 公 司 ;722S 型 可 见 分 光 光 度 计 : 上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司 1.2 试 验 方 法 接 种 菌 液 的 制 备 称 取 干 酪 乳 杆 菌 双 歧 杆 菌 冻 干 发 酵 剂 各 1 g, 分 别 投 放 于 99 ml 的 灭 菌 脱 脂 奶 中, 摇 匀, 制 成 菌 含 量 为 1% 的 接 种 菌 液 发 酵 接 种 量 以 接 种 的 脱 脂 乳 体 积 计 算 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 制 备 工 艺 流 程 脱 脂 奶 粉 + 葡 萄 糖 + 水 等 60 ~ 65 溶 解 110 杀 菌 15 min 冷 却 至 37 左 右 接 种 发 [16] 酵 冷 却 至 15 4 冷 藏 1.3 试 验 内 容 与 设 计 复 合 菌 体 最 适 吸 收 波 长 的 确 定 在 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12% 的 条 件 下, 110 灭 菌 15 min 后 制 得 灭 菌 乳 在 此 基 础 上, 发 酵 温 度 为 37, 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 接 种 体 积 比 为 1 1, 接 种 量 为 6% 的 条 件 下 发 酵 24 h, 制 得 发 酵 乳 以 去 离 子 水 为 对 照 调 零, 取 灭 菌 乳 和 发 酵 乳 分 别 稀 释 10 倍, 在 不 同 波 长 下 用 1 cm 的 光 径 比 色 皿 测 定 吸 光 度 (optical delnsity,od), 以 此 来 分 析 最 适 吸 收 波 长 [17] 复 合 菌 种 发 酵 的 单 因 素 试 验 1) 益 生 菌 接 种 量 确 定 以 干 酪 乳 杆 菌 双 歧 杆 菌 为 试 验 对 象, 在 益 生 菌 接 种 体 积 比 为 1 1, 发 酵 温 度 为 37, 葡 糖 糖 的 添 加 量 为 2.5%, 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.6%, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 % 的 条 件 下, 研 究 不 同 的 接 种 量 (2% 4% 6% 8% 10%) 对 发 酵 乳 的 产 酸 量 和 活 菌 总 数 的 影 响, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 OD 值 和 最 终 ph 值 做 为 试 验 指 标 2) 益 生 菌 接 种 比 例 的 确 定 其 他 发 酵 条 件 不 变, 接 种 量 为 确 定 的 最 佳 接 种 量, 研 究 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 接 种 体 积 比 (L B= ) 对 发 酵 乳 产 酸 量 和 活 菌 数 的 影 响, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 OD 值 和 最 终 ph 值 为 试 验 指 标 3) 葡 萄 糖 添 加 量 的 确 定 其 他 发 酵 条 件 不 变, 接 种 量 为 确 定 的 最 佳 接 种 量, 益 生 菌 接 种 体 积 比 为 确 定 的 最 佳 比 例, 研 究 葡 萄 糖 的 不 同 添 加 量 (1.5% 2% 2.5% 3% 3.5%) 对 试 验 结 果 的 影 响, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 OD 值 和 最 终 ph 值 做 为 试 验 指 标 4) 大 豆 多 肽 添 加 量 的 确 定 其 他 发 酵 条 件 不 变, 接 种 量 益 生 菌 接 种 体 积 比 葡 萄 糖 的 添 加 量 均 为 上 述 确 定 的 最 佳 水 平, 研 究 大 豆 多 肽 的 不 同 添 加 量 (0.2% 0.4% 0.6% 0.8% 1.0%) 对 试 验 结 果 的 影 响, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 OD 值 和 最 终 ph 值 为 试 验 指 标 5) 发 酵 温 度 的 确 定 发 酵 条 件 均 为 上 述 单 因 素 试 验 选 出 的 最 佳 水 平, 研 究 不 同 的 发 酵 温 度 ( ) 对 试 验 结 果 的 影 响, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 OD 值 和 最 终 ph 值 为 试 验 指 标 响 应 面 法 优 化 复 合 益 生 菌 发 酵 技 术 的 试 验 对 单 因 素 试 验 结 果 进 行 显 著 性 分 析, 选 出 差 异 显 著 的 因 素 为 Box-Benhnken 设 计 的 自 变 量, 以 发 酵 乳 的 OD 值 为 响 应 面, 通 过 响 应 面 分 析 与 模 型 的 建 立 对 复 合 益 生 菌 发 酵 条 件 进 行 优 化 [18-20] 1.4 主 要 指 标 的 测 定 方 法 酸 度 的 测 定 ph 值 : 采 用 S20 型 ph 计 直 接 测 定 OD 值 的 测 定 乳 酸 菌 生 长 动 力 学 研 究 发 现 菌 体 的 吸 光 度 值 与 菌 体 的 显 微 镜 直 接 计 数 值 之 间 呈 相 关 关 系, 因 此 可 以 采 用 测 定 OD 值 的 方 法 来 评 定 发 酵 乳 的 活 菌 数 [21] 本 试 验 根 据 发 酵 乳 中 钙 离 子 在 碱 性 条 件 下 与 盐 类 络 合 而 使 发 醉 乳 均 匀 分 散 成 溶 液 状 态 的 原 理, 选 取 乙 二 胺 四 乙 酸 (EDTA) 为 螯 合 剂, 络 合 发 酵 乳 中 的 钙 离 子, 使 待 测 溶 液 变 澄 清, 其 测 定 步 骤 如 下 : 试 管 中 加 入 1 ml 的 发 酵 乳 加 入 9 ml 0.2% 的 EDTA 溶 液 调 节 ph 值 至 12 左 右 混 匀 并 静 置 5 min 以 灭 菌 乳 作 为 空 白 对 照 调 零 在 最 适 波 长 处 测 定 吸 光 度 值 菌 体 进 入 稳 定 期 后 OD 值 变 化 不 明

3 288 农 业 工 程 学 报 2013 年 显 [22], 此 时 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 达 到 最 大 值 试 验 从 发 酵 48 h 起 OD 值 变 化 不 大 据 此, 从 发 酵 48 h 开 始, 连 续 3 d 测 定 OD 值, 以 每 种 发 酵 条 件 下 测 定 的 吸 光 度 平 均 值 (The Average Optical Delnsity, OD ) 做 为 试 验 指 标 2 结 果 与 分 析 2.1 菌 体 最 适 吸 收 波 长 的 确 定 灭 菌 乳 和 发 酵 24 h 后 的 脱 脂 乳 在 不 同 波 长 下 的 OD 值 如 图 1 从 图 中 可 以 看 出,350~430 nm 之 间, 发 酵 乳 的 吸 光 度 比 较 大, 但 灭 菌 乳 的 吸 光 度 也 很 大, 所 以 透 过 比 色 皿 的 很 大 一 部 分 光 束 被 灭 菌 乳 所 吸 收, 影 响 了 菌 体 的 吸 光 度 在 540~660 nm 之 间, 虽 然 灭 菌 乳 本 身 的 吸 光 度 很 小, 但 是 发 酵 乳 的 吸 光 度 也 不 大 波 长 在 450~500 nm 之 间, 灭 菌 乳 的 吸 光 度 不 大, 但 发 酵 乳 的 吸 光 度 较 大, 在 此 波 段 中, 发 酵 乳 和 灭 菌 乳 差 值 最 大 的 一 组 为 460 nm 因 此 选 择 该 复 合 菌 体 的 最 适 吸 收 波 长 为 460 nm 李 学 贵, 袁 生 报 道 的 微 生 物 转 化 过 程 中 利 用 OD 值 实 [17] 时 监 测 细 菌 生 物 量 变 化 的 研 究 一 文 中 测 定 的 假 单 胞 菌 最 大 吸 收 波 长 为 470 nm, 与 本 试 验 测 定 的 复 合 菌 体 的 最 适 吸 收 波 长 相 差 不 大 0.878,pH 值 为 3.20 考 虑 生 产 成 本 的 节 约, 选 择 接 种 量 为 6 % 为 此 单 因 素 试 验 的 最 佳 水 平 采 用 方 差 分 析 法 对 发 酵 乳 的 OD 值 进 行 显 著 性 分 析, 结 果 表 明 接 种 量 对 OD 值 的 影 响 不 显 著 (P>0.05) 因 此 在 响 应 面 试 验 中, 不 将 接 种 量 列 为 试 验 因 素 注 : 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 的 接 种 体 积 比 为 1 1, 发 酵 温 度 为 37, 葡 糖 糖 的 添 加 量 为 2.5 %, 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.6% Note: Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 1:1, fermentation temperature was at 37, glucose level was 2.5%, soybean peptide level was 0.6%. 图 2 不 同 接 种 量 对 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 的 影 响 Fig.2 Effect of different inoculation volume on ph value and average OD value of fermented milk 益 生 菌 接 种 比 例 对 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 试 验 研 究 了 不 同 益 生 菌 接 种 比 例 (L B) 对 发 酵 乳 ph 值 和 OD 值 的 影 响, 试 验 结 果 见 图 3 图 1 发 酵 乳 和 灭 菌 乳 在 不 同 波 长 下 的 OD 值 Fig.1 OD value of fermented milk and sterilized milk at different wavelengths 2.2 单 因 素 试 验 结 果 与 分 析 接 种 量 对 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 试 验 研 究 了 不 同 接 种 量 对 发 酵 乳 ph 值 和 OD 值 的 影 响, 试 验 结 果 见 图 2 ph 值 表 示 发 酵 过 程 的 产 酸 量, 预 试 验 结 果 表 明, 当 发 酵 结 束 后 ph 值 达 到 3.6 左 右 时, 则 在 益 生 菌 乳 饮 料 的 调 配 过 程 中 不 需 要 额 外 添 加 酸 味 剂 OD 值 表 示 发 酵 乳 中 的 活 菌 数, OD 越 大, 发 酵 乳 的 品 质 也 就 越 高 从 图 中 可 以 看 出, 当 接 种 量 大 于 6% 时, 发 酵 乳 的 OD 变 化 不 明 显 ph 值 随 接 种 量 的 增 加 呈 现 先 下 降 后 变 化 不 大 的 趋 势 当 接 种 量 为 6% 时, 发 酵 乳 的 OD 值 为 注 : 接 种 量 为 6 %, 发 酵 温 度 为 37, 葡 糖 糖 的 添 加 量 为 2.5%, 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.6% Note: inoculation volume was 6%, fermentation temperature was at 37, glucose level was 2.5%, soybean peptide level was 0.6 %. 图 3 不 同 益 生 菌 比 例 对 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 的 影 响 Fig.3 Effect of different ratio of probiotics strains on ph value and average OD value of fermented milk 从 图 3 中 两 条 曲 线 可 以 看 出, 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 成 线 性 关 系,OD 值 越 大 所 对 应 的 ph 值 就 越 小 当 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 的 比 值 小 于 2 时, 发 酵 乳 的 OD 值 随 着 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 的 比 值 增 大 而 上 升 当 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 比 例 为 2 1 时, OD 值 为 0.927,pH 值 为 3.18, 此 条 件 下 的 发 酵 乳 活 菌 总 数 和 产 酸 量 均 最 大 当 干 酪 乳 杆 菌 : 双

4 第 13 期 刘 成 国 等 : 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 289 歧 杆 菌 比 例 为 3 1 时,OD 值 下 降 为 进 一 步 检 验 不 同 益 生 菌 比 例 对 发 酵 乳 活 菌 总 数 的 影 响 是 否 显 著, 对 试 验 结 果 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 方 差 分 析 的 结 果 为 P<0.01, 所 以 不 同 接 种 比 例 下 的 OD 差 异 极 显 著 因 此 在 益 生 菌 比 例 单 因 素 试 验 中, 选 择 干 酪 乳 杆 菌 双 歧 杆 菌 =2 1 为 最 佳 水 平 葡 萄 糖 添 加 量 对 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 试 验 研 究 了 不 同 葡 萄 糖 添 加 量 对 发 酵 乳 ph 值 和 OD 值 的 影 响, 试 验 结 果 见 图 4 由 图 中 可 以 得 到, 发 酵 乳 的 OD 值 和 ph 值 先 随 葡 萄 糖 的 增 加 几 乎 呈 直 线 上 升 和 下 降 的 趋 势, 当 添 加 量 3% 时,OD 值 为 1.031,pH 值 为 3.19, 此 条 件 下 的 发 酵 乳 产 酸 量 和 活 菌 总 数 均 达 到 最 大 值 当 葡 萄 糖 含 量 继 续 增 加, 产 酸 量 和 活 菌 总 数 反 而 出 现 下 降 的 趋 势 在 发 酵 过 程 中, 菌 体 大 量 繁 殖, 利 用 乳 糖 和 葡 萄 糖 做 为 能 源 物 质 [23] 当 发 酵 乳 中 添 加 的 葡 萄 糖 不 足 以 提 供 菌 体 繁 殖 所 需 要 的 能 源 物 质 时, 菌 体 的 繁 殖 受 到 影 响 当 发 酵 乳 中 的 葡 萄 糖 浓 度 过 大 时, 菌 体 的 生 长 也 将 受 到 抑 制 采 用 方 差 分 析 法 对 发 酵 乳 的 OD 值 进 行 显 著 性 分 析, 方 差 分 析 的 结 果 表 明 葡 萄 糖 添 加 量 对 OD 值 有 极 显 著 影 响 (P<0.01) 此 单 因 素 试 验 中, 最 佳 水 平 是 葡 萄 糖 的 添 加 量 为 3.0% 注 : 接 种 量 为 6%, 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 的 接 种 体 积 比 为 2 1, 发 酵 温 度 为 37, 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.6% Note: inoculation volume was 6 %,the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, fermentation temperature was at 37, soybean peptide level was 0.6 %. 图 4 葡 萄 糖 添 加 量 对 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 的 影 响 Fig.4 Effect of different glucose contents on ph value and average OD value of fermented milk 大 豆 多 肽 添 加 量 对 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 试 验 研 究 了 不 同 大 豆 多 肽 添 加 量 对 发 酵 乳 ph 值 和 OD 值 的 影 响, 试 验 结 果 见 图 5 从 图 中 可 以 得 到, 发 酵 乳 的 活 菌 总 数 和 产 酸 量 先 随 大 豆 多 肽 添 加 量 的 增 加 而 变 大, 当 添 加 量 达 到 0.8% 时,OD 值 为 1.067,pH 值 为 3.17, 此 条 件 下 的 产 酸 量 和 活 菌 总 数 最 大 当 大 豆 多 肽 添 加 量 大 于 0.8% 时, 发 酵 乳 的 产 酸 量 和 活 菌 总 数 变 化 不 明 显 由 于 乳 酸 菌 的 蛋 白 水 解 能 力 弱, 牛 乳 中 酪 蛋 白 形 成 的 短 肽 和 氨 基 酸 不 能 完 全 满 足 乳 酸 菌 高 密 度 生 长 的 需 要 [24], 将 一 定 量 的 大 豆 多 肽 添 加 到 牛 乳 中 可 为 乳 酸 菌 的 生 长 提 供 足 够 的 氮 源, 从 而 大 幅 度 提 高 菌 体 数 量 当 牛 乳 中 的 大 豆 多 肽 继 续 增 加 时, 菌 体 利 用 大 豆 多 肽 做 为 营 养 物 质 已 达 到 限 度, 所 以 活 菌 总 数 和 产 酸 量 变 化 并 不 明 显 为 考 查 大 豆 多 肽 添 加 量 对 发 酵 乳 活 菌 总 数 的 影 响 是 否 显 著, 对 试 验 结 果 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 不 同 大 豆 多 肽 添 加 量 下 的 OD 差 异 极 显 著 (P<0.01) 此 单 因 素 试 验 中, 最 佳 水 平 是 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.8% 注 : 接 种 量 为 6%, 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 的 接 种 体 积 比 为 2 1, 发 酵 温 度 为 37, 葡 萄 糖 的 添 加 量 为 3% Note: inoculation volume was 6%, the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, fermentation temperature was at 37, glucose level was 3 %. 图 5 大 豆 多 肽 添 加 量 对 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 的 影 响 Fig.5 Effect of different soybean peptide contents on ph value and average OD value of fermented milk 发 酵 温 度 对 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 试 验 研 究 了 不 同 发 酵 温 度 对 发 酵 乳 ph 值 和 OD 值 的 影 响, 试 验 结 果 见 图 6 由 图 中 可 以 看 出, 29~37 之 间 的 产 酸 量 和 活 菌 总 数 均 较 大, 最 佳 发 酵 温 度 为 33, 此 时 OD 值 为 1.083,pH 值 为 3.18 发 酵 温 度 过 低 或 过 高, 乳 酸 菌 的 细 胞 活 性 都 不 高, 影 响 基 因 的 表 达 与 转 录, 菌 体 的 大 量 繁 殖 将 受 到 抑 制 为 进 一 步 检 验 发 酵 温 度 对 发 酵 乳 活 菌 总 数 的 影 响 是 否 显 著, 对 试 验 结 果 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 结 果 表 明 发 酵 温 度 对 OD 值 有 极 显 著 影 响 此 单 因 素 试 验 中, 发 酵 温 度 的 最 佳 水 平 为 响 应 面 优 化 试 验 结 果 与 分 析 响 应 面 模 型 试 验 方 案 及 结 果 根 据 Box-Benhnken 的 中 心 组 合 试 验 设 计 原 理, 在 单 因 素 试 验 的 基 础 上, 固 定 接 种 量 为 6%, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12%, 选 取 发 酵 温 度 益 生 菌 接 种 比 例 葡 萄 糖 添 加 量 大 豆 多 肽 添 加 量 4 个 因 素 为 Box-Benhnken 设 计 的 自 变 量, 利 用 响 应 面 分 析 法 对 复 合 益 生 菌 的 发 酵 工 艺 条 件 进 行 优 化 由 单 因 素 试 验 可 知, 总 体 上 发 酵 乳 的 OD 值 越 大 所 对 应 的 ph 值 就 越 小, 即 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 与 产 酸 量 成 负 相 关 发 酵 结 束 后, 发 酵 乳 的 ph 值 均 在 3.6 以 下, 在 后 期 工 序

5 290 农 业 工 程 学 报 2013 年 的 调 配 过 程 中 无 需 额 外 添 加 酸 味 剂 而 反 映 发 酵 乳 品 质 的 主 要 是 活 菌 数, 因 此 在 响 应 面 分 析 试 验 中 仅 以 OD 作 为 响 应 面 试 验 因 素 与 设 计 见 表 1 表 1 响 应 面 分 析 因 素 与 水 平 Table 1 Variables and levels of response surface analysis 因 素 Factors 水 平 Level 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 比 例 Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium 葡 萄 糖 添 加 量 Glucose content/% 大 豆 多 肽 添 加 量 Soybean peptide content/% 发 酵 温 度 Fermentation temperature/ 1:1 2:1 3: 注 : 接 种 量 为 6%, 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 的 接 种 体 积 比 为 2 1, 大 豆 多 肽 的 添 加 量 为 0.8%, 葡 萄 糖 的 添 加 量 为 3% Note: inoculation volume was 6%,the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, soybean peptide level was 0.8%, glucose level was 3%. 图 6 发 酵 温 度 对 发 酵 乳 的 ph 值 和 OD 值 的 影 响 Fig.6 Effect of different fermentation temperature on ph value and average OD value of fermented milk 根 据 表 1 的 试 验 因 素 与 水 平 的 设 计, 进 行 四 因 素 三 水 平 响 应 面 试 验, 具 体 试 验 方 案 及 结 果 见 表 响 应 面 模 型 的 分 析 以 发 酵 乳 的 OD 值 为 响 应 值, 由 软 件 Design Expert 8.0 进 行 分 析, 得 到 的 结 果 见 表 3 试 验 号 Test number A( 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 比 例 ) Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium 表 2 响 应 面 分 析 试 验 结 果 Table 2 Results of response surface analysis B 葡 萄 糖 添 加 量 Glucose content C 大 豆 多 肽 添 加 量 Soybean peptide content D 发 酵 温 度 Temperature OD 值

6 第 13 期 刘 成 国 等 : 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 291 项 目 Iterm 表 3 OD 值 响 应 面 模 型 的 方 差 分 析 表 Table 3 Analysis of variance table for response surface quadratic model of average OD value 平 方 和 Quadratic sum 自 由 度 DOF 均 方 Mean square F 值 F value P 值 P value 显 著 性 Significance 模 型 Model < * * A < * * B < * * C < * * D < * * AB AC < * * AD BC < * * BD * * CD < * * A < * * B < * * C < * * D < * * 残 差 (residue) 失 拟 项 (lack of fit) 净 误 差 (net error) 总 误 差 (overall error) 注 :** 代 表 极 显 著 水 平 P<0.01,* 代 表 显 著 水 平 P<0.05 Note: ** represents the extremely significant level P<0.01, * represents the significant level P<0.05. 经 回 归 拟 合 后, 根 据 各 项 的 回 归 系 数, 去 掉 不 显 著 项 得 到 的 模 型 方 程 如 下 : OD = A 0.025B+0.029C+0.058D 0.058AC 0.069BC+0.014BD+0.059CD 0.11A B C D 2 (1) 式 中, OD 为 平 均 OD 值 ;A 为 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 的 接 种 体 积 比 ;B 为 葡 萄 糖 添 加 量,%;C 为 大 豆 多 肽 添 加 量,%;D 为 发 酵 温 度, 经 过 表 3 的 方 差 分 析 可 得 到, 该 模 型 达 到 极 显 著 的 水 平 (P<0.0001) 同 时, 该 模 型 的 失 拟 度 不 显 著 (P>0.1), 可 见 此 方 程 跟 实 际 数 据 拟 合 性 良 好, 试 验 设 计 可 靠, 适 用 于 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 条 件 的 优 化 信 噪 比 (Adeq Precision) 的 值 为 , 远 大 于 4, 因 此 该 模 型 可 用 于 预 测 试 验 数 据 决 定 系 数 R 2 =0.9981, 调 整 后 R 2 =0.9959, 说 明 该 模 型 的 变 量 与 自 变 量 之 间 关 系 显 著 在 此 模 型 中, 益 生 菌 比 例 葡 萄 糖 添 加 量 大 豆 多 肽 添 加 量 发 酵 温 度 对 发 酵 乳 的 OD 值 均 有 极 显 著 的 影 响 (P<0.0001) 且 益 生 菌 比 例 与 大 豆 多 肽 添 加 量 葡 萄 糖 添 加 量 与 大 豆 多 肽 添 加 量 葡 萄 糖 添 加 量 与 发 酵 温 度 大 豆 多 肽 添 加 量 与 发 酵 温 度 之 间 的 交 互 作 用 极 显 著 (P <0.0001) 各 因 素 间 的 交 互 作 用 分 析 对 响 应 面 模 型 中 交 互 作 用 显 著 的 因 素 (P<0.01) 进 行 分 析 1) 发 酵 温 度 与 大 豆 多 肽 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 发 酵 温 度 和 大 豆 多 肽 添 加 量 的 交 互 作 用 如 图 7 所 示 从 图 中 可 以 看 出, 在 较 低 的 发 酵 温 度 下, 随 着 大 豆 多 肽 添 加 量 的 增 加, 发 酵 乳 的 OD 值 变 化 趋 势 不 明 显 在 较 高 的 发 酵 温 度 下, 发 酵 乳 的 OD 值 随 大 豆 多 肽 添 加 量 的 增 加 先 升 高, 后 下 降 且 幅 度 不 大 在 相 同 的 大 豆 多 肽 添 加 量 的 情 况 下, 发 酵 乳 的 OD 值 随 着 发 酵 温 度 的 上 升 先 增 加 后 减 少, 且 大 豆 多 肽 添 加 量 高 时 的 增 幅 比 添 加 量 低 时 的 增 幅 大 在 温 度 较 低 的 情 况 下, 细 胞 中 酶 活 性 不 高, 所 以 增 加 发 酵 乳 中 的 营 养 因 子 浓 度 所 起 到 提 高 活 菌 数 的 作 用 也 就 不 大 当 发 酵 乳 中 有 足 量 的 营 养 物 质 供 菌 体 生 长 时, 活 菌 数 随 温 度 的 升 高 所 呈 现 的 增 幅 也 变 大 从 图 中 OD 值 出 现 的 最 大 值 区 域 可 以 看 出, 适 当 地 提 高 发 酵 温 度 和 大 豆 多 肽 添 加 量 有 利 于 发 酵 乳 活 菌 总 数 的 增 加

7 292 农 业 工 程 学 报 2013 年 3) 大 豆 多 肽 添 加 量 和 葡 萄 糖 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 注 : 干 酪 乳 杆 菌 和 双 岐 杆 菌 接 种 体 积 比 为 2 1, 葡 萄 糖 添 加 量 为 3%, 接 种 量 为 6 %, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 % Note: the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, glucose level was 3%, inoculation volume was 6%,,the mass fraction of skim milk solid was 12 %. 图 7 发 酵 温 度 与 大 豆 多 肽 添 加 量 对 OD 值 的 影 响 Fig.7 Combined effect of fermentation temperature and soybean peptide content on average OD value 2) 发 酵 温 度 与 葡 萄 糖 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 发 酵 温 度 和 葡 萄 糖 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 如 图 8 所 示 从 图 中 可 以 看 出, 随 着 发 酵 温 度 和 葡 萄 糖 添 加 量 的 增 加, 发 酵 乳 的 OD 值 也 不 断 地 变 大, 当 两 者 增 大 到 一 定 程 度 时, 发 酵 乳 的 OD 值 达 到 最 大 值, 当 发 酵 温 度 和 葡 萄 糖 添 加 量 继 续 增 加 时, OD 值 反 而 下 降 单 独 提 高 或 降 低 发 酵 温 度 或 葡 萄 糖 添 加 量, 都 不 会 使 发 酵 乳 的 OD 值 达 到 最 大 因 此, 只 有 发 酵 温 度 和 葡 萄 糖 添 加 量 同 时 取 适 中 值 时, 才 能 提 高 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 注 : 干 酪 乳 杆 菌 和 双 岐 杆 菌 接 种 体 积 比 为 2 1, 大 豆 多 肽 添 加 量 为 0.8%, 接 种 量 为 6 %, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 % Note: the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, soybean peptide level was 0.8 %, inoculation volume was 6%,,the mass fraction of skim milk solid was 12 %. 图 8 发 酵 温 度 与 葡 萄 糖 添 加 量 对 OD 值 的 影 响 Fig.8 Combined effect of fermentation temperature and glucose content on average OD value 注 : 干 酪 乳 杆 菌 和 双 岐 杆 菌 接 种 体 积 比 为 2 1, 发 酵 温 度 为 33, 接 种 量 为 6 %, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 % Note: Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1, fermentation temperature was at 33, inoculation volume was 6%,the mass fraction of skim milk solid was 12 %. 图 9 大 豆 多 肽 添 加 量 与 葡 萄 糖 添 加 量 对 OD 值 的 影 响 Fig.9 Combined effect of soybean peptide content and glucose content on average OD value 大 豆 多 肽 添 加 量 与 葡 萄 糖 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 见 图 9 从 图 中 可 以 看 出, 当 葡 萄 糖 添 加 量 取 值 在 2.5%~3% 以 及 大 豆 多 肽 添 加 量 在 0.8%~1.0% 时,OD 值 达 到 最 大 值 范 围 当 葡 萄 糖 添 加 量 和 大 豆 多 肽 添 加 量 同 时 作 为 营 养 因 子 添 加 到 发 酵 乳 中, 提 高 大 豆 多 肽 添 加 量 所 起 到 的 增 加 活 菌 数 作 用 要 大 于 提 高 葡 萄 糖 添 加 量 所 起 到 的 作 用 在 发 酵 乳 这 个 体 系 中, 总 营 养 物 质 的 浓 度 在 一 定 范 围 内 对 菌 体 的 生 长 是 有 利 的, 而 当 总 营 养 物 质 的 浓 度 过 高 或 过 低 时, 对 菌 体 的 生 长 都 起 到 抑 制 作 用 因 此, 适 当 提 高 大 豆 多 肽 添 加 量 的 同 时 降 低 葡 萄 糖 添 加 量 有 利 于 发 酵 乳 中 活 菌 数 的 提 高 4) 益 生 菌 接 种 比 例 与 大 豆 多 肽 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 益 生 菌 比 例 与 大 豆 多 肽 添 加 量 的 交 互 作 用 对 试 验 结 果 的 影 响 见 图 10, 从 图 中 可 以 得 到, 随 着 大 豆 多 肽 添 加 量 和 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 比 例 的 增 加, 发 酵 乳 的 OD 值 也 不 断 变 大, 当 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 的 比 值 增 大 到 1.5~2.5, 大 豆 多 肽 添 加 量 增 加 到 0.80%~0.95 % 时,OD 值 达 到 最 大 值 范 围 当 大 豆 多 肽 添 加 量 和 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 比 例 继 续 增 大 时, 发 酵 乳 中 OD 值 反 而 变 小 大 豆 多 肽 做 为 氮 源 添 加 到 牛 乳 中 时, 干 酪 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 对 其 利 用 情 况 不 同, 且 双 歧 杆 菌 的 需 求 量 要 大 于 干 酪 乳 杆 菌 因 此 OD 值 出 现 最 大 范 围 时, 大 豆 多 肽 提

8 第 13 期 刘 成 国 等 : 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 293 高 的 幅 度 要 大 于 干 酪 乳 杆 菌 与 双 歧 杆 菌 比 值 增 加 的 幅 度 单 方 面 增 加 或 减 少 益 生 菌 接 种 比 例 和 大 豆 多 肽 添 加 量 都 不 能 使 OD 值 达 到 最 大, 只 有 两 者 均 取 适 当 值 范 围 时 才 能 使 发 酵 乳 中 的 活 菌 数 达 到 最 大 值 注 : 葡 萄 糖 添 加 量 为 3%, 发 酵 温 度 为 33, 接 种 量 为 6 %, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 % Note: Glucose level was 3%, fermentation temperature was at 33, inoculation volume was 6%,,the mass fraction of skim milk solid was 12 %. 图 10 大 豆 多 肽 添 加 量 与 益 生 菌 接 种 体 积 比 对 OD 值 的 响 Fig.10 Combined effect of soybean peptide content and ratio of probiotics strains on average OD value 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 最 佳 工 艺 条 件 的 优 化 与 验 证 利 用 Design Expert8.0 软 件 进 行 分 析, 得 到 的 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 最 佳 工 艺 条 件 是 益 生 菌 比 例 为 , 葡 萄 糖 添 加 量 为 2.92%, 大 豆 多 肽 添 加 量 为 0.804%, 发 酵 温 度 是 33.8, 在 此 条 件 下 OD 预 测 值 为 在 工 业 生 产 中 为 了 便 于 实 践 操 作, 对 优 化 条 件 的 参 数 取 整 后 得 到 益 生 菌 比 例 为 3 1, 葡 萄 糖 添 加 量 2.9%, 大 豆 多 肽 添 加 量 为 0.8%, 发 酵 温 度 为 34, 为 检 验 响 应 面 模 型 的 可 靠 性, 按 上 述 最 佳 工 艺 条 件 重 复 3 次 试 验 并 用 平 板 计 数 法 测 定 此 条 件 下 的 最 大 活 菌 数, 以 及 测 定 发 酵 乳 的 ph 值 验 证 试 验 得 到 实 际 OD 值 为 1.087, 与 理 论 预 测 值 相 比, 相 对 误 差 为 1.0%, 可 见 通 过 响 应 面 优 化 方 法 得 到 的 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 最 佳 工 艺 条 件 是 可 靠 的 验 证 试 验 得 到 的 发 酵 乳 凝 固 状 态 均 匀, 乳 清 析 出 少, 且 有 浓 郁 的 发 酵 乳 香 味, 风 味 纯 正, 无 异 味 经 测 定 发 酵 乳 的 ph 值 为 3.17, 最 大 活 菌 数 为 cfu/ml, 陈 健 凯, 潘 裕 添, 林 洵 等 在 活 性 乳 [16] 酸 菌 乳 饮 料 高 活 菌 数 发 酵 工 艺 的 优 化 一 文 中 探 索 了 获 取 高 活 菌 数 的 发 酵 乳 饮 料 的 发 酵 条 件, 试 验 中 所 用 的 乳 酸 菌 为 干 酪 乳 杆 菌 结 果 表 明, 获 得 高 活 菌 数 的 发 酵 乳 最 佳 工 艺 条 件 为 : 发 酵 温 度 为 29, 奶 粉 加 入 量 ( 营 养 液 质 量 浓 度 ) 为 10g/L, 接 种 体 积 分 数 为 5%, 在 此 条 件 下 每 毫 升 发 酵 液 中 能 获 得 对 数 值 为 9.57( cfu/ml) 的 乳 酸 菌 数 本 试 验 将 菌 种 高 密 度 培 养 技 术 应 用 到 发 酵 乳 的 整 个 发 酵 过 程 中, 把 葡 萄 糖 和 大 豆 多 肽 的 添 加 量 做 为 试 验 考 查 的 因 素, 与 文 献 相 比, 活 菌 数 提 高 了 1-2 个 对 数 级 在 4 条 件 下 贮 藏 21 d 后, 优 化 后 的 发 酵 乳 活 菌 数 为 cfu/ml, 与 有 些 市 售 产 品 货 架 期 结 束 后 活 菌 数 仅 为 10 5 cfu/ml [10] 相 比, 优 化 后 的 发 酵 工 艺 不 仅 提 高 了 发 酵 乳 中 的 活 菌 数, 而 且 显 著 减 缓 了 活 菌 数 下 降 的 速 度 据 BCC 公 司 发 布 的 市 场 研 究 报 告 数 据 显 示 [25], 2013 年 全 球 益 生 菌 消 费 市 场 总 量 约 达 196 亿 美 元, 中 国 的 益 生 菌 产 品 年 消 费 市 场 总 量 达 到 130 亿 元 至 150 亿 元 人 民 币, 其 市 场 份 额 又 以 益 生 菌 发 酵 乳 制 品 为 主 张 天 鸿 报 道 的 益 生 菌 产 品 活 菌 数 与 保 健 效 [26] 果 关 系 之 研 究 一 文 从 菌 体 细 胞 的 大 小 角 度 分 析 得 出, 若 产 品 含 cfu/g 以 上 的 活 菌, 则 表 明 其 生 产 效 率 已 经 达 到 理 论 值 本 试 验 通 过 响 应 面 法 建 立 了 复 合 益 生 菌 发 酵 工 程 模 型 并 得 到 最 佳 发 酵 工 艺 条 件, 在 此 条 件 下 的 发 酵 乳 活 菌 数 可 达 到 cfu/ml, 解 决 了 当 前 市 售 益 生 菌 产 品 中 活 菌 数 不 足 的 问 题 本 研 究 的 结 果 表 明, 通 过 优 化 益 生 菌 发 酵 条 件, 在 发 酵 乳 中 添 加 适 量 的 大 豆 多 肽 和 葡 萄 糖 能 够 显 著 提 高 发 酵 乳 的 活 菌 数 (P<0.0001) 大 豆 多 肽 的 市 售 价 格 约 为 200 元 /kg, 葡 萄 糖 的 市 售 价 格 约 为 3.5 元 /kg, 且 两 者 的 添 加 量 很 小, 平 均 1 kg 的 发 酵 乳 中 所 增 加 的 成 本 大 约 为 1.7 元 主 要 的 成 本 来 源 是 大 豆 多 肽, 但 是 将 其 做 为 功 能 性 成 分 添 加 到 发 酵 乳 中 并 且 能 够 提 高 产 品 的 活 菌 数, 其 成 本 可 以 为 企 业 所 接 受 研 究 成 果 可 以 作 为 益 生 菌 发 酵 技 术 应 用 于 益 生 菌 饮 料 的 生 产 中, 也 可 应 用 于 工 业 化 生 产 益 生 菌 菌 种 应 用 于 普 通 酸 牛 乳 的 生 产, 从 而 大 大 提 高 酸 牛 乳 中 益 生 菌 数 量, 改 善 产 品 的 功 能 特 性 3 结 论 本 试 验 研 究 了 接 种 量 益 生 菌 比 例 葡 萄 糖 添 加 量 大 豆 多 肽 添 加 量 发 酵 温 度 对 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 中 发 酵 乳 活 菌 数 的 影 响 在 单 因 素 试 验 的 基 础 上, 用 方 差 分 析 法 对 试 验 结 果 进 行 显 著 性 分 析, 选 出 差 异 显 著 的 因 素 做 为 Box-Benhnken 设 计 的 自 变 量, 以 OD 值 为 响 应 面, 进 行 响 应 面 优 化 试 验, 利 用 Design Expert8.0 软 件 分 析 得 出 该 发 酵 体 系 模 型 达 到 极 显 著 的 水 平 (R 2 =0.9981), 并 可 对 试 验 结 果 进 行 预 测 在 此 模 型 中, 各 因 素 对 发 酵 乳 的 OD 值

9 294 农 业 工 程 学 报 2013 年 均 有 极 显 著 的 影 响 且 益 生 菌 比 例 与 大 豆 多 肽 添 加 量 葡 萄 糖 添 加 量 与 大 豆 多 肽 添 加 量 葡 萄 糖 添 加 量 与 发 酵 温 度 大 豆 多 肽 添 加 量 与 发 酵 温 度 之 间 的 交 互 作 用 极 显 著 发 酵 体 系 的 最 佳 工 艺 条 件 是 接 种 量 为 6%, 脱 脂 乳 乳 固 体 质 量 分 数 为 12 %, 干 酪 乳 杆 菌 : 双 歧 杆 菌 接 种 体 积 比 为 3 1, 葡 萄 糖 添 加 量 为 2.9%, 大 豆 多 肽 添 加 量 为 0.8%, 发 酵 温 度 为 34 在 此 条 件 下 OD 预 测 值 为 1.076, 试 验 验 证 值 为 1.087, 相 对 误 差 为 1% 验 证 试 验 得 到 的 发 酵 乳 凝 固 状 态 均 匀, 乳 清 析 出 少, 且 有 浓 郁 的 发 酵 乳 香 味, 风 味 纯 正, 无 异 味, 发 酵 乳 的 ph 值 为 3.17, 最 大 活 菌 数 为 cfu/ml 本 试 验 将 菌 种 高 密 度 培 养 技 术 应 用 到 发 酵 乳 的 整 个 发 酵 过 程, 将 葡 萄 糖 和 大 豆 多 肽 的 添 加 量 做 为 试 验 考 查 的 因 素 与 已 有 报 道 相 比, 活 菌 数 提 高 了 1~2 个 对 数 级 在 4 条 件 下 贮 藏 21 d 后, 发 酵 乳 活 菌 数 为 cfu/ml, 与 有 些 市 售 产 品 货 架 期 结 束 后 活 菌 数 低 于 10 5 cfu/ml 相 比, 优 化 后 的 发 酵 工 艺 不 仅 提 高 了 发 酵 乳 中 的 活 菌 数, 而 且 显 著 减 缓 了 活 菌 数 下 降 的 速 度 可 见 通 过 响 应 面 优 化 法 与 模 型 的 建 立 得 到 的 复 合 益 生 菌 发 酵 体 系 最 佳 工 艺 条 件 对 实 际 生 产 具 有 指 导 意 义 [ 参 考 文 献 ] [1] Million M, Raoult D. Publication biases in probiotics[j]. Eur J Epidemiol, 2012(27): [2] 邱 宏 端, 林 娟, 宋 智 晶, 等. 植 物 多 糖 的 提 取 及 对 双 歧 杆 菌 的 增 殖 作 用 [J]. 农 业 工 程 学 报,2002,18(2): Qiu Hongduan, Lin Juan, Song Zhijing, et al. Extraction of vegetal polysaccharose and its effect on Bifidobacterium multiplication[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2002, 18(2): (in Chinese with [3] 张 勇, 刘 勇, 张 和 平. 世 界 益 生 菌 产 品 研 究 和 发 展 趋 势 [J]. 中 国 微 生 态 学 杂 志,2009,21(2): [4] Shah N P. Probiotic bacteria selective enumeration and survival in dairy foods[j]. Dairy Sci, 2000, 83: [5] 赵 瑞 香, 王 大 红, 孙 俊 良, 等. 嗜 酸 乳 杆 菌 微 胶 囊 的 热 稳 定 性 及 热 动 力 学 研 究 [J]. 农 业 工 程 学 报,2006, 22(10): Zhao Ruixiang, Wang Dahong, Sun Junliang, et al. Thermal stability and thermodynamics of Lactobacillus acidophilus microcapsule[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2006, 22(10): (in Chinese with [6] Nasrin M, Mohamad R E, Zahra E, et al. Effect of refrigerated storage time on the viability of probiotic bacteria in fermented probiotic milk drinks: Journal of the Society of Dairy Technology[J]. International Journal of Dairy Technology, 2009, 62(2): [7] Li Day, Robert B. Seymour, et al. Incorporation of functional ingredients in to foods[j]. Trends Food Sci Techno, 2009, 9(20): [8] 张 开 屏, 田 建 军, 刘 静, 等. 双 歧 杆 菌 与 乳 酸 菌 混 合 发 酵 乳 的 研 究 [J]. 中 国 乳 品 工 业,2011,39(11):7-9. Zhang Kaiping, Tian Jianjun, Liu Jing, et al. Studies on the yoghurt fermented by Bifidobacteria and Lactobacteria together[j]. China Dairy Industry, 2011, 39(11): 7-9. (in Chinese with [9] 朱 丽 云, 张 拥 君, 高 永 生, 等. 货 架 期 内 酸 乳 益 生 菌 菌 数 与 酸 度 变 化 研 究 [J]. 中 国 乳 品 工 业,2011,39(6): Zhu Liyun, Zhang Yongjun, Gao Yongsheng, et al. During the yoghurt s shelf-life to research the content of probiotics and Aciditie s change[j]. China Dairy Industry, 2011, 39(6): (in Chinese with [10] 艾 连 中, 何 楚 莹, 徐 致 远, 等. 干 酪 乳 杆 菌 货 架 期 存 活 性 影 响 因 素 的 研 究 [J]. 食 品 与 发 酵 工 业,2010, 36(6): Ai Lianzhzong, He Chuying, Xu Zhiyuan, et al. Influence Factors of Lactobacillus casei Viability in Milk Drink, s Shelf-life[J]. Food and Fermentation Industries, 2010, 36(6): (in Chinese with [11] 霍 贵 成. 乳 酸 菌 的 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社,2007:58. Hui Guicheng. Research and application of lactic acid bacteria[m]. Beijing: China Light Industry Press, 2007: 58. (in Chinese with [12] 孟 祥 晨, 杜 鹏, 李 艾 黎, 等. 乳 酸 菌 与 乳 品 发 酵 剂 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,2009:94. Meng Yangchen, Du Peng, Li Aili, et al. Lactic acid bacteria and dairy starter culture[m]. Beijing: Science Press, 2009: 94. (in Chinese with [13] 白 凤 翎, 曲 玲 童, 张 柏 林, 等. 大 豆 蛋 白 水 解 物 促 乳 酸 菌 增 殖 发 酵 的 研 究 [J]. 食 品 工 业 科 技,2012,33(16): Bai Fengling, Qu Lingtong, Zhang Bolin, et al. Study on soy protein promoting proliferation fermention of lactic acid bacteria[j]. Science and Technology of Food

10 第 13 期 刘 成 国 等 : 高 活 菌 数 复 合 益 生 菌 发 酵 乳 工 艺 优 化 295 Industry, 2012, 33(16): (in Chinese with [14] Collado M C, Meriluoto J, Salminen S. In vitro analysis of probioticst rain combinations to inhibit path ogen adhesion to human intestinalmucus[j]. Food Res Int, 2007, 40(5): [15] 张 大 为, 张 洁, 邝 仁 亮. 产 细 菌 素 的 嗜 酸 乳 杆 菌 WS 发 酵 动 力 学 模 型 的 建 立 [J]. 农 业 工 程 学 报,2008,24(3): Zhang Dawei, Zhang Jie, Kuang Renliang. Development of fermentation kinetic models for Lactobacillus acidophilus WS capable of producing bacteriocin[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2008, 24(3): (in Chinese with [16] 陈 健 凯, 潘 裕 添, 林 洵, 等. 活 性 乳 酸 菌 乳 饮 料 高 活 菌 数 发 酵 工 艺 的 优 化 [J]. 食 品 与 生 物 技 术 学 报,2009, 28(4): Chen Jianka, Pa Yutian, Lin Xun, et al. Optimized the Fermentation Conditions for Highly Active Lactococcus in Fermented Milk Beverage[J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2009, 28(4): (in Chinese with [17] 李 学 贵, 袁 生. 微 生 物 转 化 过 程 中 利 用 OD 值 实 时 监 测 细 菌 生 物 量 变 化 的 研 究 [J]. 南 京 师 大 学 报,2003, 26(4): Li Xuegui, Xuan Sheng. OD Value Assay was Used to Determine Bacterial Biomass in the Real- Time Detection During Microbial Transformation[J]. Journal of Nanjing Normal University,2003,26(4): (in Chinese with [18] 张 军 伟, 傅 大 放, 彭 奇 均, 等. 响 应 面 法 优 化 酸 水 解 稻 秆 制 木 糖 的 工 艺 参 数 [J]. 农 业 工 程 学 报,2009, 25(11): Zhang Junwei, Fu Dafang, Peng Qijun, et al. Optimized conditions for production of xylose by acid-hydrolysis of rice straw based on response surface methodology[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2009, 25(11): (in Chinese with [19] 张 黎 骅, 张 文, 吕 珍 珍, 等. 响 应 面 法 优 化 酒 糟 微 波 间 歇 干 燥 工 艺 [J]. 农 业 工 程 学 报,2011,27(3): Zhang Lihua, Zhang Wen, Lü Zhenzhen, et al. Optimization of intermittent microwave drying technology for lees by response surface methodology[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2011, 27(3): (in Chinese with [20] 周 向 荣, 夏 延 斌, 周 跃 斌. 响 应 面 法 优 化 盐 渍 藠 头 蒜 素 提 取 工 艺 参 数 [J]. 农 业 工 程 学 报,2008,24(2): Zhou Xiangrong, Xia Yanbin, Zhou Yuebin. Optimization of the technology for extracting allicin from pickled Allium Chinense G. Don by response surface methodology[j]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2008, 24(2): (in Chinese with [21] 吕 加 平, 董 晓 波, 肖 锐. 发 酵 乳 品 中 乳 酸 菌 生 物 量 测 定 方 法 的 研 究 [J]. 肉 品 卫 生,1997(2):3-7. [22] 严 佩 峰, 张 孔 海, 李 建 芳. 乳 酸 菌 培 养 液 中 活 菌 数 与 吸 光 度 的 关 系 研 究 [J]. 信 阳 农 业 高 等 专 科 学 校 学 报, 2012,22(1): Yan Peifeng, Zhang Konghai, Li Jianfang. On the relations between viable bacteria counts and absorbency of fermented liquid of lactobacillus[j]. Journal of Xinyang Agricultural College, 2012, 22(1): (in Chinese with [23] 袁 秀 丽, 吕 嘉 枥, 韩 迪, 等. 益 生 菌 制 品 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 乳 品 工 业,2010,38(4): Yuan Xiuli, Lv Jiali, Han Di, et al. Research progress of probiotic products[j]. China Dairy Industry, 2010,38(4): (in Chinese with [24] Poolman B, Konings W N. Relation of growth of Streptococcuslactis and Streptococcus cremoris to amino acid transport[j]. Journal of Bacteriology, 1988, 170(2): [25] 雷 芸. 益 生 菌 及 其 制 品 研 究 和 应 用 开 发 的 最 新 进 展 [J]. 甘 肃 联 合 大 学 学 报,2013,27(1): Lei Yun. The latest progress of research and application on probiotics and its products[j]. Journal of Gansu Lianhe University, 2013, 27(1): (in Chinese with [26] 张 天 鸿. 益 生 菌 产 品 活 菌 数 与 保 健 效 果 关 系 之 研 究 [J]. 现 代 食 品 科 技,2011,21(4): Zhang Tianhong. The relation between probiotics s live cultures and health function[j]. Modern Food Science and Technology, 2011, 21(4): (in Chinese with

11 296 农 业 工 程 学 报 2013 年 Optimization of fermentation conditions of milk with blend probiotic strains based on high viable count Liu Chengguo 1,2, Yi Wenzhi 1, Zhou Hui 1,2 (1. College of food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha , China; 2. Hunan Provineial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha , China) Abstract: The viable probiotic count is the key factor to functionality of fermented milk. It is very important for the milk industry to improve the number of viable bacteria in its final products. Lactobacillus casei and Bifidobacterium were blended using them as a starter culture for fermented milk to achieve a high viable probiotic count. Lactobacillus casei and Bifidobacterium were studied and a high density culture technology of Lactobacillus was applied to increase the number of viable bacteria in the fermentation system. Determination of the absorbance method was used to assess the viable count of probiotics in fermented milk in which the calcium ion would combine with salt under alkaline conditions to make fermented milk dispersed evenly in a solution state. Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) was selected as a chelating agent to chelate the calcium ion in the fermented milk, and to make the solution clarify. The OD value of the bacteria did not change significantly after entering the stable phase, and the number of viable probiotics count in the fermented milk achieved the maximum. The OD value of fermented milk in this study did not change significantly from the second day of fermentation. On this basis, OD value was measured for three consecutive days from the second day, and the average OD value was used as indicator of the viable probiotic count. Inoculation volume ratio of probiotics strains added glucose, added soybean peptide, and fermentation temperature were studied as a single factor affecting the number of viable bacterium in the fermented milk. Results show that the average OD value at different inoculation volume was not significant (P<0.01) while the other four factors were highly significant (P>0.01). The ratio of probiotics strains in blend culture glucose level soybean peptide level, and fermentation temperature were further studied using a Box-Benhnken design to optimize the fermentation technology. The results were analyzed with the software Design Expert to 8.0. Results indicated that the fermentation system model had an extremely significant effect on predicting the result of the test. The studied factors had significant effects on the average OD value of fermented milk. Results of the response surface optimization test showed that the optimal fermentation condition was: inoculation volume was 6%, the mass fraction of kim milk solid was 12%, the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium in blend culture was 3:1, glucose level was 2.9%, soybean peptide level was 0.8%, and fermentation temperature was at 34. The predicated average OD value was with the optimal fermentation condition, and the verification tests demonstrated that the actual value was 1.087, the relative error was 1.0% compared with the predicated value. The verification tests also showed that the coagulation state of fermented milk was uniform, with less whey separation, and that there was a rich fermented milk flavor, pure without a peculiar smell. The maximum number of viable probiotics count was cfu/ml., which is 78.3% higher than the maximum number of viable count ( cfu/ml) before the optimization process. When stored under 4 after 21 d, the number of viable probiotics count remained at cfu/ml. The research result could be used as a probiotic fermentation technology applied to production of probiotic beverages. In addition, it was applied to the industrialized production of probiotic strains used in common acid milk production. Thus, the result greatly increased the viable count of probiotic in the fermented milk and improved functional properties of the product. Key words: fermentation, optimization, models, probiotic, lactobacillus casei, bifidobacterium ( 责 任 编 辑 : 郭 海 枫 )