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1 摇南京农业大学学报摇 2009, 32 (3): Journal of Nanjing Agricultural University http: / / nauxb 郾 njau 郾 edu 郾 cn 何新华, 郑青松, 刘玲, 等. 菊芋菊粉纯化中脱蛋白和脱色工艺条件研究 [J]. 南京农业大学学报, 2009, 32(3): 菊芋菊粉纯化中脱蛋白和脱色工艺条件研究何新华, 郑青松, 刘玲, 刘兆普 *, 张静, 魏微, 汪辉 ( 南京农业大学资源与环境科学学院 / 江苏省海洋生物学重点实验室, 江苏南京 ) 摘要 : 以干菊芋块茎粗粉为原料, 对菊芋菊粉纯化中脱蛋白和脱色工艺条件进行优化结果表明, 菊粉纯化的最佳工艺条件为 : 灭多酚氧化酶 (PPO) 活性的最佳温度为 90 益, 时间 10 min; 石灰乳脱蛋白最佳 ph 值为 11 ~ 12, 蛋白去除率约为 83 郾 61% ; 磷酸回调最佳 ph 值为 6 ~ 6 郾 5, 蛋白去除率为 12 郾 53% 菊粉提取液最佳脱色条件 : 采用 D311 弱碱阴离子树脂, 脱色温度 45 益, 色素浓度 0 郾 796 Abs, 洗脱速度为 4 B h -1, 树脂对色素的吸附量可达 15 郾 58 驻 A ml -1, 菊粉平均损失率为 3 郾 08% 关键词 : 菊芋 ; 菊粉 ; 灭酶活 ; 除蛋白 ; 脱色中图分类号 : S377 摇摇摇文献标志码 : A 摇摇摇文章编号 : (2009) Study on the technical conditions of deproteination and decolorization in purifying inulin from jerusalem artichoke HE Xin 鄄 hua, ZHENG Qing 鄄 song, LIU Ling, LIU Zhao 鄄 pu *, ZHANG Jing, WEI Wei, WANG Hui ( College of Resources and Environmental Sciences / Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province, Nanjing Agricultural University, Nanjing , China) Abstract: Technical conditions of the deproteination and decolorization in purifying inulin from jerusalem artichoke were optimized by orthogonal experiments. The results were described as follows: the optimum conditions for polyphenoloxidase sterilization were 90 益 and 10 min. The deproteination rate could reach 83 郾 61% with slack lime methods at the condition of ph However, the range of ph was between 6 and 6 郾 5 using phosphoric acid modulation method and the deproteination rate was 12 郾 53%. The op 鄄 timum conditions for decoloring for weak alkaline anion resin D311 were 45 益, pigment concentration 0 郾 796 Abs and the feeding rate 4 B h -1. Under these conditions the absorptive capacity of weak alkaline anion resin D311 reached 15 郾 58 驻 A ml -1 and the rate of inulin loss was only 3 郾 08%. Key words: jerusalem artichoke; inulin; enzyme sterilization; deproteination; decolorization 菊芋 (Helianthus tuberosus L. ) 属菊科多年生草本植物, 耐寒冷, 耐干旱, 耐贫瘠, 适应性强, 产量潜力大, 一般每公顷产菊芋块茎 30 ~ 60 t 菊芋中菊粉含量高, 占菊芋湿重的 15% ~ 20% [1], 占其块茎干重的 70% 以上 [2], 是生产菊粉的主要原料菊粉又名菊糖 (inulin), 是由果糖经茁 (2 寅 1) 糖苷键连接而成的线性直链多糖, 末端常带有琢 (1 寅 2) 糖苷键连接一个葡萄糖残基, 其结构式简写为 GFn [3] 菊粉的生理聚合度通常为 2 ~ 60, 平均聚合度为 10 菊粉为白色无定型粉末, 熔点约 190 益, 略有甜味, 无臭, 热值低, 可溶于水, 有很好的热稳定性, 菊粉溶液的 ph 值较低, 易吸湿菊粉是一种天然功能性食用多糖, 现代医学研究表明, 菊粉具有抗炎降低血清胆固醇抗肿瘤抗菌以及增强免疫等广泛的药理功效 [4-9] 菊粉水解产物具有多种保健功能, 近年来成为国际上热门的功能性食品, 所以菊粉的开发利用受到国际食品界的高度重视 [10] 目前, 菊芋菊粉的提取多采用热水浸提的方法, 但得到的粗提液含有大量的果胶蛋白质等杂质, 而且提取液呈棕褐色为了保证菊粉品质, 在生产高浓度菊粉液或固体菊粉之前, 必须进行除杂和脱色处理国内外有关菊苣的大孔树脂脱色已有报道 [11], 但是在菊芋上的相关研究甚少且缺乏系统性本研究以菊芋块茎为原料, 从灭多酚氧化酶酶活性除蛋白脱色等方面, 对菊粉提取纯化条件进行了系收稿日期 : 基金项目 : 国家 863 计划海洋技术领域重点项目 (2007AA091702); 国家科技支撑计划项目 (2006BAD09A04, 2006BAD09A08) 作者简介 : 何新华, 硕士研究生 * 通讯作者 : 刘兆普, 教授, 研究方向为近海资源利用, E 鄄 mail: sea@ njau 郾 edu 郾 cn

2 84 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 32 卷摇统研究, 初步确立了一套较为理想的菊粉提取工艺条件, 为该资源的综合利用和开发以及工业化生产菊粉产品提供了理论依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料仪器与试剂摇摇菊芋块茎采自南京农业大学大丰王港滩涂实验站, 洗净烘干粉碎备用仪器 : 755B 紫外可见分光光度计 ( 上海精密科学仪器有限公司 ), FZ102 型微型植物粉碎机 ( 天津泰斯特仪器有限公司 ), SECKMAN J2 HS ( 贝克曼库尔特实验系统 ( 苏州 ) 有限公司上海分公司 ), R 301 旋转蒸发器 ( 南京金正教学仪器有限公司 ), SHB 芋循环水式多用真空泵 ( 郑州长城科工贸有限公司 ) 葡萄糖磷酸蒽酮等试剂均为分析纯 ; 果糖为 BR 级试剂 ; 3,5 试剂 ) 为 CP 级试剂 1 郾 2 摇浸提方法二硝基水杨酸试剂 ( 又称 DNS 取菊芋块茎干粗粉 5 g, 以水为溶剂, 根据文献 [12-13] 和预试验的结果, 采用不同的浸提时间浸提温度和固液比分批次加热回流浸提 1 郾 3 摇菊粉纯化菊粉提取液中含有大量的果胶蛋白质色素及各种灰分等杂质, 在后续工艺中要去除 1 郾 3 郾 1 摇菊芋多酚氧化酶的灭活摇采用热烫方法对菊芋进行预处理 [2], 充分灭多酚氧化酶 (PPO) 的活性, 以降低后面菊粉脱色工艺的难度 1 郾 3 郾 2 摇除蛋白试验摇采用石灰乳沉淀法 [2] 往菊粉提取液中加入石灰乳, 在 50 益条件下分别对 ph 值为的菊粉提取液进行脱蛋白处理, 然后测定损失率和蛋白去除率, 以确定石灰乳处理的最佳作用 ph 值 1 郾 3 郾 3 摇磷酸处理最佳 ph 值的确定摇经过石灰乳除蛋白后的菊粉液 ph 值为 12, 液体中仍含有一部分蛋白质和酯类等杂质, 需要回调 ph 值来进一步去除杂质本试验采用磷酸回调 ph 值去除杂质 1 郾 3 郾 4 摇脱色摇采用 D311 弱碱阴离子树脂脱色法 [14-18] 选取不同温度色素浓度和洗脱速度, 以吸附量为考察指标, 进行 L 9 (3 4 ) 正交试验, 以确定最佳脱色工艺条件吸附量 ( 驻 A ml -1 ) = 驻 A 伊 V / V 1 式中 : 驻 A 为菊粉液脱色前后吸光值差 ; V 为菊粉脱色液体积 ; V 1 为树脂床体积洗脱速度 (B h -1 ): 每小时流过床层流动相的体积 1 郾 4 摇测定方法 [2] 1 郾 4 郾 1 摇菊粉含量提取率和损失率的测定摇菊粉含量 (mg ml -1 ) = 总糖含量 - 还原糖含量 ; 菊粉提取率 = (C T -C R ) / C T 伊 100% ; 菊粉损失率 = (C 0 -C) / C 0 伊 100% 式中 : C T C R 分别为总糖和还原糖的含量 ; C 0 C 分别为脱色前后的菊粉含量 [19] 1 郾 4 郾 2 摇菊芋还原糖浓度的测定摇采用 3,5 二硝基水杨酸比色法测定 [19] 1 郾 4 郾 3 摇菊芋提取液总糖浓度的检测摇采用蒽酮比色法测定 1 郾 4 郾 4 摇菊粉中蛋白质的测定摇采用紫外分光光度计法测定 [19] 蛋白质去除率 = ( C P0 - C P ) / C P0 伊 100% 式中 : C P0 C P 分别为除蛋白前后的蛋白质含量 1 郾 4 郾 5 摇多酚氧化酶 (PPO) 活性的测定摇参照文献 [20] 切取菊芋 2 mm 厚的皮层作为皮部, 按 1 颐 10 ( 质量比 ) 加蒸馏水, 低温下匀浆 2 min, 过滤, 取滤液于 25 益保温 5 min 即为待测粗酶液将粗酶液 2 ml 磷酸缓冲液 (ph 6 郾 84) 2 ml 和 0 郾 2% 的邻苯二酚 8 ml 混合后于 25 益下保温 10 min, 然后测定 A 416 值, 用驻 A 416 值表示 PPO 的活性 1 郾 4 郾 6 摇菊粉液中色值的测定摇取菊粉提取液, g 离心 10 min, 微孔滤膜 ( 孔径 0 郾 45 滋 m) 过滤后以去离子水为空白对照用分光光度计测定 A 420 值, 作为待测液的色值若待测液 A 420 值大于 1, 则稀释后再测定 [21-22] 色值以所测得的 A 420 值乘以稀释倍数来表示 1 郾 5 摇数据处理与分析所有数据均为 3 次重复的平均值, 运用 SPSS 13 郾 0 统计软件进行数据分析

3 第 3 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇何新华, 等 : 菊芋菊粉纯化中脱蛋白和脱色工艺条件的研究 85 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇菊粉多酚氧化酶灭活的最佳时间和温度的确定摇摇由图 1 可见, 20 ~ 40 益对 PPO 活性几乎没有影响 ; 随着温度升高, PPO 活性逐渐降低, 50 益保温 30 min 后酶活性为 79 郾 48% ; 60 益保温 30 min 后酶活性为 52 郾 19% 当温度超过 70 益时, PPO 活性就急剧下降 70 益保温 5 min 后的酶活性为 58 郾 47%, 30 min 后, PPO 完全失活而 80 益或 90 益保温 5 min 后的酶活性为 22 郾 38% 和 8 郾 26% 90 益时只需要保温 10 min, PPO 活性就完全丧失因此, 灭 PPO 活性最佳条件是 90 益热水处理菊芋块茎干粗粉 10 min, 而且能够达到减少菊粉提取液褐变程度的目的图 1 摇不同温度及时间对菊芋块茎多酚氧化酶活性 ( A 416 ) 的影响图 2 摇不同 ph 值对提取液中蛋白质去除率和菊粉损失率的影响 Fig 郾 1 摇 Effects of different temperature and time on poly 鄄 phenoloxidase activity ( A 416 ) in tubers of jerusa 鄄 Fig 郾 2 摇 Effects of different ph values on deproteination rate and inulin loss rate in extract lem artichoke 2 郾 2 摇除蛋白试验最佳参数的确定 2 郾 2 郾 1 摇石灰乳处理最佳 ph 值的确定摇采用新鲜石灰乳溶液处理菊芋提取液, 结果 ( 图 2) 显示, 最佳 ph 值为 11 ~ 12 时, 菊芋提取液中蛋白质的去除率达 83 郾 61%, 而菊粉损失率仅约为 1 郾 5% 2 郾 2 郾 2 摇磷酸处理的最佳 ph 值的确定摇由图 3 可以看出, 磷酸回调碱性菊粉液在 ph 值 12 ~ 8 时没有蛋白质沉淀产生 ; 当 ph 值为 6 ~ 6 郾 5 时达到最大沉淀量 ; 过酸则产生的蛋白质沉淀会重新溶解, 而且菊粉在酸性条件下不稳定, 会加速菊粉水解, 影响菊粉得率因此在进行磷酸回调碱性菊粉提取液的最佳 ph 值为 6 ~ 6 郾 5, 此条件下蛋白质沉淀量约为 60 mg, 蛋白质去除率为 12 郾 53% 2 郾 3 摇脱色工艺条件的确定经去除蛋白质的菊芋提取液脱色的 L 9 (3 4 ) 正交试验结果见表 1, 方差结果分析见表 2 图 3 摇不同 ph 值对蛋白质沉淀量的影响由表 1 和表 2 可知, 洗脱速度脱色温度和色素浓度 3 因素对脱色效率的影响依次减小, 其最佳试验方案为 A2B2C2, 即脱色温度 45 益, 色素浓度 Fig 郾 3 摇 Effects of different ph values on protein precipitati 鄄 on content 0 郾 796 Abs, 洗脱速度 4 B h -1 以 A2B2C2 作为优化条件重复试验 5 次, 脱色率分别为 14 郾郾郾郾 15 和 15 郾 96 驻 A ml -1, 平均脱色率为 15 郾 58 驻 A ml -1, 菊粉平均损失率仅为 3 郾 08%

4 86 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 32 卷摇表 1 摇 D311 树脂对菊芋提取液脱色的 L 9 (3 4 ) 正交试验结果 Table 1 摇 Orthogonal experiment results for decolorization of extract in jerusalem artichoke with D311 resin 试验号 Number of experiment A. 脱色温度 / 益 Decolorization temperature 因素 Factors B. 色素浓度 / Abs Pigment concentration C. 洗脱速度 / (B h -1 ) Eluting rate 吸附量 / ( 驻 A ml -1 ) Absorption 郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾郾 96 K 1 32 郾郾郾 38 K 2 36 郾郾郾 49 K 3 39 郾郾郾 60 k 1 10 郾郾郾 79 k 2 12 郾郾郾 83 k 3 13 郾郾郾 20 极差 R 7 郾 01 5 郾 97 7 郾 22 Table 2 摇表 2 摇菊芋提取液脱色工艺条件正交试验方差分析 Variance analysis of the orthogonal experiments for decolorization of extract in jerusalem artichoke 误差来源 Origin of variance 脱色温度 Decolorization temperature 色素浓度 Pigment concentration 洗脱速度 Eluting rate 误差 Error 摇摇注 : * 表示显著性 *Distinctiveness. 方差 Sum of square 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F 值 F value P 值 P value 8 郾郾 46 4 郾 90 * 6 郾郾 46 3 郾 80 * 10 郾郾 06 5 郾 56 * 1 郾郾 91 3 摇讨论与结论目前, 国际上菊芋菊粉及相关产品的生产已经成为很大的一个产业, 因为菊粉水解可得到果糖和低聚果糖 [23], 它们具有不同的保健功能我国菊粉纯化多采用热水提取菊粉微波提取等方法 [24], 工艺方法比较粗糙, 菊粉含量与品质都不高, 且多以菊苣为原料生产, 很少对以菊芋作为原料生产的菊粉进行系统深入地研究本试验以菊芋作为菊粉的生产原料, 菊粉含量高, 可占菊芋干重的 70% 以上, 解决了菊粉生产的原料问题 ; 试验中得出的工艺条件可操作性强, 适合扩大生产, 且产率高, 品质也好, 解决了菊粉生产的技术问题, 同时也为菊粉进一步加工生产更高附加值的果糖和低聚果糖奠定了基础本试验首先对 PPO 酶进行灭活, 以防止在后续步骤中发生褐变而增加菊芋提取液脱色的难度, 且高温灭 PPO 酶活性工艺条件简单易行, 有利于最终菊粉产品质量的提高试验中采用大孔树脂作为菊粉脱色材料, 因为大孔树脂具有吸附容量大吸附速度快易解吸易再生物理与化学稳定性高流体阻力较小等优点 [25] 同时采用 D311 弱碱阴离子树脂, 其色素吸附量大且目的产物菊粉损失率小 (3 郾 08% ), 明显优于目前传统上常用的活性炭脱色氧化剂 H 2 O 2 脱色 [17] 本试验得出的菊芋块茎提取纯化菊粉的工艺, 为今后菊芋资源的开发利用和菊粉的产业化生产提供了一定的参考和借鉴由于本试验为初级研究, 因此其中一些技术参数与工艺条件还需要进一步完善, 菊粉产品的深加工也需要进一步地研究和探讨

5 第 3 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇何新华, 等 : 菊芋菊粉纯化中脱蛋白和脱色工艺条件的研究 87 参考文献 : [1] 摇林容, 陈封怀, 黄秀兰. 中国植物志 [M]. 北京 : 科学出版社, 1979: [2] 摇郑建仙. 功能性低聚糖 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 2004: [3] 摇 Edelman J, Jefford T G. The mechanism of fructose metabolism in higher plants as exemplified in Helienthus tuberosus [ J]. New Phytol, 1968, 67: [4] 摇 Ernst M, Chatterton N J, Harrison P A. Carbohydrate changes in chicory(cichorium intybus L. var. foliosum) during growth and storage [ J]. Scientia Horticulturae, 1995, 63: [5] 摇 Laurenzo K S, Navia J L, Neiditch D S. Preparation of inulin products: US, [P] [6] 摇 Vervoort L, van den Mooter G. Inulin hydrogels. I. Dynamic and equilibrium swelling properties [J]. International Journal of Pharmaceu 鄄 tics, 1998, 172: [7] 摇 Vervoort L, Rombaut P. Inulin hydrogels. 域. In vitro degradation study [ J]. International Journal of Pharmaceutics, 1998, 172: [8] 摇朱宏吉, 郭强. 菊粉应用研究的新进展 [J]. 中国糖料, 2000(4): [9] 摇屠用利. 菊粉的功能与应用 [J]. 食品工业, 1997(4): [10] 林金莺, 周勇强, 赖子尼. 菊粉的功能与应用 [J]. 广州化工, 1999, 27(4): 8 9 [11] 尚红梅, 呼天明, 张存莉, 等. 大孔树脂用于菊苣菊粉的脱色研究 [J]. 西北植物学报, 2006, 26(9): [12] 熊善柏, 赵山, 李云捷, 等. 菊糖的提取与精制 [J]. 冷饮与速冻食品工业, 2001, 7(4): 1 3 [13] 吴洪新, 呼天明, 张存莉, 等. 菊苣菊粉提取与纯化研究 [J]. 西北农林科技大学学报 : 自然科学版, 2006, 34(6): [14] 刘永宁, 史作清, 喝柄林. 脱色树脂性能研究 [J]. 离子交换与吸附, 1993, 9(5): [15] 李丹丹, 金征宇. 牛蒡菊糖脱色工艺的研究 [J]. 农业工程学报, 2007, 23(8): [16] 李辰, 袁健, 邸多隆, 等. 5 种大孔吸附树脂对沙棘叶黄酮苷元的静态吸附 / 解吸附性能 [ J]. 精细化工, 2007, 24(7): [17] 吕磊. 大枣多糖的提取分离与脱色研究 [D]. 西安 : 西北大学, 2003 [18] 徐建国, 胡青平, 田呈瑞, 等. 大孔树脂纯化山茱萸总皂苷的动态吸附条件研究 [ J]. 西北植物学报, 2005, 25(11): [19] 大连轻工业学院, 华南理工大学, 郑州轻工业学院, 等. 食品分析 [M]. 北京 : 中国轻工业出版社, 1994: [20] 姜绍通, 罗志刚, 潘丽军. 甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制 [J]. 食品科学, 2001, 22(3): [21] 魏凌云. 菊粉的分离纯化过程和功能性产品研究 [D]. 杭州 : 浙江大学, 2006 [22] 王元凤, 金征宇. D315 树脂分离茶多糖工艺的研究 [J]. 农业工程学报, 2005, 21(10): [23] 范莹莹, 邢思敏. 常压下酸催化菊糖水解反应动力学研究 [J]. 广州化学, 1999(4): [24] 王启为, 张境, 张霞. 用微波法提取菊芋中的菊糖 [J]. 宁夏大学学报 : 自然科学版, 2002, 23(4): [25] 王跃生, 汪洋. 大孔吸附树脂研究进展 [J]. 中国中药杂志, 2006, 31(12): 责任编辑 : 范雪梅

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mm ~ 16 3 2011 6 Vol 16 No 3 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Jun 2011 1 2 3 1 150040 2 150040 3 450052 1 3 4 > 1 ~ 3 > > U414 A 1007-2683 2011 03-0121- 06 Shrinkage Characteristics of