1994 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012,28(11): [ 文章编号 ] (2012) 实验技术 IgH 基因单克隆重排检测及其在 B 细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用李银珍 1

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1 1994 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012,28(11): [ 文章编号 ] (2012) 实验技术 IgH 基因单克隆重排检测及其在 B 细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用李银珍 1, 王芳 1, 邵琼 1, 张旭 1, 邓玲 1, 汤涛 1, 张晓 1 2, 吴秋良 ( 华南肿瘤学国家重点实验室, 中山大学肿瘤防治中心 1 分子诊断科, 2 病理科, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 建立准确可靠操作性强适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链 (immunoglobulinheavy chain,igh) 基因单克隆重排检测方法, 用于 B 细胞性非霍奇金淋巴瘤 (B-celnon-Hodgkinlymphoma,B-NHL) 的辅助诊断方法 : 采用骨架区 (frameworkregion,fr) 引物 FR2 FR3 和重链连接区 (joiningregionofheavychain, J H ) 引物 LJH VLJH 组合 A 管 +B 管模式半巢式聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction,pcr) 法对 121 例 B- NHL 58 例 T 细胞性非霍奇金淋巴瘤 (T-celnon-Hodgkinlymphoma,T-NHL) 和 19 例淋巴结反应性增生的石蜡组织进行 IgH 基因单克隆重排检测, 分析 IgH 基因单克隆重排检出率在 B-NHL 组 T-NHL 组和淋巴结反应性增生组中的差异, 以及 B-NHL 中联合应用 FR2 和 FR3 与单独应用 FR2 FR3 之间 IgH 基因单克隆重排检出率的差异结果 :118 例成功检测的 B-NHL 中,IgH 基因单克隆重排检出率为 81%(96/118);54 例成功检测的 T-NHL 中,IgH 基因单克隆重排检出率为 4%(2/54);19 例成功检测的淋巴结反应性增生中未检出 IgH 基因单克隆重排 B-NHL 组与 T-NHL 组淋巴结反应性增生组相比,IgH 基因单克隆重排检出率差异具有显著性 (P<0 05) B- NHL 中,FR2 基因单克隆重排检出率为 58%(68/118),FR3 基因单克隆重排检出率为 55%(65/118), 联合应用 FR2 和 FR3,IgH 基因单克隆重排检出率为 81%(96/118), 联合应用 FR2 和 FR3 与单独应用 FR2 FR3 的检出率有显著差异 (P<0.05) 结论: 采用 FR2 FR3 LJH 及 VLJH 引物组合 A 管 +B 管模式和半巢式 PCR 法进行石蜡组织 IgH 基因单克隆重排检测, 简单易行, 结果准确可靠, 阳性率较高, 可用于临床 B-NHL 的辅助诊断 [ 关键词 ] 淋巴瘤 ; 免疫球蛋白 ; 基因重排 [ 中图分类号 ] R733.4 [ 文献标志码 ] A doi: /j.isn Detectionofmonoclonalimmunoglobulinheavychaingenerearrangements anditsapplicationindiagnosisofb-celnon-hodgkinlymphoma LIYin-zhen 1,WANGFang 1,SHAOQiong 1,ZHANGXu 1,DENGLing 1,TANGTao 1, ZHANGXiao 1,WUQiu-liang 2 ( 1 DepartmentofMolecularDiagnosis, 2 DepartmentofPathology,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,SunYat -senuniversitycancercenter,guangzhou510060,china. wuql@sysuc.org.cn) [ABSTRACT] AIM:Toestablishareliableandfeasibleprotocolfordetectionofmonoclonalimmunoglobulin heavychain(igh)generearangementsforroutinediagnosisofb-celnon-hodgkinlymphoma(b-nhl).meth ODS:UsingtheprimercombinationsofFR2,FR3,LJHandVLJH,modetubeA+tubeB,andsemi-nestedPCR,the monoclonalighgenerearangementsin121casesofb-nhl,58casesoft-celnon-hodgkinlymphoma(t-nhl) and19casesofreactivelymphoidhyperplasiaweredetected.thediferencesofclonalitydetectionratebetweenb-nhl groupandt-nhlgroup,b-nhlgroupandreactivelymphoidhyperplasiagroup,andbetweentheuseoffr2,fr3and FR2+FR3primerswereanalyzed.RESULTS:TheclonalitydetectionratesofB-NHL,T-NHLandreactivelymphoid hyperplasiawere81% (96/118),4% (2/54)and0% (0/19).TherewereremarkablediferencesbetweenB-NHL groupandt-nhlgroup,b-nhlgroupandreactivelymphoidhyperplasiagroupinmonoclonalighgenerearangements (P<0.05).InB-NHLgroup,monoclonalitywasfoundin58% ofthecasesusingprimerfr2,55% usingfr3,and [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 基金项目 ] 中山大学肿瘤防治中心单病种科研基金 (No ) 通讯作者 Tel: ; wuql@sysucc.org.cn

2 % usingthecombinationofbothprimers,withsignificantdiferences(p<0.05).conclusion:usingtheprimer combinationsoffr2,fr3,ljhandvljh,detectionofparafin-embeddedtisues,themethodoftubea+tubebmode andsemi-nestedpcrfordeterminingmonoclonalighgenerearangementsisfeasibleandreliable,andtheclonalityde tectionrateishighenoughforclinicaldiagnosisofb-nhl. [KEYWORDS] Lymphoma;Immunoglobulin;Generearangement 免疫球蛋白重链 (immunoglobulinheavychain,igh) 基因单克隆重排是 B 细胞性非霍奇金淋巴瘤 (B-celnon- Hodgkinlymphoma,B-NHL) 的重要特征, 国内外病理界已达成一致共识 : 应用聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction, PCR) 技术检测 IgH 基因单克隆重排可以辅助诊断 B- NHL [1-3] 由于 IgH 基因单克隆重排过程的复杂性多样性和引物设计的局限性,IgH 基因单克隆重排的检测方法目前并没有统一的标准, 假阴性率和假阳性率较高, 使其应用受到限制 [2] 2008 年起, 本课题组不断优化引物选择改进检测体系, 最终建立了成熟的 IgH 基因单克隆重排检测方法, 与临床病理诊断取得了高度的一致性与吻合率本文将介绍优化的 IgH 基因单克隆重排检测方法, 并且比较 IgH 基因单克隆重排检出率在 B-NHL 和 T 细胞性非霍奇金淋巴瘤 (T-celnon-Hodgkinlymphoma,T-NHL) 淋巴结反应性增生中的差异, 为 IgH 基因单克隆重排检测用于 B-NHL 辅助诊断提供依据材料和方法 1 标本来源 198 例石蜡标本均来自中山大学肿瘤防治中心病理科 2009 年 ~2011 年间诊断为淋巴瘤的存档蜡块及外院送检石蜡标本, 男性 134 例, 女性 64 例标本分为 B-NHL 组 121 例 T-NHL 组 58 例和淋巴结反应性增生组 19 例阳性对照为证实发生 IgH 基因单克隆重排的 B-NHL 病例, 阴性对照为淋巴结慢性炎, 空白对照为双蒸水所有病例均由两位高年资病理医生重新阅片并按照 2008 年 WHO 标准进行诊断和分类 2 DNA 提取用无菌刀片切取石蜡标本 3~4 片, 厚度为 4~5μm, 裱于非涂胶白片常规脱蜡后, 对照 HE 刮取肿瘤组织, 避开坏死出血组织按照 QIAamp DNAFFPETisueKit 说明书提取 DNA,-20 保存 3 DNA 质量检测核酸蛋白测定仪检测 DNA 的浓度与纯度, 并稀释至 50 ~70mg/L, 看家基因 β-actin 扩增, 证实 DNA 的质量 4 引物设计 IgH 基因单克隆重排检测所使用上游引物针对骨架区 (frameworkregion,fr)2 和 FR3 设计, 下游引物针对重链连接区 (joiningregionofheavychain,j H ) 设计, 命名为 LJH 和 VLJH, 见图 1 引物 FR2 FR3 LJH VLJH 以及内参照引物 β -actin 均由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成, 序列见表 1, 稀释至 10μmol/L,-20 保存 Figure1.TheprimersofmonoclonalIgHgenerearangement. 图 1 IgH 基因单克隆重排引物设计表 1 引物序列 Table1.Thesequencesoftheprimers Primer Sequence FR2 5 -TGGRTCCGMCAGSCYYCNGG-3 FR3 5 -ACACGGCYSTGTATTACTGT -3 LJH 5 -TGAGGAGACGGTGACC-3 VLJH 5 -GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG -3 β-actin-f 5 -CTCCATCCTGGCCTCGCTGT -3 β-actin-r 5 -GCTGTCACCTTCACCGTTCC -3 5 PCR 扩增 PCR 体系均为 25μL, 反应液为 2 PfuPCRMasterMix IgH 基因单克隆重排检测采用半巢式 PCR 法,A 管 +B 管模式,A 管上游引物为 FR2,B 管上游引物为 FR3, 第 1 轮 PCR 下游引物为 LJH, 第 2 轮 PCR 下游引物为 VLJH, 所有标本进行复孔 PCR 程序为 :95 预变性 5min,95 30s,58 30 s,72 1min,33 个循环 ( 半巢式 PCR 第 1 轮为 16 个循环 ), 最后 72 7min 6 PCR 产物分析 PCR 产物经 2% 琼脂糖 ( 含 0.5mg/LEB 替代液 ) 电泳, 电压 220V,25min, 凝胶成像系统照相分析 7 盲法设计采用 Excel 表中的 Random 函数对标本进行随机排列, 以排除结果判读时的主观倾向 8 IgH 基因单克隆重排判断标准电泳后, 见 1~2 条清晰条带, 边缘整齐, 宽 <lmm, 其中 IgH 基因单克隆重排 A 管条带 250~270bp,B 管条带 80~ 120bp, 且复孔结果一致, 视为 IgH 基因单克隆重排阳性 ; 背景上条带弥散呈涂抹状或无条带存在, 或复孔结果不一致, 视为阴性, 见图 2

ResultofclonalIgHgenerearangements.Marker:50 bpdna ladder;pc:positivecontrol;nc:negative control;bc:blankcontrol;s1:sample1,positive; S2:sample2,positive;S3:sample3,negative.

3 1996 表 2 IgH 基因单克隆重排的组间差异 Table2.B-NHLidentifiedbytheuseofmonoclonalIgHgene rearangements Group n Positive Negative Detectionrate B-NHL %(96/118) T-NHL %(2/54) Lymphadenosis %(0/19) Figure2.ResultofclonalIgHgenerearangements.Marker:50 bpdna ladder;pc:positivecontrol;nc:negative control;bc:blankcontrol;s1:sample1,positive; S2:sample2,positive;S3:sample3,negative. 图 2 IgH 基因单克隆重排判断标准 9 统计学处理采用 2 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义结果 1 DNA 质量检测经核酸蛋白测定仪与 β-actin 扩增检测,121 例 B- NHL 中,3 例没有 DNA,58 例 T-NHL 中,4 例没有 DNA 其余 DNA 浓度在 76.5~359.1mg/L 之间,A 260/280 值在 1.9~ 2 0 之间,β-actin 扩增在 268bp 处均有明亮单一的条带, 见图 3 Figure3.PCRresultofβ-actin.M:50bpDNAladder;S1~ S10:sample1~10. 图 3 β-actin 扩增结果 2 IgH 基因单克隆重排检出率的组间差异 118 例 B-NHL 中,96 例检测到 IgH 基因单克隆重排, 检出率为 81%(96/118);54 例 T-NHL 中,2 例检测到 IgH 基因单克隆重排, 检出率为 4%(2/54),19 例淋巴结反应性增生中, 未检测到 IgH 基因单克隆重排, 见表 2 B-NHL 组与 T-NHL 组淋巴结反应性增生组相比,IgH 基因单克隆重排检出率差异显著 (P 值分别为和 ) 3 IgH 基因单克隆重排检出率的基因差异 118 例 B-NHL 中,FR2 基因单克隆重排检出 68 例, 检出率为 57.62%(68/118),FR3 基因单克隆重排检出 65 例, 检出率为 55.08%(65/118), 联合应用 FR2 和 FR3,IgH 基因单克隆重排检出 96 例, 检出率为 81.36%(96/118), 见表 3 FR2 与 FR3 之间检出率差异无统计学意义 (P>0.05), 联合应用 FR2 和 FR3 与单独应用 FR2 FR3 的检出率差异有统计学意义 (P 值分别为和 ) 4 B-NHL 各亚类检测结果 118 例 B-NHL 中,IgH 基因单克隆重排检出率从高到低依次为 : 套细胞性淋巴瘤 95%(18/19)> 伯基特淋巴瘤 89% (8/9)> 小 B 细胞性淋巴瘤 86%(6/7)> 边缘区淋巴瘤 83% (24/29)> 滤泡性淋巴瘤 82%(23/28) > 弥漫大 B 细胞性淋巴瘤 65%(17/26), 见表 3 表 3 IgH 基因单克隆重排在不同类型 B-NHL 中的差异 Table3.ThetypesofB-NHLidentifiedbytheuseofmono clonalighgenerearangements Type n Positive-FR2 Positive-FR3 Total BL 9 67%(6/9) 67%(6/9) 89%(8/9) FL 28 50%(14/28) 46%(13/28) 82%(23/28) DLBCL 26 46%(12/26) 42%(11/26) 65%(17/26) MCL 19 68%(13/19) 74%(14/19) 95%(18/19) SLL 7 71%(5/7) 86%(6/7) 86%(6/7) MZL 29 62%(18/29) 52%(15/29) 83%(24/29) Total %(68/118) 55%(65/118) 81%(96/118) BL:Burkitlymphoma;FL:folicularlymphoma;DLBCL: difuselargeb-cellymphoma;mcl:mantlecellymphoma; MZL:marginalzonelymphoma;SLL:smallymphocyticlympho ma. 讨论在 B 淋巴细胞分化成熟过程中, 免疫球蛋白 (immuno globulin,ig) 基因的 V D J 片段要发生分子重排, 从而成为具有表达功能的基因当某一 B 淋巴细胞克隆性增生 ( 如 B- NHL) 时, 这些相同的 Ig 基因重排构型经 PCR 扩增后, 电泳呈一窄带, 称为单克隆 ; 不同来源的淋巴细胞其重排的碱基序列各异, 经 PCR 扩增后, 电泳呈弥散分布或涂抹状, 称为多克隆因此检测标本是否发生 Ig 基因单克隆重排可辅助诊断 B-NHL [2-3] 2002 年 BIOMED -2 协作研究计划完成, 该研究报

4 1997 道 [2,7-8], 采用新鲜标本或冰冻组织,28 条引物 8 个反应管同时检测免疫球蛋白重链 (heavychain,h) κ 链轻链 (light chain,l),b 细胞淋巴瘤中 Ig 基因单克隆重排的检出率可达 90% 以上临床实际工作中, 送检的均为石蜡包埋组织, 新鲜标本难以得到, 且 28 条引物 8 个反应管同时检测繁琐费时, 不利于临床上普及应用, 因此我们综合国内外文献报道 [1,9], 结合临床实际, 反复实践, 将 Ig 基因单克隆重排的检测方案做了如下优化 : 以重排检出率最高的 IgH 为检测对象, 采用 FR2 FR3 LJH VLJH 引物组合 A 管 +B 管模式半巢式 PCR 法本研究利用该实验方案对 118 例 B-NHL 石蜡组织进行 IgH 基因单克隆重排检测, 检出率为 81%, 与国内外报道的 70% -90% 的检出率一致 [4-7] 54 例 T-NHL 中, 2 例检测到 IgH 基因单克隆重排阳性, 检出率为 4%(2/54), 19 例淋巴结反应性增生病例均未检出 IgH 基因单克隆重排 B-NHL 组与 T-NHL 组淋巴结反应性增生组相比,IgH 基因单克隆重排检出率差异显著, 因此可用该实验方案检测 IgH 基因单克隆重排辅助临床 B-NHL 的诊断研究显示,FR2 与 FR3 之间检出率 (58% 与 55%) 差异不具有统计学意义, 联合应用 FR2 和 FR3( 检出率为 81%) 与单独应用 FR2 FR3 的检出率差异有统计学意义由此可见, 联合应用 FR2 和 FR3 可显著提高 IgH 基因单克隆重排检测率本研究 118 例 B-NHL, 涵盖了临床诊断中 6 种最常见的 B-NHL 类型, 其检出率由高到低依次为 : 套细胞性淋巴瘤 95%(18/19)> 伯基特淋巴瘤 89%(8/9)> 小 B 细胞性淋巴瘤 86%(6/7)> 边缘区淋巴瘤 83%(24/29)> 滤泡性淋巴瘤 82%(23/28) > 弥漫大 B 细胞性淋巴瘤 65%(17/26), 与 BIOMED-2 计划国内李新霞等的报道一致 [7-9] 本研究显示,IgH 基因单克隆重排在套细胞性淋巴瘤伯基特淋巴瘤和小 B 细胞性淋巴瘤中检出率高达 85% 以上, 推测可能是因为套细胞淋巴瘤伯基特淋巴瘤和小 B 细胞性淋巴瘤的肿瘤细胞主要来源于生发中心前 B 细胞, 较少发生体细胞突变, 因此检出率较高对于边缘区淋巴瘤滤泡性淋巴瘤和弥漫大 B 细胞性淋巴瘤等成熟型的淋巴瘤, 由于发生体细胞超突变, 导致 V H 基因片段缺失, 因此阳性率稍低 [9] 由此可见,IgH 基因单克隆重排的结果对套细胞性淋巴瘤伯基特淋巴瘤和小 B 细胞性淋巴瘤的诊断具有明确的指导意义 54 例 T-NHL 中,2 例检测到 IgH 基因单克隆重排阳性, 其中 1 例为血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤,1 例为外周 T 细胞性淋巴瘤, 检出率为 4%(2/54) 我们对这 2 例 T 细胞性淋巴瘤病例另外进行了 TCRγ 基因单克隆重排的检测, 发现其 TCRγ 基因单克隆重排也为阳性, 即为文献报道的双重排阳性 [10], 其检出率为 5% ~29% PCR 技术应用于石蜡组织 IgH 基因单克隆重排检测以来, 一直饱受假阳性和假阴性的困扰, 其原因主要有以下几点 :(1) 石蜡标本固定不规范 ;(2) 组织在甲醛固定酒精脱水石蜡包埋过程中,DNA 的完整性受到破坏 ;(3) 切片厚度 >5μm, 切片数量过多等导致脱蜡不干净消化不彻底, 影响 DNA 的质量 ;(4) 坏死出血组织过多抑制 PCR 反应 ;(5) 反应性增生淋巴细胞比例过大, 恶性单克隆细胞不能成为优势, 单克隆条带淹没在弥散或涂抹状电泳中 ;(6) 模板 DNA 的量过多或过少均会导致假阳性和假阴性的存在 ;(7) 引物覆盖率不高 ;(8) 检测方法敏感性低为提高 IgH 基因单克隆重排的检出率, 保证实验结果准确可靠, 我们做了以下改进 :(1) 组织用 10% 中性福尔马林固定 8~10h;(2) 组织求精不贪多, 厚度 4~5μm, 手术标本 2~3 张切片即可, 活检穿刺标本 10~12 张切片裱在 2 张 HE 玻片上 ;(3) 对照 HE 染色刮片, 只刮取肿瘤组织 ;(4) 使用专业的石蜡组织 DNA 提取试剂盒 ;(5) 检测 DNA 的浓度与纯度, 将 DNA 稀释至 50~70mg/L 浓度范围 ;(6) 使用看家基因 β-actin 扩增, 证实 DNA 的质量 ;(7) 采用更为敏感的半巢式 PCR 法, 提高检出率 ;(8) 每次实验均设阳性对照阴性对照和空白对照 ;(9) 由 PCR 经验丰富的技术人员进行实验本研究经以上改进,198 例标本中, 共有 7 例无 DNA, 排除了假阴性的可能, 其余标本 DNA 质量均较高, 单克隆重排重复实验结果一致, 且实验过程中严格遵守盲法原则, 结果准确可靠总之, 采用 FR2 FR3 LJH 及 VLJH 引物组合 A 管 +B 管模式和半巢式 PCR 法进行 IgH 基因单克隆重排检测, 简单易行, 结果准确可靠, 阳性率较高, 可用于临床 B-NHL 与 T -NHL 淋巴结反应性增生等的鉴别, 尤其是当组织形态不典型免疫组化效果欠佳时, 单克隆重排检测的结果对 B-NHL 的诊断显得尤为重要 [ 参考文献 ] [1] ClearyML,ChaoJ,WarnkeR,etal.Immunoglobulin generearangementasadiagnosticcriterionofb-cel lymphoma[j].procnatlacadsciu SA,1984,81 (2): [2] vandongen J,LangerakAW,BrüggemannM,etal.De signandstandardizationofpcrprimersandprotocolsfor detectionofclonalimmunoglobulinandt-celreceptor generecombinationsinsuspectlymphoproliferations:re portofthebiomed-2concertedactionbmh4-ct [j].leukemia,2003,17(12): [3] WangY,ShenD,WangVM,etal.Molecularbiomarkers fordiagnosisofprimaryvitreoretinallymphoma[j].intj MolSci,2011,12(9): [4] BergetE,HelgelandL,MolvenA,etal.Detectionof clonalityinfolicularlymphomausingformalin-fixed, parafin-embeddedtisuesamplesandbiomed-2im munogliobulinprimers[j].jclinpathol,2011,64(1): [5] CatherwoodMA,AlexanderHD,McManusDT,etal.Im munoglobulingenerearangementinvestigationsinthedi agnosisoflymphoid malignanciesfrom formaldehyde- fixedbiopsies[j].leuklymphoma,2003,44(4): [6] 王倩, 李小秋, 朱雄增, 等.B 淋巴细胞增生性疑难病

5 1998 例中 IgH 基因克隆性重排的分析 [J]. 中华病理学杂志,2010,39(5): [7] vankriekenjh,langerakaw,macintyreea,etal.im provedreliabilityoflymohomadiagnosticsviapcr-based clonalitytesting:reportofthebiomed-2concertedac tionbhm4-ct [j].leukemia,2007,21(2): [8] EvansPA,PotCh,GroenenPJ,etal.Significantlyim provedpcr-basedclonalitytestinginb-celmalignan ciesbyuseofmultipleimmunoglobulingenetargets.re portofthebiomed-2concertedactionbmh4-ct [j].leukemia,2007,21(2): [9] 李新霞, 陈云昭, 李锋, 等.IgH 基因重排检测在 B 细胞非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用 [J]. 中华病理学杂志,2007,36(2): [10] VergierB,DubusP,KutschmarA,etal.Combineda nalysisoft celreceptorγ andimmunoglobulinheavy chaingenerearangementsatthesingle-cellevelinlym phomaswithdualgenotype[j].jpathol,2002,198(2): 櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆 ( 上接第 1981 页 ) 通过本研究显示,DEX 对严重创伤良好有效的镇痛镇静治疗不仅仅是传统意义上的减轻患者痛苦, 增加创伤患者耐受性, 更重要的意义在于可在一定程度上降低创伤后过度应激反应, 阻止炎症介质的进一步产生和释放, 有助于病情的稳定和恢复, 但 DEX 可能会产生低血压和心动过缓, 所以应加强监测, 对于有心动过缓和低血压的患者应慎用 [ 参考文献 ] [1] WaageA,HalstensenA,ShalabyR,etal.Localproduction oftumornecrosisfactoralpha,interleukin1,andinterleukin 6inmeningococcalmeningitis.Relationtotheinflammatory response[j].jexpmed,1989,170(6): [2] 美国机动车医学促进会 (AAAM), 重庆市急救医疗中心. 简明损伤定级标准 (2005)(2005 修订本 )[M]. 第 1 版. 重庆 : 重庆出版社,2005: [3] RamsayMA,SavegeTM,SimpsonBR,etal.Controledse dationwithalphaxalone-alphadolone[j].brmedj, 1974,2(5920): [4] 刘都户, 粟永萍, 程天民. 严重创伤后应激反应的调控机理 [J]. 中国病理生理杂志,2001,17(1): [5] JastrowKM3rd,GonzalezEA,McGuireMF,etal.Early cytokineproductionriskstratifiestraumapatientsformulti pleorganfailure[j].jam ColSurg,2009,209(3): [6] SpielmannS,KernerT,AhlersO,etal.Earlydetectionof increasedtumournecrosisfactoralpha(tnfα)andsolu bletnfreceptorproteinplasmalevelsaftertraumareveals asociationswiththeclinicalcourse[j].actaanaesthesiol Scand,2001,45(3): [7] DinareloCA. Proinflammatory cytokines[j]. Chest, 2000,118(2): [8] 中华医学会重症医学分会. 中国重症加强治疗病房患者镇痛和镇静治疗指导意见 (2006)[J]. 中华外科杂志,2006,44(17): [9] HelmySA,Al-AtiyahRJ.Theimmunomodulatoryefects ofprolongedintravenousinfusionofpropofolversusmid azolamincriticalyilsurgicalpatients[j].anaesthesia, 2001,56(1):4-8. [10] 林洪启. 连续输注异丙酚和咪达唑仑对老年患者免疫功能的影响 [J]. 中国医院药学杂志,2009,29(14): [11] ZavalaF,TaupinV,DescampsLB,etal.Invivotreatment withbenzodiazepinesinhibitsmurinephagocyteoxidative metabolismandproductionofinterleukin-1,tumornecro sisfactorandinterleukin-6[j].jpharmacolexpther, 1990,255(2): [12] VennRM,KarolMD,GroundsRM.Pharmacokineticsof dexmedetomidineinfusionsforsedationofpostoperative patientsrequiringintensivecare[j].brjanaesth,2002, 88(5): [13] QiaoH,SandersRD,MaD,etal.Sedationimprovesearly outcomeinseverelysepticsprague-dawleyrats[j].crit Care,2009,13(4):R136. [14] HoferS,SteppanJ,WagnerT,etal.Centralsympatholyt icsprolongsurvivalinexperimentalsepsis[j].critcare, 2009,13(1):R11. [15] CanM,GulS,BektasV,etal.Efectsofdexmedetomidine ormethylprednisoloneoninflammatoryresponsesinspinal cordinjury[j].actaanaesthesiolscand,2009,53(8):

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