期 张 海等 牛乳头状瘤病毒贵州株 & 基因克隆及生物信息学分析 -0--%000-&0&-0&--%-0000 #00-:0'0-0-0#0000- #00--&&%-%-#000-#0--0 牛乳头状瘤是由牛乳头状瘤病毒 0- 引起的慢性

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1 中国畜牧兽医 " # 牛乳头状瘤病毒贵州株 基因克隆及生物信息学分析 张 海 周碧君 杨忠成 廖 梅 王开功 文 明 程振涛 王 伟 冯旭芳 贵州大学动物科学学院 贵阳 贵州省动物疫病研究室 贵阳 贵州省畜禽遗传资源管理站 贵阳 摘 要 为分析牛乳头状瘤病毒贵州株 +@ 株 & 基因的分子特征 预测其编码蛋白的生物学功能 本试验对 +@ 株 & 基因进行 +27 扩增 克隆及序列测定 应用生物信息学相关软件及方法对 +@ 株 & 基因进行序列分析 并对其编码蛋白进行二级结构 三级结构 细胞表位 保守结构域 跨膜结构域和信号肽预测 结果显示 & 基因序列全长为 编码 个氨基酸 与 +@+@)5+@8)+@ +@ 株相应序列核苷酸同源性分别为 和 氨基酸同源性分别为 和 系统进化树显示 +@ 株与 +@)5 株亲缘关系最近 ' 蛋白二级结 构以无规则卷曲 折叠和 螺旋区域所占比例较大 预测此蛋白可能存在 个 细胞优势抗原表位 无跨膜区域 无信号肽区域 三级结构呈弯曲状螺旋结构 本研究结果将为贵州省 +@ 免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据 关键词 牛乳头状瘤病毒 & 基因 生物信息学分析 蛋白结构预测 中图分类号 文献标识码 文章编号 $'$$&'$"'($():& )$72$" - 3 #%#0% '3 "0 5 8-%% 5 "% 2# (-% 2) )## +)3-+ 2+))-# $ #+ 2+))-# ))&-)#+#)#"+ +('"0:---:0&%000-&-+@# 0#0&%00 +@- --&00-0B00%&- -0- &0#- #0 0-: 00-: &---:-&0&-0&--%-00&% #00#0#-#00%#&%00-0%-&- #0&%00 +@-#-0--& # #0 +@+@)5+@8)+@- +@-000:#00 #:%0000--:-0#-# #000 +@- +@)5-#000-:0'0-0#-#0- &000---#-#0-#%#000-%0#0'0-0 收稿日期 基金项目 贵州省农业委员会科技专项 动物疫病防控能力提升专项 黔农财 号 贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队 黔科合人才团队 号 贵州省黔南州社会发展科技重大计划项目 喀斯特石漠化林草牧综合治理技术研究与示范 黔南社发科 贵州现代肉牛产业技术体系专项 2( 作者简介 张 海 男 贵州仁怀人 硕士生 研究方向 预防兽医学 &-BB& 通信作者 周碧君 女 贵州贵阳人 教授 硕士生导师 研究方向 预防兽医学 &--#%0

2 期 张 海等 牛乳头状瘤病毒贵州株 & 基因克隆及生物信息学分析 -0--%000-&0&-0&--%-0000 #00-:0'0-0-0#0000- #00--&&%-%-#000-#0--0 牛乳头状瘤是由牛乳头状瘤病毒 0- 引起的慢性增生性疾病 也称为 疣 该病的肿瘤多发于体表 黏膜等 是牛常见的良性肿瘤疾病 颗粒是直径为 & 的正二十面体 为非包膜病毒 长约 的双链闭环超螺旋 < 分子 是乳头状瘤病毒家族的成员 & 基因是 ' 区的开放阅读框 37 主要编码 ' 衣壳蛋白 在 基因组中 & 基因最为保守 常被用来鉴定新的病毒类 型 ' 蛋白约为 能自我组装成空的病毒样颗粒 暴露在病毒表面 可以与细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用 可能对病毒感染和免疫原性 有一定的作用 ' 重组蛋白可诱导机体产生中和抗体 并起免疫保护作用 具有细胞特异性抗 原表位 ' 质粒的体外装配是生产预防多种型别乳头状瘤感染疫苗的基础 本试验对 贵州株 株 & 基因进行了克隆和测序分析 并与国内外不同毒株进行同源性比对 构建系统进化树 分析毒株间的亲缘关系 以阐明 株 & 基因的分子特点 并采用生物信息学软件对 & 基因编码的蛋白进行了二级结构 三级结构 细胞表位 保守结构域 跨膜结构域和信号肽预测 为进一步对该基因进行表达和核酸疫苗研制奠定基础 同时能了解当前 贵州流行株的生物信息学特征 丰富中国 分子流行病学资料 材料与方法 材料 株 大肠杆菌 < 感受态细胞均由贵州大学动物疫病研究所保存 "< 载体购自宝生物工程 大连 有限公司?' +27 "-0 "< "-0< 提取试剂盒均购自天根生化科技 北京 有限公司 琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司 氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公司 引物设计与合成 对 0 - 登录的各型 +@ 衣壳蛋白 & 基 因序列进行比对分析 选择较为保守的区域设计 对引物 引物序列为 上游引物 +A 222A 下游引物 +A 22A 预期扩增片段长 引物由上海英潍捷基公司合成 # 扩增 采用 < 提取试剂盒抽提 +@ 株病毒 < 以此模板进行 +27 扩增 +27 反应体系 ' 上 下游引物 &' 各 ' 模板 '?'+27 "-0"' 灭菌 3 '+27 反应程序 预变性 & 变性 退火 延伸 个循环 延伸 & 扩增产物进行 琼脂糖凝胶电泳检测 基因克隆及序列分析 回收纯化目的 < 并连接至 "< 载体上 转化大肠杆菌 < 感受态细胞 利用含氨苄青霉素 %&' 抗性的 ' 平板筛选阳性重组质粒 提取质粒 进行 +27 鉴定 产物经 琼脂糖凝胶电泳检测 鉴定为阳性的重组质粒命名为 "<' 送往赛默飞世尔科技 中国 有限公司测序 参考 0- 上公布的 株 +@& 基因序列 利用 <)-"0%- 等软件对测序结果进行分析 并构建系统进化树 参考毒株信息见表 生物信息学分析 采用 )+3" 软件 #-- %--&- -%0 +)- &-#& 预测蛋白质二级结构 采用 <)- 软件 +0- 程序预测 细胞表位多参数 采用 2 中 200<&-# <7 工具 #-&# %- 预测保守结构域 采用 """ )00#00" "" 预测跨膜结构域 采用 )%-+ #00)%-+ 预测信号肽 利用 )5))"3<'# &00-:% 在线预测蛋白质的三级结构

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 )' 中 : 参考株序列信息 '+("$&'$:"('$($)' 名称 乳头瘤病毒名称 属 0 - 登录号 -&0 +-&--& @ )-&- $)- ( +@ )-&- $)- " +@)5 )-&- $)- 82 +@8) )-&- $)- 8" +@ )-&- 7)- +@ )-&- 7)- ( +@ )-&- ))- +@ )-&- 7)- E +@ )-&- -&0 < +@ )-&- ))- < +@ )+-&- 7)- +@ )-&- 7)- +@ )-&- 7)- +@ )-&- 7)- E +@ )-&- $)- E 结果与分析 # 扩增 以提取的 +@ 株病毒 < 为模板 进 行 & 基因特异性 +27 扩增 经 琼脂糖凝胶电泳分析 得到大小为 的条带 图 与预期结果相符 "<'< "-0 扩增产物 阴性对照 "<'< "-0-&-0%-0 图 :) 株 基因 # 扩增产物电泳图 5$&$$"'$"(:)('$+# 测序结果 将鉴定的阳性重组质粒进行测序 测序结果采用 <)- 软件进行序列拼接 获得的 +@ 株 & 基因核苷酸序列结果见图 由图 可知 & 基因核苷酸序列长为 编码 个氨基酸 +@ 株 & 基因核苷酸同源性分析 将 +@ 株 & 基因序列与 0- 上公布 的 株 +@& 基因的对应序列进行核苷酸比对分析 结果见图 由图 可知 +@ 株 & 基因序列与 +@ 型的核苷酸序列同源性为 其中与 +@)5 株 登录号 82 的同源性最高达到 与 2 收录的另外两株 +@ 登录号 E+@ 登录号 ( 的同源性分别为

4 %% 期 张 海等$牛乳头状瘤病毒贵州株 8% 基因克隆及生物信息学分析 0 图 (:XIA["# 株 '# 基因测序结果 ) + 3'# 图 &(:XIA["# 株 '# 基因的核苷酸同源性分析 3'# :0 :02CdN?&% 株 8% 基因氨基酸同源性分析 E I 软 件 分 析 出 2CdN?&% 株 8% 基 采用 `L>A 因的 氨 基 酸 序 列并 与 NH-2E- 中 公 布 的 % 株 2Cd 8% 基因编 码 氨 基 酸 序 列 作 同 源 性 分 析结 果

5 0 中国畜牧兽医 ) 卷 见图 )&由图 ) 可知 2CdN?&% 株 8% 基因 氨基 酸 将 2CdN?&% 株 8% 基 因与 国内 外发 表的 2Cd 不同 序列与 2Cd0 型 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 为 :)^ $ 毒株 8% 基因 的核 苷酸 序列 采用 `L>A E I软 件 构 建 :)^ 其中 与 2Cd0 A&% 株 的 同 源 性 最 高 达 到 :)^ (与 LP23收录的另外两株 2Cd%' 2Cd% 的 系统进 化 树& 由 图 可 知 2CdN?&% 株 与 2Cd0' 同源性分别为 ) :)^ ' % :^ & 2Cd0 A&%' 2Cd0 >VA &% 株的亲 缘 关 系 较 近都 处 在同 一 遗 传 进 化 分 支表 明 2CdN?&% 株 为 0 型 0 :0 :2CdN?&% 株 8% 基 因 系 统 进 化 树 分 析 2Cd其中与 2Cd0 A&% 株的亲缘关系最近& 图 %(:XIA["# 株 '# 基因的氨基酸同源性分析 3'# - - 图 K(:XIA["# 株 '# 基因核苷酸序列的系统进化树 K:0 3'# O+

6 %% 期 张 海等$牛乳头状瘤病毒贵州株 8% 基因克隆及生物信息学分析 0 &(:XIA["# 株 ># 蛋白 ( 细胞表位预测 0 : :%% 蛋白二级结构预测 采用 AQC> 软 0 : :0 % 蛋 白 2 细 胞 多 参 数 分 析 采 用 `L>A E I程 序 包 中 的 CI # H E- 软 件 综 合 分 析 预 测 件预测 % 蛋白的二级结构结果见图 (& 由图 ( 可 % 蛋 白 2 细 胞 表 位 各 参 数& 采 用 VX H `&& $ H 法 分 析 亲 水 性VE I OJ A5O G 法 分 析 柔 韧 性 [ 知 2CdN?&% 株 % 蛋 白 的 二 级 结 构 主 要 包 括 螺旋' 转 角'无 规 则 卷 曲 和 折 叠所 占 比 例 分 " 别为 0& :0^ ' :)(^ ' )& :&)^ 和 0 :^ &在整个 i E8H J## 法分析 抗 原 指 数 D8$ $法 分 析 氨 基 酸表面可及性以高 于 阈 值 的 氨 基 酸 残 基 作 为 候 选 蛋白二级结构 中 无 规 则 卷 曲' 折 叠 和 " 螺 旋 区 域 参考区域结果见图 &由图 可 知该 蛋 白 在 整 个 出现相 对 较 多而 此 序 列 中 转 角 所 占 比 例 相 对 较少& 氨基酸区域中都具有良好的亲水性柔韧性分布较 均匀抗原性和表面可及性较高& 5 螺旋( 转角( 无规则卷曲( H 折叠 " 5 > $ Z( 2H E O I -( UE-"#8 # $ ( H DZ H-"H"J I E-" [5E5H 图 $(:XIA["# 株 ># 蛋白二级结构预测 $) + + < 3>#< -@ 图 Q(:XIA["# 株 ># 蛋白 ( 细胞表位参数预测 Q( < < < 3>#<

7 中 国 畜 牧 兽 医 卷 细胞抗原表位综合分析结果 根据二级结构 亲水性 抗原指数 表面可及性和柔韧性综合分析 ' 蛋白各肽段区域成为优势抗原表位的可能 结果见表 由表 可知 ' 蛋白第 $$ $$$ 和 $ 位氨基酸 的亲水性 表面可及性 抗原指数及柔韧性均较高 :) 株 蛋白保守结构域预测采用 2 服务器上的 2<7 工具分析 & 基因氨基酸序列保守结构域 没有发现具有明显特征的保守结构域 图 表 应用不同参数预测 :) 株 蛋白抗原表位的肽段位置 '+$"$(($:)('$$-$$''&( 预测参数 +0--&00 二级结构 )0-:0 亲水性 :#: 柔韧性 0: 抗原指数 %0: 表面可及性 )-0-: 合计 - 预测结果 +00 图 :) 株 蛋白保守结构域分析 5$(2&'$''($($:)('$ :) 株 蛋白的跨膜结构预测 采用 """ )00 对 ' 蛋白跨膜结 构域进行预测和分析 结果显示 +@' 蛋白未发现跨膜结构域 图 图 蛋白跨膜结构域预测 5$$"$'(&&+'&'$($ :) 株 蛋白信号肽预测 采用 )%-+ 对 ' 蛋白序列中是否存在潜 在的信号肽进行预测 结果显示 此蛋白无信号肽 图 即为非分泌型蛋白

8 %% 期 张 海等$牛乳头状瘤病毒贵州株 8% 基因克隆及生物信息学分析 Q># 蛋白三级结构预测 利用 A3 AA Q`D 预 测 % 蛋 白 的 三 级 结 0)% 构结果显示 % 蛋 白 的 结 构 域 区 呈 弯 曲 螺 旋 结 构 "图 %%#& 图 #"># 蛋白信号肽预测 3>#< - 图 ##(:XIA["# 株 ># 蛋白三级结构预测 ##N + + < >#< -@ 生物信息学分析对 2Cd 疫苗的研究有重要意义& & 讨 论 本研究 根 据 NH-2E- 登 录 的 2Cd 8% 基 因 序 对 列设 计 特 异 性 引 物从 2CdN?&% 株 中 克 隆 该 基 养牛业造 成 了 较 大 的 经 济 损 失& 至 今 已 被 鉴 定 的 因经质粒 鉴 定 及 `L> 测 序 验 证 克 隆 成 功& 本 研 近年来犊牛的发病率有逐渐上升的趋 势 ) ) 2Cd 基因型有 % 种还 有 很 多 的 假 定 基 因 型 %& 究 测 序 结 果 显 示2CdN?&% 基 因 序 列 全 长 为 目前 尚 无 有 效 的 疫 苗 来 预 防 牛 乳 头 状 瘤 病 )%%%& %))\[编码 ) 个氨 基酸& 将 2CdN?&% 株 8% 以抗原表位为基础 的 表 位 疫 苗 具 有 针 对 性 强'毒 副 基因与 LP23收录 的 % 株 毒 株 进 行 核 苷 酸 和 氨 基 作用小等优 点已 成 为 疫 苗 研 制 的 热 点 和 趋 势 ) %) 而利用生物信息学的方法对抗原表位的预测也是较 为实用'简便的方法之 一 ) % & 因 此 2Cd 8% 基 因 的 酸同源性分 析结 果 显 示 2CdN?&%8% 基 因 序 列 与其中 株 2Cd0 型核苷酸和氨基酸序列同源性高 达 :%^ $ :^ 和 :)^ $ :)^ 其 中 与

9 中 国 畜 牧 兽 医 卷 同源性最高 为 和 与 2 收录的另外 株 +@+@ 的核苷酸和氨基酸同源性分别为 和 从系统进化树可以看出 +@ 株与 +@)5 亲缘关系最近 与 +@+@ 的亲缘关系也较近 证实 +@ 株是 型 +@ 这 些结果与张婉琪等 梁辰等 贺志昊等研究结果相似 螺旋和 折叠的化学键能较高 能较牢固地 维持蛋白的高级结构 因此 二级结构对抗原表位有较大影响 通常作为蛋白功能分析的重要指 标 预测蛋白的生物学特征时 单一参数的预测结果正确率往往有限 还需综合考虑跨膜结构 信号肽 亲水性 表面可及性 抗原指数及柔韧性等预测 结果综合作出分析 ' 蛋白二级结构预测结果显示 螺旋和 折叠占 二者常处于内部且不易变形 可以稳定蛋白质结构 但不利于抗原表位形成 转角和无规则卷曲占 二者盘旋 扭曲于蛋白表面 有利于抗体结合与细胞优势抗 原表位形成 ' 蛋白第 位氨基酸的亲水性 表面可及性 抗原指数及柔韧性均较高 提示该蛋白具有较好的免疫原性 可初步应用于免疫学的相关研究中 综合保守结构域 信号肽和跨膜结构域分析发现 +@ 株 ' 蛋白无特征性功能结构域和信号肽 无跨膜结构域 即 ' 蛋白为 二次跨膜蛋白和非分泌型蛋白 三级结构显示 ' 蛋白的结构域区呈弯曲螺旋结构 氨基酸的二级结构是高级结构的基础 同时也对高级结构的形成 产生一定的影响 通过蛋白质的三级结构预测为 +@ 株 & 基因抗原表位的分析提供了更为直观的分子模型 增加了细胞抗原表位预测的可靠性 本试验结果为进一步研究该基因功能奠定基础 对后期该基因表达和核酸疫苗研制的研究提供参考 结 论 +@ 株 & 基因序列全长为 编码 个氨基酸 ' 蛋白无特征性功能结构域和信号肽 无跨膜结构域 是非分泌型蛋白 具有良好的亲水性 柔韧性分布较均匀 抗原性和表面可及性较高 参考文献 -)#@-@ &-- ') <0 %-0&-0E "#))) '&-'-72E0 '0-<00&0 -<-0-0-0%:-%-0- &-0%#0&%00E +# ")# # 2-& " )+-& #&- --&-E)- #)) 史巧芸 庞 峰 杜 丽 等 牛乳头瘤病毒的研究进展 E 中国畜牧兽医 -#0700-&-0 -&---0-0E # 殷 霞 刘景华 动物病毒学 " 第 版 北京 科学出版社 贺志昊 孟庆玲 乔 军 等 牛乳头瘤病毒基因 型流行株全基因组的克隆及序列分析 E 西北农业学报 姜晓文 权 鑫 冯欣欣 等 牛乳头状瘤病毒临床病理学检测及感染 2 细胞研究 E 中国预防兽医学报 0-2)-" 72--# &-< 000# &-E) " '-)2&&0 #0-&--E' " ) 梁 辰 牛乳头状瘤病毒的检测及其细胞感染试验 < 哈尔滨 东北农业大学 权 鑫 苦参碱抗牛乳头状瘤病毒感染 2 细胞研究 < 哈尔滨 东北农业大学 贺志昊 新疆北疆地区牛乳头瘤病毒流行株基因分型及其衣壳蛋白表达研究 < 石河子 石河子大学 E'& 7E %E 成 岩 白 靓 董丽刚 等 布鲁氏菌 ) 株 '' 蛋白细胞线性抗原表位的预测与鉴定 E 中国病原生物学杂志 张婉琪 胡建军 闫石磊 等 牛乳头瘤病毒基因 型新疆南疆 流行株全基因组序列测定及其特征分析 E 病毒学报 梁 辰 姜晓文 刘 旭 等 牛乳头状瘤的病理学观

10 期 张 海等 牛乳头状瘤病毒贵州株 & 基因克隆及生物信息学分析 察及其病毒基因型分析 E 中国预防兽医学报 贺志昊 刘贤侠 乔 军 等 奶牛乳头状瘤病理学诊断及病原分子检测研究 E 石河子大学学报 张双翔 程振涛 唐 宇 等 绵羊肺炎支原体热休克蛋白 的生物信息学分析 E 中国畜牧兽医 唐 媛 李春花 张 瑗 等 蛋白质的二级结构预测研究进展 E 现代生物医学进展 8 7--&-2&0-& %000-%%- 0E&) 0 8& :00-0-&00 &-#0 --#E) )-#-)7-%# %0%000-0E )# #) ))# 杨 羽 吴清民 羊布鲁氏菌 " 基因组分泌蛋白的生物信息学分析 E 畜牧兽医学报 孙 伟 李 达 苏 锐 等 绵羊 5 基因全长 < 克隆及生物信息学分析 E 中国农业科学 责任编辑 姚倩倩

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