雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究 1, 程天佑 2 1,, 徐晓莹 2, 张文蕾 1, 张维 1, 陈林 1 1,, 袁冠华 2 1, 刘天中 (1.,, ; 2., ) 摘要 : 基于雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) 培养过程中游动细胞

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法倍圭
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目次 2017 年 8 月 1 日 / 第 8 期 / 总 338 期 1/ 雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究程天佑, 徐晓莹, 张文蕾, 张维, 陈林, 袁冠华, 刘天中 9/ 北方用维尼纶苗帘培育海带夏苗的实验研究 HAI YANG KE XUE 1977 年创刊 ( 月刊 ) 第 41 卷第 8 期国内外公开发行中国标准刊号 ISSN 1000-3096 CN

2 目次 2017 年 8 月 1 日 / 第 8 期 / 总 338 期 1/ 雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究程天佑, 徐晓莹, 张文蕾, 张维, 陈林, 袁冠华, 刘天中 9/ 北方用维尼纶苗帘培育海带夏苗的实验研究 HAI YANG KE XUE 1977 年创刊 ( 月刊 ) 第 41 卷第 8 期国内外公开发行中国标准刊号 ISSN CN /P 国内邮发代号 2-6 国外发行代号 M6666 主管 : 中国科学院主办 : 中国科学院海洋研究所主编 : 李铁刚出版 : 印刷 : 北京科信印刷有限公司总发行 : 北京报刊发行局订购处 : 全国各地邮局国外总发行 : 中国国际图书贸易总公司 ( 北京 399 信箱, ) 本期责任编辑 : 张培新编辑部地址 : 青岛南海路 7 号, 电话 : , , 传真 : hykxbjb@163.com index.aspx 潘金华, 张壮志, 孙娟, 李晓捷, 曲善村, 盛宝利, 杨官品 16/ 盐度对瘤背石磺幼贝存活生长性能和肌肉生化成分的影响陈威, 沈永龙, 黄金田, 李强, 张明明 24/ 一株海洋细菌 YCSC6 的鉴定及其体外杀盾纤毛虫的能力杜光迅, 曲凌云, 尚琨, 王琛, 高萍 32/ 投喂频率对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长及系统水质指标的影响朱晓芳, 曹潇, 巩建华, 徐善良, 郭春阳 40/ 绿鳍马面鲀精子的超微结构刘琨, 刘长琳, 陈四清, 张乐乐, 边力 46/ 气水比对移动床生物滤器净化海水养殖废水的影响马晓娜, 李贤, 张延青, 王博, 李甍, 刘鹰 3/ 美国滨海核电厂温排水混合区的设置及启示魏新渝, 张琨, 王韶伟, 徐海峰, 方圆, 杨端节 64/KSS32-M 型海洋重力仪动态性能分析李秀敏, 付永涛, 周章国 70/ 一种新型双体无人监测船风力作用下的运动特性变化预报研究官晟, 何志强, 金久才, 王岩峰 76/ 乐清湾水域纳潮量演变分析王诚超, 潘国富, 许雪峰, 陈培雄 86/ 四点长基线深海定位模型建立方法及精度分析林冠英, 刘蔚, 周保成, 许铭彬 91/ 减数分裂期雄性大菱鲆孕激素及受体基因的表达分析丰程程, 柳意樊, 安皓, 徐世宏, 王彦丰, 宋宗诚, 刘清华, 李军 99/ 一株海藻多糖降解菌的分离鉴定及产酶条件优化朱大玲, 唐啸龙, 张宝玉, 杨振芳, 王乐普, 秦乐宁, 张蕾 108/Hg 对锦州湾表层沉积物异养细菌代谢酶活性的影响研究徐庆彤, 刘瑞志, 郭小雅, 李捷, 雷坤, 刘庆庆, 郝晨林 116/ 中心硅藻梅尼小环藻淡水株和海水株亚显微结构的形态学差异李长玲, 陈健冰, 黄翔鹄 122/ 近 30 年西北太平洋热带气旋的时空变化及与海洋上层热状态的关系陈志伟, 康建成, 顾成林, 汤明 134/ 基于 NPS 模型的南海蒸发波导中尺度数值模拟研究吴超, 钟莹, 杨少波, 何鑫, 李醒飞每月 1 日出版定价 : 元 142/ 四千年前胶州湾的岸线在哪里繁荣的三里河聚落为什么千年间两次荒芜 CONTENTS

3 雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究 1, 程天佑 2 1,, 徐晓莹 2, 张文蕾 1, 张维 1, 陈林 1 1,, 袁冠华 2 1, 刘天中 (1.,, ; 2., ) 摘要 : 基于雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) 培养过程中游动细胞和不动细胞的形态差异与转换, 对比研究了两种细胞类型在离心收集与藻落形成效率上的差异结果表明, 雨生红球藻 SCCAP K-0084 在 BYA 培养基中培养 4~6 d 和 9~12 d 分别以绿色游动细胞与绿色不动细胞为主 ; 早期游动细胞离心收集需要更高的离心力, 但 00~1 000 g 离心 min 可以在不影响细胞存活率的情况下有效收获所有类型细胞 ; 相比于传统直接涂布法, 双层琼脂平板法可有效提高平板藻落形成效率, 且游动细胞藻落形成效率比不动细胞藻落形成效率更高 TAP 培养基由于藻落形成效率较低并不适合于雨生红球藻平板培养与筛选, 自养型培养基虽然具有较好的藻落形成效率但是藻落形成速度较慢, 相比而言, BYA 培养基藻落形成效率较高且生长速度快, 更适合用于雨生红球藻细胞的后期平板培养与筛选过程关键词 : 雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis); 游动细胞 ; 不动细胞 ; 形态转换 ; 藻落形成差异中图分类号 : Q94.1 文献标识码 : A 文章编号 : (2017) DOI: /hykx [1], [2] 4%, [3],, [4-] [6] [7] [8], Sammy Boussiba [9],, [10],,,, [11],, ( ), SCCAP-K0084, BYA,,,,, 1 材料与方法 1.1 实验藻种 (Haematococcus pluvialis K-0084), (SCCAP), : ; : : ( ) [Foundation: 2016 Sino-Thai Cooperation Project from the National Science Foundation of China (Grant No )] : (1991-),,,,, : , chengty@qibebt.ac.cn;,,,,,,, : , zhangwei@qibebt.ac.cn Marine Sciences / Vol. 41, No. 8 /

4 1.2 培养基和培养条件 : BG11 [12], 8P-BG11, BG11 2 g/l 2 g/l BYA, BBM [13], 3N-BBM, TAP [14] ; ( 8P-BG11, 3N-BBM, BYA TAP) 1.% 20 ml 10 ml BYA, BG11 10~1 d, ~ /ml, (2 1), (2 1) µmol/(m 2 s), 3, 24 h 2 ml, (2 1), 1~20 mol/(m 2 s) 1.3 液体培养基细胞密度计数和形态转换观察 :,, 0.2% (Olympus BX1), 3, 200, ( = / 100%), 0.019% Triton-X100 [1-16] ( y= 0.943x+0.846, x Triton, y ), 1.4 细胞活力染色 [17], 1 mg/ml 4, 0.01%,, 200, 3 A, B, =B/(A+B) 100%, =A/(A+B) 100% 1. 离心收集检查 0 ml 3 ml (, Beckman Coulter),, 1 ml,, 90%, 2 ml EP 1.8 ml 0 ml (H 160-W, ), 1 ml, =( )/ 100% 1.6 不同细胞涂布方式藻落形成效率 : /ml, 100 µl (TAP ), 3, 20 d M, =M/ % :, 1% (low melting-point agarose, Solarbio) 42, 1 ml 2 ml EP, 100 µl, (, ): 2, 7% (V/V), 20% (m/v) 0.4% PEG8000 (m/v) 3, 1 ml 0 µl, 1 ml 1.7 数据处理 excel, Sigmaplot, SPSS, P<0.0 2 结果 2.1 雨生红球藻培养中生长曲线和细胞形态转换 1 SCCAP K-0084 BYA 12 d 2 d, /ml 10 /ml, 6, 6 10 /ml,,, 80% 2 / 2017 / 41 / 8

d 后的对数期细胞, 以游动细胞为主, 在 0 ml 和 2 ml 离心管中离心 min 需要的最低离心力分别为 00 g 和 400 g; 培养 8 d 的细胞中游动细胞占 60%, 其在 0 ml 和 2 ml 离心管中离心需要的最低离心力分别为 400 g 和 300 g; 而培养 12 d 后不动细胞占 80%以上, 其在 0 ml 和 2 ml 离心管中所需的离心力分别降低到了

5 以上从第 7 天培养开始, 细胞维持了 2~3 d 的缓慢胞形式存在, 而稳定期的细胞(9~12d)则更多是以不生长, 细胞密度最高达到 8 10 个/mL 左右, 并且细动细胞形态存在胞开始逐步的向不动细胞转换, 培养 11~12 d 后, 培 2.2 养液中大约 80% 左右的细胞已完全进入绿色的不动细胞期雨生红球藻细胞的离心收集雨生红球藻培养中细胞密度一般仅能达到 10 ~ 106 个/mL, 然而对于遗传转化等分子生物学操作, 通常需要将细胞浓缩到 107 ~108 个/mL 的细胞密度, 因此离心收集是必不可少的环节 BYA 中培养 4 8 和 12 d 后的细胞分别在不同离心条件下进行离心, 结果如表 1 所示培养 4 d 后的对数期细胞, 以游动细胞为主, 在 0 ml 和 2 ml 离心管中离心 min 需要的最低离心力分别为 00 g 和 400 g; 培养 8 d 的细胞中游动细胞占 60%, 其在 0 ml 和 2 ml 离心管中离心需要的最低离心力分别为 400 g 和 300 g; 而培养 12 d 后不动细胞占 80%以上, 其在 0 ml 和 2 ml 离心管中所需的离心力分别降低到了 200 g 和 100 g 这一结果表明, 不动细胞相比于游动图 1 雨生红球藻在培养中细胞形态转换和细胞密度曲线 Fig. 1 Growth curve and morphological shift of Haematococcus pluvialis in a mixotrophic culture medium 细胞, 离心收集需要的离心力更低, 研究还发现即使图 2 中分别显示了雨生红球藻 SCCAP K-0084 胞存活率的影响, 结果如图 3 所示游动细胞与不动细的绿色游动细胞和绿色不动细胞阶段的形态相对胞在离心力不大于 1000 g 时, 藻细胞存活率为 8%~ 于游动细胞, 不动细胞失去了鞭毛, 且部分细胞还 92%, 同未离心的对照样品没有明显差异(P>0.0) 因失去了细胞外胶质鞘的包裹, 不同培养时期细胞类此, 00~1000 g 离心 ~10 min 完全能够适用于雨生红型存在明显差异, 对数期细胞(3~6 d)主要以游动细球藻不同类型细胞的高效收集 Fig. 2 在最低离心力下提高离心时间也不能明显改善收集效果实验中还考察了提高离心力和增加离心时间对细图 2 雨生红球藻绿色游动细胞与绿色不动细胞的形态 Micrographs of motile and non-motile cells of Haematococcus pluvialis 表 1 游动细胞与不动细胞离心最低离心力 Tab. 1 Lowest centrifugal force of enriched motile and non-motile cells of Haematococcus pluvialis 培养 4 d 细胞项目培养 8 d 细胞培养 12 d 细胞离心管体积 (ml) 最低离心力 (g) 离心时间 (min) Marine Sciences / Vol. 41, No. 8 /

2.3 植板方式对藻落形成效率的影响 3 Fig. 3 Effects of different centrifugal forces on cell viability rate of motile and non-motile cells of Haematococcus pluvialis A. 300 g 10 min, B. 00 g min, C. 00 g 10 min, D.

6 2.3 植板方式对藻落形成效率的影响 3 Fig. 3 Effects of different centrifugal forces on cell viability rate of motile and non-motile cells of Haematococcus pluvialis A. 300 g 10 min, B. 00 g min, C. 00 g 10 min, D. 700 g min, E g min,, 3 2, BYA 4 d TAP, 10.83% 13.83%, (P>0.0) 21.67%(P<0.0), 表 2 不同植板方式对藻落形成效率的影响 Tab. 2 Effects of different cell-coating methods on phycocolony forming rate of Haematococcus pluvialis ( ) ( ) (%) (%) 10.83± ± ± 雨生红球藻在不同培养基上藻落形成效率的差异, BYA d, 8P-BG11 TAP BYA 3N-BBM 4, TAP, 4 d 8 d 12 d 18% 11.33% 6% 4 d BYA 8P-BG11 3N-BBM 2.83% 3.17% 42.67%, TAP (P<0.0) 8 d 12 d 4 d 8 d 12 d 4d (>80%),,, TAP BYA, 2, 2 d, BYA TAP 8P-BG11 3N-BBM,,, TAP, 8P-BG11 3N-BBM 4 8P-BG11 TAP BYA 3N-BBM BYA d Fig. 4 Effects of different phycocolony forming rates of cells cultivated at 4, 8, and 12 days in the mixotrophic medium BYA on four types of solid plates (8P-BG11, TAP, BYA, and 3N-BBM) 4 / 2017 / 41 / 8

7 图 BYA 培养 4 8 和 12 d 的细胞在 8P-BG11 TAP BYA 和 3N-BBM 四种固体培养基平板上生长 2 d 的藻落大小 Fig. 对比 Colony count of cells cultivated at 4, 8, and 12 days in the mixotrophic medium BYA on four types of solid plates (8P-BG11, TAP, BYA, and 3N-BBM) after 2 days 落形成效率较高但生长缓慢, 只有 BYA 培养基能够以 2700 g 离心 10 min 收集细胞用于叶绿体基因枪更快更有效的用于雨生红球藻的平板筛选 3 以 g 离心 8 min 收集藻细胞; Gutierrez 等 [22] 转化; 卢水秀等 [6] 在雨生红球藻电转化研究中则以讨论 1000 g 离心 min 收集藻细胞; Kathiresan 等 [8] 在土雨生红球藻不仅可以进行光合自养生长, 而且 [18] 壤农杆菌介导的雨生红球藻转化实验中以 110 g 离以心 min 收集细胞这些离心条件的选择性差异可往的研究证明乙酸钠的添加, 提高了雨生红球藻的能源于实验中雨生红球藻细胞类型的不一致本研生长速率, 且在乙酸钠浓度为 1. g/l 时细胞密度最究中发现, 雨生红球藻不动细胞在 100~200 g 离心力可以基于乙酸(盐)为底物进行异养或兼养生长 [19] 高可达 6 10 个/mL 本研究中采用的 BYA 培养基, 下即可实现高效率的收集, 而游动细胞则至少需要仅通过 6 d 的培养细胞密度就可达到 6 10 个/mL 以 400~00 g 的离心力条件研究结果还发现, 00~ 上而且研究发现在不同培养时期培养液中细胞类 1000 g 离心 min 足以满足不同时期与不同类型雨型存在巨大差异, 这可能与雨生红球藻复杂生活史生红球藻细胞的收集, 其对细胞活力没有明显影响, 有关 [11, 20] 本研究中雨生红球藻 BYA 培养第 3~6 d 能够满足后期分子生物学研究的需要对数生长期时, 主要是以绿色游动细胞为主, 第 7 d 固体平板的藻落形成与培养是细胞转化和筛选后, 绿色游动细胞逐渐向不动细胞阶段转变, 在培的最后一步藻落形成效率的高低会直接影响转化养 9~12 d 时, 以绿色不动细胞为主, 这可能是由于和筛选成功与否文献报道莱茵衣藻中淀粉粒包裹后期营养盐浓度降低所导致 BYA 中第 7~9 d 的后的方法被证明能够有效的提高细胞藻落形成与筛选期培养中, 细胞生长缓慢, 这一过程中仍然保持较效率 [23], 双层琼脂平板也被证明能够有效的提高细为缓慢的细胞个数增殖, 龙元薷等 [18] 认为雨生红球胞的菌落形成效率 [24-2] 本研究发现, 双层琼脂法能藻不动细胞虽然呈现不游动的静止状态, 但仍然能够有效的提高雨生红球藻的藻落形成效率, 但淀粉以较低的概率进行无性的细胞增殖, 不动细胞可以粒包裹法的效果并不明显以往的雨生红球藻转化通过形成孢子囊或出芽等方式释放游动或不动的子研究中大部分并未报道所采用的细胞来源中的主要细胞细胞类型, 仅有卢水秀等 [6]和 Kathiresan 等 [8]的报道离心是藻类分子生物学操作必不可少的环节, 藤长英等 [21] 在进行雨生红球藻基因枪转化实验中中分别提到采用不动期的细胞用于电转化和农杆菌介导转化研究, 而且都没有对细胞在平板上的藻落 Marine Sciences / Vol. 41, No. 8 / 2017

8 4 d, 8 d 12 d TAP, [6] Sharon-Gojman [9] TAP ; Kathiresan [8] TAP,, TAP, 21.67%, 8P-BG11, 3N-BBM BYA 0% 3, TAP, 7. mmol/l 1.13 mmol/l Borowitzka [26], 4.9~9.89 mmol/l 0.7 mmol/l, TAP TAP, Borowitzka [26],, TAP, TAP BYA,, 1~2, 8P-BG11 3N-BBM 4 BYA,,,, 表 3 四种培养基 (8P-BG11, TAP, BYA and 3N-BBM) 中主要营养元素含量对比 Tab. 3 Comparison of main nutrient elements in four culture media (8P-BG11, TAP, BYA, and 3N-BBM) 8P-BG11 TAP BYA 3N-BBM NO 3 (mmol/l) NH + 4 (mmol/l) 7. 3 PO 4 (mmol/l) Ca 2+ (µmol/l) Mg 2+ (µmol/l) Fe (µmol/l) Acetate (mmol/l) (g /L) 2 4 结论, : (1) ; (2), 00~1000 g min ; (3), ; (4), BYA : [1] Kamath B S, Srikanta B M, Dharmesh S M, et al. Ulcer preventive and antioxidative properties of astaxanthin from Haematococcus pluvialis[j]. European Journal of Pharmacology, 2008, 90 (1-3): [2] Domínguez-Bocanegra A R, Ponce-Noyola T, Torres- Muño J A. Astaxanthin production by Phaffia rhodozyma and Haematococcus pluvialis: a comparative study[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 7(4): [3] Boussiba S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response[j]. Physiologia Plantarum, 2000, 108(2): [4],,,. [J]. ( ), 2011, 27(4): Ye Tao, Wang Mingzi, Huang Jianzhong, et al. Preparation and regeneration breeding of protoplasts from Haematococcus pluvialis[j]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2011, 27(4): [],,,. IPP (Haematococcus pluvialis) 6 / 2017 / 41 / 8

9 [J]., 2013, 44(4): Wang Na, Lin Xiangzhi, Ma Ruijuan, et al. The effects of genetic transformation of isopentenyl diphosphate isomerase gene on the astaxanthin content of Haematococcus pluvialis[j]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013, 44(4): [6],. [J]., 2010, 26(6): 4-7. Lu Shuixiu, Chen Gu, Wei Dong. Effect of electroporation conditions on cell viability of Haematococcus pluvialis[j]. Mordern Food Science & Technology, 2010, 26(6): 4-7. [7] Steinbrenner J and Sandmann G. Transformation of the green alga Haematococcus pluvialis with a phytoene desaturase for accelerated astaxanthin biosynthesis[j]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(12): [8] Kathiresan S, Chandrashekar A, Ravishankar G A, et al. Agrobacterium-mediated transformation in the green alga haematococcus pluvialis (Chlorophyceae, Volvocales)[J]. Journal of Phycology, 2009, 4(3): [9] Sharon-Gojman R., Maimon E, Leu S, et al. Advanced methods for genetic engineering of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae, Volvocales)[J]. Algal Research, 201, 10: 8-1. [10],. [J]., 200, 18(2): Wang Chaogang, Hu Zhangli. The research advance in nuclear transformation system of Chlamydomonas reinhardtii[j]. Journal of Zhongkai University of Agriculture and Technology, 200, 18(2): [11],. [J]., 2000, 31(2): Liu Jianguo, Yin Mingyan. Studies of cell cycle in Haematococcus pluvialis[j]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2000, 31(2): [12] Stainier R Y, Kunisawa R, Mandel M, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales)[J]. Bacteriol Reviews, 1971, 3(2): [13],,,. ph [J]., 2014, 38(3): Zhang Dan, Zhu Xiaoyan, Wen Xiaobin, et al. Studies on equilibrium ph values of microalgal medium[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(3): [14] Melis A, Zhang L, Forestier M, et al. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algae Chlamydomonas reinhardtii[j]. Plant Physiology, 2000, 122(1) : [1] Tjahjono A E, Kakizono T, Hayama Y, et al. Formation and regeneration of protoplast from a unicellular green alga Haematococcus pluvialis[j]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1993, 7(3): [16],,,. [J]., 2016, 16(6): Xu Xiaoying, Cheng Tianyou, Chen Lin, et al. Effects of phosphorus on Haematococcus cell propagation and differentiation in two medium[j]. The Chinese Journal of Process Engineering, 2016, 16(6): [17] Widholm J M. The Use of fluorescein diacetate and phenosafranine for determining viability of cultured plant cells[j]. Stain Technology, 1972, 47(4): [18],,. [J]., 2014, 38(12): 1-7. Long Yuanru, Liu Jianguo, Zhang Litao. The cell growth enhancement and difference of 4 strains of Haematococcus pluvialis under mixotrophic culture mode[j]. Marine Sciences, 2014, 38(12): 1-7. [19],,,. [J]., 2000, 27(3): Zhuang Huiru, Chen Bilian, Wang Mingzi, et al. Mixotrophic and heterotrophic growth of Haematococcus pluvialis[j]. Microbiology, 2000, 27(3): [20] Elliott A M. Morphology and life history of Haematococcus pluvialis[j]. Archiv fur Protistenkunde, 1934, 82: [21] Teng C Y, Qin S, Liu J G, et al. Transient expression of lacz in bombarded unicellular green alga Haematococcus pluvialis[j]. Journal of Applied Phycology, 2002, 14(6): [22] Gutierrez C L, Gimpel J, Escobar C, et al. Chloroplast genetic tool for the green microalgae haematococcus pluvialis (Chlorophyceae, Volvocales)[J]. Journal of Phycology, 2012, 48(4): [23] Shimogawara K, Fujiwara S, Grossman A, et al. Highefficiency transformation of Chlamydomonas reinhardtii by electroporation[j]. Genetics, 1998, 148(4): [24],. [J]., 1994, 13(): Su Xiong, Wang Mengping. Isolation of Bordetella bronchiseptica with a double-layered plate at two different temperatures[j]. Journal of Huazhong Agricultural University, 1994, 13(): [2],. : [J]., 200, 2(10): Wang Shimei, Zhou Lixiang. A renovated approach for Marine Sciences / Vol. 41, No. 8 /

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1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)(

1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)( 24 1 Vol.24 No.1 94 2008 1 Transactions of the CSAE Jan. 2008 2008 1 100094 2 100035 3 100081 4 100081 5 100101 GIS ( ) 65.12 16.82 13.74 15.27 11.07 t/(hm 2 a) 10.93% 41.43% 46.93% 65.4%. Bi Jiye, Zhu