中 国 畜 牧 兽 医 卷 &+4 ""-''"'" 在哺乳动物受精过程中 精子必须首先侵入并穿 透卵丘细胞层到达卵子透明带 成熟的卵母细胞是以卵子 ( 卵丘细胞复合体 '"-"- 形式被排出 体外受精时去除卵丘细胞会导致 受精率显著降低 许多研究表明 卵丘细胞不仅能够参与维持精子运动活力 控制和引

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1 中国畜牧兽医 " 米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响 周 崇 黄 莉 石德顺 蒋建荣 广西大学亚热带生物资源保护利用国家重点实验室 南宁 广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 南宁 摘 要 本研究旨在探讨米非司酮 "'4 对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响 分别添加 &"4 到精子获能液或穿卵培养液 检测小鼠精子顶体反应发生比率和穿透卵丘细胞层能力 结果显示 添加 4 能够极显著抑制孕酮 &" 诱导的精子顶体反应 & 并极显著减少穿透卵丘细胞层到达卵子透明带的精子数量及在卵子 ( 卵丘细胞复合体 中精子发生顶体反应的比率 & 同时添加 和 4 情况下 相比单独添加 4 虽然 能够极显著地促进精子穿透卵丘细胞层到达透明带 但对 中的精子顶体反应没有明显作用 综上表明 4 能够抑制 诱导的顶体反应并影响小鼠精子穿透卵丘细胞层过程 揭示 孕酮受体 通路在小鼠精子穿卵过程中具有重要作用 关键词 米非司酮 孕酮 精子 ( 卵丘互作 顶体反应 精子中图分类号 +A 文献标识码 文章编号 &&-&'-&(&&& 74%& 4 +=% & )(4 ()4%4 ' ")%':"''&''%'4"'" '''%&%'%"---&'-;'"'&"4: ''%'''%""-''""'-'% "':''-''%'""'-'" "-''%-'%:'%''%'4&'-& " "''%''" &" ''&'%&%'%"-"'%&'%';- 7-" - '% '& "' " :'% '% '"- "- &":'%'%'4- ''%%' '4'%"'" :'%'%'%&%''-" "'''%&%'%"- "'%&'%7 & % 4-%' "'"'''%&%'% "-"':%%&&''%' &'''%:"&%' " ''"'''%&%'%"--- 收稿日期 基金项目 广西自然科学基金 + 广西博士后基金 作者简介 周 崇 ) 男 广西南宁人 博士 研究方向 动物生殖生理学黄 莉 ) 女 广西南宁人 博士 副研究员 研究方向 病毒分子生物学 "--%&" 周崇和黄莉对本文具有同等贡献 并列为第一作者 通信作者 周 崇 "-;%" 石德顺 ) 男 广西南宁人 研究员 博士生导师 研究方向 动物胚胎工程与转基因动物 "-%&

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 &+4 ""-''"'" 在哺乳动物受精过程中 精子必须首先侵入并穿 透卵丘细胞层到达卵子透明带 成熟的卵母细胞是以卵子 ( 卵丘细胞复合体 '"-"- 形式被排出 体外受精时去除卵丘细胞会导致 受精率显著降低 许多研究表明 卵丘细胞不仅能够参与维持精子运动活力 控制和引导精子趋向卵母 细胞 诱导精子获能并提高精子穿卵能力 还有助 于防止多精受精及提高胚胎后续发育能力 卵丘细胞能够分泌孕酮 &' ) 其作用是通过孕酮受体 &' ' 来介导的 作为一种甾体激素 与生殖活动密切相关 在生殖医学上 或 表达缺陷不仅会导致女性不孕 而且也会导致 男性出现少精 弱精及畸形精子症 最近有报道指出 受精时 可调控卵丘细胞释放特异性的细 胞 趋化因子 提高精子结合卵母细胞的能力 由此可见 信号通路对受精具有重要的影响 但其作用机制尚不明确 米非司酮 " '4 是一种人工合成的 颉颃 剂 临床上多用于终止早孕和避孕 有研究表明 添加 &" 4 能够显著抑制小鼠体外 受精 且这种抑制效果不可逆 本试验通过在小鼠精 ( 卵互作过程中添加 4 初步探讨 信号通路在精子穿卵过程中的功能 为进一步阐释受精机理奠定基础 材料与方法 材料 试验动物 系小鼠 雄性 月龄 雌性 周龄 购自北京维通利华公司 小鼠的饲养管理和使用严格按照广西大学试验动物管理委员会的管理条例执行 试剂及仪器 所有化学药品除特别说明外均购自 +&" 公司 抗 74 抗 7 等抗体均购自上海圣克鲁斯公司 -- 标记的兔抗羊 &-- 标记的羊抗大鼠 & 均购自 + 公司 + 购自上海市计划生育研究所 % 购自宁波市第二激素厂 倒置荧光显微镜购自 公司 方法 精子免疫染色 小鼠附睾尾部精子回收于 液滴中分散培养 " 吸取液滴 上方的精子添加到含有 "&" 牛血清白蛋白 + 的 液滴中 和 湿度培养箱中获能培养 % 精子获能后 在处理组分别添加 &" 或 &"> 4 &" 继续培养 " 备用 各样品用 多聚甲醛 固定 " 用磷酸盐缓冲液 + 洗涤 次 加入 C 稀释的抗 74 抗体 作用 % 然后用 + 洗涤 次 再加入 C 稀释的 -- 标记的兔抗羊 & 作用 % 用 + 洗涤 次 装载到载玻片 倒置荧光显微镜下观察 精子 卵丘细胞穿透分析 参照 7% 等的方法 为了标记精子核 小鼠附睾尾部精子在含有 %'&" 的 液滴中分散培养 " 然后在含有 "&"+ 的 液滴中 和 湿度培养箱中获能培养 % 将雌鼠腹腔注射 + 和 % 各 4 两次注射间隔 %% 注射后 % 于输卵管壶腹部收集含有 期卵母细胞的 并移至含有 + 的 液滴中 获能后的精子添加到 液滴中 终浓度为 个 与 相互作用 或 " 精 ( 卵互作后 带有精子的 用 固定 " 用含有 的 + 洗涤 次 洗涤后 分别加入抗 74C 和抗 7C 抗体 作用 % 的 + 洗涤 次 再加入 -- 标记的兔抗羊 & C 和 -- 标记的羊抗大鼠 & C 作用 % 的 + 洗涤 次 装载到载玻片 倒置荧光显微镜下观察 数据处理和统计分析 试验数据用 +'' 检验进行统计分析 当 & 时 数据差异显著 当 & 时 数据差异极显著 结 果 对小鼠精子顶体反应的影响精子顶体反应试验结果表明 &" 诱导精子发生顶体反应 箭头所示 极显著高于对照组 & 而同时添加 4 能够显著抑制 诱导的精子顶体反应 & 同时添加 4 和 处理组精子顶体反应比率虽然高于对照组 但两者之间差异不显著 & 图

3 期 周 崇等米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响 %// ;孕 酮 处 理 组( J孕 酮 和 米 非 司 酮 处 理 组( a精 子 发 生 顶 体 反 应 的 比 率& ( 标 注 不 同 小 写 字 母 表 示 'I对照 组( 差异显著" %&' &(不同大写字母表示差异极显著" %&' &%(相同字母表示差异不显著" "&' &&下同 ( ( ( S6 ; =) 4 S6 J =) b>r)h( 4 S6 a > ' 'I J X 7" 4 -" " - " %&' &(` 7" 6 -" (a %&' &%(I-"X " - " - " "&' &'W7 7 " - " 7 N 4 X 图 PW%H( 对小鼠精子顶体反应的影响" &&i < J + -PW%H( / ++ - / /+: " &&i? 小鼠精子穿透卵丘细胞层过程中的顶体反应 对小鼠精子穿 透 卵 丘 细 胞 层 % 4 -时进行顶 GPW%H( 对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响 在添加 >R)H( 或 同 时 添 加 =) ' >R)H( 的 条 件 体反应检测发现在 穿 透 卵 丘 细 胞 层 过 程 中 精 子 顶 下分别检测小鼠精子穿透卵丘细胞层 & 4 -时的 体反应不仅发生在卵子透 明 带" U=表 面还 发 生 于 情况结果见 图 & 由 图 可 知与 对 照 组 相 比无 卵丘细胞基质" J<内 部 及 卵 丘 细 胞 层 表 面 或 外 部 边缘" _C&在 U=' J< 和 _C 各部 位发 生顶体 反应 论是否添加 =) >R)H( 都能够极显著抑制精子到达 的比率分别为 )%' (? " ' /%%' /顶 体 反 应 平 均 数% 总 平 均 数 ' )'? " H' (%%H' A和 /' %? " %' (% ' A结果见图 & 卵子透明带表面" %&' &%并 极 显 著 降 低 _JJ 中 精子的 顶 体 反 应 比 率 " %&' &%(相 比 单 独 添 加 >R)H( 组同 时 添 加 =) ' >R)H( 的 情 况 下虽 然 能 够极显著地促进精子到达卵子透明带但对 _JJ 中 精子的顶体反应并未有所改善" "&' &&

4 %/H 中国畜牧兽医 )) 卷 ; _JJ 中 总 的 和 顶 体 反 应 'I小鼠精子穿透卵丘细胞层图&红点为标记的精子核绿 点 为 标 记 的 精 子 顶 体 反 应( 的精子数& (_C卵丘细胞层外部边缘( J<卵丘基质( U=卵子透明带 : S7 7S4S S'>"" 7 7 "6 4 -S S -" 'I : UR<_% " 4 "6 4( ;PS4 -" 4 ""I> _JJ' _JJS ( J< S4S S4 F( U= N U= (_C 图 小鼠精子穿透卵丘细胞层过程中的顶体反应" %&&i < 4 + +/ +;:? /" :/: : + /+: " %&&i? I小鼠精子穿透卵丘细胞层图( ;透明带表面的精子数( J _JJ 中精子顶体反应比率 I: S7 7S4S S( ;PS N U=( J> _JJ 图 GPW%H( 对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响" %&&i < GJ + -PW%H(+ /" :/: : + /+: " %&&i? ) 上 =) 或 =B> 表 达 缺 陷 都 会 导 致 不 孕 不 育 % & 在 兔和人上卵丘细胞能够 分泌 产生 =)))A不 仅 能 够 G 讨 论 =) 是一种甾体激素目 前 已 知 与 排 卵'着 床'妊 娠和分娩等 生 殖 活 动 密 切 相 关 参与维持精子运动 活 力'控 制 和 引 导 精 子 趋 向 卵 母 ) %% %H %A 且 其 作 用 是 细 胞而 且 还 能 够 调 控 卵 丘 细 胞 释 放 细 胞%趋 化 因 ) %& %% &在生殖医学 子促进 受 精 完 成 ))%& 目 前有 关 =)=B> 信 号 通过 孕 酮 受 体 =B> 来 介 导 的

5 期 周 崇等 米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响 ) 通路在小鼠精 ( 卵互作过程中的相关作用尚未见到报道 因此 本试验利用人工合成的 颉颃剂 4 初步研究 信号通路在精子穿卵过程中的功能 并探讨其可能的作用机制 在哺乳动物受精过程中 卵丘细胞层是精子要 穿越的第一道屏障 体外受精时去除卵丘细胞 会导致受精率显著降低 最近 利用转有荧光蛋白基因的可视化精子穿卵丘细胞试验表明 部分精子在穿透卵丘细胞层尚未到达卵子透明带就已经发生了顶体反应 而这些顶体反应后的精子仍能正常 到达透明带 这与本研究的精子穿透卵丘细胞层过程中 74 免疫染色分析结果相一致 确实一部分精子的顶体反应是发生在卵丘细胞层基质 且在尚未到达卵子透明带之前 但精子在卵丘细胞层基质中发生顶体反应的具体生理意义 还有待进一步研究 在精子获能中可引起胞内快速 持续的 > 增加 随后诱导精子发生顶体反应 并已在 ) 兔 猪和人等哺乳动物中获得证实 而在猪精子上 这一结果能够被 颉颃剂 4 所抑 制 本研究通过在精子获能培养液中添加 结果表明 能够促进小鼠精子发生顶体反应 而同时添加 4 则抑制精子顶体反应的发生 这与上述其他研究者的研究结果相似 此外 4 还能够抑制受精中小鼠 兔 及人的精子穿透卵子质膜过程 进而抑制受精率 卵裂率及囊胚发育率 鉴于目前还没发现 4 对小鼠精子 ( 卵丘互作时的功能研究 因此本研究通过检测小鼠精子穿透卵丘细胞层的能力及 中精子发生顶体反应的状况 探讨 信号通路与精子穿卵的机制 研究结果显示 4 不仅能抑制精子到达卵子透明带表面 而且抑制 中的精子发生顶体反应 虽然同时添加 能够促进精子到达透明带 但改善效果不明显 许多研究表明 受精时卵丘细胞通过 信号通路调控并释放细胞 趋化因子 参与精 ( 卵之间的相互识别 诱导精子获能及提高精子体外受精能 力 这将使其作用机制变得更为复杂 尚需进一步深入研究 结 论 精子穿透卵丘细胞层时 顶体反应可发生在卵丘细胞层基质中 4 能够抑制 诱导的顶体反应并影响小鼠精子穿透卵丘细胞层过程 揭示 信号通路在小鼠精子穿卵过程中具有重要作用 参考文献?--=%%-&' :)) "-= ''% """-"&&'' ) : %" '-'-; '"''' :'%'% ')))) ' " '- %"%"''''" %" "--&'' ) %@'%?% &' '''% - > %- %" " ) &+%? '-"-- '%'--"'''%6-''% "';''&'%"-"/ )))) '% "--"-) "' '') '-;' 6' -&' ""'&= '-' '''"'- ': "-&--"--% ') )- 4' = ' - &'"'%"--'%"% "'''' '% ''"- "-&+ +% '-&-''& '' "-'"- &) "''%' )) -'- &'&&"" '-"""-'%-' ' ) -'-?;'-= '&'"';-& ;"'' ))

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