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1 摇南京农业大学学报摇 2011,3(2): 摇 Journal of Nanjing Agricultural University http: / / nauxb. njau. edu. cn 試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試王燕, 周学军, 蔡亚非, 等. 鹅胚脾淋巴细胞选择机制研究 [J]. 南京农业大学学报,2011,3(2): 鹅胚脾淋巴细胞选择机制研究王燕 1, 周学军 2, 蔡亚非 1*, 陈杰 1, 杨帆 1, 李平 1, 刘再群 1 3, 邓立翠 (1. 安徽师范大学生命科学学院 / 生物环境与生态安全安徽省高校省级重点实验室, 安徽芜湖 21000; 2. 芜湖卫岗乳业有限公司, 安徽芜湖 21000;3. 安徽省无为县三缘养殖实业有限责任公司, 安徽无为 ) 摘要 : 取发育到第 1 天的鹅胚胎 ( E1) 到 1 日龄雏鹅的脾脏用免疫荧光双标法研究 CD 抗原表达, 用 Hoeschst 3332 的荧光染色方法分析细胞凋亡率, 探索鹅胚脾淋巴细胞选择机制结果显示 :E1 脾初具轮廓,E19 脾出现红髓和白髓,1 日龄时脾被膜增厚, 脾小结数目增多, 脾结构完整 CD 共表达于脾的红髓和被膜上, 白髓中表达量较少鹅胚脾的 CD 表达量为 1% ~ 30% ;1 日龄雏鹅的双阳性面积百分比与胚胎鹅 E1 E19 E2 E27 差异极显著 ( P < 0 郾 01);1 日龄雏鹅的凋亡率与胚胎鹅 E1 E2 差异极显著 (P<0. 01) 表明鹅胚脾的 CD 表达与细胞凋亡存在协同关系关键词 : 鹅胚 ; 脾 ;CD ; 外周淋巴细胞中图分类号 :S 摇摇摇摇文献标志码 :A 摇摇摇摇文章编号 : (2011) Study on the selection mechanism of lymphocytes in goose fetal spleen WANG Yan 1,ZHOU Xue 鄄 jun 2,CAI Ya 鄄 fei 1*,CHEN Jie 1,YANG Fan 1,LI Ping 1, LIU Zai 鄄 qun 1,DENG Li 鄄 cui 3 (1. College of Life Sciences / Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, Anhui Normal University,Wuhu 21000,China;2. Anhui Wuhu Weigang Dairy CO.,Ltd.,Wuhu 21000,China; 3. Anhui Wuwei San 鄄 Yuan Breeding Industrial Co.,Ltd.,Wuwei ,China) Abstract:The selection mechanism of lymphocytes of the fetal spleen at the age from E1(1 鄄 day embryos) to 1 day 鄄 old(1 d after hatching)were studied by morphological observation,and the expression of CD and was studied using the method of double 鄄 labeled immunofluorescence,and the apoptosis was also analyzed with the fluorescent dye Hoeschst The results were shown as follows:the spleen formed until the spleen at E1. The red and white pulp appeared at E19. The spleen capsule became thicker at 1 day 鄄 old. The cell number in splenic corpuscle increased,and the spleen structure grew mature. CD immunofluorescence was distributed in the splenic red pulp and the membrane,but absent in white pulp. In goose embryo,the expression of CD was around from 1% to 30%. Compared with 1 day 鄄 old,the expression of CD of E1,E19,E2 and E27 was significantly different (P<0. 01);Compared with 1 day 鄄 old,the apoptotic rate of E1 and E2 was significantly different(p<0. 01). It was suggested that there was a coordination relationship between expression of CD and apoptosis in the spleen of the goose. Key words:goose embryo;spleen;cd ;peripheral lymphocytes 脾脏是体内最大外周淋巴器官 [1], 具有造血储血免疫应答等多种功能 [2] 家禽脾脏附近可能存在一个或多个副脾 [3] [] 早在 1962 年 Delanney 等对鸡胚脾脏内的细胞分化作过初步研究 Chen 等 [5] [6-7] [8] [9] Bucy 等和 Cooper 等等研究了成年鸡脾脏内淋巴细胞的特性和分布,Yassine 等对鸡胚脾脏的发生做了初步研究, 但鹅淋巴器官发育过程尚未见报道 CD 是 T 细胞表面玉型跨膜糖蛋白, 也是 T 淋巴细胞的表面标志 CD 是存在于大多数辅助 / 诱导 T 细胞表面的相对分子质量为 59 伊 10 3 的糖蛋白鸡与哺乳动物类似 [10], 其 T 淋巴细胞表面也存在分化抗原 CD 鹅的 T 淋巴细胞表面也存在 CD CD T 细胞能识别 MHC- 域类分子递呈的抗原, 而 T 细胞能识别 MHC- 玉类分子递呈的抗原 CD T 细胞与 MHC 分子的相互作用能加强 MHC 分子和 TCR 之间结合的亲和力, 二者与家禽的免疫防御紧密相关 [11] 研究发现鸡外周组织脾中存在 CD T 细胞在 H. B15 系鸡的某些个体中, 外周血 (20% ~ 0% ) 脾脏 (10% ~ 20% ) 和肠上皮细胞 (5% ~ 10% ) 中存在大量的 T 细胞共表达 CD 收稿日期 : 基金项目 : 安徽省高校省级自然科学研究重点项目 (KJ2009A039); 安徽省科技人员服务企业计划项目 ( ) 作者简介 : 王燕, 硕士研究生 * 通讯作者 : 蔡亚非, 教授, 主要从事动物分子遗传学研究,E 鄄 mail:caiyafeinau@ 163. com

2 108 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 3 卷琢, 而不表达茁为了探索鹅胚脾的各组织结构及淋巴细胞选择过程, 本文用免疫荧光双标法研究发育到第 1 天的鹅胚 ( E1) 和 1 日龄雏鹅的免疫器官脾 CD 的分布, 以发现脾细胞凋亡与 CD 表达的关系, 为鹅类家禽等动物胚胎学和免疫学研究提供理论依据 1 摇材料与方法 1. 1 摇材料以 E1 E19 E2 E27 鹅胚胎 ( 发育到第天的鹅胚胎 ) 和 1 日龄雏鹅 5 个时期的脾脏为试验材料 ( 每个时期 5 只 ), 由安徽省无为县三缘养殖实业有限责任公司提供 CD 在脾中依次会出现双阴性单阳性和双阳性表达, 文中标示方法依次为 :CD - CD - 8 CD (CD 单阳性 ) 或 CD 8 ( 单阳性 ) CD CD 摇试剂兔抗小鼠 CD 多克隆抗体和 FITC 标记羊抗兔 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司 ; 小鼠抗人单克隆抗体 TRITC 羊抗小鼠 IgG 氨醛酸乙基硅( APES) 牛血清白蛋白( BSA) 封闭液 PBS 缓冲液 ( ph 7 郾 2) 和枸橼酸缓冲液等均购自武汉博士德生物有限公司 1. 3 摇 HE 染色切片厚约 6 滋 m, 用苏木精 - 伊红染色, 用 Olympus BX61 型电动正置荧光显微镜观察脾结构 1. 摇免疫荧光双标法研究 CD 抗原的表达切片经 BSA 封闭后加一抗 ( 兔抗小鼠 CD 多克隆抗体和小鼠抗人单克隆抗体 ) 益过夜 ;PBS 缓冲液冲洗, 加二抗 (FITC 标记羊抗兔 IgG 和 TRITC 羊抗小鼠 IgG),37 益避光孵育 1 h,pbs 缓冲液冲洗, 最后甘油封片 1. 5 摇 Hoeschst 3332 染色研究淋巴细胞的凋亡率按常规制成石蜡切片,1% BSA 封闭,10 滋 g ml -1 Hoeschst 3332 染细胞核,PBS 缓冲液冲洗, 甘油缓冲液封片 1. 6 摇数据统计及分析染色后的切片在 Olympus BX61 型电动正置荧光显微镜下观察, 利用 DP 70 图像分析软件采集图像, 运用 Image 鄄 Pro Plus 6. 0 图像分析软件合成 (merge) 荧光照片, 并计数双阳性细胞面积百分比和统计细胞凋亡率所有数据均表示为 x 軃依 SE, 并用 SPSS 软件进行统计分析, 应用单因素方差分析法 ( one 鄄 way ANOVA) 检验 1 日龄和 E1 E19 E2 E27 的差异显著性, 运用 SPSS13. 0 对两变量进行相关分析 2 摇结果与分析 2. 1 摇不同时期鹅胚脾的组织形态学结构由图 1 可见,E1: 脾已初具轮廓, 淋巴细胞较少, 可见大量血细胞, 被膜边界不清, 无严格界限, 模糊可见红髓白髓, 可见多核巨噬细胞 E19: 清晰可见被膜白髓和红髓, 清晰可见小梁静脉和小梁, 红髓中可见脾索和脾窦, 脾索中含有有核红细胞, 白髓中可见脾小结 ; 脾动脉脾静脉均可分, 可见较多巨噬细胞, 具主脾和 2 副脾 E2: 由致密结缔组织组成, 被膜结构清晰, 被膜表面覆盖有间皮, 白髓数量相对增加, 脾小结和中央动脉增多, 可见动脉周围淋巴鞘结构 ; 红髓中脾索结构明显, 可见较多的脾窦, 脾窦内含有核红细胞 E27: 红白髓分界明显, 红髓中脾索的淋巴组织内有较多的淋巴细胞和少量有核红细胞, 脾血窦壁如多孔隙的栅栏, 由一层平行排列的长杆状内皮细胞围成, 脾血窦明显增加, 内含少量有核红细胞, 动静脉结构明显, 可见多个小梁动脉和中央动脉 1 日龄 : 红白髓结构明显, 脾的被膜增厚, 且富含大量弹性纤维和平滑肌, 与血管相连的动静脉明显大量脾小梁伸入脾内构成脾的支架, 被膜和小梁有许多分散的平滑肌动脉和静脉结构明显, 中央动脉和小梁动脉数目更多脾索和脾窦互联成网状结构, 脾索内的血细胞可穿越内皮细胞间隙进入血窦腔, 脾窦汇入小梁静脉, 再于脾门处汇合为脾静脉出脾

3 摇第 2 期王燕, 等 : 鹅胚脾淋巴细胞选择机制研究 109 Fig. 1 摇图 1 摇不同时期脾的形态学结构图 (HE 染色 ) The morphology diagram of different stage spleen(he staining) 摇摇上图依次为 E1 脾结构图 ( 伊 00) E19 脾红髓和白髓 ( 伊 200) E2 脾小梁 ( 伊 200) 和脾结构 ( 伊 0) E27 脾动脉 ( 伊 200) 和 1 日龄脾脾门结构 ( 伊 200) RC: 红细胞 ;M: 巨噬细胞 ;RP: 红髓 ;WP: 白髓 ;SS: 脾窦 ;A: 动脉 ;V: 静脉 ;SC: 脾小结 ;SH: 脾门 E1 spleen structure chart( 伊 00);E19 splenic red pulp and white pulp structure chart( 伊 200);E2 spleen trabecular structure chart( 伊 200)and spleen structure at E2( 伊 0);E27 splenic artery structure chart( 伊 200);1 day 鄄 old splenic hilum chart( 伊 200). RC:Red blood cell;m:macrophages;rp:red pulp;wp:white pulp;ss:splenic sinus;a:artery;v:vein;sc:splenic corpuscle; SH:Splenic hilum 摇脾 CD 的抗原表达摇免疫荧光双标定位摇免疫荧光单标显示,CD 抗原呈绿色荧光, 抗原为红色荧光 ( 图 2), 所有阴性对照未见阳性荧光信号结果显示 :CD 抗原在红髓白髓和被膜中均有表达, 在脾小结中表达量较少, 抗原在白髓红髓和被膜上少量表达 CD 免疫荧光双标合成 (merge) 结果显示 :CD 主要共分布于脾的红髓和被膜, 在红髓和被膜上密集分布, 白髓中鲜见共表达双标细胞可分为两种类型 : 胞质双标细胞和胞核双标 E1 E19 和 E2 中 CD 产物定位于胞核 ;E27 双标阳性定位于胞质和胞核,1 日龄双标阳性定位于胞质摇 CD 面积摇对不同时期鹅胚脾所对应 CD 面积表达结果进行统计分析,E1 E19 E2 E27 和 1 日龄阳性面积分别为 2. 5% 25. 5% 1. 19% % 和 %, 呈现先升高后降低的趋势运用单因素方差分析不同时期鹅脾与 CD 面积百分比的差异显著性 ( 图 3), 结果显示 :1 日龄雏鹅的双阳性面积百分比与胚胎鹅 E1 E19 E2 E27 差异极显著 (P<0. 01) 2. 3 摇鹅胚胎不同时期脾的细胞凋亡情况摇 Hoeschst 3332 染色细胞核分析结果摇 Hoeschst 3332 染色显示, 蓝色的为细胞核 ( 图 ) E1 胞核小且稀,1 日龄胞核多而密, 可见 : 鹅胚胎发育成雏鹅, 细胞核数目逐渐增多摇细胞凋亡率统计分析摇对不同时期鹅胚脾细胞凋亡率进行统计分析, 结果 ( 图 5) 显示 :E1 E19 E2 E27 和 1 日龄的凋亡率分别为 8. 05% % 7. 8% % 和 %, 整体呈现先升高后降低, 又逐渐升高的趋势采用单因素方差分析不同时期鹅胚脾的凋亡率, 结果显示 : 与 1 日龄雏鹅的凋亡率相比,E1 E2 鹅胚胎的细胞凋亡率差异极显著 (P<0. 01) 摇 CD 面积与细胞凋亡率的相关性摇双阳性面积百分比 ( 图 3) 和细胞凋亡率 ( 图 5) 都显示 : 1 日龄与 E1 E2 差异极显著不同时期鹅胚脾 CD 面积百分比高时, 对应时期的细胞凋亡率也高利用 SPSS13. 0 软件分析 CD 面积百分比与细胞凋亡率之间的相关性, 结果显示 :CD 面积百分比与细胞凋亡率之间的相关系数为 ( P<0. 05) 这显示 : 不同时期鹅胚脾的细胞凋亡率与 CD 面积百分比存在协同关系

110 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 3 卷图 2 摇不同时期鹅胚脾的 CD 表达情况 Fig.

; 绿色为 CD 阳性表达 ; 黄色为 CD 阳性共表达 Red:Showing expression of 鄄 positive; Green:

the double 鄄 labeled immunofluorescence. 图 3 摇不同时期鹅脾 CD 面积百分比的差异 Fig.

** 表示与 1 日龄相比差异极显著 (P<0 郾 01) ** indicates extremely different significance(

4 110 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 3 卷图 2 摇不同时期鹅胚脾的 CD 表达情况 Fig. 2 摇 CD CD 8 expression of spleen in different stage goose embryos 摇摇红色为阳性表达 ; 绿色为 CD 阳性表达 ; 黄色为 CD 阳性共表达 Red:Showing expression of 鄄 positive; Green: Showing expression of CD 鄄 positive; Yellow: Showing CD and co 鄄 expression by the double 鄄 labeled immunofluorescence. 图 3 摇不同时期鹅脾 CD 面积百分比的差异 Fig. 3 摇 Difference of goose spleen CD CD 8 area percentage at different stage 摇摇 ** 表示与 1 日龄相比差异极显著 (P<0 郾 01) ** indicates extremely different significance( P< ) comparied with 1 day 鄄 old. 图摇不同时期细胞核的 Hoeschst 3332 染色 Fig. 摇 Hoeschst 3332 staining nucleus in different stage

5 摇第 2 期王燕, 等 : 鹅胚脾淋巴细胞选择机制研究摇讨论摇摇本研究通过对不同时期的鹅胚脾结构进行组织学切片观察, 发现鹅胚脾脏的外形呈椭圆形, 与杨银凤等 [12] [13] [1] 王绍琛等对鸡胚脾的描述和杨蓉生等对鸽脾的结构描述类似但与鸡胚脾的发育过程差异较大, 鸡胚脾 E8 在脾索内含有许多成血细胞和少量的成髓细胞 [12-13], 鹅 E8 只见到鹅胚的神经系统发育, 未能见到鹅胚脾结构这可能与鹅胚孵化周期不同有关鹅 E19 期可见 1 个主脾和 2 个副脾, 与王述 [3] 柏等对鸡脾结构的描述一致鹅胚脾中红髓的淋巴组织内有较多的淋巴细胞和红细胞, 脾血窦内皮细胞核为圆形, 凸向腔面 [15], 脾白髓中的淋巴小结不发 Fig. 5 摇图 5 摇不同时期鹅脾细胞凋亡率的差异 Difference of goose spleen apoptotic rate at different stage 达, 数量较少, 在胚胎发育过程中鞘动脉结构和小梁结构发达, 鹅脾被膜较厚, 红白髓分界明显, 动静脉和脾窦结构丰富, 与其他禽类和哺乳动物之间存在差异鹅的脾脏随着胚胎日龄的增长, 各组织结构趋于完善, 大量血液可进入鹅脾窦, 动静脉丰富, 造血和调节血量能力显著增强鸟类脾脏淋巴细胞的选择过程至今不清, 相关资料较少众所周知, 哺乳动物脾脏和外周血的 T 细胞表面只表达 CD 或分子, 或两者都不表达 ; 脾脏和外周血中存在 CD T 细胞, 这说明它们具有重要的生物学功能 [10] 有资料显示 CD T 细胞存在于 H. B15 系鸡的最近胸腺迁移物中鸡是唯一证实 CD 共表达遗传性的动物模型本研究发现鹅胚也存在 CD 表达, 且共分布于红髓和被膜上在 E1 E19 E2 E27 和 1 日龄时 CD 面积百分比依次为 2. 5% 25. 5% 1. 19% 11 郾 28% 和 % 脾的 CD T 淋巴细胞表达量呈现先增高后降低的模式, 脾的 CD T 淋巴细胞阳性选择过程与 T 细胞在胸腺内的分化发育过程类似早期的 T 细胞主要为 CD - -, 脾的 CD 表达量少 ; 第二阶段为不成熟胸腺细胞, 由 CD - - 分化为 CD CD 8, 脾 CD 表达量明显增加 ; 第三阶段由 CD 选择分化为只表达 CD 或 CD 8, 脾 CD 表达开始减少 ;1 日龄 CD 表达增加, 可能是雏鹅免疫力较弱,CD 增多能增强免疫力 CD 的表达数量多于 CD 8, 哺乳动物的的激活反应都离不开 CD 的帮助, 因为 CD T 细胞能分泌 IL-2, 参与细胞免疫 [16-17], 激活 T 细胞 ; CD 可调节机体对外来抗原的应答, 共同维持免疫系统 [18] 鹅胚脾的 CD 共表达特征与哺乳动物有一定的类似之处, 可能决定了脾淋巴细胞的选择过程鹅类等家禽脾脏的 CD 的表达如何共同维持免疫调节研究机制还不清楚, 仍需进一步研究本试验结果显示鹅胚脾发育过程中细胞数目逐渐增多, 不同时期鹅胚脾细胞凋亡率与 CD 面积百分比呈协同关系, 可能是 CD 与 MHC 复合物结合, 诱导细胞形成了自身耐受, 导致细胞阴性选择而发生凋亡的结果不同日龄鹅胚脾 CD 面积百分比高时, 对应的细胞凋亡率也高, 这与 T 细胞 [19] 在胸腺内的发育过程类似 Chan 等运用双色免疫荧光分析证实鸡外周组织的琢茁 T 细胞是 CD 或 CD 8, 而在胸腺中是 CD CD [20] 8 Katevuo 等采用胸腺内荧光素原位标记的方法研究了 3 周龄雏鸡胸腺细胞的迁移情况, 发现每天有 0. % 的胸腺细胞从胸腺迁移到脾脏中, 与哺乳动物一样, 大部分胸腺细胞在胸腺中凋亡 [10] 本试验结果也证实了鹅胚外周 CD T 细胞来源于胸腺的假设 ; 同时也证明了鹅胚脾发育过程中也存在细胞凋亡现象参考文献 : [1] 摇沈霞芬. 家畜组织学与胚胎学 [M]. 3 版. 北京 : 中国农业出版社,2001:121-12, [2] 高英茂. 组织学与胚胎学 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2003: [3] 王述柏, 李如治, 夏东, 等. 热应激对鸡免疫器官组织学影响的研究 [J]. 畜牧兽医学报,1999,30(1):33-39 [] Delanney L E,Ebert J D. On the chick spleen:origin patten of normal development and their exprimental modifications[ J]. Contrib Embryol, 1962,255:57-86 [5] Chen C I,Cihak J,L 觟 sch U,et al. Differential expression of two T cell receptors,tcr1 and TcR2,on chicken lymphocytes[j]. Eur J Immunol,

6 112 南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报第 3 卷 1988,18: [6] Bucy R P,Chen C I,Cihak J,et al. Avian T cells expressing receptors localise in the spleen sinusoids and the intestinal epithelium [ J]. J Immuno,1988,11(1): [7] Bucy R P,Coltey M,Chen C I,et al. Cytoplasmic CD 3 cell(tcro)develop as a thymus independent cell lineage in chick 鄄 quail chimeras[j]. Eur J Immunol,1989,19(8): [8] Cooper M,Peterson R,Good R. Delineation of the thymic and bursal lymphoid systems in the chicken[ J]. Nature,1965,205:13-16 [9] Yassine F, Fedecka 鄄 Bruner B, Dieterlen 鄄 Lievre F. Ontogeny of the chick embryo spleen 鄄 a cytological study [ J]. Cell Differentiation and Development,1989,27(1):29-5 [10] 胡青海, 焦新安. 鸡 CD 分子研究进展 [J]. 动物医学进展,2005,26():16-20 [11] 刘胜旺. 鸡 T 淋巴细胞亚群及其表面分化抗原研究进展 [J]. 国外医学免疫学分册,1998,21(): [12] 杨银凤, 赵艳芳, 王永胜, 等. 鸡胚脾脏的组织发生 [J]. 内蒙古农业大学学报 : 自然科学版,2001,22(3):28-30 [13] 王绍琛, 刘迎春, 高怀涛, 等. 鸡胚免疫器官组织学发育过程观察 [J]. 中国兽医科技,200,3(8):57-61 [1] 杨蓉生, 刘群. 鸽子法氏囊和脾脏的形态组织学观察 [J]. 西南民族大学学报 : 自然科学版,2006,32(5): [15] 张祥令, 胡蓉, 杨宇. 鱼牛蛙鸡与小鼠脾的比较组织学研究 [J]. 贵阳医学院学报,2007,32(6):6-65 [16] Ridge J P,Rosa F D,Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD T 鄄 helper and a T 鄄 killer cell[ J]. Nature,1998,393:7-78 [17] Srinivasan M,Frauwirth K A. Peripheral tolerance in CD 8 T cells[j]. Cytokine,2009,6: [18] 高晓明. 免疫学教程 [M]. 北京 : 高等教育出版社,2003: [19] Chan M M, Chen C H, Ager L L, et al. Identification of the avian homologues of mammalian CD and antigens [ J]. The Journal of Immunology,1998,10(7): [20] Katevuo K,Vainio O. Thymocyte emigration in the chicken:an over 鄄 representation of CD cells over CD 8 in the periphery[ J]. Immunology, 1996,89(3):19-23 责任编辑 : 周广礼

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<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63> EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌分期的关系蔡永林, 郑裕明, 成积儒, 李军, 莫永坤, 钟青燕 ( 广西梧州市红十字会医院, 梧州市肿瘤防治研究所, 广西梧州 543002) 摘要 : 目的探讨 EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌临床分期的关系方法用酶