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1 第３９卷第６期２０１５年１１月南京林业大学学报自然科学版ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎＶｏｌ３９Ｎｏ６Ｎｏｖ２０１５ｄｏｉ１０３９６９ｊｉｓｓｎ１０００２００６２０１５０６００７凝结芽孢杆菌中 β 半乳糖苷酶基因的克隆及表达郑兆娟徐颖石磊欧阳嘉南京林业大学化学工程学院江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室江苏南京２１００３７摘要从１株快速水解乳糖发酵产酸的凝结芽孢杆菌ＮＬ０１的基因组上克隆获得了１个新的 β 半乳糖苷酶基因该基因长度为１９９８ｂｐ其编码的氨基酸序列与已经报道的 β 半乳糖苷酶相似度低于４０将该 β 半乳糖苷酶基因整合到表达载体ｐｅｔｄｕｅｔ１上并在大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３中进行重组表达 β 半乳糖苷酶粗酶酶活为１１９０ μｍｏｌｍｉｎｍｇ经镍柱纯化获得的重组 β 半乳糖苷酶酶活为６６６４ μｍｏｌｍｉｎｍｇ利用该重组 β 半乳糖苷酶水解乳糖经ＴＬＣ和ＨＰＬＣ分析显示该酶具有将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的活力是一种新型的 β 半乳糖苷酶关键词凝结芽孢杆菌 β 半乳糖苷酶表达纯化乳糖水解中图分类号Ｑ８１５ＴＱ９３文献标志码Ａ文章编号１０００２００６２０１５０６００３５０５Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＺＨＥＮＧＺｈａｏｊｕａｎＸＵＹｉｎｇＳＨＩＬｅｉＯＵＹＡＮＧＪｉａＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＢｉｏｍａｓｓＢａｓｅｄＧｒｅｅｎＦｕｅｌｓａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌｓＮａｎｊｉｎｇ２１００３７ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＡｎｏｖｅｌ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＮＬ０１ｗｈｉｃｈｈａｄａｂｉｌｉｔｙｔｏｈｙｄｒｏｌｙｚｅｌａｃｔｏｓｅｉｎｔｏｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｗａｓ１９９８ｂｐａｎｄｉｔｓｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｖｅｒｙｌｏｗｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒｒｅｐｏｒｔｅｄ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＴｈｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐｅｔｄｕｅｔ１ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１ＤＥ３Ｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ１１９０ μｍｏｌｍｉｎｍｇａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ６６６４ μｍｏｌｍｉｎｍｇａｆｔｅｒＮｉＮＴＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＩｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｐｒｏｄｕｃｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｔｈａｔｔｈｉｓｎｏｖｅｌ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｗａｒｄｌａｃｔｏｓｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｉｎｔｏｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅＫｅｙｗｏｒｄｓＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ β ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｌａｃｔｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ β 半乳糖苷酶ＥＣ３２１２３８学名为 β Ｄ半乳糖苷半乳糖水解酶常用名为乳糖酶广泛存在于微生物植物及哺乳动物的肠道中能水解乳糖中的 β １４糖苷键使其生成葡萄糖和半乳糖１３ β 半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业在液态奶类和乳制品加工过程中加入 β 半乳糖苷酶使其消化为葡萄糖和半乳糖相应的产品被称作低乳糖液态奶和低乳糖乳制品低乳糖奶不仅可以满足正常消费者的需要更可以满足乳糖不耐症者和先天性 β 半乳糖苷酶缺乏者对乳制品中营养充分吸收的需要 β 半乳糖苷酶来源广泛目前已经商品化的收稿日期２０１５０３２５ β 半乳糖苷酶主要来源于微生物包括大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ黑曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ米曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ克鲁维酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ脆壁酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ等４这些微生物的最适生长温度在３０左右其活性大多由常温 β 半乳糖苷酶表征目前市场上耐热 β 半乳糖苷酶产品较少耐热的 β 半乳糖苷酶不仅能够有效降低生产工艺中微生物污染的风险也能够提高反应速度在乳品生产工艺中有显著优势因此研究者们将对 β 半乳糖苷酶的来源研究转向高温微生物３５凝结芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ是经美国ＦＤＡ批准的一种普遍修回日期２０１５０８２５基金项目国家自然科学基金青年基金项目３１３００４８７３１２００４４３江苏省自然科学基金青年项目ＢＫ２０１３０９７０江苏高校优势学科建设工程资助项目ＰＡＰＤ第一作者郑兆娟讲师博士通信作者欧阳嘉教授Ｅｍａｉｌｈｇｏｕｙｊｎｊｆｕｅｄｕｃｎ引文格式郑兆娟徐颖石磊等凝结芽孢杆菌中 β 半乳糖苷酶基因的克隆及表达Ｊ南京林业大学学报自然科学版２０１５３９６３５３９

2 36 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ) 第 39 卷认为安全 ( Generally Recognized as Safe) 的乳酸菌, 其最适生长温度在 50 ~ 55 [6-8] 乳糖发酵实验表明, 凝结芽孢杆菌具有快速水解乳糖发酵产酸的特性, 但目前还没有来自凝结芽孢杆菌的 β- 半乳糖苷酶基因被克隆表达的报道笔者参照 Gen Bank 中凝结芽孢杆菌基因组上假定的 β- 半乳糖苷酶基因信息, 设计引物, 通过 PCR 技术从江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室保存的 1 株能以乳糖为唯一碳源的凝结芽孢杆菌 NL01 中克隆获得了 β- 半乳糖苷酶基因, 构建到原核表达载体 petduet-1 上, 在大肠杆菌表达宿主中高效诱导表达, 并对重组蛋白的乳糖水解和转糖基活性进行了进一步的分析 1 材料与方法 1.1 供试材料基因来源菌株 B. coagulans NL01 克隆宿主菌 E. coli Mach1-T1 表达宿主菌 E. coli BL21(DE3) 由江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室保存克隆载体 peasy -Blunt PFU DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司 ; 表达载体 petduet-1 购自 Novagen 公司 ; 限制性内切酶 T 4 DNA 连接酶购自 Fermentas 公司 ; 胰蛋白胨酵母浸粉购自 Oxoid 公司 ; 基因组提取试剂盒质粒提取试剂盒和 DNA 胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 ; 乳糖葡萄糖半乳糖和邻硝基苯 β-d- 半乳吡喃糖苷 (onpg) 购自 Sigma 公司 ; 其他生化试剂为进口产品或国产分析纯产品 1.2 引物设计参考 GenBank 中已完成全基因组注释的凝结芽孢杆菌 36D1(GenBank 登录号 :NC_ ) 和 2-6( GenBank 登录号 :NC_ ) 的全基因组 DNA 序列, 应用 Oligo 6 引物设计软件设计上下游引物, 由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成上游引物 : 5 - GAATTCGATGTTAAAAAAA CAAGAAAAATTTTATTATG-3 ( 斜体表示 EcoR I 酶切位点, 下划线部分表示起始密码子 ) 下游引物 : 5 -GTCGACCTATTTTTCAATTACCTGCAAAATTTTCA -3 ( 斜体表示 Sal I 酶切位点, 下划线部分表示终止密码子 ) 1.3 培养基及培养条件 LB 培养基包含胰蛋白胨 10 g / L, NaCl 10 g / L, 酵母浸粉 5 g / L 必要时添加终质量浓度为 100 μg / ml 的氨苄青霉素, 在 r / min 条件下振荡培养凝结芽孢杆菌液体培养基为葡萄糖 20 g / L, 酵母浸粉 10 g / L, 在 r / min 条件下振荡培养 1.4 目的基因 PCR 扩增克隆及测序将培养至对数中期的凝结芽孢杆菌 NL01 离心收集菌体, 利用基因组提取试剂盒提取其全基因组, 作为 PCR 反应的模板 PCR 扩增体系为 :5 Buffer 20 μl dntps 10 μl 上下游引物各 2 μl 模板 DNA 0.5 μl PFU DNA 聚合酶 2 μl, 用去离子水补充至总体积为 100 μl PCR 反应条件为 : 预变性 95 2 min; 变性 s 退火 s 72 1 min,35 个循环 ;72 延伸 10 min 扩增产物经 1% 琼脂糖凝结电泳鉴定后, 连接至 peasy- Blunt 载体, 转化 E. coli Mach1-T1, 在抗生素平板上挑选阳性克隆并提取重组质粒将重组质粒命名为 Blunt-gal, 经双酶切验证后送上海华大基因科技有限公司测序 1.5 重组 β- 半乳糖苷酶的表达与纯化利用限制性内切酶 EcoR I 和 Sal I 同时双酶切重组质粒 Blunt-gal 和表达载体 petduet-1, 利用 T 4 DNA 连接酶连接后转化 E. coli BL21(DE3), 在抗生素平板上挑选阳性克隆并提取重组质粒进行双酶切验证, 将验证正确的重组菌株命名为 E. coli BL21(pETDuet-gal) 培养 E. coli BL21( pet Duet-gal) 至 OD 600 nm 值达到 0.6 时加入 IPTG 诱导表达剂, 继续培养 5 h 收集诱导表达的菌体, 用生理盐水洗涤后重悬于结合缓冲液 (20 mmol / L 磷酸钠 500 mmol / L 氯化钠 20 mmol / L 咪唑,pH 7.4) 中, 在冰水浴中用超声波破碎菌体, 将破碎后的菌体离心, 所得上清即为粗酶液粗酶液通过 Ni 2+ 亲和柱进行纯化, 用不同梯度的洗脱缓冲液 ( 20 mmol / L 磷酸钠 500 mmol / L 氯化钠 500 mmol / L 咪唑, ph 7 4) 洗脱, 收集目的蛋白组分, SDS - PAGE 检测纯化效果 1.6 酶活及酶解产物分析方法 1)β- 半乳糖苷酶酶活测定方法 : 反应体系总体积为 1 ml, 依次加入 700 μl 去离子水,100 μl 500 mmol / L ph 7. 0 的磷酸钾缓冲液,100 μl 20 mmol / L 的 onpg, 先 37 水浴 5 min 后, 再加入 100 μl 经适当稀释的酶液, 混匀后 37 温水浴 10 min, 立即加入 2 ml 0. 5 mol / L 的 Na 2 CO 3 终止反应用分光光度计测量 410 nm 处的吸光值, 由测得的吸光值根据 onpg 标准曲线确定 onpg 的生成量, 定义 1 min 水解生成 1 μmol onpg 所需酶量为 1 个活力单位 [9] 采用 Brandford 法以牛血清蛋

第 6 期郑兆娟, 等 : 凝结芽孢杆菌中 β- 半乳糖苷酶基因的克隆及表达 37 白作为标准品测定蛋白浓度 [10] 2) TLC 法分析酶解产物 : 将反应混合物点样于硅胶薄板, 用正丁醇乙醇水以体积比为 5 3 2 作为展层剂, 置于层析缸中展开配置 0.

1 β- 半乳糖苷酶基因的 PCR 扩增克隆与测序结果提取凝结芽孢杆菌 NL01 的基因组 DNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测显示其条带单一, 基因组没有降解, 可以作为后续 PCR 实验的模板以凝结芽孢杆菌 NL01 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增得到 β- 半乳糖苷酶全基因, 约 2 000 bp 将该扩增条带连接至 peasy-blunt 后转化 E.

3 第 6 期郑兆娟, 等 : 凝结芽孢杆菌中 β- 半乳糖苷酶基因的克隆及表达 37 白作为标准品测定蛋白浓度 [10] 2) TLC 法分析酶解产物 : 将反应混合物点样于硅胶薄板, 用正丁醇乙醇水以体积比为作为展层剂, 置于层析缸中展开配置 0. 5% (w / v) 的 3,5- 二羟基甲苯溶于 20% 的浓硫酸中作为显色剂,105 加热 10 min 显色 [11] 3)HPLC 法分析酶解产物 : 采用 Agilent 1200 型高效液相色谱仪,Aminex HPX-87 液相色谱柱, 以 5 mmol / L 硫酸为流动相, 流速为 0.6 ml / min, 柱温 55, 示差折光检测 2 结果与分析 2.1 β- 半乳糖苷酶基因的 PCR 扩增克隆与测序结果提取凝结芽孢杆菌 NL01 的基因组 DNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测显示其条带单一, 基因组没有降解, 可以作为后续 PCR 实验的模板以凝结芽孢杆菌 NL01 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增得到 β- 半乳糖苷酶全基因, 约 bp 将该扩增条带连接至 peasy-blunt 后转化 E. coli Mach1-T1, 从抗性筛选平板上选取 6 个转化子, 进一步提取重组质粒 Blunt-gal 并双酶切 (EcoR I 和 Sal I) 验证, 结果如图 1 所示, 其中 5 号转化子在 bp 和 bp 附近出现条带, 说明此转化子含有正确质粒, 送样测定核苷酸序列家族分类方法,β- 半乳糖苷酶分属于糖苷水解酶家族 GH-1 GH-2 GH-35 和 GH-42( www. cazy. org) [12-13] 目前已经分离纯化鉴定的 β- 半乳糖苷 [1-3, 酶多来源于 GH - 2 和 GH - 35 家族 14-19], 该研究中的 β- 半乳糖苷酶属于 GH-42 家族由氨基酸序列的同源性比对发现, 该蛋白与目前已经报道的微生物来源的 β- 半乳糖苷酶 ( 例如来源于 Lac tobacillus bulgaricus ATCC 11842( GenBank 登录号为 WP _ ) [14] Enterobacter cloacae B5 (GenBank 登录号为 ABB73039) [15] Penicillium ex pansum F3(GenBank 登录号为 ACD75821) [16] Ba cillus megaterium ( GenBank 登录号为 ABN13675 ) [17] 和两种土壤未培养微生物 ( GenBank 登录号为 ADD69785 和 AFD21844) [18-19] ) 的相似性都低于 40%; 与凝结芽孢杆菌 36D1 和 2-6 基因组上注释的假定 β- 半乳糖苷酶同源性均大于 90% 同源性比对数据说明此次研究中来源于凝结芽孢杆菌 NL01 中的 β- 半乳糖苷酶是一个新型的 β- 半乳糖苷酶, 该酶在不同凝结芽孢杆菌菌株中普遍存在 2.3 重组表达质粒 petduet-gal 的构建选择具有强启动子的 petduet - 1 为表达载体, 构建重组表达质粒 petduet-gal 用 EcoR I 和 Sal I 同时双酶切 petduet-1 和 Blunt-gal, 回收相应片段后连接并转化 E. coli BL21( DE3), 从抗性筛选平板上选取 5 个转化子, 进一步提取重组质粒 petduet-gal 并双酶切 (EcoR I 和 Sal I) 验证, 结果如图 2 所示, 其中 4 号和 5 号转化子在 bp 和 bp 附近出现条带, 说明此转化子含有正确质粒图 1 重组质粒 Blunt-gal 的双酶切验证 Fig.1 Identification of the recombinant plasmid Blunt gal by digestion 注 : 泳道 1 ~ 6 的重组质粒来自 6 个不同转化子 Note:The plasmids for lane 1 to 6 are from six different recombi nant strains. 2.2 β- 半乳糖苷酶序列分析来源于凝结芽孢杆菌 NL01 的 β- 半乳糖苷酶基因序列全长 bp, GenBank, 登录号为 KM216751, 编码 665 个氨基酸, 分子质量为 76 ku, 等电点为 6.1 根据 Henrissat 建立的糖苷水解酶图 2 重组质粒 petduet-gal 的双酶切验证 Fig.2 Identification of the recombinant plasmid petduet-gal by digestion 注 : 泳道 1 ~ 5 的重组质粒来自于 5 个不同转化子 Note:The plasmids for lane 1 to 5 are from five different recom binant strains.

4 38 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ) 第 39 卷 2.4 重组 β- 半乳糖苷酶的诱导与纯化结果重组目的蛋白的 N 端具有 His 标签, 便于融合蛋白纯化将诱导表达的重组菌 E. coli BL21 (petduet-gal) 经超声波破碎后, 利用镍柱对重组 β- 半乳糖苷酶进行纯化, 结果如图 3 所示由图 3 可知, 诱导蛋白分子质量约为 70 ku, 与目的蛋白大小相符粗酶比酶活为 μmol / (min mg), 纯酶比酶活为 μmol / (min mg), 纯化倍数为 5.6 倍图 3 重组 β- 半乳糖苷酶的 SDS-PAGE 分析 Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant β-galactosidase 注 : 泳道 M 为标准蛋白分子质量,ku; 泳道 1 为含有质粒 petduet-1 的重组大肠杆菌诱导后的破碎液 ; 泳道 2 为含有质粒 petduet-gal 的重组大肠杆菌诱导后的破碎液 ; 泳道 3 为纯化的重组 β- 半乳糖苷酶 Note:M. protein marker; lane 1. cell - free extract of BL21 (DE3) harboring petduet - 1; lane 2. cell - free extract of BL21 ( DE3) harboring petduet-gal; lane 3. purified β-galactosidase. 2.5 重组 β- 半乳糖苷酶水解产物的 TLC 和 HPLC 法分析用 50 mmol / L ph 6.0 的磷酸氢二钾 - 磷酸二氢钾缓冲液配置 20 g / L 的乳糖溶液, 加入 5 μmol / (min g) 的 β- 半乳糖苷酶,55 下反应 60 min 后, 沸水浴加热使其停止反应, 对水解液产物进行 TLC 分析, 结果见图 4 从图 4 可以看出, 样品中的乳糖完全被降解为葡萄糖和半乳糖同时, 以 40 g / L 的乳糖为底物, 加入过量 β- 半乳糖苷酶酶液在 50 下反应,2 h 后以 HLPC 检测反应结果,HPLC 结果显示乳糖剩余量为 0.7 g / L, 葡萄糖和半乳糖的生成量分别为 19 7 g / L 和 19 5 g / L TLC 和 HPLC 数据都说明该研究中被克隆的基因确为 β- 半乳糖苷酶基因 β- 半乳糖苷酶具有两种活性, 即水解活性和转糖基活性, 不同来源的 β- 半乳糖苷酶的这两种活性差异较大水解活性高的 β- 半乳糖苷酶主要用于水解牛奶等乳制品中的乳糖, 而转糖基活性高 Fig.4 图 4 酶水解乳糖产物的 TLC 图 TLC profiles of the hydrolysis products of lactose 注 : 泳道 1 ~ 3 分别为乳糖半乳糖葡萄糖标准品 ; 泳道 4 为乳糖水解后样品 Note: lane 1. standard lactose; lane 2. standard galactose; lane 3. standard glucose; lane 4. sample of lactose after hydrolysis. 的 β- 半乳糖苷酶主要用于低聚半乳糖的合成例 [20] 如, 陆文伟等分析了来自于发酵乳杆菌的 β- 半乳糖苷酶, 其 TLC 结果除了检测到半乳糖和葡萄糖外, 还检测到了相应的低聚半乳糖, 在不同条件 [14] 下该酶都具有较强的转糖基活性 Nguyen 等克隆了来自保加利亚乳杆菌 DSM 的 β - 半乳糖苷酶基因并在植物乳杆菌中进行表达分析, 其水解和转糖基实验表明该酶也是以转糖基活性为主与上述 β- 半乳糖苷酶相比, 该研究中来源于凝结芽孢杆菌的 β- 半乳糖苷酶以水解活性为主, 同时考虑其耐高温的特性, 该酶在乳品生产工艺中具有显著优势 3 结论 1) 从凝结芽孢杆菌 NL01 基因组 DNA 上扩增得到 β- 半乳糖苷酶基因, 长 bp 该 β- 半乳糖苷酶属于糖苷水解酶 GH-42 家族, 与已经报道的其他微生物来源的 β - 半乳糖苷酶相似性低于 40% 2) 以大肠杆菌为表达宿主, 利用表达质粒 petduet-1 成功异源表达了具有生物活性的 β- 半乳糖苷酶, 并利用镍柱纯化获得电泳纯的重组蛋白, 纯酶比酶活为 μmol / (min mg) 参考文献 (References): [ 1 ] Mlichova Z, Rosenberg M.Current trends of β-galactosidase ap plication in food technology [ J]. Journal of Food and Nutrition Research, 2006, 45(2): [ 2 ] Park A R, Oh D K. Galacto oligosaccharide production using mi crobial β-galactosidase: current state and perspectives[ J]. Ap

5 第 6 期郑兆娟, 等 : 凝结芽孢杆菌中 β- 半乳糖苷酶基因的克隆及表达 39 plied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85 ( 5 ): [ 3 ] Ansari S A, Satar R. Recombinant β - galactosidases Past, present and future: A mini review[ J]. Journal of Molecular Ca talysis B: Enzymatic, 2012, 81: 1-6. [ 4 ] Panesar P S, Panesar R, Singh R S, et al. Microbial production, immobilization and applications of β-d galactosidase[ J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2006, 81( 4): [ 5 ] 董艺凝, 陈海琴, 刘小鸣, 等. 耐热 β- 半乳糖苷酶的研究进展 [J]. 食品工业科技, 2012, 33(1): Dong Y N, Chen H Q, Liu X M, et al. Research progress in thermostable β - galactosidases [ J]. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(1): [ 6 ] Ouyang J, Ma R, Zheng Z J, et al. Open fermentative production of L-lactic acid by Bacillus sp. strain NL01 using lignocellulosic hydrolyzates as low cost raw material [ J ]. Bioresource Technology, 2013, 135: [ 7 ] 张刚. 乳酸细菌 - 基础技术和应用 [ M]. 北京 : 化学工业出版社, Zhang G. Lactic acid bacteria basic, technology and application [ M]. Beijing: Chemical Industry Press, [ 8 ] 凌代文, 东秀珠. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法 [M]. 北京 : 中国轻工业出版社, Ling D W, Dong X Z. Classification and identification of lactic acid bacteria and experimental method[ M]. Beijing: China Light Industry Press, [ 9 ] Sun X J, Duan X G, Wu D, et al.characterization of Sulfolobus solfataricus β - galactosidase mutant F441Y expressed in Pichia pastoris [ J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94: [10] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding [ J ]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: [11 ] Li Z Y, Xiao M, Lu L L, et al. Production of non monosaccharide and high purity galactooligosaccharides by immo bilized enzyme catalysis and fermentation with immobilized yeast cells[ J]. Process Biochemistry, 2008, 43(8): [ 12] Henrissat B, Bairoch A. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities[ J]. Biochem J, 1991, 280: [13] Henrissat Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities [ J]. Bio chemical Journal, 1993, 293: [14] Nguyen T T, Nguyen H A, Arreola S L, et al. Homodimeric β- galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081: expression in Lactobacillus plantarum and biochemical characterization[ J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012,60(7): [ 15] Lu L L, Xiao M, Li Z Y, et al. A novel transglycosylating β-gal actosidase from Enterobacter cloacae B5 [ J ]. Process Biochemistry, 2009, 44(2): [16] Li Y M, Lu L L, Wang H M, et al. Cell surface engineering of a β-galactosidase for galactooligosaccharide synthesis[ J]. Applied and Environment Microbiology, 2009, 75(18): [17] Li Y M, Wang H M, Lu L L, et al. Purification and characteriza tion of a novel β - galactosidase with transglycosylation activity from Bacillus megaterium [ J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 158(1): [18] Wang K, Li G, Yu S Q, et al. A novel metagenome derived β- galactosidase: gene cloning, overexpression, purification and characterization [ J ]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 88(1): [19] Zhang X, Li H, Li C J, et al. Metagenomic approach for the iso lation of a thermostable β-galactosidase with high tolerance of ga lactose and glucose from soil samples of Turpan Basin[ J]. BMC Microbiology, 2013, 13: 237. [20] 陆文伟, 孔文涛, 孔健, 等. 发酵乳杆菌 β- 半乳糖苷酶转糖基活性研究 [ J]. 山东大学学报 : 理学版, 2008, 43 ( 7 ): Lu W W, Kong W T, Kong J, et al. Transgalactosylation activity of beta galactosidase produced by Lactobacillus fermentum K4[ J]. Journal of Shandong University: Natural Science, 2008, 43 ( 7): ( 责任编辑刘昌来 )

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌