常雪莲

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厉叹计
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1 基础研究基于 mtdna-coi 基因序列分析我国中华按蚊种群的遗传结构常雪莲, 钟代斌 2, 李小聪 3, 黄亚铭 4, 朱国鼎 5, 魏星, 夏惠, 陈晓光 3, 方强蚌埠医学院病原生物学教研室, 安徽蚌埠 2333; 2 美国加州大学欧文分校健康科学院公共卫生部, 加州尔湾 9267; 3 广东普通高校新发传染病防治重点实验室, 广东广州 555; 4 广西壮族自治区疾病预防控制中心, 广西南宁 5328; 5 江苏省血吸虫病防治研究所, 江苏无锡 2464 摘要 : 目的探讨我国中华按蚊种群遗传多样性遗传分化及种群系统发育关系方法本实验采用 2-22 年间在我国山东, 安徽, 江苏, 贵州, 广西和云南等 6 个不同地理环境采集的中华按蚊样品, 进行线粒体 COI 基因扩增并测序采用 Bioedit 7. 软件对测序结果进行比对分析 ; 运用 DnaSP 5. 软件确定种群遗传结构特点 ; 应用 Arlequin 3. 软件计算种群的遗传距离及遗传分化系数 ; 通过 IBDWS 在线软件来明确遗传距离与地理距离的相关性 ; 使用 PHYLIP 3.6 软件构建种群系统发育进化树结果六个中华按蚊种群共 23 个雌蚊个体的 PCR 产物成功扩增和测序 PCR 扩增中华按蚊线粒体 COI 基因序列大小为 84 bp, 平均 A+T 含量 (7.2%)> 平均 G+C 含量 (28.8%) 线粒体 COI 序列分析结果显示, 种群具有丰富的遗传多样性 ; 分子变异等级分析表明中华按蚊遗传分化主要来自于种群内部 ; 种群间存在一定的地理隔离现象中性检验, 错配分析及聚类进化树结果显示 : 中华按蚊种群发展经历扩张状态, 而云南种群相对其他种群较独立, 在系统树中为孤立一支结论线粒体 COI 基因可以作为研究中华按蚊种群遗传结构和系统进化的理想分子标志云南种群遗传发育较其他地理种群具有一定特殊性关键词 : 中华按蚊 ;mtdna-coi; 种群遗传 Analysis of population genetic structure of Anopheles sinensis based on mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunit I gene fragment CHANG Xuelian, ZHONG Daibin 2, LI Xiaocong 3, HUANG Yaming 4, ZHU Guoding 5, WEI Xing, XIA Hui, CHEN Xiaoguang 3, FANG Qiang Department of Microbiology and Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 2333, China; 2 Program in Public Health, College of Health Sciences, University of California at Irvine, Irvine 9267, USA; 3 Key Laboratory of Prevention and Control for Emerging Infectious Diseases of Guangdong Higher Institutes, Guangzhou 555, China; 4 Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Diseases Control and Prevention, Nanning 5328, China; 5 Jiangsu Institute of Parasitic Diseases, Wuxi 2464, China Abstract: Objective To study the population genetic variation, genetic diversity and phylogenesis of Anopheles sinensis in China. Methods Anopheles sinensis samples collected from Shandong, Anhui, Jiangsu, Guizhou, and Yunnan Provinces and Guangxi Zhuang Autonomous Region with different geographical conditions between 2 and 22 were analyzed by mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunit I (mtdna-coi) gene amplification and sequencing. Bioedit 7. and DnaSP 5. software was used to compare the gene sequences and analyze the population genetic structure, respectively. Arlequin 3. was used to calculate the genetic distance and parameters of population differentiation. The relationship between the geographic and genetic distances was analyzed using IBD Web Service. PHYLIP 3.6 was used to construct the phylogenetic tree. Results PCR amplification and sequencing was performed successfully for 6 Anopheles sinensis populations containing 23 female mosquitoes. The length of mtdna-coi gene fragment was 84 bp with an average A + T content of 7.2% and G + C content of 28.8%. High nucleotide diversity and genetic differentiation were observed among the Anopheles sinensis populations based on mtdna-coi gene. Analysis of the molecular variance revealed a greater variation between populations than that within populations with isolation by distance between the populations. The Anopheles sinensis populations appeared to have undergone expansion, but the Yunnan population constituted an isolated branch in the phylogenetic tree. Conclusion mtdna-coi can serve as the molecular marker to analyze population genetic variation and phylogenesis of Anopheles sinensis. The Yunnan population shows a phylogenetic difference from the other populations analyzed in this study. Key words: Anopheles sinensis; mtdna-coi; population genetic 收稿日期 : 基金项目 : 美国国立卫生研究院 NIH 项目 (D43TW9527-); 广东省普通高校新发传染病防治重点实验室开放基金项目 (KLB97); 安徽省自然科学基金 (3885MH6); 蚌埠医学院自然科学基金重点项目 (BYKY43ZD) 作者简介 : 常雪莲, 博士, 讲师,E- mail: xuelianchang@26.com 通信作者 : 方强, 博士, 教授,E- mail: fq333@sohu.com; 陈晓光, 博士, 教授, xgchen@fimmu.com 中华按蚊 (Anopheles sinensis) 属于节肢动物门昆虫纲双翅目蚊科, 分布于除新疆和青海以外的全国各省区, 是广大平原地区, 特别是水稻种植区疟疾和马来丝虫病的重要媒介 [] 有研究显示不同地理分布区的中华按蚊在生态习性传病能力和对杀虫剂的抗性等方面均存在一定的差异 [2-5] 中华按蚊不同地理种群的遗 [6-9] 传分化研究将有助于解释这些差异目前已有研究

2 分析我国按蚊属内蚊虫的系统发育关系, 但仅有运用微卫星标记分析了我国中华按蚊的种群遗传结构报道 [] 近年, 分子遗传学多用于研究种群遗传结构, 常用的分子标记为微卫星和线粒体基因, 其中线粒体 DNA 细胞色素氧化酶亚基 (mitochondria l DNA cytochrome oxidase subunit I, mtdna-coi) 基因序列因位置比较保守, 已被用于我国多种蚊虫的种群遗传结构分析, 成为具重要价值的一种有效的分子标记 [6-8,] 本研究采用线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA) 分子标记技术, 对 mtdna-coi 片段进行序列分析, 以探讨我国中华按蚊种群遗传多样性遗传分化种群系统发育关系通过对中华按蚊的遗传现状的了解, 以期为传疟媒介的治理提供基础资料材料与方法. 样本来源实验中华按蚊为 2 年 ~22 年的 7~9 月份采集自中国境内 6 个地理自然种群的现场样本 ( 图 ), 主要用吸蚊器诱蚊灯及吸蚊管采集各地区中华按蚊的成蚊样本采集地区地理形势变化多样, 由北向南包括 : 山东省济宁市 (N35o2',E6o4') 安徽省蒙城县 (N33o4',E6o35') 江苏省南京市 (N3o5', E9o') 贵州省独山县 (N25o49',E7o32') 广西省东兰县 (N24o3',E7o22') 云南省元阳县 (N23o3', E2o5') 6 个地理自然种群中, 山东江苏和安徽采集点三省位于我国华东地区的黄河长江中下游平原水网地带, 是以中华按蚊为媒介的间日疟流行区 ; 贵州广西和云南三省位于我们西南部的云贵高原地带, 地理环境特殊和气候复杂多样, 疟区分布较为复杂, 中华按蚊是该地区主要传疟媒介之一,6 个地理自然种群能较好的代表了我国中华按蚊的不同地理种群特点野外现 [2] 场采集到的样本带回室内按照陆宝麟的方法进行形态学鉴定,95% 乙醇保存, 置 -2 备用.2 DNA 制备和中华按蚊分子鉴定将单蚊置于吸水纸上晾干放入.5 ml EP 管, 加入 2 μl 新配置的 DEB 裂解液和.5 μl RNAse 酶 ( μg/μl), 用研磨棒使其匀浆化, 置 37 孵育 6 min; 加入 3. μl 蛋白 K(2 μg/μl), 置 5 孵育 6 min; 每管加入氯仿和酚各 6 μl, 涡旋混匀以 3 g 离心 min; 将上清液移入.5 ml EP 管中, 加入 3 μl 预冷 95% 乙醇, 振荡 min 放置 -2 沉淀过夜 ; 以 3 g 离心 min, 弃上清, 加入 3 μl 预冷 7% 乙醇, 以 3 g 离心 min, 弃上清, 开盖置于 37 恒温箱中干燥后, μl TE (PH7.4) 重悬 DNA 沉淀,-2 长期保存备用对提取的 [3] DNA 样本进行中华按蚊种群分子鉴定, 采用 Gao 等 [4] 和 D.JOSHI 等建立的, 已为国内外研究者广泛采用的 : 2: 3: 4: 5: 6: 图采样点地图 Fig. Map of the sampling sites. 方法对单蚊 DNA 样本进行中华按蚊种群分子鉴定, 确认为中华按蚊的样本用于后续研究.3 mtdna -COI 扩增和测序以中华按蚊基因组 DNA 为模板, 根据 Folmer [5] 设计 mtdna-coi 基因片段的兼并引物 : 上游 5'-CMCTT TCATCTGGAATTGCT-3', 下游 5'-AAAAATGTTGA GGGAArAATGTTA-3' PCR 反应体系 22 μl,dreamtaq Green PCR Master Mix(Thermo 公司 ).5 μl 上下游引物各.5 μl( μmol/l) 基因组 DNA 模板. μl 灭菌蒸馏水 8.5 μl PCR 反应条件 :95 3 min; 94 3 s;55 3 s;72 min, 共 35 个循环 ;72 6 min;4 保存取 5 μl PCR 产物经.5% 琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统观察拍照记录结果扩增成功样品送美国 Genewize 公司用 ABI 377 测序仪进行双向测序.4 数据分析采用 Bioedit 7. 软件对测序结果进行拼接处理, 正反链序列结果一致的样本再进行下一步的分析登陆 GenBank 对序列进行 BLAST 同源性比对采用 [6] DnaSP 5. 软件确定变异位点, 计算中华按蚊各种群的核酸多样性 (nucleotide diversity) 和单倍型多样性 (haplotype diversity) 及中性检验 [7] (test of selective neutrality) 和错配分布 (mismatch distribution) 分析 [8] 应用 Arlequin 3. 软件计算各地方种群间的遗传距离及进行分子方差分析 (Analysis of molecular variance, AMOVA), 以明确种群内和种群间的遗传多样性和分化程度, 通过 IBDWS [9] (IBD Web Service) 在线软件进行 Mantel 检验, 以明确遗传距离与地理距离的相关性以白跗按蚊 (Anopheles albitarsis,genbank: HQ ) 为外群, 依据遗传距离 Kimura 2- parameter 双参数法, 使用 PHYLIP 3.6 [2] 软件中 NJ

3 (Neighbor-Joining, 邻接法 ) 进行聚类分析构建系统进化树, 探讨中华按蚊各地理种群的系统发生关系 2 结果 2. 中华按蚊 mtdna -COI 基因片段的碱基组成及变异分析六个种群共 23 个雌蚊经分子鉴定为中华按蚊, PCR 扩增获得 23 条中华按蚊的 mtdna -COI 基因序列, 经比对后选用 84 bp 的片段序列进行分析 mtdna -COI 序列片段中 A C G T 平均碱基组成统计结果显示 : 四种碱基的平均含量 A:33.3%,T:37.9%,G: 5.%,C:3.7% (A+T)%=7.2%>(G+C)%=28.8%, 表现出 AT 偏倚特征, 符合线粒体 DNA 的特性变异分析 :mtdna-coi 基因序列片段 84 个位点中有 73 个保守位点,84 个变异位点,35 个单态位点,49 个简约信息位点, 无插入和缺失本研究样本序列获得 9 种单倍型 ( 至少一个碱基差异 ), 其中不同种群共享单倍型 2 种, 种群特有单倍型 7 种, 单倍型多样性 :.992, 核酸多样性 :.97 中华按蚊不同种群 mtdna -COI 序列遗传多样性具体见 ( 表 ) 表基于 mtdna-coi 基因序列中华按蚊种群遗传多样性 Tab. Haplotype and nucleotide diversity of the mitochondrial DNA-COI gene Population Sample size Parsimony ormative sites Haplotypes Haplotype diversity, Hd Nucleotide diversity Total 中华按蚊的种群遗传结构对 6 个地理种群的中华按蚊进行分子变异等级分析 ( 表 2), 结果显示 : 种群内差异为 92.67%, 种群间差异为 7.33%, 可见种群内变异明显大于种群间变异, 差异显著 (P<.), 说明遗传分化主要来自于种群内部对 6 个中华按蚊种群的遗传分化系数 (FST) 和基因流 (Nm) 进行计算表明, 种群间的遗传分化系数 Fst 范围在.5~.2423 之间 ( 表 3), 其中云南种群与其它 5 表 2 中华按蚊种群遗传变异的分子变异等级分析结果 Tab.2 AMOVA analysis of genetic variation in Anopheles sinensis populations Source of variation Among populations Within population Degree of freedom 5 7 Variarce components Percentage of variation (%) 个种群之间的分化水平均达到显著 (P<.5) 或者极显著 (P<.) 该种群与其它 5 个种群之间遗传分化系数更是达到.743~.2423 之间同时, 它与各种群间的基因流 Nm 值均较小, 表明种群间的基因交流程度较低贵州, 广西, 江苏和山东种群间有丰富的基因流 (Nm>) IBDWS 在线软件 Mantel 检验 ( 图 2), 结果显示 : 本研究所涉及的中华按蚊 6 个地理种群遗传距离和地理距离的相关系数 r=.375(p<.5), 基本呈现随距离增加基因流减少的趋势, 表明种群的遗传距离和地理距离之间符合距离隔离模型, 可能有地理隔离现象中性检验 ( 表 4) 结果显示 : 除云南种群外, 其余种群 Tajima's D 均为负值且不显著 (P>.5), 说明中华按蚊种群的线粒体 COI 基因符合中性模型, 进化过程中选择表 3 中华按蚊群体之间的基因流 Nm( 右上角 ) 和遗传距离 FST( 左下角 ) Tab.3 Pairwise Nm, genetic distance (FST) for populations of Anopheles sinensis * * * **.2423**.39**.743*.* *P<.5; **P<..

4 Exp Obs Genetic distance (Fst) Geographical distance (km) 图 2 中华按蚊种群间遗传距离和地理距离相关性 Fig.2 Isolation by distance and relationship between geographic and genetic distances in Anopheles sinensis populations. Frequence Pairwise differences 图 3 基于 mtdna-coi 部分序列中华按蚊种群错配分析 Fig.3 Mismatch distribution of Anopheles sinensis based on partial sequence of COI gene. GZ-LD 表 4 基于 mtdna-coi 序列中华按蚊种群中性检验数值 Tab.4 Neutrality test of Anopheles sinensis based on mitochondrial DNA-COI Tajima's D Fu's Fs Population D P Fs P An.albitarsis.8 图 4 中华按蚊各种群间的聚类关系 ( NJ 法 ) Fig.4 Clustering relationship among Anopheles sinensis populations based on pairwise genetic distance ( NJ method). 压力小 Fu's Fs 检验值均为负数且显著 (P<.5), 说明本研究所涉及的我国中华按蚊在近期历史发展过程中经历了种群扩张状态错配分析 ( 图 3) 结果显示 : 本研究所涉及的 6 个中华按蚊地理种群分布曲线呈单峰, 符合种群扩张模型所期望的理论分布, 进一步说明中华按蚊近期出现过扩张发展 2.3 中华按蚊 mtdna -COI 基因系统发育关系根据遗传距离 Kimura 2-parameter( 双参数法 ) 对 6 个地理种群中华按蚊进行聚类关系分析 ( 图 4), 系统树结果显示 : 中华按蚊各地理种群聚为一大支, 与外群白跗按蚊明显分开, 形成 2 个不同的大分支中华按蚊不同地理种群间又分成若干分支 : 江苏南京种群和山东济宁种群先聚在一起, 然后与贵州罗甸种群广西东兰种群及安徽蒙城种群聚为一支 ; 云南元阳种群与其他种群相对独立, 在系统树中为孤立一支 3 讨论中华按蚊分布于除新疆和青海以外的全国各省区, 是广大平原地区, 特别是水稻种植区疟疾和马来丝虫病的重要媒介, 对其种群遗传结构的研究, 将对传播疾病的防控提供重要的指导依据线粒体 DNA 是真核细胞中的遗传物质, 由卵细胞传递给后代, 呈母系遗传由于它具有分子量小进化速度快, 拷贝数量多的特点, 从而成为目前研究物种起源进化及种群遗传分析的理想研究对象在昆虫种群遗传学研究中, 细胞色素 C 氧化酶亚基基因 COI COII, 细胞色素 b(cytochrome b, Cytb) 基因等常作为分析亲缘关系较近的种亚种的系统发育分析以及地理种群之 [2] 间系统关系的分子工具本研究通过 PCR 扩增获得 23 条中华按蚊 mtdna -COI 基因序列, 经比对后, 选用 84 bp 的片段序列进行分析, 从中华按蚊 COI 基因碱基

5 特点上看,(G+C) 含量 28.8%,(A+T) 含量 7.2%, 统计 [6] 结果与我国有报道的雷氏按蚊 COI 基因序列 (G+C) 含 [7] 量 3.4%,(A+T) 含量 68.6 %, 多斑按蚊复合体 COI 基因序列 (G+C) 含量 29.%,(A+T) 含量 7.9%; 及大劣按 [8] 蚊 COI 基因序列 (A+T) 含量 7.%~7.22% 的碱基组成结果相近, 具有明显的 A/T 碱基偏倚性 6 个中华按蚊地理种群 COI 基因中检测到 73 个保守位点,84 个变异位点,35 个单态位点,49 个简约信息位点, 无插入和缺失 6 个种群序列的高度相似提示我们, 中华按蚊有着共同的祖先 mtdna-coi 序列, 随着群体扩张和迁移, 以及地理以及气候等因子的变化,mtDNA-COI 序列也不断发生突变, 从而形成了目前的群体遗传结构格局 23 个样品中检测到 9 种单倍型, 其中共享单倍型 2 种, 特有单倍型 7 种, 单倍型多样性 h:.992, 核酸多样性 π:.97, 表明以线粒体 COI 序列分析中华按蚊具有丰富的遗传多样性, 线粒体 COI 序列可以作为研究物种起源进化及种群遗传分析的理想分子标志本研究对 6 个地理种群 AMOVA 分析显示, 中华按蚊种群内变异明显大于种群间变异 (P<.), 遗传分化主要来自于种群内部而在 Mantel 检验中却显示, 种群遗传距离和地理距离的相关系数 r=.375, 表明 6 个中华按蚊种群遗传结构格局基本符合距离隔离模型对 6 个中华按蚊种群的遗传分化系数 (FST) 和基因流 (Nm) 进行分析, 结果表明, 种群间存在遗传分化, 其中云南种群与其它 5 个种群之间的分化水平最高基因流分析结果进一步证实该种群与其它 5 个种群之间的基因交流程度较低可能存在生殖隔离现象马雅军等运用 RAPD-PCR 技术检测中华按蚊种群遗传分化同样显示分化主要来自于种群内部, 但在遗传距离分析上显示, 中华按蚊种群遗传距离与地理位置没有对应关 [22] 系本研究提示地理隔离对中华按蚊种群间遗传分化从 COI 序列数据分析上看, 似乎有着一定的影响进一步的中性检验和错配分析结果显示 : 除云南种群外, 其余种群 D 均为负值, 中华按蚊种群在遗传进化中经历过扩张状态在系统树结果显示 : 云南元阳种群与其他种群相对独立, 在系统树中为孤立一支一个物种种群的遗传结构受到诸多因素的影响, 如分布的地理特征气候杀虫剂的使用等在 AMOVA 分析中显示出中华按蚊种群内变异明显大于种群间变异是由于云南检测样品数量远远小于其他地方数量之和, 从而表现出遗传分化主要来自于种群内部, 当然若要证实上述中华按蚊群体的遗传分化现象, 需要增加云贵广的样本检测众所周知, 我国云南省是一个著名的生物多样性的 [23] 中心, 云南省地处云贵高原, 地理地貌复杂, 气候变化从热带到亚热带, 特殊地理气候条件, 使得云南地区中华按蚊种群与其他种群间产生了地理隔离现象 [24] Zhong 等研究发现, 云南地区中华按蚊种群抗药性机理上与其他种群存在巨大的差别, 这在一定程度上也与本研究发现的云南种群遗传结构与其他地方种群存在差异的结果相互印证, 并显示出种群遗传结构的差异可能是药物抗性等蚊媒治理中倍受关注问题的产生机制不同的遗传基础参考文献 : [] 边长玲, 龚正达. 我国蚊类及其与蚊媒病关系的研究概况 [J]. 中国病原生物学杂志, 29, 4(7): [2] Guoding Zhu, Hui Xia, Huayun Zhou, et al. Susceptibility of Anopheles sinensis to Plasmodium vivax in malarial outbreak areas of central China[J]. Parasite Vector, 23, 6: 76. [3] 孙定炜, 王善青, 卓开仁, 等. 海南省中华按蚊对 3 种杀虫剂的抗药性研究 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 24, 32(2): [4] 张玉勤, 刘吉起, 郭祥树, 等. 河南省淮滨县中华按蚊的抗药性研究 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 22,3(6): [5] 刘颖, 陈建设, 周瑞敏, 等. 中华按蚊对杀虫剂敏感性调查 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 22, 3(4): 9-. [6] 杨曼尼, 马雅军. 基于 mtdna-coi 基因序列的雷氏按蚊分子群体遗传结构研究 [J]. 昆虫学报, 29, 52(9): -7. [7] 武松, 黄芳, 周水森. 我国多斑按蚊复合体 mtdna-coi 基因序列特征与系统发育学研究 [J]. 中国病原生物学杂志, 23, 8(2): [8] 王冬, 马雅军, 周红宁. 应用 mtdna-coi 基因序列研究我国大劣按蚊 A, D 群体的遗传差异 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 27, 25(5): [9] 刘茜, 武松, 汤林华, 等. 伪威氏按蚊 mtdna-cytb 基因群体遗传学研究 [J]. 中国人兽共患病学报, 2l, 27(2): 7-4. []Ma Y, Yang M, Fan Y, et al. Population structure of the malaria vector Anopheles sinensis (Diptera:Culicidae) in China:two gene pools erred by microsatellites[j]. PloS One, 2, 6(7): e2229. [] 兰策介, 沈元, 鲁亮, 等. 5 种库蚊的 COI 基因分子进化分析 [J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 23,24():28-3. [2] 陆宝麟, 陈汉彬, 瞿逢伊, 等. 中国动物志. 昆虫纲. 第八卷. 双翅目. 蚊科 ( 上 )[M]. 北京 : 科学出版社, 997: [3]Gao Q, Beebe NW, Cooper RD. Molecular identification of the malaria vectors Anopheles anthropophagus and Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae) in central China using polymerase chain reaction and appraisal of their position within the Hyrcanus group [J]. J Med Entomol, 24, 4():5-. [4]Joshi D, Park MH, Saeung A, et al. Multiplex assay to identify Korean vectors of malaria[j]. Mol Ecol Resour, 2, (4): [5]Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[j]. Mol Mar Biol Biotechnol, 994, 3(5): [6]Rozas J, Sanchez-DelBarrio JC, Messequer X, et al. DnaSP,DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[j]. Bioormatics, 23, 9(8): [7]Kimura M. A simple model for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J]. J Mol Evol, 98, 6(2): -2.

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48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [ 5 6 2 00 9 1 2 South China Fisheries Science Vol. 5, No. 6 Dec., 2009 doi: 10. 3969/ j. issn. 1673-2227. 2009. 06. 009 16S rrna,,, (, 510300) : PCR ( Pinctada fucata) ( P. chemnitzi) ( Pteria penguin)