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朝焱炀秦
5 years ago
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1 章淑芳博士浙江大学医学院干细胞与组织工程中心浙江大学医学院科研楼 B

2 4. 微丝的结合蛋白及其功能肌动蛋白结合蛋白 (actin-binding protein, ABP) 细胞内存在的一大类能与肌动蛋白单体或肌动蛋白纤维结合的能改变其特性的蛋白 ABP 从不同的水平调控微丝的组装, 在细胞中起控制微丝的形成交联盖帽和截断的作用, 并可移动细胞中的微丝, 影响微丝的稳定性长度和构型按其功能可分为三大类 : 1 与 F- 肌动蛋白的聚合有关的蛋白 :profilin; 2 与微丝结构有关的蛋白 :filamin; 3 与微丝收缩有关的蛋白 :myosin; 2

3 In vitro observation 3

4 Nature Jan 28;463(7280):

5 5

6 ABP 将微丝组织成以下三种主要形式 : Parallel bundle: MF 同向平行排列, 主要发现于微绒毛与丝状伪足 Contractile bundle: MF 反向平行排列, 主要发现于应力纤维和有丝分裂收缩环 Gllik Gel-like network: 细胞皮层 (cell cortex) 中微丝排列形式, MF 相互交错排列 6

7 Actin arrays in a cell 7

8 The formation of two types of actin filament bundles 8

9 肌动蛋白结合蛋白功能示意图 9

10 交联蛋白与微丝装配相关的蛋白膜结合蛋白参与形成化学机械装置系统的结合蛋白 10

11 使微丝成网成束的交联蛋白成束的交联蛋白交联蛋白可以将 actin 微丝组装成棒状或网状大多数交联蛋白是二聚体, 有两个 actin- 结合区域几个交联蛋白 (filamin,α-actinin,dystrophin,fimbrin) 的 actin- 结合区域是同源的根据交联蛋白的长度或 actin- 结合区域的距离,actin 微丝以棒状紧密结合, 或足够分开以利于与其他蛋白 ( myosin ) 相互作用丝束蛋白 (fimbrin) 绒毛蛋白 (villin) α- 辅肌动蛋白细丝蛋白成束成网 11

12 Bundles Networks Bundles: actin 纤维以平行阵列紧紧相连 Networks: actin 纤维交叉疏松相连 12

13 Fimbrin 丝束蛋白 13

14 Filamin( 细丝蛋白 ) 是一种 V- 形交联蛋白 Filamin 导致 actin 微丝以疏松的网络状相连, 使得胞质的某些区域具有胶类性质 Filamins 还可以起绞手架作用, 与信号通路中的成分 (plasma l membrane receptors, calmodulin, caveolin, protein kinase C, transcription factors, etc) 结合 Filamin cross-links actin in loose networks. 14

15 与微丝装配相关的蛋白 Actin 多聚化是由蛋白质调控的核化蛋白使游离的 actin 核化开始组装如 :ARP2/3 复合物单体聚合蛋白使肌动蛋白单体组装到纤维如 :Profilin 微丝解聚蛋白使微丝快速解聚例如 :Thymosin 4 封端蛋白防止 actin 亚基的增加或交换如 :CapZ, 纤维切断蛋白切断纤维丝如 :Cofilin Tropomodulin 多功能蛋白可使纤维丝解聚, 也可促进聚合如 :Gelsolin 15

16 核化蛋白 1 16

17 核化蛋白 2 Formins Formins 帮助无分枝的 actin 微丝 ( 压力纤维 ) 形成成核中心 Formins 结合到 actin 微丝的 (+) 端, 与质膜相连 actin-adp actin-atp + form in pl lasma membra ane 17

18 ProfilinP 单体聚合蛋白 ( ) () Profilin 与 G-actin 形成 1:1 复合物 Profilin 结合在 (+) 端, 与核苷结合区相对, 改变了 G-actin 构象, 使其核苷结合位点更开放 (+) ATP-Sr actin profilin PDB file 2BTF 18

19 Actin + Profilin Profilin 促进了 ATP/ADP 交换, 导致局部 G-actin-ATP 的浓度增加, 利于聚合 Profilin 可起载体作用, 把 actin 单体运输到微丝的 (+) 端 19

20 微丝解聚蛋白 Thymosin i β4 Thymosin β4 是一种分子量为 5 kda 的小蛋白, 与 G-actin 形成 1:1 复合物. 通过减少游离 G-actin 浓度, 增加 thymosin β4 浓度增加可以促进 F-actin 去多聚化 20

21 Thymosin β4 结合 ATP-G-actin (1:1) 阻断 ATP 结合位点防止 actin 微丝聚合 Profilin 结合 ATP-G-actin (1:1) 1) 允许 ATP/ADP 交换促进 actin 微丝聚合如果一个细胞大多数单体结合了 thymosin β4, 你在细胞内加入 profilin, 结果如何? 21

22 capping protein actin filament 封端蛋白 (CapZ, Tropomodulin) 结合在 actin 微丝的末端依据这些蛋白结合在 (+) 或 (-) 端, 起稳定微丝或促进解聚作用例如 : Tropomodulins 结合在 (-) 端 - 稳定 actin 微丝 22

23 纤维切断蛋白 Cofilin Cofilin 是 ADF 蛋白家族的成员之一, actin- 去聚合因子 Cofilin 结合在 actin 微丝的侧面, 扭曲螺旋 cofilin bound to actin-adp Cofilin 促进 G-actin-ADP ( 与 cofilin 的复合物 ) 从 actin 微丝的 (-) 端分离 Cofilin 与 G-actin-ADP 结合后抑制 ADP/ATP 交换, 从而抑制 actin 重新聚合 + actin-atp 某些情况下, cofilin 作用于微丝, 提供微丝生长成核所需的新的 (+) ends 23

24 Cofilin 的磷酸化导致其从 G-actin 上脱离, 使得 G-actin 能够进行 ADP/ATP 交换并加到 F-actin 得 (+) 端某些情况下,actin 多聚化可被导致 cofilin 磷酸化的信号链而启动. Twinfilin 是结构上与 cofilin 相近的一种蛋白, 可结合 G-actin-ADP 上, 起到捕获 actin 单体的作用 AIP1 (actin-interacting i t protein 1) 与 cofilin 作用, 在 cofilin- 作用的微丝 (+) 端封端 24

25 Gl Gelsolin li 多功能蛋白被 Ca 2+ 活化后, gelsolin 作用在 actin 微丝 (+) 端, 阻止微丝再生 actin filaments filamin or other cross-linker cross-linked actin network (gel) Ca ++ -activated gelsolin severs & caps (+) end of actin filaments. smaller filament fragments (sol) 25

26 Gelsolin 还可以促进片状伪足向前扩展作用在 actin 微丝,gelsolin g 对分枝的 actin 微丝网络的形成起作用, 这种网络形成可推动质膜前沿前进 Ca 2+ 缺乏时,Gelsolin l li 不与 actin 结合 Ca 2+ 导致 gelsolin 大的构象变化, 从而暴露与 actin- 结合位点 26

27 单体聚合蛋白纤维切断蛋白核化蛋白 27

28 4.3 膜结合蛋白把膜与微丝结合起来, 确定细胞表面特征例如 : 红细胞的膜骨架黏着斑的整合素血影蛋白 (spectrin) 锚蛋白 (ankyrin) 带三蛋白 (band III) 血型糖蛋白 (glycephorin) 28

29 Spectrin 是一种 actin- 结合蛋白, 形成一种延长的四聚物复合物 ( 在红细胞表面下的蛋白质网络结构 ) 维持红细胞结构的完整性长薄灵活的棒红细胞通过毛细血管所必需 29

30 Integrins( ( 整合素 ) 整合素是细胞表面的异二聚体受体 Integrins 介导细胞内 actin 骨架和细胞外基质组分的动态连接 ligand-binding site at α / β interface 整合素的细胞质区域结合转接蛋白质 (e.g., a-actinin, i talin, α β filamin), 这些蛋白质可以连接整合素和细胞骨架 integrin heterodimer extracellular space cytosolic domains bind cytoskeleton 30

31 整合素的两个亚基分别为 α & β, 均为单跨膜蛋白胞外配体结合到整合素 α & β 亚基的结合面 α & β 亚基有多种异构体 α & β 亚基的不同组合产生多种不同结合特性的整合素, 如 : collagen( 胶原质 ). fibronectin( 纤连蛋白 ). 31

32 cytosol actin filament plasma membrane domain that binds matrix proteins cross-linker adapter complex integrin heterodimer Focal Adhesion 连接 actin 微丝到整合素胞质区域的转接蛋白包括 α-actinin & talin. 整合素的胞外区域与基质蛋白连接, 使得细胞牢固地结合在细胞外基质上 32

33 参与形成化学机械装置系统的结合蛋白肌球蛋白肌动蛋白纤维的分子发动机肌球蛋白的结构 : 分子组成 : 一条重链两条轻链球形头部结构域 : 具有与肌动蛋白 ATP 结合位点, 有 ATPase 的活性 α 螺旋颈部结构域 : 通过钙调节机制, 调节头部的活性尾部结构域 : 决定与膜结合还是同其它尾部结合 33

34 肌球蛋白的功能以微丝作为轨道, 在消耗 ATP 的情况下, 沿微丝从负极向正极移动 Ⅴ Ⅰ 肌球蛋白 : 细胞骨架与膜之间的相对运动 Ⅱ 肌球蛋白 : 为肌肉收缩提供动力运动机制第一步 ; 与 ATP 结合 ---- 头部与肌动蛋白纤维脱离合第二步 : 水解 ---- 头部转动并与新的肌动蛋白亚基结第三步 :Pi 释放 ---- 头部转动第四步 :ADP 释放 ---- 头部自然下垂肌球蛋白怎样将从 ATP 获得的能量同产生运动的力偶连起来? 34

35 5. 微丝的功能构成细胞的支架, 维持细胞的形态作为肌纤维的组成成分, 参与肌肉收缩参与细胞分裂参与细胞运动参与细胞内物质运输参与细胞内信号转导 35

36 5.1 维持细胞的形态构成细胞的支架并维持细胞的形态, 如细胞皮层应力纤维微绒毛等 Actin creates gross morphological change in platelet cells 36

37 Specialized dactin Based Structures: Microvilliilli MBOC, 2004

38 5.2 肌肉收缩 (muscle contraction) 肌肉可看作一种特别富含细胞骨架的效力非常高的能量转换器, 它直接将化学能转变为机械能肌肉的细微结构 ( 以骨骼肌为例 ) 肌小节的组成肌肉收缩系统中的有关蛋白肌肉收缩的滑动模型 38

39 肌肉组成和结构肌细胞 ( 肌纤维 ) 肌原纤维粗肌丝 : 肌球蛋白细肌丝 : 微丝原肌球蛋白肌钙蛋白肌小节 39

40 肌肉收缩系统中的有关蛋白 1 肌球蛋白 (myosin) 其头部具 ATP 酶活力, 沿微丝从负极到正极进行运动有两个球形头部结构域 ( 具有 ATPase 活性 ) 和尾部链, 多个 Myosin 尾部相互缠绕, 形成 myosin filament, 即粗肌丝 2 原肌球蛋白 (tropomyosin, Tm) 由两条平行的多肽链形成 α- 螺旋构型, 位于肌动蛋白螺旋沟内加强稳定肌动蛋白纤维, 调节肌动蛋白与肌球蛋白头部的结合 3 肌钙蛋白 (Troponin, Tn) 为复合物, 包括三个亚基 :TnC(Ca 2+ 敏感性蛋白 ) 能特异与 Ca 2+ 结合 ( 控制 Tm 在细丝表面的位置 ); TnT( 与原肌球蛋白结合 ); TnI( 抑制肌球蛋白 ATPase 活性 ) 40

41 4 CapZ 结合肌动蛋白纤维 (+) 端, 阻止肌动蛋白纤维 (+) 端解聚 5 肌联蛋白 : 连接 Z 盘与肌球蛋白, 将肌球蛋白纤维定位于肌小节中央 6 伴肌动蛋白 : 与肌动蛋白伴行, 调节肌动蛋白纤维的装配 41

42 肌钙蛋白的作用模式 : TnC 与钙离子结合后, TnC TnT TnI 三亚基结合力增强, TnI 与肌球蛋白结合力削弱, TnT 使原肌球蛋白移动到肌动蛋白双螺旋沟的深处, 暴露出与肌球蛋白结合的位点 42

43 43

44 肌球蛋白在细肌丝上的移动 44

45 45

46 肌肉的收缩过程 1 肌膜动作电位的产生神经冲动神经 - 肌肉接点终板电位肌质网的动作电位钙离子的释放 2 肌球蛋白的位移 3 粗肌丝与细肌丝的相对滑行 46

47 5.3 参与细胞分裂胞质分裂通过质膜下由微丝束形成的收缩环完成收缩环是细胞有丝分裂末期, 两个即将分裂的子细胞产生的, 由平行排列的微丝和 myosinⅡ 组成 47

48 5.4 参与细胞运动参与细胞的多种运动形式 : 变形运动胞质环流细胞的内吞和外吐等细胞的变形运动微丝纤维生长, 使细胞表面突出, 形成片足 (Lamellipodia ) 在片足与基质接触的位置形成粘着斑 (adhesion site) 在肌球蛋白 (myosin) 的作用下, 微丝滑动, 使细胞主体迁移解除后方的粘着点 48

49 Lamellipodia ( 片足 ) 或 ruffle( ( 皱褶 ) 是运动细胞表面薄而宽的扁形突起在巨噬细胞的表面上, 普遍存在着皱褶结构, 与吞噬颗粒物质有关片足是动态结构, 持续改变形状片足包含大量分枝的 actin 微丝,(+) 端朝质膜定向片足通过与运动细胞前沿质膜相连的 actin 微丝的生长而向前扩展 49

50 微丝参与细胞内物质运输属于马达蛋白家族的肌球蛋白 (myosin), 它们以微丝作为运输轨道参与物质运输活动输 Ⅱ 型肌球蛋白分子结构 50

51 5.6 微丝参与细胞内信息传递细胞外的某些信号分子与细胞膜上的受体结合, 可触发膜下肌动蛋白的结构变化, 从而启动细胞内激酶变化的信号转导过程主要参与 Rho 蛋白家族有关的信号转导 5.7 微丝参与受精作用精子头端启动微丝组装, 形成顶体刺突完成受精 51

52 52

53 学习目标掌握中间纤维的形态结构和分类了解中间纤维的化学组成和分布说出中间纤维在结构上与其他两种纤维的异同点中间纤维与微丝微管组装有何区别简单叙述中间纤维的功能 53

54 主要内容中间纤维的结构与类型中间纤维组装与去组装中间纤维的功能 54

55 中间纤维直径 (~10nm) 介于微丝和微管之间, 是一种坚韧耐久的蛋白质纤维主要起支撑作用爪和头发主要由中间纤维蛋白组成在上皮细胞和神经元的轴中, 中间纤维丝的含量是微丝或微管的 10 倍非常稳定可以抵抗去垢剂和高浓度的盐尿素用于解聚中间纤维具有组织特异性编码中间纤维的基因家族, 具有高度的同源性基因表达具有严格的组织特异性肿瘤细胞转移后仍保留源细胞的中间纤维 55

56 1. 中间纤维的形态结构中间纤维的基本组成单位中间纤维单体中间纤维单体共同结构域 α- 螺旋杆状区 310 个氨基酸残基 (I-IV 型和 VI 型 IF) 或 356 个氨基酸残基 (V 型 IF) 非螺旋区头部 (N- 端 ) 尾部 (C- 端 ) 头部 (N- 端 ) 杆状区尾部 (C- 端 ) 56

57 特点 : α 螺旋的杆区 : 高度保守球形端部 :N 端和 C 端氨基酸序列变化较大结构稳定 : 既不受秋水仙素也不受细胞松弛 B 素影响 IF 没有极性 L 12 L 1 L 2 连连连 1A 接接接区 1B 区 2A 区 2B α- 螺旋 α- 螺旋 α- 螺旋 α- 螺旋 N- 端 C- 端 57

58 几种中间纤维的模式图 58

59 2. 中间纤维的分类角蛋白 (keratin) ( 表皮细胞 ) 组织来源及免疫原性中 / 碱性角蛋白 : 为头发指甲等坚韧结构所有酸性角蛋白 : 位于胞内, 亦称胞质角蛋白结蛋白 (desmin) 亦称骨骼蛋白 ( 肌肉细胞 ) 主要功能是使肌纤维连在一起胶质原纤维酸性蛋白 (glial l fibrillaryill acidic protein, ti GFAP) ( 星形神经胶质细胞和雪旺细胞 ) 主要起支撑作用波形纤维蛋白 (vimentin) ( 间充质细胞及中胚层来源的细胞 ) 一端与核膜相连, 另一端与细胞表面的桥粒半桥粒相连, 将细胞核和细胞器维持在特定空间神经纤丝蛋白 (neurofilament) ( 神经元纤维 ) 神经干细胞蛋白 (nestin)( 神经干细胞 ) 59

60 3. 中间纤维的化学组成中间纤维蛋白中间纤维蛋白的类型和分布顺序类型名称分子量 (kd) 多肽数组织分布 I 酸性角蛋白 >15 上皮细胞 II 碱性角蛋白 >15 上皮细胞 III 结蛋白 53 1 肌细胞胶质纤维酸性蛋白胶质细胞和星形细胞波形蛋白 55 1 间质细胞外周蛋白 57 1 神经元 IV 神经纤维蛋白成熟的外周和中枢神经元 a- 内连蛋白 66 1 发育中的中枢神经系统 V 核纤层蛋白 A.B.C 真核细胞 VI 巢素蛋白中枢神经系统干细胞 60

61 胚胎干细胞向神经系统分化过程胚胎干细胞神经干细胞神经元神经胶质 Oct4,SSEA1/4 Nestin MAP2 (neuron) GFAP (glial cells) 61

62 4. 中间丝结合蛋白 (intermediate filament associated protein,ifap) 是一类在结构和功能上与中间丝有密切联系, 但其本身不是中间丝结构组分的蛋白使中间丝之间交联成束成网, 并把中间丝交联到质膜或其他骨架成分上目前已知约 15 种,( 见教材中间丝结合蛋白表 ) IFAP 共同特征 : 1 具有中间丝类型特异性 ; 2 表达有细胞专一性 ; 3 不同的 IFAP 可存在于同一个细胞中与不同的中间丝组织状态相联系 ; 4 在细胞中某些 IFAP 的表达与细胞的功能和发育状态有关 62

63 5. 中间丝的组装中间纤维蛋白单体平行且相互对齐 X 2 双股超螺旋二聚体反向平行半分子长度交错 X 2 四聚体原丝 ( 基本亚基 ) 半分子长度交错 X 2 八聚体原纤维 X4 中间纤维为什么中间丝没有极性? 63

64 中间纤维组装的动态调节中间纤维在体外装配时不需要核苷酸和结合蛋白, 也不依赖于温度和蛋白质的浓度 ; 在体内, 大多数中间纤维蛋白都处于聚合状态, 并装配成了中间纤维, 很少有游离的四聚体, 不存在相应的可溶性蛋白库, 也没有与之平衡的踏车行为 ; 目前认为, 中间丝的组装和去组装通过中间丝蛋白的磷酸化和去磷酸化控制, 中间纤维蛋白丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化作用是中间纤维动态调节最常见最有效的调节方式 64

65 65

66 6. 中间丝的功能 6.1 参与构成细胞完整的支撑网架系统构成细胞完整的支撑网架系统, 还参与细胞核的形态支持和定位相邻细胞之间细胞与基膜之间连接结构的形成 66

67 中间丝与细胞连接 ( 桥粒 ) ( 半桥粒 ) 67

68 ( 桥粒 ) 68

69 69

70 6.2 为细胞提供机械强度支持 70

71 大苞性表皮松懈症 mutation in keratin gene 71

72 6.3 参与细胞的分化 1. 不同类型的 I F 严格地分布在不同类型的细胞中, 具有组织细胞的特异性 2. 发育不同阶段的细胞, 会表达不同类型的中间纤维, 是细胞分化的标志 72

73 6.4 参与细胞内信息传递中间纤维与 DNA 复制转录和 mrna 的运输有关, 胞质 mrna 锚定于中间纤维, 可能对其在细胞内的定位及是否翻译起重要作用 73

74 74

75 75

76 IFs 用于确定某些肿瘤的细胞起源 Why? 肿瘤细胞转移后仍保留源细胞的中间纤维 fluorescent-tagged antibodies Epithelial cancers and mesenchymal cancers are sensitive to different treatments 来自于胸腺和肠胃道的恶性肿瘤包含角蛋白, 缺乏波形蛋白, 表明它们来源于上皮细胞, 而不是基质间叶细胞 76

77 77

78 细胞运动 78

79 79

80 External Signals Can Dictate the Direction of Cell Migration 80

81 81

82 Adhesive cells exert traction forces on the substratum These fibroblasts have been cultured on a very thin sheet of silicon rubber. Attachment of the cells, followed by contraction of their cytoskeleton, has caused the rubber substratum to wrinkle. (From A.K. Harris, P. Wild, and D. Stopak, Science 208: , AAAS.) 82

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84 细胞运动与肿瘤转移 84

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94 恶化细胞增殖失控的原因是什么? 恶化细胞和肿瘤细胞中的微管数量为正常细胞的 1/2, 钙调蛋白却是正常细胞的 2 倍产生肿瘤的最大危险因子是衰老, 而与衰老有关的非整倍体性和基因表达与微管和纺垂体装配器功能异常相关微丝组装和分布异常, 不受正常调控 94

95 肌肉萎缩症产生的原因是什么? 患者萎缩蛋白基因异常, 肌肉细胞不能在细胞膜下方形成皮质细丝网, 即缺乏皮质细胞骨架当肌肉细胞收缩或被压挤时, 很容易被破坏, 肌肉细胞渐渐死亡, 而造成肌肉萎缩 95

96 老年痴呆与什么相关? 微小管是细胞骨架的重要组成, 细胞内的微小管上有 Tau 蛋白结合, 使微小管维持一定的结构当 Tau 蛋白因磷酸化, 而使折叠方式改变, 就不能与微小管结合脑细胞会出现很多纤维纠缠在一起, 使脑细胞死亡, 而造成老年痴呆症 96

97 Tau 蛋白形成的双螺旋形细丝构建了 AD 脑中神经纤维缠结块两条有明显的 80nm 周期和 8-20nm 变化宽度的拧在一起的链分子组成为 Tau 蛋白 Lee 等,Science(1991)251,

98 变色龙为什么会变色? 变色龙的色素粒原集中在细胞中心体附近当有刺激传来时, 色素粒沿着微小管的轨道, 被运送到细胞表面, 造成变色 98

99 Quiz 1. 何谓马达蛋白? 简述马达蛋白的三个不同家族成员的物质运输特点 2. 中间纤维的功能是什么? 为什么可以利用中间纤维来鉴定细胞? 99

100 推荐阅读资料 1.[ 美国 ]Lewin,B 等编著, 桑建利, 连慕兰等译. 细胞. 科学出版社, 翟中和, 王喜中, 丁明孝. 细胞生物学 ( 第 3 版 ). 高等教育出版社, 陈誉华, 杨恬, 李丰. 医学细胞生物学. 人民卫生出版社, 易静汤雪明医学细胞生物学. 上海科学技术出版社, 韩贻仁. 分子细胞生物学 ( 第三版 ). 高等教育出版社, Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of Cell. 5th ed. New York. Landon. Garland Publishing Inc,

101 生物学网站生物通生物谷生物秀生物谷论丁香园论坛中国生物论坛 NCBI-American 101

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General 第十章细胞骨架 (Cytoskeleton) 重点 : 微管微丝中间丝的结构特点组成成分类别和作用组装的特点及功能 1962 年 slauterback 改用戊二醛作固定剂, 才在电镜下发现细胞骨架细胞骨架 : 真核细胞中细胞核和质膜之间的由蛋白质组成的纤维网状结构, 包括微管微丝中等纤维, 与细胞运动和细胞形状的支持物质运输细胞分裂等有关微管分布在核周围, 并呈放射状向胞质四周扩散