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替童甯让
5 years ago
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1 中国畜牧兽医! " # / 从江香猪抑制素基因克隆及其卵巢表达研究张笑苏艳杨世彬王嘉福冉雪琴贵州大学农业生物工程研究院贵阳贵州大学生命科学学院贵阳贵州大学动物科学学院贵阳摘要为了探索抑制素基因 5, 与从江香猪繁殖性状之间的相关性试验采用特异性聚合酶链式反应 -) 技术克隆从江香猪 ) 基因测定其核苷酸序列通过等位基因特异性 -)!#!#9#8-),-) 方法检测从江香猪低产群与高产群之间 ) 基因的多态性变化以实时荧光定量 -) 技术检测高产低产从江香猪卵巢组织中 ) 基因的表达量结果表明从从江香猪基因组中成功克隆了 ) 基因编码区完整全长 0 9 编码个氨基酸经比对发现 ) 基因外显子序列中存在个候选 - 位点 0, 和, 经大样本检测从江香猪高产群与低产群之间个候选 - 位点的基因频率没有明显差异相比之下高产从江香猪卵巢中 ) 基因的表达量较高研究结果提示从江香猪 ) 基因结构保守可能主要通过基因的表达量变化调节从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育关键词从江香猪抑制素基因克隆卵巢 - 中图分类号./ 文献标识码, 文章编号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收稿日期 / 基金项目国家高技术研究发展计划 / 计划课题,, 贵州省农业科技攻关项目黔科合号贵州省科技创新人才团队建设专项黔科合人才团队 0 贵州大学大学生创新训练计划项目基础兽医学教学团队 62 作者简介张笑 00 女河北邯郸人学士研究方向生物技术 *1!:;%1 通信作者王嘉福 0 男教授博士生导师研究方向生物化学与分子生物学 *1!8%%;"#"#!//0/

2 0 中国畜牧兽医卷!#&#!1%$ ##'#8'$#'#%"!$8&'3%'$8!!##&#!91#$)%% 2%9% '## +&)')%%2%9%%##!%&'3- 抑制素 5 是转化生长因子超家族成员之一由雌性动物的卵巢颗粒细胞分泌主要通过负反馈抑制垂体促卵泡激素 8!!#$1"!$%'1#5 的合成和分泌抑制哺乳动物卵巢的生长和发育抑制素为异源二聚体二者的亚基相同由 ) 基因编码亚基不同由 ) 和, ) 基因编码雌性哺乳动物抑制素的浓度变化与发情周期中生长卵泡的数量直接相关是决定排卵数的关键激素之一而且对动物卵巢的发育和繁殖性能起重要的调节作用研究发现绵羊 ) 基因中有多个单核苷酸多态性位点对产羔数具有显著的基因效应是绵羊繁殖性能的候选基因从大白猪和长白猪 ) 基因外显子中确定的 - 位点, 与产仔数有关从江香猪是中国珍贵的小型地方猪种产于贵州省从江县月亮山区具有体型矮小耐近交等优 / 点杨廷模等在从江香猪主产区发现了高产从江香猪群体经产从江香猪产仔数增加头但数量很少仅占从江香猪群体总数的 > 左右目前还不清楚从江香猪这种种群内繁殖差异的生理机制本试验选择从江香猪的高产群和低产群着重研究 ) 基因多态性及其在卵巢中的表达差异探索从江香猪种群内繁殖差异的调节机制材料与方法, 样品采集雌性低产从江香猪血液或耳组织样本份高产从江香猪份新生高低产仔猪卵巢样本各个均采于清镇香猪养殖场于液氮中保存和运输, 主要试剂与仪器动物血液基因组 +, 提取试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒质粒 +, 提取试剂盒 "9#'#! -'#: '## 染料和 ';! 试剂均购自天根生化科技北京有限公司 9* *3 #$' 试剂盒和总, 提取试剂盒均购自 -' 1#% 公司引物合成和序列测定由生工生物工程上海股份有限公司完成荧光定量 -) 仪型号为美国 )20, 基因组 % 的提取参照动物血液基因组 +, 提取试剂盒说明书抽提 > 琼脂糖凝胶电泳检测基因组 +, 的质量? 保存备用, 克隆测序根据已知猪 ) 基因序列 # 登录号 ) 设计对引物 5, 和 5, 引物序列见表以基因组 +, 为模板进行 ) 基因外显子和的扩增 -) 反应体系 (C-) :( 模板 +,( 上下游引物 91! ( 各 (5 补足体系 -) 反应条件 0? 预变性 10? 变性? 退火? 延伸个循环? 延伸 1-) 扩增产物经 > 琼脂糖凝胶电泳分离回收纯化连接 9* 载体连接反应体系 C9(%$"8#'(9* *3 #$'(+,(%#( 目的片段 (? 连接过夜转化大肠杆菌 +5 感受态细胞? 倒置培养挑取单个菌落为模板经菌落 -) 质粒 -) 检测阳性克隆测定核苷酸序列,0 位点的群体分布频率检测以测序碱基序列与已知序列进行在线比对找到差异的候选 - 位点设计套引物 -0 和 - 引物序列见表采用等位基因特异性 -),-) 方法研究从江香猪群体 ) 基因的多态性变化并分析基因型与产仔数间的相关性, 从江香猪卵巢 *+( 基因的表达分析 ';! 法提取从江香猪卵巢总, 经反转录合成 +, 作为模板用引物 =5, 和 =,-+5 进行普通 -) 扩增引物序列见表回收目的片段连接 9* 载体制备重组质粒测序正确后作为模板绘制 =-) 的标准曲线计算扩增效率采用方法定量分析基因的表达量 -) 反应体系 C-'#1:*:2 ( 上下游引物 %( 各 (+, 模板 (+*-) 水补足 ( 体积 -) 反应条件 0? 预变性 10? 变性? 退火? 延伸个循环熔解曲线检测条件 0??0? 每个样品设个重复以 / 基因为内参 )$ 方法计算基因的相对表达量计算公式 )$ )$ 目的基因 )$,-+5

3 期张笑等从江香猪抑制素基因克隆及其卵巢表达研究 0 表引物序列!-'.$' 引物引物序列 << 退火温度? 扩增片段大小 9 -'1#' -'1#'#="##,#!%$#19#'$"'# -'"$;# 5,,),),,),,) 5,,),,)),),))),),, ),)),,)))) -0 ))))),),),),) /,)),,)),,),, ))))),),),),), ))),),,,,,,,,) - ),)),)))),,,)),,)),,),,,)),)))), ))),),,,,,,,,) =5,,)))),)),)) 0 ))),)))))) =,-+5 )),))),), ),),),, 结果与分析, 从江香猪 *+( 基因的克隆测序以从江香猪基因组 +, 为模板利用引物 5, 与 5, 进行扩增分别得到和 9 个片段图经克隆测序 ) 基因编码区全长 0 9 编码个氨基酸个片段的碱基序列与已知猪 ) 基因外显子和外显子序列 # 序列号 ) 的相似性分别为 00> 和 00> 表明扩增片段确为从江香猪 ) 基因外显子和外显子基因片段随机选取高产和低产从江香猪基因组样本各份分别扩增 ) 基因外显子和外显子片段克隆测序从中找到外显子的区含有个变异分别为 0, 和, 以 ) 基因外显子中的起始密码子, 开始计数导致,'%5',! 替换, 位点的群体分布频率以从江香猪样本基因组 +, 为模板采用,-) 方法检测 0,, 位点的群体分布结果见图和表由表可知高产低产从江香猪群个 - 位点等位基因频率之间的差异均不明显以基因型与从江香猪第胎产仔数之间进行关联分析 0,, 位点 9#'1 相关系数分别为 / 和 // 个位点的基因型频率与产仔数之间均不相关 +(+, '#') 基因外显子扩增片段 ) 基因外显子扩增片段 +(+, '#'#19!8$9'"$8) %###:#19!8$9'"$8 )%###: 图从江香猪 *+( 基因片段的扩增!,/-*!!#!$*#' *+($!$$!$!$*!

4 0 中国畜牧兽医卷 +(+, '#'0, 位点扩增片段, 位点扩增片段 +( +, '#'#19!8$ 9'"$ 8 0, $##19!8$ 9'"$ 8,$# 图从江香猪群体 *+( 基因多态性检测!,&- */!'-'##!$ *+($!$$!$!$*!**#!$ 表 *+( 基因 90% 位点基因型频率和等位基因频率 9$#&*.$&$.$& *+($#90%'!# 组别 '"9 样本数头基因型频率 #$39#8'#="#3 等位基因频率,!#!#8'#="#3,,,, 从江香猪低产群 )%%2%9%$!!$#'3#! 0 0 从江香猪高产群 )%%2%9%$%!$#'3#! / / 表 *+( 基因 %9 位点基因型频率和基因频率 9$#&*.$&$.$& *+($#%9'!# 组别 '"9 样本数头基因型频率 #$39#8'#="#3 等位基因频率,!#!#8'#="#3,,,, 从江香猪低产群 )%%2%9%$!!$#'3#! / 0 从江香猪高产群 )%%2%9%$%!$#'3#! // 0, 从江香猪卵巢中 *+( 基因的表达以从江香猪卵巢 +, 为模板扩增得到单一的 0 和 9 条带图经测序 0 9 位于从江香猪外显子末端 9 外显子前端 9 与猪 ) 基因 1, 序列 # 登录号 /0 相似性为 00> 以重组质引物的扩增效率为 0> 引物 =5, 的扩增效率为 > 对引物的扩增效率接近可以进行相对定量分析经统计高产和低产从江香猪卵巢中都检测到 ) 基因的表达与低产从江香猪相比高产从江香猪卵巢中的表达量较高是低产从江香猪的倍图粒为模板测定标准曲线得出内参基因 /

替换从大白猪与长白猪 ) 基因 0 外显子中检测到, 变异山羊和绵羊中发现多个变异位点同源的位点包括 /,) 0, 等从西农萨能奶山羊关中山羊和波尔山羊中 ) 基因 < 调控区检测到个 ) 突变和个插入突变从乐至黑山羊藏山羊 ) 基因编码区中检测到个同源位点突变, 5,'%, #$0!

5 期张笑等从江香猪抑制素基因克隆及其卵巢表达研究 0 +(+, '#' 内参基因 / 扩增片段 ) 基因扩增片段 +(+, '#'#19!8$9'"$8/ %###19!8$9'"$8)%## 图. 片段的扩增!,/-*!!#!$*#' #!- 图从江香猪卵巢中 *+( 基因 -% 的表达水平!,/-%8*'!$6 *+($!$#/ 6!' $!$!$*! 讨论从从江香猪基因组中克隆得到 ) 基因的外显子和外显子序列全长 0 9 编码个氨基酸核苷酸序列与已知猪种相应序列的相似度为 00> 定位于猪号染色体 ' 8 上经小样本克隆测序找到 0,, 个 - 位点分别导致,'%5 '! 替换从大白猪与长白猪 ) 基因 0 外显子中检测到, 变异山羊和绵羊中发现多个变异位点同源的位点包括 /,) 0, 等从西农萨能奶山羊关中山羊和波尔山羊中 ) 基因 < 调控区检测到个 ) 突变和个插入突变从乐至黑山羊藏山羊 ) 基因编码区中检测到个同源位点突变, 5,'%, #$0!, 这些变异在从江香猪 ) 基因中未检测到从江香猪 ) 基因中发现的 0,, 属于新的变异位点针对从江香猪 ) 基因中的个 - 位点设计引物采用,-) 方法扩大样本量进行群体检测从高产从江香猪群与低产从江香猪群中都检测到了, 种等位基因但是从江香猪 0,, 高产低产群体等位基因之间的频率差异不明显相关性分析结果显示个位点的基因型与香猪的产仔数之间没有直接的相关性大白猪与长白猪 ) 基因外显子中的, 位点与产仔数有关大白猪与长白猪的基因型与,, 基因型在总产仔数和产活仔数个参数的差异均显著 A 总产仔数分别提高了 A> 和 A> 0 经分析香猪基因编码的蛋白前体有个氨基酸为信号肽 / 为前肽为成熟肽从江香猪中发现的个 - 位点 0,, 编码的氨基酸位于 5, 前肽区域在成熟肽加工过程中前肽被切除这个变异的氨基酸可能不影响从江香猪成熟肽的一级结构和功能进一步采用实时荧光定量 -) 方法对从江香

6 0 中国畜牧兽医卷猪卵巢中 ) 基因的表达量进行研究得出高产从江香猪卵巢中 ) 基因的表达量较高为低产从江香猪的倍雌性动物中抑制素主要由卵巢产生胎盘子宫内膜等也有少量表达在腺垂体抑制素与 5 雌激素共同作用抑制 5 的释放及其对卵巢的各项功能抑制素的浓度变化影响下丘脑垂体性腺轴的平衡此外抑制素还有自分泌和旁分泌作用直接控制卵泡的发生卵母细胞的成熟对胚胎的发育也有调节作用小的有腔卵泡主要表达 5, 和 5 亚基二者结合为抑制素随着优势卵泡的发育开始表达 5, 和 5, 亚基二者结合生成抑制素, / 同时体外试验证明抑制素促进鹅颗粒细胞凋亡影响细胞从期进入期等有丝分裂过 0 程推测抑制素影响卵泡的选择决定次级卵泡是发育为优势卵泡还是闭锁卵泡女性妊娠后抑制素水平开始上升同时抑制素水平过低是临床上不排卵不育的原因之一在动物中采用免疫中和技术证明通过抑制素抗体可促进肉用小母牛卵巢中卵泡的发育进程提高排卵数说明抑制素调节雌性动物卵巢的生长发育影响排卵推测高产从江香猪卵巢中 ) 基因的表达量较高可能主要以自分泌或旁分泌作用调节卵巢的生长控制卵泡的发育可能是实际观察到的高产母猪的发情期较低产母猪晚的原因之一本研究结果提示 ) 基因表达量的差异可能是调节从江香猪卵巢发育影响从江香猪繁殖力的主要方式参考文献李万宏王春强周虚抑制素对动物生殖系统的影响及其在动物生产中的应用 6 中国畜牧兽医 / 孙晓萍刘建斌张万龙等不同来源抑制素抗原对牛羊繁殖力影响研究 6 黑龙江畜牧兽医 #19$36 7; #$!*:9'# )#!"!'$'"$85,5 # 8'#8$#'-!&"!$&$89'#3$#!$#8'18!!#88#'#$;#6*& &!#&/0 # 7$##$!11"; $8%$%$'##8!"!'#&#! 91#$&"!$'$#6*,& - 张超罗艳梅张家骅等激活素抑制素及其受体与动物生殖作用的研究进展 6 中国畜牧兽医 // 姜庆林储明星陈国宏等绵羊抑制素基因外显子多态性及其与高繁殖力关系的研究 6 安徽农业大学学报 000 田秀娥孙红霞王永军个绵羊群体 ) 基因的遗传多态性及对产羔数的影响 6 西北农林科技大学学报 /0 / 杨廷模刘畅赵恒鑫等高产从江香猪资源调查及其 5 基因型分析 6 畜牧与兽医 // 0 丁朝阳陈斌柳小春等 ) 基因多态性与猪产仔数的相关性分析 6 中国畜牧杂志 0 赵中权李周权张家骅 ) 亚基基因的多态性与山羊产羔数的相关性分析 6 中国畜牧杂志 / 周文然储明星孙少华等小尾寒羊高繁殖力候选基因 ) 的研究 6 农业生物技术学报滑国华陈世林姚红卫等山羊抑制素亚基基因酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析 6 遗传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责任编辑晋大鹏

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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0 中 国 畜 牧 兽 医 卷!#&#!1%$ ##'#8'$#'#%"!$8&'3%'$8!!##&#!91#$)%% 2%9% '## +&)')%%2%9%%##!%&'3- 抑制素 5 是转化生长因子 超家 族成员之一 由雌性动物的卵巢颗粒细胞分泌 主要通过负反馈抑制垂体促卵泡激素 8!!#

0 中国畜牧兽医卷!#&#!1%$ ##'#8'$#'#%"!$8&'3%'$8!!##&#!91#$)%% 2%9% '## +&)')%%2%9%%##!%&'3- 抑制素 5 是转化生长因子超家族成员之一由雌性动物的卵巢颗粒细胞分泌主要通过负反馈抑制垂体促卵泡激素 8!!#