1 期伍梦楠等 : 连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展 107 界影响小成本低等优点, 因而被广泛应用于反刍动物饲料营养价值评定瘤胃微生物瘤胃甲烷排放等研究领域但目前世界范围内连续培养瘤胃发酵装置在结构上存在着较大的差异, 运行参数也各不相同, 而且其主要运行参数 ( 如 : 温度

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1 中国畜牧兽医 2017,44(1): 犆犺犻狀犪犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔牔犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲 doi: /j.cnki 连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展伍梦楠, 沈维军, 张佩华, 陈东 ( 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 ) 摘要 : 体外培养法作为反刍动物营养学研究的重要方法, 主要有批次培养法和连续培养法两种由于连续培养法能够更好地模拟瘤胃内发酵情况, 其应用也更为广泛但连续培养瘤胃模拟装置的主要运行参数多, 如温度 ph 稀释率缓冲液与瘤胃液接种比搅拌速率与方式等, 且不同运行参数设置以及参数的组合对试验结果影响较大, 因此作者在总结前人研究结果的基础上, 就不同工作参数对连续培养瘤胃模拟发酵过程中挥发性脂肪酸干物质消失率 ph 酶活原虫数量微生物蛋白等指标的影响进行了综述关键词 : 体外培养 ; 连续培养系统 ; 运行参数中图分类号 :Q482 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) 犚犲狊犲犪狉犮犺犘狉狅犵狉犲狊狊狅狀犠狅狉犽犻狀犵犘犪狉犪犿犲狋犲狉狊狅犳狋犺犲犆狅狀狋犻狀狌狅狌狊犆狌犾狋狌狉犲狅犳犚狌犿犲狀犛犻犿狌犾犪狋犻狅狀犛狔狊狋犲犿 WU Meng nan,shen Wei jun,zhangpei hua,chendong ( 犆狅犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犎狌狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犆犺犪狀犵狊犺犪 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 : 犐狀狏犻狋狉狅 culturemethodisanimportantwaytoresearchinruminantdietetics,including batchandcontinuousculturemethods.becausethecontinuousculturemethodcanbetersimulate theconditionsoffermentationinrumen,itwasapplied morewidely.therearemanyoperation parametersofrumensimulationtechniqueinvolvedincontinuousculture,suchastemperature, ph,dilutionrate,theproportionofbufertorumenfluid,stirringrateandway,meanwhile,dif ferentoperationparametersandtheircombinationswilhaveagreatinfluenceonthefermentation results.onthebasisofsummarizingtheresultsofpreviousstudies,theauthorsreview the efectsofdiferentparametersonvolatilefatyacid,drymaterdisappearancerate,ph,enzyme activity,numberofprotozoaandmicrobialprotein,indual flowcontinuousculturesysteminthis paper. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 犻狀狏犻狋狉狅 culture;continuousculturesystem;operatingparameters 反刍动物营养传统研究方法主要有体内法或半体内法, 均需要利用活体动物进行试验体内法需要活体动物样本数量大, 试验周期长, 成本高, 同时还受到试验动物个体试验地点试验环境等因素的影响, 从而导致试验结果变异系数大半体内法需要实施造瘘手术, 风险性大, 还会对动物健康造成伤 [1] 害, 进而影响试验结果体外法是利用消化装置来模拟反刍动物瘤胃的发酵过程, 起步于 20 世纪 30 年代, 在 1948 年 McDougal 的研究公开了绵羊 [2] 唾液矿物质组成之后, 得以迅速发展至今, 基本形成了批次培养瘤胃模拟和连续培养瘤胃模拟两大技术类型体外法具有试验周期短试验结果受外收稿日期 : 基金项目 : 瘤胃模拟系统运行参数优化与模拟精度提升的研究与应用 (2015JC3105) 作者简介 : 伍梦楠 (1992 ), 女, 新疆石河子人, 硕士, 研究方向 : 动物营养与饲料科学,E mail: @qq.com 通信作者 : 沈维军 (1971 ), 湖南岳阳人, 副教授, 硕士生导师, 研究方向 : 动物营养与饲料科学,E mail:shenweijun@hunau.edu.cn

2 1 期伍梦楠等 : 连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展 107 界影响小成本低等优点, 因而被广泛应用于反刍动物饲料营养价值评定瘤胃微生物瘤胃甲烷排放等研究领域但目前世界范围内连续培养瘤胃发酵装置在结构上存在着较大的差异, 运行参数也各不相同, 而且其主要运行参数 ( 如 : 温度 ph 稀释率缓冲液与瘤胃液接种比搅拌速率与方式等 ) 对试验结果均有较大的影响 1 体外培养法概述 1 1 批次培养法批次培养法 (batchculture), 即指将微生物接种物和发酵底物一次性加入到培养装置中, 经一定时间培养后, 在固定时间内结束培养批次培养法主要有两阶段法和体外产气法两种两阶段法又称为两步法由 Tily 和 Terry 于 1963 年在一级 [4] 离体消化法的基础上改进后提出他们在试验中用试管作为发酵装置, 第一阶段分别加入瘤胃液和饲料样品, 培养 48h, 模拟瘤胃的消化 ; 第二阶段在原来基础上加入胃蛋白酶再培养 48h, 模拟真胃和部分小肠的消化过程培养结束后对试管中的残渣进行分析, 进而评定饲料的可消化性后来 Jones 和 Hayward 将此法进一步改进 : 第一阶段用纤维素酶代替变异大的瘤胃液, 第二阶段依旧使用 [5] 胃蛋白酶产气法首先由德国霍恩海姆大学动物 [6] 营养研究所 Menke 于 1979 年提出, 后来被广泛应用于反刍动物饲料营养价值的评定, 在国外常称 HFT(hohenheimerfuterwettest) 技术, 其原理是根据试验所测得的总产气量以及气体中 CO 2 和 CH 4 浓度的变化来进行研究总之批次培养法虽然能较好地模拟瘤胃的发酵和评定饲料的消化率, 但由于发酵产物不能排出, 理论上违背了实体动物瘤胃发酵连续进入和排出的特点, 无法长时间地模拟瘤胃的消化过程 1 2 连续培养法连续培养法是指在培养装置中接种瘤胃液和加入初始发酵底物后, 在发酵过程中还需要持续注入缓冲液, 间歇加入发酵底物, 同时将发酵产物连续或间歇排出, 模拟瘤胃进食和排出消化后食糜的方法, 以维持培养装置中内容物的平衡, 因而连续培养系统是一个动态系统, 理论上可以无限期运行, 故又称为长期人工瘤胃模拟技术根据发酵过程中固相和液相的排出方式, 又将连续培养法分为单外流连续培养 (single flowcontinuousculturesystem,sf CCS) 和双外流连续培养 (dual flowcontinuouscul turesystem,dfccs) 两种系统单外流连续培养系统单外流连续培养系统目前有两种定义 : 一种是指消化糜固相和液相均以相同的速度外流的系统 ; 另一种说法是只有液体以一定的速度排出发 [8] 酵容器, 而消化后的固体食糜仍然停留在容器内单外流连续培养系统最初在 1960 年由 Davey 提出 [9] 并开始设计经过了众多研究学者的改进和发展, 其中以 Czerkawski 在 1977 年设计的系统最为 [10] 经典, 之后的单外流连续培养系统大都以此为基 [11] 础并加以改进任鹏等在 Czerkawski 方法的基础上加以改进, 研制了有 6 个发酵罐的持续单外流 [12] 装置之后陈小霞等于 2012 年在前人基础上研发了一套新型单外流连续培养装置, 该装置的发酵罐采用了独特的密封及搅拌方式设计, 并用可更换式内网代替以往的尼龙袋双外流连续培养系统双外流体外连续培养系统是指将消化后的固相食糜和液相分别排出发酵罐, 且消化靡固相和液相的排出速度可以分别进行控制的系统双外流连续培养系统在单外流连续培养系统的基础上解决了培养系统不能长时间培养的缺陷, 更接近于活体内瘤胃发酵的情况国外最早的双外流连续培养系统 [13] 由 Vathauer 于 1970 年设计, 该系统首次采用了溢流的方式来排出被微生物降解后的食糜随后双外流连续培养系统进入了快速发展阶段, 其中比较有影响的系统是 :1976 年 Hoover 设计出一种模拟固液相分离的持续人工瘤胃 (CC 系统 ) [14] ; 美国明 [15] 尼苏达大学 Hannah 等设计的气液固相能独立进出的双外流连续培养系统, 并增加了实时监控 [16] 技术 ;1988 年 Teather 等设计了一套自动分层瘤 [17] 胃模拟持续发酵系统 ; 在 2008 年,Muetzel 等设计了一种快速准确模拟瘤胃功能的发酵系统, 使得人工瘤胃进入了计算机控制时代国内相应的研究开始于 1993 年, 王加启与冯仰廉设计出一种瘤胃持续模拟装置 (RSI) [18] 1999 年, 孟庆翔等设计了 CCS 培养系统 2009 年, 陈强在 CC 系统的基础上研发了 4 个发酵罐的双外流 [8] 连续培养系统 2012 年, 沈维军等研制出更为精良的双外流连续培养装置, 解决了恒温排固堵塞搅拌方式等一系列问题 [19] 2 运行参数对连续培养系统模拟瘤胃发酵的影响连续培养系统作为瘤胃模拟装置, 其基本运行

3 108 中国畜牧兽医 44 卷条件要尽可能与活体动物瘤胃发酵环境一致, 才能使模拟瘤胃发酵过程更接近真实瘤胃发酵情况因 [20] 此, 早期研究者 Vathauer 等便指出培养系统需达到以下几点要求 :1 瘤胃实际温度 ;2 厌氧环境 ; 3 周期性加入发酵底物 ;4 发酵底物的咀嚼 ;5 连续加入缓冲液 ( 人工唾液 );6 定期加水 ;7 搅拌混合 ; 8 排出多余的气体 ;9 排出微生物降解和代谢的终产物 ;10 排出未降解的发酵底物在连续培养系统运行过程中应严格控制以下几个发酵参数, 其中任一发酵参数的不稳定都将对发酵结果产生极大影响 2 1 温度瘤胃内的温度在 38.5~39 之间, 比动物体温高 1~1.5, 主要依靠细菌和原虫降解释放出的能量来维持通过体内直接测定瘤胃温度可以发现, 瘤胃内温度变化具有一定范围, 会随日粮模式 [21] [22] 动物活动程度采食情况一天之内不同时间 [23] 段等而变化, 但变化范围会稳定在 38.5~40 之间在连续培养模拟瘤胃发酵过程中, 随着温度的升高瘤胃内发酵所产生的气体量逐渐增加, 在 39 时达到最高, 说明瘤胃模拟过程中微生物生长繁殖 [24] 最适合温度为 39 左右因此在进行体外人工瘤胃模拟时, 通常将连续培养系统的发酵温度设为 39 [25 27] 也有研究者把发酵温度设为 38.5, 用于自行研发的新型双外流连续瘤胃发酵模拟系统, 结果发现设备前 3d 发酵参数浮动较大, 在第 4 [28] 天稳定, 可开始正式试验 ;Busquet 等在将双外流连续瘤胃模拟系统温度参数设定为 38.5 情况下, 研究不同剂量肉桂醛和大蒜精油对瘤胃微生物发酵的影响, 获得了肉桂醛和大蒜精油对挥发性脂肪酸和氮代谢影响的数据该研究证明可以将双外流瘤胃模拟系统的工作温度设定为 38.5 体外培养时, 温度参数应尽可能接近瘤胃真实温度, 在日粮投喂充足, 微生物活动频繁的时候, 温度会有所升高, 而在投喂日粮 2h 后, 温度会降低并平稳 2 2 狆犎正常情况下反刍动物在采食后 2~6h 内, 瘤胃液的 ph 会先下降再上升直至采食前的水平, 波动范围在 6~7 之间但随饲料类型饲喂量和饲喂频 [29] 率的不同,pH 会在 5~7 之间变动, 如以精料为主的日粮可使瘤胃液 ph 接近 5, 而以粗饲料为主的日粮可使 ph 接近中性当 ph 低于 6 时就会对瘤胃发酵产生影响, 但瘤胃对低 ph 有自我适应性, 只要不长时间处于低 ph 情况下, 对瘤胃发酵并无 [30] 大的影响在 ph 分别为 5.5 和 6.2 的情况下, 通过对含大麦秸秆日粮或纤维来源非草料日粮体外发酵的研究, 表明低 ph 会减少发酵液中氨态氮的浓度, 同时增加了非氨态氮的代谢, 因此会对不同纤维来源的 [31] 饲料微生物代谢产生影响而当 ph 分别为 5.5 和 6.4 时, 低 ph 会影响瘤胃液中微生物发酵和饲料养分的代谢, 但在发酵 12h 后发酵系统的 ph 都会有所降低, 但只要持续时间不长 ( 不超过 4h), 对试验过程有机物和中性洗涤纤维的消化代谢挥发性脂肪酸的结构氨态氮的浓度粗蛋白质的降解等 [32] 均无影响 ph 变动范围为 7.1~5.6 对发酵结果无较大影响, 但在 5.6~5.1 范围内变化时会对发酵产生明显影响, 当连续模拟装置在 ph 5.1 条件下运行 2h 后, 有机物消化代谢率降低 ( 犘 <0.10), 中性洗涤纤维降解率乙酸和短链挥发性脂肪酸占总挥发性脂肪酸的比例都下降, 但丙酸比例升高 ; 与 ph6.4 相比, 粗蛋白质降解率下降, 食物来源中的 [29] 氮循环能力下降, 这些都说明发酵系统的 ph 应尽量稳定在 6~7 之间, 最低不应低于 5.6, 且在低 ph 情况下运转时间不应超过 4h, 在不考虑日粮精粗比及日粮中添加物影响的情况下, 可通过调整缓冲液配方来稳定 ph, 以保证连续培养装置的模拟效果 2 3 稀释率反刍动物瘤胃消化的一个重要特征是饲料和饮水连续不断地进入瘤胃, 在瘤胃中被微生物发酵后, 又不断地流入后部消化道瘤胃内容物的稀释率和外流速度反映了这种进入和排出的过程国内外研究都指出, 瘤胃液的稀释率是影响瘤胃微生物发酵的重要因素, 瘤胃内的液体稀释率一般不超过 100%/d [33] 在连续培养系统中, 稀释率又分为固相稀释率和液相稀释率两种固相稀释率是指通过溢流口流出发酵罐的发酵液流速与发酵罐体积之比 ; 液相稀释率是指进入发酵罐的缓冲液流速与发酵罐体积之比在连续培养系统中, 改变稀释率, 对原虫真菌的数量 ( 浓度 ) 和日产量瘤胃内挥发性脂肪酸含量 ph 微生物蛋白质的合成都有显著影响若使用相似或较高于瘤胃内的稀释率时, 原虫的数量会锐 [10,33] 减 ; 但稀释率过低同样也会造成原虫数量锐减, 原因可能是由于发酵终产物毒素积累作用于微 [34] [35] 生物而导致赵广永等试验表明, 提高瘤胃

4 1 期伍梦楠等 : 连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展 109 液稀释率能显著提高微生物氮的合成 ( 犘 <0.05); 但对瘤胃液体积没有显著影响 ( 犘 >0.05) 在一定范围内提高稀释率可促进真菌繁殖 ; 但过度提升稀 [36] 释率会导致其繁殖力下降提高稀释率能够显著增加人工瘤胃发酵液的 ph ( 犘 <0.05), 并显著降低其氨态氮浓度总挥发性脂肪酸及各挥发酸浓度微生物蛋白质产量和木聚糖酶的活性 ( 犘 < 0.05) [37] 但也有研究发现, 当液相稀释率从 8%/h 增加到 12%/h( 发酵罐体积 1400mL),pH 和氨态氮均显著增加, 溢流液中挥发性脂肪酸浓度下降, 而对其他性能无显著影响这些研究结果之间的差异可能是试验中设置的固相停留时间不同造成的, [38] 固相停留时间增加则氨态氮浓度显著上升 ; 此外, 如果试验时采用的发酵装置以及其他运行参数不同也会导致氨态氮浓度的差异根据目前文献来看, 大多数发酵罐体积都在 800~1400mL, 由于发酵罐体积不同, 研究者使用的稀释率也不同, 在 6%/h~15%/h 总之每个装置运行参数不同, 应根据与动物活体瘤胃内测定值的吻合度来确定该装置最优稀释率控制发酵罐内每天的液体更换不超过 100%, 且不能低于 50% 2 4 投料量由于连续培养系统不能象瘤胃一样吸收发酵所产生的有机酸, 饲料添加过多会造成发酵罐内 ph 无规律下降和渗透压升高, 进而影响发酵, 因此每日干物质的投料量一般以发酵罐有效体积的 4% ~ [39] 6% 为宜若投料量太少, 会导致微生物养分不 [18] 足, 使微生物的活力下降而在试验开始时向发酵罐中加入一定量的瘤胃内容物, 可将日投料量降低到 15~30g/d [40 41] [37] 包万华等研究发现, 投料量由 30g/d 增加到 40g/d 时,pH 有所降低但未达到显著, 当投料量增加到 50g/d 时,pH 显著降低 ; 随着发酵罐投料量从 30g/d 增加到 50g/d, 氨态氮浓度显著增加, 增幅为 16.31%; 总挥发性脂肪酸浓度显著降低, 降低 9.07%, 其中乙酸浓度也有下降趋势, 但未达到显著 ; 其余各挥发性脂肪酸浓度乙酸与丙酸的比例在投料量为 40g/d 的日粮条件下达到最高, 但均没有达到显著水平, 而丙酸浓度则在投料量为 40g/d 的日粮条件下最低 ; 投料量从 30g/d 上升到 40g/d, 每毫升发酵液中原虫数量增加了 3.04% ( 犘 <0.05), 投料量从 40g/d 增加到 50g/d 时, 原虫数量增加了 2.39%( 犘 <0.05) 50 与 40g/d 处理组发酵液中木聚糖酶的活性显著高于 30g/d 处理组 ; 当投料量从 40g/d 上升到 50g/d 时, 微晶纤维素酶和羧甲基纤维素酶分别由和 mU/mL 上升到和 mU/mL, 但未达到显著水平随着投料量从 30g/d 增加到 50g/d, 微生物蛋白质产量从 mg/mL 增加到 mg/mL ( 犘 <0.05);50g/d 处理组干物质消失率经过 5d 的适应后接近于试验动物的真实值结合以上研究结果, 如果在发酵装置中只加入过滤后的瘤胃液, 而不加入瘤胃内容物, 为保证瘤胃微生物养分充足, 应提高投料量 ( 以 40~50g/d 为宜 ), 有利于瘤胃发酵, 维持原虫的数量酶活以及各瘤胃发酵参数但在采用高水平投料量的同时要考虑消化和未经消化的饲料沉积对微生物发酵的影响 2 5 缓冲液与瘤胃液接种比例缓冲液既人工唾液, 其经典配方可参考 Mc [2] Dougal 的报道添加人工唾液是为了平衡瘤胃 [42] 液的酸碱度目前相关试验中根据添加饲料精粗比不同, 缓冲液配方也基于经典配方在不断更改具体标准可参照孟庆祥提出的方法在试验开始前需要按一定比例向发酵罐中加入缓冲液和瘤胃液缓冲液和瘤胃液接种比例增大, 对于试验过程中瘤胃液 ph 没有影响, 瘤胃液中微生物在 4~24h 内便可利用饲料中养分完成自身分裂增殖, 因此对 [43] 24h 以上的产气量也无重要影响但也有研究发现, 当缓冲液与瘤胃液接种比为 1:1 时, 总挥发性脂肪酸和氨态氮浓度较低, 这可能是因为瘤胃液在晨饲前采集并用 4 层纱布过滤, 从而微生物数量较少, 再经过缓冲液的稀释, 使微生物数量进一步减 [44] 少所致, 从而影响了发酵结果 Berthiaume 等在用连续培养瘤胃模拟发酵系统研究苜蓿中非结构性碳水化合物对瘤胃发酵和微生物蛋白质合成的影响时, 缓冲液与过滤后的瘤胃液接种比接近 1 3, 结果发现苜蓿中含有的非结构性碳水化合物能增加饲料干物质降解率, 增加瘤胃挥发性脂肪酸浓度 ; 与低水平非结构性碳水化合物相比, 含有高水平非结构性碳水化合物的发酵液 ph 显著降低, 同时乙酸异丁酸异戊酸产量显著降低, 但丙酸 / 丁酸的比值升高总体来看, 增加苜蓿中非结构性碳水化合物的含量能提高葡萄糖的发酵和微生物氮的合成, 其结果与大多数试验结果相同也有采用缓冲液与瘤胃液接种比为 7 3 来测试自动分层连续培养瘤胃模拟系统的运行参数的研究, 瘤胃液采集后经 100 微米的金属网过率, 结果发现在经过几天的适应期后, 该装置

5 110 中国畜牧兽医 44 卷 [45] 可以保证原虫存活直至试验结束缓冲液与瘤胃液接种比目前存在非常大的差异, 每个体外试验所采用接种比几乎都不相同, 为了能够使各连续培养瘤胃模拟装置的试验结果具有可比性, 应当考虑采用统一的接种比另外, 瘤胃液的接种方式, 如采用瘤胃原液或过滤后的瘤胃液接种, 也应有统一的标准 2 6 搅拌方式与搅拌速率连续培养瘤胃模拟装置中的搅拌是为了模拟真实瘤胃的蠕动, 其搅拌速率和搅拌方式的不同对瘤胃模拟装置的模拟效果会有影响目前搅拌方式有间歇搅拌和连续搅拌两种搅拌速率通常使用 25 [19] 和 27r/min [45] Mason 等用连续搅拌方式和间歇搅拌方式测试了一种连续培养系统, 相对于间歇搅拌, 连续搅拌导致连续培养装置内 ph 降低 (6.50vs6.57, 犘 <0.001), 且原虫数量下降 ( 个 /ml, 犘 <0.001), 所以间接搅拌方式更适合双外流连续培养系统也有学者对单向转动和双向转动两种搅拌方式进行研究, 发现双向转动提高了搅拌强度, 使饲料停留时间缩短, 认为单向转动为更 [46] 好的运行方式但在试验过程中发现, 由于精料和粗料质量的不同, 大部分精料会沉积于发酵罐底部, 在低速搅拌时, 无法被充分搅动因此, 可考虑加快搅拌速率, 或在设计搅拌装置时, 除单纯的旋转搅拌外, 还应增加上下搅拌方式, 或使搅拌桨叶尽可能接近发酵罐底部 2 7 瘤胃液的接种方式瘤胃液中原虫数量在 10 5 ~10 6 个 /ml [47] 体外试验采集瘤胃液一般选择晨饲前或晨饲后 2h, 采集时间不同, 瘤胃液中固体内容物浓度不同若在晨饲 2h 后采集, 接种时可选用 4 层纱布过滤瘤胃液 ; 如在晨饲前采集, 由于饲料经过一晚的反刍与消化, 瘤胃液中的固形物很少, 且颗粒很细, 接种时瘤胃液可不通过纱布过滤, 或者选用 2 层纱布过滤再添加适量的固形物在晨饲前采集的瘤胃液通过 2 层纱布过滤后, 通过原虫计数板计数, 瘤胃液中原虫数量为个 /ml, 如果采用 4 层纱布过滤, 瘤胃液中原虫约有个 /ml [48 49] 而原虫数量或发酵底物的不足都会导致产气量降低目前体外试验中瘤胃液的接种方式与步骤并未完全统一, 建议当试验中日投料量为高水平 (40~ 50g/d) 时, 如果在晨饲前采集瘤胃原液, 接种时的瘤胃液可用 2 层纱布过滤, 如果在晨饲后 2h 采集瘤胃原液, 则用 4 层纱布过滤 ; 如在接种时还添加瘤胃固形物且日投料量为低水平 (15~30g/d) 时, 则接种时瘤胃液统一用 4 层纱布过滤 3 小结综上所述, 体外连续培养装置虽然具有操作简便成本低试验结果准确等优点, 但其主要运行参数 ( 如温度 ph 稀释率缓冲液与瘤胃液接种比搅拌速率与方式等 ) 对试验结果均有较大的影响, 在具体操作过程中应注意以下几点 :1 发酵温度维持在 38.5~39.5 之间, 尽量避免温度变化过大 ;2pH 可根据瘤胃液刚采集时的标准调试, 试验期间由于添加饲料的精粗比或添加剂的不同会引起 ph 的波动, 为防止 ph 长期处于 5.6 以下, 应适时调整缓冲液配方使 ph 稳定在 6~7 之间 ;3 稀释率应根据发酵罐内液体更换每天不超过 100% 且不低于 50% 这一标准设定 ;4 对于缓冲液与瘤胃液接种比, 如果瘤胃原液采用纱布过滤, 则应选用低稀释比例, 如果瘤胃原液不经过滤而直接添加, 则应该增大稀释比例 ; 5 日投料量为发酵罐有效体积的 4%~6%;6 搅拌方式应采用间歇式单向搅拌, 速率控制在 27r/min 左右除以上必须考虑的工作参数以外, 还应深入研究其他参数以更精准地模拟瘤胃的发酵由于研究目的的不同, 不同的设备其最优运行参数也不尽相同, 从而导致不同设备间试验结果没有可比性因此, 有必要开展标准的体外连续培养装置研究, 并进行大量的运行参数试验, 以期为体外模拟技术的标准化应用提供理论依据参考文献 : [1] 崔彦召, 徐晓明, 张克春. 反刍动物人工瘤胃技术研究及应用 [J]. 乳业科学与技术,2011,34(2): [2] McdougalEI.Studiesonruminantsaliva1.The compositionandoutputofsheep ssaliva[j]. 犅犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犑狅狌狉狀犪犾,1948,43: 沈维军. 新型双外流瘤胃模拟系统研制与运行参数研究 [D]. 长沙 : 湖南农业大学,2012. [4] TileyJM A,TerryR A.Atwo stagetechniquefor the 犻狀狏犻狋狉狅,digestionofforagecrops.[J] 犌狉犪狊牔犉狅狉犪犵犲犛犮犻犲狀犮犲,200618(2): [5] JonesDI,HaywardM V.Acelulosedigestiontech niqueforpredictingthedry materdigestibility of grasses[j]. 犛犮犻犉狅狅犱犃犵狉犻犮,1973, 24 (11): [6] MenkeK H,RaabL,SalewskiA.Theestimationof

6 1 期伍梦楠等 : 连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展 111 thedigestibilityand metabolisableenergycontentof ruminantfeedingstufsfromthegasproductionwhen theyareincubatedwithrumenliquor[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1979,93: 孟庆翔. 双外流连续培养系统用于瘤胃发酵的体外模拟 : 技术综述 [J]. 动物营养学报,1999,11(S1): [8] 陈强. 自动化双外流人工瘤胃模拟系统设计 [D]. 乌鲁木齐 : 新疆农业大学,2009. [9] DaveyL A,CheesemaG C,BriggsC A E.Evalua tionofanimprovedartificialrumendesignedforcon tinuouscontrolduringprolongedoperation[j]. 犜犺犲犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1960,55(2): [10] CzerkawskiJ W,BreckenridgeG.Designanddevel opmentofalong term rumensimulationtechnique (Rusitec)[J]. 犅狉犻狋犻狊犺犑狅狌狉狀犪犾狅犳犖狌狋狉犻狋犻狅狀,1977, 38(3): [11] 任鹏, 冯仰廉. 体外持续发酵法评定反刍动物饲料干物质和蛋白质降解率的研究 [J]. 动物营养学报, 1989,1(1): [12] 陈晓霞, 胡晓丽, 孟宪章, 等. 新型单外流瘤胃体外连续培养系统 [J]. 饲料研究,2012,4: [13] VathauerRJ,HindsFC,GarrigusU S.Continu ous 犻狀狏犻狋狉狅 culturesystemforruminantresearch.i. Design[J]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1970,30 (4): [14] HooverW H,CrookerBA,SnifenCJ.Efectsofdif ferentialsolid liquidremovalratesonprotozoanumbers incontinousculturesofrumencontents[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1976,43(2): [15] HannahS M,Stern M D,EhleFR.Evaluationofa dualflow continuousculturesystem forestimating bacterialfermentation 犻狀狏犻狏狅 ofmixeddietscontai ningvarioussoyabeanproducts[j]. 犃狀犻犿犪犾犉犲犲犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,1986,16 (1 2): [16] TeatherR M,SauerFD.Anaturalycompartmented rumensimulationsystemforthecontinuouscultureof rumenbacteriaandprotozoa[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犇犪犻狉狔犛犮犻犲狀犮犲,1988,71(3): [17] MuetzelS.Afermentationsystemforrapidandaccu ratemodelingofrumenfunction[r]. 犖犲狑犣犲犪犾犪狀犱 : 犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犉狅狉犲狊狋狉狔,2008. [18] 王加启, 冯仰廉. 瘤胃持续模拟技术的研究 [J]. 动物营养学报,1995,7(1): [19] 沈维军, 姜雅慧, 王加启, 等. 固液气分流式瘤胃模拟系统的设计与测试 [J]. 农业工程学报,2012,28(3): [20] VathauerRJ,HindsFC,GarrigusU S.Continu ous 犻狀狏犻狋狉狅 culturesystemforruminantresearch.i. Biologicalcharacterization[J]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1970,30(4): [21] 覃春富, 卜登攀, 王加启, 等. 不同日粮模式对泌乳奶牛采食量和瘤胃发酵环境的影响 [A]. 第十一次全国动物营养学术研讨会论文集 [C]. 中国畜牧兽医学会动物营养学分会,2012. [22] MunroJ,SchenkelF,MilerS,etal.Remotesens ingofheartrateandrumentemperatureinfeedlot beefcatle:associations withfeeding and activity paterns[j]. 犘狉狅犮犲犲犱犻狀犵狅犳犖犲狑犣犲犪犾犪狀犱犛狅犮犻犲狋狔狅犳犃狀犻犿犪犾犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀.2015,75: [23] 严学兵, 汪玺, 张德罡. 放牧牦牛瘤胃生理指标的测定 [J]. 黄牛杂志,2003,29(3): [24] 赵广永, 冯仰廉. 用短期人工瘤胃发酵法研究饮水温度对反刍动物瘤胃发酵的影 [J]. 中国畜牧杂志, 1996,5:8 10. [25]?ztürkH,DemirbasYS,AydinFG,etal.Efects ofhydrolyzedandliveyeastsonrumenmicrobialfer mentationinasemicontinuousculturesystem (Rus itec)[j]. 犜狌狉犽犻狊犺犑狅狌狉狀犪犾狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔牔犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊,2015,39(5): [26] LiXX,DurmicZ,LiuSM,etal.Eremophilaglabra reducesmethaneproductionandmethanogenpopula tionswhenfermentedinarusitec[j]. 犘犺犪狉犿犪犮狅犾狅犵狔犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔牔犅犲犺犪狏犻狅狉,2014,29(22): [27] 王照华.DFCCS Ⅱ 型双外流连续培养系统与活体牛瘤胃发酵和厌氧真菌培养的比较研究 [D]. 呼和浩特 : 内蒙古农业大学,2004. [28] BusquetM,CalsamigliaS,FerretA,etal.Efectsof cinnamaldehydeandgarlicoilonrumenmicrobialfer mentationin a dualflow continuous culture[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犇犪犻狉狔犛犮犻犲狀犮犲,2005,88(7): [29] Cerrato SanchezM,CalsamigliaS,FerretA.Efectof themagnitudeofthedecreaseofrumenphonrumen fermentationinadual flowcontinuousculturesystem [J]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,2008,86(2): [30] Johnson V,SutonJ.Thecontinuousrecordingof thephinthebovinerumen[j]. 犅狉犻狋犻狊犺犑狅狌狉狀犪犾狅犳犖狌狋狉犻狋犻狅狀,1968,22(2): [31] SariM,FerretA,CalsamigliaS.EfectofpHon 犻狀狏犻狋狉狅,microbialfermentationandnutrientflowindi ets containing barley straw or non forage fiber sources[j]. 犃狀犻犿犪犾犉犲犲犱犛犮犻犲狀犮犲牔犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 2015,200(2): [32] Cerrato Sanchez M,CalsamigliaS,FerretA.Efects

7 112 中国畜牧兽医 44 卷 ofpaternsofsuboptimalph onrumenfermentation inadual flowcontinuousculturesystem[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犇犪犻狉狔犛犮犻犲狀犮犲,2007,90(9): [33] AbeM,KumenoF. 犐狀狏犻狋狉狅 simulationofrumenfer mentation:apparatusandefectsofdilutionrateand continuous dialysis on fermentation and protozoal population[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1973, 36(5): [34] CrawfordRJ,HooverW H,KnowltonPH.Efects ofsolidsandliquidflowsonfermentationincontinu ouscultures.1.drymaterandfiberdigestion,vfa productionand protozoa numbers[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,1980,51(4): [35] 赵广永, 冯仰廉. 人工唾液对绵羊瘤胃液相平衡, 瘤胃发酵和微生物氮合成的影响 [J]. 动物营养学报, 1995,7(4): [36] 王照华, 侯先志, 李鹏飞. 利用双外流连续培养系统研究不同稀释率对真菌生长及发酵参数的影响 [J]. 饲料工业,2006,27(18): [37] 包万华. 新型双外流人工瘤胃模拟装置最优稀释率和投料量的探究 [D]. 乌鲁木齐 : 新疆农业大学,2013. [38] HooverW H,MilerTK,StokesSR,etal.Efects offishmealsonrumenbacterialfermentationincon tinuousculture1[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犇犪犻狉狔犛犮犻犲狀犮犲, 1989,72(11): [39] 夏兆刚, 孟庆翔. 双外流连续培养系统模拟瘤胃消化 [J]. 中国饲料,2002,23: [40] RanilaMJ,CarroM D,BenSalem,etal.Chaleng ingstrategiestopromotethesheepandgoatsector in the Current Global Context [M ]. Zaragoza: CIHEAM/CSIC/UniversidaddeLeón/FAO,2011. [41] GuadagainM,TagliapietraF,CataniM,etal.Rumen fermentationand microbialyieldofhighorlow protein dietscontaining ground soybean seeds or homemade rapeseedexpelersevaluatedwithrusitec[j]. 犆犪狀犪犱犻犪狀犑狅狌狉狀犪犾狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲,2013,93(3): [42] 连紫璇. 模拟瘤胃生物环境发酵玉米秸秆制取可食用性糖的研究 [D]. 长春 : 吉林大学,2008. [43] 赵慧娟, 赵广永. 接种不同的瘤胃液与缓冲液比例对短期人工瘤胃发酵产气量及 ph 值的影响 [J]. 中国畜牧杂志,2006,42(5): [44] BerthiaumeR,Benchaar C, Chaves A V,et al. Efectsofnonstructuralcarbohydrateconcentrationin alfalfaonfermentationand microbialproteinsynthe sisincontinuousculture[j]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犇犪犻狉狔犛犮犻犲狀犮犲,2010,93(2): [45] MasonF,ZanfiC,SpangheroM.Testingastratified continuous rumen fermenter system [J]. 犃狀犻犿犪犾犉犲犲犱犛犮犻犲狀犮犲牔犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,2015,201: [46] 陈晓霞, 卢广林, 常维毅, 等. 网孔孔径和转动方式对瘤胃活体外发酵参数的影响 [J]. 饲料研究,2012, 4: [47] 冯仰廉. 反刍动物营养学 [M]. 北京 : 科学出版社,2006. [48] Ribeiro G O,GoncalvesL C,PereiraL G,etal. Efectoffibrolyticenzymesaddedtoaandropogon gayanusgrasssilage concentratedietonrumenfer mentationinbatchculturesandtheartificialrumen (Rusitec)[J]. 犃狀犻犿犪犾,2015,9(7):1 10. [49] 李袁飞, 郝建祥, 马艳艳, 等. 体外瘤胃发酵法评定不同类型饲料的营养价值 [J]. 动物营养学报,2013, 25(10): ( 责任编辑卢庆萍 )

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