中国组织化学与细胞化学杂志 228 第 27 卷 RNA 酶抑制剂 (Epicentre),2.5mmol/L dntp 混合液 (datp,dgtp,dctp 和 dttp 各 2.5mmol/L) (HyTest Ltd),2 PCR master mix(arraystar), Gene Am

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1 第 27 卷第 3 期 2018 年 6 月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vol.27.No.3 June.2018 孕酮膜受体在小鼠生殖系统的分布与表达 * ( 莆田学院基础医学部, 莆田,351100) 摘要 目的观察孕酮膜受体 (membrane progestin receptors, mprs) 在小鼠子宫 输卵管和卵巢的分布及其周期性变化 方法用实时定量 PCR 免疫组织化学分别检测动情期和动情间期小鼠生殖系统 mprs 的 mrna 及蛋白表达 结果在子宫内,mPRα β 免疫阳性反应分布于内膜上皮 腺体上皮 内膜基质和血管内皮, 而 mprγ 弱免疫阳性反应见于腺体上皮和血管内皮 ; 在卵巢中,mPRα β 免疫阳性反应见于卵巢间质 卵母细胞和颗粒细胞,mPRγ 而未见明显免疫阳性反应 ; 在输卵管中,3 种蛋白均未见明显免疫阳性反应 实时定量 PCR 显示 3 种 mrna 在卵巢 输卵管和子宫均表达,mPRβ 的 mrna 表达水平最高 ; 动情期和动情间期 3 种 mrna 在卵巢 输卵管和子宫中均有表达, 而表达水平无显著性差异 结论 mprα β 在卵巢和子宫中表达稳定, 提示小鼠生殖系统中, 孕酮的非基因效应可能更多依赖 mprα mprβ 的介导, 尤其是 mprβ 关键词 孕酮膜受体; 卵巢 ; 输卵管 ; 子宫 ; 小鼠 中图分类号 R321.1 文献标识码 A DOI: / j. cnki Distribution and expression of membrane progesterone receptors in mouse reproductive system Lin Cuiying *, Lin Yangyuan, Zhang Chenhua, Liu Lixing, Wang Shouan (Department of Preclinical Medicine, Putian University, Putian , China) Abstract Objective To investigate the distribution of membrane progesterone receptor α, β and γ (mprα, mprβ and mprγ) in mouse reproductive system and their expression level changes during estrous cycle. Methods Immunohistochemistry was used to observe the distribution of mprs in mouse reproductive system. Real time PCR was applied to detect the mprs expression level changes in mice during or between estrus. Results In uterus, both mprα and mprβ were detected in the uterine endometrial epithelia, glandular, stroma and vascular endothelial cells, while mprγ was seen in the endometrial stroma and vascular endothelial cells. In ovary, both mprα and mprβ but not mprγ were found in ovary medulla, oocyte, and granulosa cells. No mprs was detected in oviduct. Real time PCR detected all 3 isoforms in uterus, ovary and oviduct at mrna level with mprβ being the highest. There was no significant difference in their expression levels during or between estrus. Conclusion The expression levels of mprα, β were stable in mouse ovary and uterus, suggesting that in mice, the non-genetic effects of progesterone in the reproductive systmen may be more dependent on mprα and mprβ, especially mprβ. Keywords Membrane progestin receptors; ovary; oviduct; uterus; mouse 在雌性哺乳动物的生殖活动中, 孕酮是一种十分重要的性激素, 也是早胚发育的关键因素 孕酮膜受体 (membrane progestin receptors, mprs) 能使孕酮产生快速非基因组效应 它们属于类孕激素和脂联素分子受体 (progestin and adipoq receptors,paqrs) 家族, 存在于细胞膜上, 通过调节膜腺苷酸环化酶的活性引起细胞内 camp 的水平变化, 而产生相应 收稿日期 修回日期 基金项目 莆田市科技局项目 2014S01(2) 作者简介 林翠英, 女 (1981 年 ), 汉族, 实验师 * 通讯作者 (To whom correspondence should be addressed): lincy2006@126.com 的效应 [1,2] 本研究通过检测 mprs 在小鼠子宫 输卵管和卵巢的定位及表达, 为进一步探讨其在早胚发育中的作用提供实验依据 材料和方法 1 实验动物和材料昆明雌鼠 (6~8w) 购自吴氏实验动物研究中心, 饲养 3~5d, 调节生理周期, 使其适应环境 抗小鼠 mprs 多克隆抗体 (Santa Cruz);S-P 超敏试剂盒 KIT-9701 内含 A 液 B 液 C 液 D 液 ( 迈新试剂公司 ); 免疫组织化学摄像系统 (Olympus) TRIZOL 试剂 无 RNA 酶的糖原 SuperScriptTM III reverse transcriptase 5 RT 缓冲液 (Invitrogen Life Technologies),

2 中国组织化学与细胞化学杂志 228 第 27 卷 RNA 酶抑制剂 (Epicentre),2.5mmol/L dntp 混合液 (datp,dgtp,dctp 和 dttp 各 2.5mmol/L) (HyTest Ltd),2 PCR master mix(arraystar), Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems), Primer( 英骏生物技术有限公司 ),QuantStudio 5 System (Applied Biosystems),Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems) 2 免疫组织化学检测 mprα mprβ 和 mprγ 蛋白质表达取 6~8w 昆明雌鼠以颈椎脱臼法处死小鼠, 迅速取出子宫 输卵管和卵巢, 置于 10% 中性缓冲福尔马林中固定过夜, 常规脱水 石蜡包埋, 制成 5μm 厚切片 烤好切片常规脱蜡入水, 柠檬酸抗原修复 :A 液 10min B 液 15min,4 一抗过夜,C 液 10min D 液 10min,DAB 显色 8min, 苏木素复染 7min, 脱水 吹干封片 对照采用 PBS 取代一抗, 其余步骤同上 3 实时定量 PCR 分析 mprα mprβ 和 mprγ 的 mrna 表达取 6~8w 昆明雌鼠阴道涂片区分动情期和动情间期, 以颈椎脱臼法处死小鼠, 迅速取出子宫 输卵管和卵巢,TRIzol 法提取总 RNA, 进行逆转录合成 cdna, 实时定量 PCR 分析分析 mprα mprβ 和 mprγ 的 mrna 表达, 并以 ACTB(- MOUSE) 基因为内参照 引物序列如下 :ACTB (247bp),F-5 GTACCACCATGTACCCAGGC3, R-5 AACGCAGCTCAGTAACAGTCC3 ;mprα (226bp),F-5 GCACCGCATCATAGTGTCTCC3, R-5 ATAATCCAGTGTCACCGCCTCT3 ; mprβ (277bp),F-5 TCTATGGAACACTACAGACGCT3, R-5 AAGAAGTAGTAACGCCACTCG3 ;mprγ (174bp),F-5 GGACTATGGTGCCGTCAATC3,R- 5 TGGAGTTCAAGAAACCTGGAGTA3 分别进行实时定量 PCR 反应 根据绘制的梯度稀释 DNA 标准曲线, 生成各样品目的基因和管家基因的浓度, 进行校正定量计算结果 4 统计学处理用 SPSS 19.0 统计软件对实时定量 PCR 结果数据进行统计分析, 运用 t 检验进行组间比较 结果 1 mprα mprβ 和 mprγ 在子宫 输卵管和卵巢的定位表达免疫组织化学染色显示, 免疫反应阳性产物呈棕黄色, 阳性细胞易于识别, 阴性对照呈阴性反应 ( 图 1A 和图 2A) 在小鼠子宫内,mPRα( 图 1B) 图 1 小鼠子宫中 mprs 免疫组织化学表达 A, 阴性对照组 ;B,mPRα;C,mPRβ;D,mPRγ; 比例尺,100μm Fig. 1 Evaluate mprs expression in mouse uterus using immunohistochemitry. A, control; B, mprα; C, mprβ; D, mprγ; scale bar, 100μm

3 第3期 229 林翠英等. 孕酮膜受体在小鼠生殖系统的分布与表达 和 mprβ 图 1C 免疫阳性反应分布于内膜上皮 2C 免疫阳性反应见于卵巢间质 弱免疫阳性反应 腺体上皮和内膜基质和血管内皮 而 mprγ( 图 1D) 见于卵母细胞和颗粒细胞 mprγ 未见明显免疫阳性 弱阳性反应见于腺体上皮和血管内皮 其他结构几 反应 图 2D 在输卵管中 三种蛋白均未见明显 乎不着色 在卵巢中 mprα 图 2B 和 mprβ 图 免疫阳性反应 图2 小鼠卵巢中 mprs 免疫组织化学表达 A PBS 阴性对照组 B mprα C mprβ D mprγ 比例尺 100μm Fig. 2 Evaluate mprs expression in mouse ovary using immunohistochemitry. A, PBS control; B, mprα; C, mprβ; D, mprγ; scale bar, 100μm 2 mprα mprβ 和 mprγ mrna 在子宫 输卵管 和卵巢的表达 实时定量 PCR 检测显示 在子宫 输卵管和卵 巢中 mprα mprβ 和 mprγ 的 mrna 均有表达 mprβ mrna 表达水平高于 mprα 和 mprγ mrna 对比 3 种组织内 mprα mprβ 和 mprγ mrna 表 达水平在动情期和动情间期之间无显著差异 图 3图 5 图 4 小鼠卵巢中 mprα mprβ 和 mprγ mrna 表达水平比较 * P<0.01 Fig. 4 mrna expression levels of mprα, mprβ and mprγ in mouse ovary, *, P<0.01 讨 论 mprs 的表达 分布及功能在鱼类及两栖类中研 究较为深入 然而其在哺乳动物生殖系统表达 分 图 3 小鼠子宫中 mprα mprβ 和 mprγ mrna 表达水平比较 * P<0.01 Fig. 3 mrna expression levels of mprα, mprβ and mprγ in mouse uterus, *, P<0.01 布及功能研究刚刚起步 PAQR7 PAQR8 和 PAQR5 又称孕激素膜受体 mprα mprβ 和 mprγ 参与孕 激素的快速调节作用 mprα 是最早被发现且研究最

4 中国组织化学与细胞化学杂志 230 第 27 卷 图 5 小鼠输卵管中 mprα mprβ 和 mprγ mrna 表达水平比较 *,P<0.01 Fig. 5 mrna expression levels of mprα, mprβ and mprγ in mouse oviduct. *, P<0.01 为深入的孕激素膜受体, 该蛋白质具有和 G 蛋白偶 [3] 联受体 (GPCRs) 相似的 7 次跨膜结构域,N 端 是糖基化位点和半胱氨酸残基保守区域 mprα 能与 抑制性 G 蛋白 (Gi) 直接耦联, 能激活 Gi 降低腺苷 酸激酶的活性, 使环磷酸腺苷 (camp) 合成减少, 激 活 p42mapk 及 PI3K 途径, 而产生生物学作用 [1,2] mprα 主要表达在生殖器官, 包括卵巢和睾丸 [2-7] 孕 酮加速进入生殖细胞减数分裂的作用很可能由 mpr 介导 [4-7] mprα 在调节卵母细胞减数分裂成熟过程 起重要作用, 它能快速诱导卵细胞减数分裂, 抑制 颗粒细胞调亡 [4] Hagiwara 等研究发现, 在 24h 产 卵周期中, 整个卵巢和排卵前滤泡的 mprα 和 mprγ 的转录本始终保持相对稳定水平 [5] 半光滑舌鳎鱼 卵巢中克隆的 cdna, 能编码新型的 PAQR, 其结 构与 mprα (Paqr7) 相似, 进化过程中介于 mprα 和 mprβ 之间的中间产物, 暂称为 Paqr7b Paqr7b 对调 节舌鳎鱼卵母细胞成熟有重要作用, 它可能对生殖 系统的其他方面 ( 比如脑垂体功能 ) 也有影响 [6] 有 研究显示鸡胚卵内表达 mprα, 和 mprβ 的 mrnas 表达比 mprγ 更高 ;mprα 免疫阳性细胞主要散在卵 巢皮质区域, 即生殖细胞分布的最大区域,mPRβ 免 疫反应阳性细胞广泛分布在卵巢内, 免疫阳性细胞 主要聚集在形态相似的生殖细胞群集, 提示孕酮可 能主要通过 mprs 调节原始胚胎生殖细胞减数分裂 启动 [7] 因此, 在孕酮调节生殖功能活动过程中, mprs 介导的快速非基因效应有着重要的作用 我们对小鼠生殖系统中 mprα mprβ 和 mprγ 的表达检测显示, 在小鼠子宫内,mPRα mprβ 免 疫阳性反应分布于内膜上皮 腺体上皮 内膜基质 和血管内皮, 而 mprγ 弱免疫阳性反应见于腺体上 皮和血管内皮 ; 在卵巢中,mPRα β 免疫阳性反应 见于卵巢间质 卵母细胞 颗粒细胞和血管内皮, mprγ 而未见明显免疫阳性反应 ;mprβ 的 mrnas 表达水平高于 mprα 和 mprγ 这些结果提示, 在 小鼠生殖系统中, 孕酮的非基因效应可能更多依赖 mprα mprβ 的介导, 尤其是 mprβ mprα mprβ 和 mprγ 在血管内皮均呈免疫阳性反应, 提示可能 参与器官血流量的调节 Kowalik 等对牛输卵管内孕 酮膜受体的研究显示, 输卵管同侧和对侧 mprα mprβ 和 mprγ 的 mrna 表达没有差异, 而在发情 周期的不同阶段输卵管同一处的表达不同,mPRα 的 mrna 在滤泡期比黄体中期表达更高,mPRα 和 mprβ 的 mrna 在伞部比峡部表达更高 [8] 对黄体 中期和滤泡期的双侧输卵管各部的免疫组织化学定 位检测显示,mPRα mprβ 和 mprγ 在黄体中期及 滤泡期的不同侧输卵管的各部反应强度和细胞定位 没有显著差别 ; 输卵管的腔细胞呈强阳性反应, 而 肌细胞和间质细胞则呈阴性反应 所有的蛋白质都 定位在输卵管内皮细胞, 表明孕酮膜受体可能参与 调节输卵管的运动 分泌功能以及器官的血流量 [8] 本研究在小鼠输卵管中, 三种蛋白均未见明显免疫 阳性反应, 而 mrnas 均有表达,mPRβ 表达水平 高于 mprα 和 mprγ 这可能与 mprs 在血管内皮表 达有关, 孕酮在小鼠输卵管中可能通过血管内 mprs 起作用 总之, 本研究显示 mprα 和 mprβ 蛋白在小鼠 卵巢和子宫中均有表达, 且表达水平不随动情周期 改变, 提示它们可能构成小鼠孕酮的快速非基因效 应的重要分子, 为早期胚胎在子宫内发育提供稳定 内环境, 其具体的作用机制还有待进一步研究 参考文献 [1] Saida M, Kamei Y, Hossain MB, et al. Cell-based assay of nongenomic actions of progestins revealed inhibitory G protein coupling to membrane progestin receptor α (mprα). Steroids, 2015, 100: [2] Tan W, Thomas P. Activation of the Pi3k/Akt pathway and modulation of phosphodiesterase activity via membrane progestin receptor-alpha (mpralpha) regulate progestin-initiated sperm hypermotility in Atlantic croaker. Biol Reprod, 2014, 90(5): [3] Thomas, P. Characteristics of Membrane Progestin Receptor Alpha (Mpralpha) and Progesterone Membrane Receptor

5 第 3 期林翠英等. 孕酮膜受体在小鼠生殖系统的分布与表达 231 Component 1 (Pgmrcl) and Their Roles in Mediating Rapid Progestin Actions. Front Neuroendocrinol, 2008, 29(2): [4] Shi B, Liu X, Xu Y, et al. Molecular and transcriptional characterization of GTHs and mprα during ovarian maturation in rock bream Oplegnathus fasciatus. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol, 2015, 323(7): [5] Hagiwara A, Ogiwara K, Takahashi T. Expression of Membrane Progestin Receptors (mprs) in Granulosa Cells of Medaka Preovulatory Follicles. Zoolog Sci, 2016, 33(1): [6] Shi B, Liu X, Thomas P, et al. Identification and characterization of a progestin and adipoq receptor (PAQR) structurally related to Paqr7 in the ovary of Cynoglossus semilaevis and its potential role in regulating oocyte maturation. Gen Comp Endocrinol, 2016, 237: [7] Mi Y, He B, Li J, et al. Progesterone regulates chicken embryonic germ cell meiotic initiation independent of retinoic acid signaling. Theriogenology, 2014, 82(2): [8] Kowalik MK, Martyniak M, Rekawiecki R, et al. Expression and immunolocalization of membrane progesterone receptors in the bovine oviduct. Domest Anim Endocrinol, 2016, 55:

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