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意羊
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1 2005 年第 63 卷化学学报 Vol. 63, 2005 第 18 期, 1646~1650 ACTA CHIMICA SINICA No. 18, 1646~1650 研究论文 pre 基因表达的分子生物学和微量热法分析李美菊耿晶陈向东 *, 梅运军刘国生刘义,c b 杨沈洋萍 ( b 武汉大学生命科学学院化学与分子科学学院武汉 ) ( c 河南师范大学生命科学学院新乡 ) 王小娟王金晶摘要利用分子生物学方法 (SDS-PAGE 和酶活检测法 ) 未检测到所克隆的 pre 基因在大肠杆菌中的表达产物 ( 碱性蛋白酶 ), 而微量热法检测结果发现 : 重组菌株的生长代谢产热曲线之间存在明显的差异. 根据这些差异, 分析了该基因的上下游调控序列对该基因在大肠杆菌中表达的重要作用, 从而进一步对该基因进行了亚克隆, 得到了生物学方法可检测到的表达产物. 由此推测, 微量热技术有可能为检测外源基因表达及其调控, 以及为指导进一步基因工程操作提供一种新的快速灵敏的技术和方法. 关键词大肠杆菌 ; pre 基因 ; 微量热技术 ; 基因表达 Anlysis of pre Gene Expression Employing Microclorimetric Technique nd Moleculr Biologicl Method LI, Mei-Jü CHEN, Xing-Dong*, LIU, Guo-Sheng,c YANG, Yng WANG, Xio-Jun GENG, Jing MEI, Yun-Jun LIU, Yi b SHEN, Ping WANG, Jin-Jing ( College of Life Sciences, b College of Chemistry nd Moleculr Sciences, Wuhn University, Wuhn ) ( c College of Life Sciences, Henn Norml University, Xinxing ) Abstrct The expression product of the cloned pre in E. coli filed to be detected by generl moleculr biologicl methods including SDS-PAGE nd protese ctivity determintion. However, the results obtined by microclorimetric technique showed tht there were obvious differences mong their metbolism het-out curves. Further nlysis suggested tht both up-strem nd down-strem regultion sequences of the pre gene could be the key fctor for the expression of this gene in E. coli. Bsed on the informtion chieved by the nlysis of metbolism het-out curves, the pre gene segments were sub-cloned gin in nother plsmid vector with stronger promoter, nd the gene expression product could be detected by generl moleculr biologicl method. The results suggested tht microclorimetric technique be novel, fst nd sensitive method to detect the foreign gene expression nd regultion, furthermore to provide some suggestions for genetic engineering. Keywords Escherichi coli; pre gene; microclorimetry; gene expression 基因工程是指对遗传信息的分子操作和加工, 即把分离得到的或合成的基因经过改造, 插入载体中, 导入宿主细胞内, 使其扩增和表达, 从而获得大量基因产物, 或者令生物表现出新的性状. 一般基因克隆后表达产物 * E-mil: xdchen@whu.edu.cn; Tel: ; Fx: Received December 30, 2004; revised April 6, 2005; ccepted My 19, 国家自然科学基金 (Nos , ) 资助项目.

2 No. 18 李美菊等 :pre 基因表达的分子生物学和微量热法分析 1647 的检测可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE), Western 杂交, 酶活测定等生物学方法 [1], 但如果克隆的片段未能按实验预期进行表达, 或表达水平低于上述方法的检测下限, 则需要利用更灵敏的检测手段, 对克隆结果进行检测分析和指导, 形成下一步的分子克隆策略. 生物量热学是研究生物系统 ( 代谢生长繁殖等过程 ) 温度或热变化的学科. 二十世纪 90 年代, 生物量热学的理论和技术日趋完善, 并在生物化学临床医学环境科学农业生态食品科学等方面获得广泛应用 [2~4]. 微量热技术具有以下优点 : 1. 可以连续自动跟踪监测各种慢过程产生的热效应. 2. 微量化, 对热过程总热效应几十毫焦耳或更小范围, 样品量为毫克级至微克级. 3. 高灵敏度. 4. 重现性好. 5. 对样品无损伤, 且不需要其他试剂. 由于细胞内各种代谢过程都伴随着能量的转移和热变化, 通过微量热技术可以连续检测细胞代谢过程中所产生的热效应, 实现对细胞代谢过程的 [5,6] 热动力学研究. 鉴于微量热技术的上述特点, 研究发现每种微生物的生长代谢产热曲线均有自身的特征, 因此当微生物遗传物质发生改变, 必然伴随着能量的转移和热变化. 我们以前报道的研究结果证实, 相同的细菌菌株在含有不同基因表达水平的外源克隆片段时其产热曲线会发生相应的变化 [7], 说明微量热技术不仅在研究微生物的生理营养上, 而且在微生物基因克隆和表达等分子水平上的应用也具有重要价值, 可提供一些用生物学方法难以得到的信息. 细菌碱性蛋白酶在制革纺织和洗涤剂等行业具有广泛的用途 [8]. 对蛋白酶基因的结构功能及其克隆表达的研究, 对于采用分子生物学技术改善蛋白酶的性质, 进一步开发其应用潜力具有重要意义. 地衣芽孢杆菌是工业上用于生产碱性蛋白酶的主要菌株, 但未检索到有关该酶基因在大肠杆菌中成功表达的文献报道. 本研究报道了我们筛选得到的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶高产菌株 L106 [9] 中编码该酶的 pre 基因克隆并转入大肠杆菌中, 分别用生物学方法和微量热技术检测基因表达. 通过微量热技术检测分析结果, 进一步设计克隆策略, 最后成功实现了该酶基因在大肠杆菌中的表达, 说明微量热技术在常规方法无法检测到基因表达产物的克隆结果分析方面具有重要的实际意义. 1 实验 1.1 材料菌株和质粒 : 质粒 pbe2 由中国科学院北京微生物研究所郭兴华教授提供. 重组菌株 E. coli C, D, E, F 和 I 均由本实验构建, 具体特征见表 1. 表 1 大肠杆菌重组菌株和质粒 Tble 1 Recombinnt E. coli strins nd plsmids 菌株受体菌质粒插入片段大小 (bp) A E. coli HB101 B E. coli HB101 pbe2(km r ) C E. coli HB101 papr8-1(km r ) pre 全基因 1579 D E. coli HB101 papr8-2(km r ) 缺失下游 1455 E E. coli HB101 papr8-3(km r ) 缺失上游 1269 F E. coli HB101 papr8-4(km r ) 缺失上下游 1127 G E. coli BL21 H E. coli BL21 plc(km r ) I E. coli BL21 plc-4(km r ) 缺失上下游 1127 J E. coli BL21 plc-3(km r ) 缺失上游 1269 培养基 : LB 培养基 : 蛋白胨 10 g, 酵母抽提物 5 g, 氯化钠 5 g, 加水至 1000 ml, 调 ph 7.0, P, 20 min 灭菌. 必要时加入卡那霉素, 终浓度为 10 µg ml -1. 牛奶平板 : 每 100 ml LB 培养基中加入 1.5 g 脱脂奶粉和 1.5 g 琼脂粉. 1.2 方法生物学方法检测基因表达牛奶平板检测 : 将细菌培养液稀释涂布于该平板, 37 培养 24 h 观察. SDS-PAGE 检测 : 具体方法参照文献 [1] 微量热法检测基因表达采用安瓿法, 具体方法和操作参照文献 [10,11], 实验检测系统控温仪器采用瑞典 TAM ir 八通道微热量计进行细菌生长代谢产热曲线测定. 2 结果和讨论 2.1 生物学方法检测基因表达产物对含有 pre 基因的大肠杆菌重组菌株 C, D, E, F, 利用 LB 牛奶平板法和 SDS-PAGE 方法均未检测到该基因的表达产物, 且各重组菌株间未见任何差异. 一般来说, 基因的表达与该基因所利用的启动子和终止子密切相关 [12,13], 其中启动子一般在基因的上游调控序列中, 终止子在基因的下游调控序列中. 重组菌株 C 中含有该基因自身的上下游调控序列, 菌株 E 含有来自地衣芽孢杆菌的下游调控序列而使用质粒 pbe2 上多克隆位点上游的 SP6 启动子, 未检测到上述两株菌的基因表达产物, 原因可能是上游序列中含有的启动子的启动活性太弱, 导致表达量太低, 或大肠杆菌中的调控因子不能识

3 1648 化学学报 Vol. 63, 2005 别来自地衣芽孢杆菌的启动子. 菌株 D 仅含有 pre 基因的上游调控序列而无下游调控序列, 菌株 F 中两者均不含, 此两种菌株也未检测到该基因的表达, 除上述两种原因外, 还有可能是无终止序列, 使得翻译过程无法正常终止, 从而不能正常表达. 以上分析表明, 未检测到表达产物的生物学活性可能是因为该基因未表达或是表达量太低而用一般的生物学检测方法无法检测到. 针对这一问题, 我们采用微量热技术对一系列的重组菌株的生长代谢产热曲线进行研究分析. 2.2 微量热法测定重组菌株的生长代谢热谱曲线菌株 B, C, D, E, F 的生长代谢热谱曲线图 1 为菌株 B, C, D, E, F 的生长代谢热谱曲线. 表现出的差异应和其细胞内遗传物质发生的变化有关. 质粒 DNA 在细胞内除进行一般的复制外, 细胞可转录并翻译表达质粒上的基因. 基因表达的强弱与该基因的启动子与终止子密切相关. 表 2 E.coli A, B, C, D, E, F 的热动力学参数 Tble 2 Thermokinetic prmeters for E. coli A, B, C, D, E nd F 菌株 P m /µw t p /min Q T /J k m /min -1 R SD A B C D E F 图 1 重组菌株 A, B, C, D, E, F 的生长代谢产热曲线 Figure 1 Power-time curves of strins E. coli A, B, C, D, E nd F 在大肠杆菌产热曲线增长期, 其代谢产热过程符合以下规律 : P t =P 0 exp(k m t) 或 ln P t =ln P 0 +k m t (1) k m 为代谢速率常数. 从产热曲线上取一系列 ln P t ~t 数据进行线性拟合, 即可求出代谢速率常数 k m. 重组菌株代谢产热过程的各参数见表 2. 由图 1 和表 2 可见, 菌株 A, B, C, D, E, F 的生长产热曲线存在明显差异. 据报道, 细菌中基因表达合成蛋白质是一个耗能过程, 基因表达量愈多, 耗能亦愈多 ; 同样, 表达的基因愈多, 耗能亦愈多, 则输出的能量就愈少 [10,14]. 此外, 出峰时间 (t p ) 亦与表达量有关, 基因表达量愈多, 或表达的基因愈多, 基因表达前所进行的准备工作就愈多, 时间也就愈长, 因此出峰时间会延长. 本研究中由于所用培养条件及操作等完全相同, 曲线上根据以上研究结果及图 1 和表 2, 可得出 : 1. 重组菌株 E 输出能量最少, 出峰时间最长, 说明该菌株中与基因表达有关的代谢活跃, 该基因表达量最高, 依次为 C, F, D. 2. 对比 E 和 C, E 的表达量高于 C, 根据其遗传特性分析, 可能与其所利用的启动子有关 ( 上游调控序列中含有启动子 ), 菌株 E 中是利用载体 pbe2 上的 SP6 启动子, 而菌株 C 中利用 pre 基因本身的启动子 ( 来自于地衣芽孢杆菌 ). 生物体中, 一般来说启动子的启动活性具有种属特异性, 只能被某种或某几种生物识别. 在大肠杆菌中由于不能很好地识别和利用来自地衣芽孢杆菌的启动子而使菌株 C 中该基因的表达量略低于 E. 3. 对比菌株 C 和 D, 两者在遗传物质上的唯一区别是 D 中 pre 基因不含下游调控序列, 而 C 中有. 下游调控序列中主要含有翻译终止子. 根据两者产热曲线的不同, 我们可以判断菌株 C 中该基因表达量远高于菌株 D, 继而推断下游调控序列对于该基因的表达是很重要的. 4. 对比 B 与 D, F, 三者的输出热量和出峰时间比较相似. 菌株 B 中不含任何外源基因, 只含有空的质粒载体 ; 菌株 F 中同时缺失了 pre 基因上游和下游调控序列. 说明菌株 D 和 F 均未表达 pre 基因, 由于菌株 D 和 F 中均无下游调控序列, 同时也说明下游调控序列的重要性. 此结果也验证了上述结论 2 和 3. 由以上分析可推出, pre 基因的上游调控序列和下游调控序列对该基因的表达均很重要, 特别是下游调控序列 ( 对比 C 和 D, E 和 F) 重组菌株 G, H, I, J 的生长代谢热谱曲线根据以上分析结果, 我们进一步对该基因进行了分子生物学操作, 分别将仅含下游调控序列的 DNA 片段和含上下游调控序列的 DNA 片段分别亚克隆至一个

No. 18 李美菊等 :pre 基因表达的分子生物学和微量热法分析 1649 含大肠杆菌强启动子 T 7 和终止子的质粒载体上, 获得了重组菌株 I 和 J. 用 SDS-PAGE 方法检测该基因表达产物. 结果表明, 菌株 I 和 J 中该基因均得到了明显表达 ( 见图 2 箭头所示 ). 用微量热技术测定菌株 G, H, I 和 J 的生长代谢产热曲线 ( 见图 3), 各参数见表 3.

从上到下依次为 97.4, 66.2, 43.0, 31.0, 20.1, 14.4 kd); 2 E. coli H, 不含 pre 基因, 作为阴性对照 ; 3 E. coli J, 箭头所示为大量表达的 41 kd 的蛋白质 ; 4 E. coli I, 箭头所示为少量表达的 41 kd 的蛋白质 Figure 2 Expression of pre gene in E.

4 No. 18 李美菊等 :pre 基因表达的分子生物学和微量热法分析 1649 含大肠杆菌强启动子 T 7 和终止子的质粒载体上, 获得了重组菌株 I 和 J. 用 SDS-PAGE 方法检测该基因表达产物. 结果表明, 菌株 I 和 J 中该基因均得到了明显表达 ( 见图 2 箭头所示 ). 用微量热技术测定菌株 G, H, I 和 J 的生长代谢产热曲线 ( 见图 3), 各参数见表 3. 对比菌株 H 和 I, J, 分析结果表明, 菌株 H 在对数生长期的热量输出最多, 且出峰时间最短, 该菌株仅含空载体质粒, 无外源 DNA 片段, 而菌株 I 和 J 中均含有外源 DNA 片段, 其中菌株 I 中含有结构基因, 无上下游调控序列, 而菌株 J 中含有结构基因和下游调控序列, 结合图 2 的结图 2 重组菌株 H, I, J 中 pre 基因表达 1 蛋白质 Mrker( 从上到下依次为 97.4, 66.2, 43.0, 31.0, 20.1, 14.4 kd); 2 E. coli H, 不含 pre 基因, 作为阴性对照 ; 3 E. coli J, 箭头所示为大量表达的 41 kd 的蛋白质 ; 4 E. coli I, 箭头所示为少量表达的 41 kd 的蛋白质 Figure 2 Expression of pre gene in E. coli recombinnts H, I nd J Lne 1 Protein mrker (from top to bottom: 97.4, 66.2, 43.0, 31.0, 20.1 nd 14.4 kd); Lne 2 E. coli H, which lcked the pre gene, ws the negtive control; Lne 3 E. coli J. The rrowhed indictes the highly expressed protein of bout 41 kd; Lne 4 E. coli I. The rrowhed indictes the reltively less expressed protein of bout 41 kd. 表 3 E. coli G, H, I, J 的热动力学参数 Tble 3 Thermokinetic prmeters for E. coli G, H I nd J 菌株 P m /µw t p /min Q T /J k m /min -1 R SD G H I J 果, 菌株 J 中该基因的表达量明显高于菌株 I 中的表达量, 说明下游调控序列在该基因的表达中起重要作用, 此结果验证了上述的分析 ( 见节 ). 对比菌株 I 和 J 的生长代谢产热曲线, 发现 J 在这一过程中热量输出少于 I, 出峰时间长于 I, 表明菌株 J 中 pre 基因表达量较 I 中多, 这一分析结果与 SDS-PAGE 检测结果一致 ( 见图 2). 同时也验证了上述对菌株 C, D, E, F 的分析结果的正确性. 综上所述, 微量热法作为一种灵敏精确快速简易方便的分析检测方法, 不但可以帮助我们检测细菌基因表达, 分析基因调控序列的重要性, 而且可以指导我们对该基因实行进一步的生物学操作, 并达到预期的目的. 近年来, 我们已将微量热技术引入微生物遗传学的研究, 如大肠杆菌感受态建立的机理 [15], 苏云金芽孢 [7] 杆菌中表达 mel 基因的生长代谢热动力学变化以及古 [14] 生菌中 DNA 片段在大肠杆菌中启动活性的检测及结合 DNA 定点突变方法, 研究了启动子片段中转录起始位点碱基突变对在大肠杆菌中的启动活性和转录效率 [10] 的影响等. 这些研究结果表明, 微量热技术与生物学方法结合在微生物遗传方面的研究是切实可行的. 本研究方法将微量热法和分子生物学法结合, 应用于基因工程操作领域. 此外, 本文直接证明了 pre 基因的上下游调控序列对该基因的表达均有重要作用, 尤其是下游调控序列. 在微量热方法的帮助下, 更好地完成了基因工程方面的研究, 并达到了预期的目的. 微量热方法突破了传统上一些生物学方法的限制, 可为检测细菌基因表达及对其调控元件进行功能分析, 以及为生命科学的研究提供一种新的灵敏的方法. References 图 3 重组菌株 G, H, I, J 的生长代谢产热曲线 Figure 3 Power-time curves of strins E. coli G, H, I nd J 1 Smbrook, J.; Fritsch, E. F.; Mnitis, T. In Moleculr Cloning A Lbortory Mnul, 2nd ed., Cold Spring Hrbor Lbortory Press, Cold Spring Hrbor, New York, 2002, pp. 19~22; 79~683; 880~ Levin, K. Clin. Chem. 1977, 23, Yn, C.-N.; Liu, Y.; Wng, T.-Z.; Tn, Z.-Q.; Qu, S.-S.; Shen, P. Chemosphere 1999, 38, Liu, Y.-W.; Deng, F.-J.; Zhng, H.; Li, J.; Wng, X.-X.;

5 1650 化学学报 Vol. 63, 2005 Wng, C.-X.; Liu, Y.; Li, F.-J.; Qu, S.-S. Act Chim. Sinic 2002, 60, 1151 (in Chinese). ( 刘欲文, 邓凤姣, 张恒, 李杰, 汪潇潇, 汪存信, 刘义, 李凤军, 屈松生, 化学学报, 2002, 60, 1151.) 5 Boling, E. A.; Blnchr, G. C.; Russed, W. J. Nture 1973, 243, Monk, P. R.; Wdsö, I. J. Appl. Bcteriol. 1975, 38, Run, L.-F.; Liu, Y.; Go, Z.-T.; Shen, P.; Qu, S.-S. J. Therm. Anl. Clorim. 2002, 70, Kim, J. M.; Lim, W. J.; Suh, H. J. Proc. Biochem. 2001, 37, Chen, X.-D.; Peng, Z.-R.; Shen, P. J. Wuhn Univ. (Nt. Sci. Ed.) 2003, 49, 761 (in Chinese). ( 陈向东, 彭珍荣, 沈萍, 武汉大学学报 ( 理学版 ) 2003, 49, 761.) 10 Yng, Y.; Liu, Y.; Zhu, J.-C.; Shen, P. J. Therm. Anl. Clorim. 2004, 75, Wdsö, I. Thermochim. Act 2002, 394, Rlph, H.; Motzkus, C.; Lmprecht, I. Thermochim. Act 1994, 239, Wdsö, I. Thermochim. Act 1993, 219, Hung, Y.-P.; Liu, Y.; Shen, P.; Qu, S.-S. Chem. J. Chin. Univ. 2002, 23, 251 (in Chinese). ( 黄玉屏, 刘义, 沈萍, 屈松生, 高等学校化学学报, 2002, 23, 251.) 15 Xie, Z.-X.; Liu, Y.; Chen, X.-D.; Shen, P.; Qu, S.-S. Act Chim. Sinic 2000, 58, 153 (in Chinese). ( 谢志雄, 刘义, 陈向东, 沈萍, 屈松生, 化学学报, 2000, 58, 153.) (A SHEN, H.; DONG, H. Z.)

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌